Summary
Trockenpulverformulierungen zur Inhalation haben ein großes Potenzial bei der Behandlung von Atemwegserkrankungen. Vor dem Eintritt in Studien am Menschen ist es notwendig, die Wirksamkeit der Trockenpulverformulierung in präklinischen Studien zu bewerten. Eine einfache und nichtinvasive Methode zur Verabreichung von Trockenpulver bei Mäusen über den intratrachealen Weg wird vorgestellt.
Abstract
Bei der Entwicklung von inhalierbaren Trockenpulverformulierungen ist es wichtig, ihre biologischen Aktivitäten in präklinischen Tiermodellen zu bewerten. Dieses Papier führt eine nichtinvasive Methode der intratrachealen Abgabe von Trockenpulverformulierung bei Mäusen ein. Präsentiert wird eine trockene Pulverladevorrichtung, die aus einer 200 l L Gel-Ladepipettenspitze besteht, die über einen Dreiwege-Stopphahn mit einer 1 ml Spritze verbunden ist. Eine kleine Menge Trockenpulver (1-2 mg) wird in die Pipettenspitze geladen und mit 0,6 ml Luft in der Spritze dispergiert. Da Pipettenspitzen Einweg- und Preisprodukte sind, können verschiedene Trockenpulverformulierungen im Voraus in verschiedene Spitzen geladen werden. Verschiedene Formulierungen können im selben Tierexperiment ohne Gerätereinigung und Dosisnachfüllen bewertet werden, wodurch Zeit gespart und das Risiko einer Kreuzkontamination durch Restpulver vermieden wird. Das Ausmaß der Pulverdispersion kann anhand der Inderintauchmenge in der Pipettenspitze untersucht werden. Ein Protokoll der Intubation in der Maus mit einer maßgeschneiderten Lichtquelle und einer Führungskanüle ist enthalten. Die richtige Intubation ist einer der Schlüsselfaktoren, die die intratracheale Abgabe von Trockenpulverformulierung entoltal entherin in den tiefen Lungenbereich der Maus beeinflussen.
Introduction
Der lungene Verabreichungsweg bietet verschiedene Vorteile bei der Bereitstellung von Therapeutika für lokale und systemische Maßnahmen. Für die Behandlung von Lungenerkrankungen kann eine hohe lokale Medikamentenkonzentration durch Lungenabgabe erreicht werden, wodurch die erforderliche Dosis reduziert und die Inzidenz systemischer Nebenwirkungen verringert wird. Darüber hinaus können die relativ geringen enzymatischen Aktivitäten in der Lunge den vorzeitigen Arzneimittelstoffwechsel reduzieren. Die Lunge ist auch effizient für die Arzneimittelabsorption für systemische Wirkung aufgrund der großen und gut durchfundierten Oberfläche, der extrem dünnen Epithelzellschicht und des hohen Blutvolumens in Lungenkapillaren1.
Inhalierte Trockenpulverformulierungen wurden umfassend für die Prävention und Behandlung von verschiedenen Krankheiten wie Asthma, chronisch obstruktiver Lungenerkrankung, Diabetes mellitus und Lungenimpfung2,3,4untersucht. Medikamente im festen Zustand sind in der Regel stabiler als in der flüssigen Form, und trockene Pulverinhalatoren sind tragbarer und benutzerfreundlicher als Vernebler5,6. Bei der Entwicklung von inhalierten Trockenpulverformulierungen müssen die Sicherheit, das pharmakokinetische Profil und die therapeutische Wirksamkeit in präklinischen Tiermodellen nach lungenerVerabreichung7 bewertet werden. Im Gegensatz zu Menschen, die trockenes Pulver aktiv einatmen können, ist die Lungenabgabe von trockenem Pulver an Kleintiere eine Herausforderung. Es ist notwendig, ein effizientes Protokoll für die Lieferung von trockenem Pulver an die Lunge von Tieren zu erstellen.
Mäuse sind weit verbreitet als Forschungstiermodelle verwendet, weil sie wirtschaftlich sind und sie gut brüten. Sie sind auch einfach zu handhaben und viele Krankheitsmodelle sind gut etabliert. Es gibt zwei Hauptansätze, um trockenes Pulver an die Lunge der Maus zu verabreichen: Inhalation und intratracheale Verabreichung. Zum Einatmen wird die Maus in eine Ganzkörper- oder Nasenkammer gelegt, in der trockenes Pulver aerosolisiert wird und die Tiere das Aerosol ohne Sedierung8,9einatmen. Teure Ausrüstung ist erforderlich und die Wirksamkeit der Medikamentenabgabe ist gering. Während die Ganzkörperkammer technisch weniger anspruchsvoll sein kann, könnte die Nasen-Expositionskammer die Exposition von Medikamenten an der Körperoberfläche minimieren. Unabhängig davon ist es immer noch schwierig, die an die Lunge abgegebene Dosis genau zu kontrollieren und zu bestimmen. Das trockene Pulver wird hauptsächlich in der Nasopharynx-Region abgelagert, wo die Mukociliaary Clearance prominentist 10. Darüber hinaus sind Mäuse in der Kammer während des Verabreichungsprozesses unter erheblichem Stress, weil sie eingeschränkt und der Nahrungs- und Wasserversorgung beraubt sind11. Für die intratracheale Verabreichung bezieht es sich in der Regel auf die Einführung des Stoffes direkt in die Luftröhre. Es gibt zwei verschiedene Techniken, um dies zu erreichen: Tracheotomie und orotracheale Intubation. Ersteres erfordert einen chirurgischen Eingriff, der einen Schnitt in der Luftröhre macht, die invasiv ist und selten für die Pulververabreichung verwendet wird. Hier wird nur die zweite Technik beschrieben. Im Vergleich zur Inhalationsmethode ist die intratracheale Verabreichung die am häufigsten verwendete Methode zur Lungenabgabe in der Maus wegen ihrer hohen Liefereffizienz bei minimalem Medikamentenverlust12,13. Es ist eine einfache und schnelle Methode, um eine kleine Menge Pulver innerhalb weniger Milligramm genau an die Maus zu liefern. Obwohl die Maus anatomisch und physiologisch für den Menschen unterscheidet und während des Intubationsprozesses eine Anästhesisierung erforderlich ist, umgeht die intratracheale Verabreichung die oberen Atemwege und bietet eine effektivere Möglichkeit, die biologischen Aktivitäten der Trockenpulverformulierung wie Lungenabsorption, Bioverfügbarkeit und therapeutische Wirkungen14,15zu bewerten.
Um trockenes Pulver intratracheal zu verabreichen, muss die Maus intubiert werden, was eine Herausforderung sein könnte. In diesem Papier wird die Herstellung eines maßgeschneiderten Trockenpulverinsufflators und einer Intubationsvorrichtung beschrieben. Die Verfahren der Intubation und Insufflation von trockenem Pulver in der Lunge der Maus werden demonstriert.
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Protocol
Die in dieser Studie durchgeführten Experimente wurden vom Committee on the Use of Live Animals for Teaching and Research (CULATR), der University of Hong Kong, genehmigt. Trockenpulverformulierungen, die durch Sprühgefriertrocknung (SFD) hergestellt werden und 0,5% der Luziferase-Boten-RNA (mRNA), 5% synthetisches Peptid PEG12KL4 und 94,5% Mannitol (w/w) enthalten, werden in dieser Studie verwendet, um die mRNA-Expression in der Lunge zu demonstrieren16. Der mittlere Aerodynamikdurchmesser (MMAD) des SFD-Pulvers beträgt 2,4 m. Sprühgetrocknetes (SD) Mannitolpulver wird verwendet, um die Wirkung des Luftvolumens in pulverdispersion16zu untersuchen. Der MMAD aus SD-Pulver ist 1,5 m.
1. Herstellung von Trockenpulver-Insufflator und Beladung von trockenem Pulver
- (Optional) Neutralisieren Sie die statischen Ladungen von trockenem Pulver (in einer Durchstechflasche) und der 200 L Non-Filter-Rund-Gel-Ladepipettenspitze. Verwenden Sie eine antistatische Pistole oder ein Gleichgewicht mit Deionisierungsfunktion gemäß der Anweisung des Herstellers.
- Bereiten Sie ein Wägepapier mit einer Größe von ca. 4 cm x 4 cm vor. Falten Sie das Papier in der Hälfte diagonal und dann entfalten.
- Wiegen Sie 1-2 mg trockenes Pulver auf dem Wägepapier.
- Füllen Sie eine Gel-Lade-Pipettenspitze mit Pulver durch die breitere Öffnung der Spitze. Tippen Sie vorsichtig, um das Pulver zu verpacken, bis das Pulver lose Agglomerate in der Nähe des schmalen Endes der Spitze bildet (Abbildung 1A). Vermeiden Sie das Verpacken des Pulvers zu eng, da es die Pulverdispersion behindern kann.
- Schließen Sie die pulverbelastete Spitze über einen Dreiwege-Stoppcock an eine 1 ml Spritze an (Abbildung 1B). Die Größe der Spritze kann entsprechend dem Volumen der Luft geändert werden, die verwendet wird, um das Pulver zu dispergieren. Halten Sie die Spitze und Spritze während des Anschlusses vertikal, um das Auslaufen von Pulver zu verhindern. Wenn die Verabreichung nicht sofort durchgeführt wird, verwenden Sie Parafilm, um die Öffnungen der Spitze zu versiegeln und vorübergehend unter geeigneten Bedingungen bis zur Verabreichung aufzubewahren.
2. Herstellung von Intubationsvorrichtung
- Lichtquelle (Abbildung 2)
- Bereiten Sie eine maßgeschneiderte Lichtquelle mit einem Leuchtdiodenbrenner (LED) und einer flexiblen Optischen Faser mit einem Durchmesser von 0,8-1 mm vor.
- Machen Sie eine zentrierte Öffnung auf der klaren Linse des LED-Brenners mit einem Handbohrer oder einem Bohrer, so dass die Glasfaser kaum passieren kann.
- Legen Sie die Glasfaser durch die Öffnung. Schalten Sie den LED-Brenner ein, um die Position und die Einfügetiefe für maximale Helligkeit am anderen Ende der Glasfaser einzustellen.
- Befestigen Sie die Glasfaser in Position mit klarem Epoxidkleber.
- Führungskanüle (Abbildung 3)
- Nehmen Sie eine 1 ml Kunststoff Pasteur Pipette (Abbildung 3A) und halten Sie die Pipette an beiden Enden.
- Verwenden Sie eine Alkohollampe (oder andere Wärmequellen im Labor wie einen Bunsenbrenner), um die Mitte der Pipette zu erhitzen, indem Sie sie bei 5-10 cm über der Flamme platzieren(Abbildung 3B). Drehen Sie die Pipette, um sicherzustellen, dass sie gleichmäßig erhitzt wird.
- Wenn der Kunststoff weich und verformbar wird, bewegen Sie die Pipette von der Flamme weg und dehnen Sie die Pipette sanft.
- Schneiden Sie die gestreckte Pipette in der Mitte mit einer Schere in Teil A und Teil B (Abbildung 3C-E). Verwenden Sie Teil A als Feinspitzenpipette und Teil B als Führungskanüle. Um die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Intubation mit der Führungskanüle zu erhöhen, machen Sie eine Abschrägung (nicht zu scharf, die das Risiko der Verletzung des Tieres erhöhen kann) am Ende von Teil B (Abbildung 3F). Wenn eine 200 L L Gel-Ladepipettenspitze (für Pulverbelastung) in die Führungskanüle eingesetzt wird, sollte sie um 1-2 mm in die Kanüle ragen.
HINWEIS: Eine Führungskanüle (Teil B) mit der entsprechenden Dimension (Innen- und Außendurchmesser) für die Intubation könnte eine 21-Spur-Nadel in sie passen, während sie auch in eine 17-Spur-Nadel passen kann. Es können mehrere Versuche erforderlich sein, um die Pipetten zu dehnen, um die entsprechende Dimension zu erreichen. - (Optional): Schneiden Sie eine kleine Öffnung am breiteren Ende der Führungskanüle, um sie flexibler zu machen, so dass es einfacher ist, die Glasfaser zu halten (Abbildung 3F). Diese Öffnung ermöglicht auch den Einbau eines Mikrosprühers für die Verabreichung von flüssigem Aerosol.
3. Intubation
- Anästhesisieren Sie die Maus (BALB/c, 7-9 Wochen) mit Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) durch intraperitoneale Injektion.
- Bereiten Sie eine Plattform aus Plexiglas vor und montieren Sie sie mit einer Klemme an einen Ständer (Abbildung 4A). Platzieren Sie die anästhesierte Maus auf der Plattform (bei etwa 60° Neigung) in einer Supine-Position. Die Höhe und der Neigungswinkel der Plattform konnten durch die Position der Klemme auf dem Ständer eingestellt werden.
- Halten Sie die Maus an, indem Sie ihre Schneidezähne an eine Nylonseide hängen (Abbildung 4B). Sichern Sie die Position der Maus durch ein Stück Klebeband oder ein Gummiband.
- Setzen Sie die optische Faser vor der Intubation mit der Spitze des Faserniveaus mit der Öffnung der Führungskanüle in die Führungskanüle ein. Schalten Sie den LED-Brenner ein, um zu leuchten.
- Schieben Sie die Zunge der Maus vorsichtig mit einem Paar Zangen hervor, um ihre Luftröhre freizulegen.
- Verwenden Sie die andere Hand, um die Führungskanüle mit Glasfaser innen zu halten. Legen Sie sie durch die Mundhöhle. Mit der Beleuchtung aus der Optischen Faser kann die Öffnung der Luftröhre als Öffnung zwischen den Stimmbändern visualisiert werden.
- Richten Sie die Abschrägung der Führungskanüle auf die Mittellinie der Öffnung aus (Abbildung 5A). Intubieren Sie die Führungskanüle mit Glasfaser sanft in die Luftröhre, indem Sie die feinste Spitze der Kanüle auf die Luftröhreeinltenöffnung zielen.
- Bei der Intubation die optische Faser schnell entfernen und die Führungskanüle in der Luftröhre lassen (Abbildung 5B). Eine normale Atmung sollte beobachtet werden.
- Halten Sie die feine Spitzenpipette (Teil A) beim Öffnen der Führungskanüle und insuffieren Sie einen kleinen Luftwirbel (ca. 0,2 ml) in die Lunge der Maus. Eine leichte Inflation in der Brust der Maus weist auf eine richtige Intubation hin. Entfernen Sie die Feinspitze Pipette vor der Pulververabreichung.
4. Pulververwaltung
- Halten Sie die pulverbelastete Spitze, die mit der Spritze verbunden ist, wie in Schritt 1.5 beschrieben. Stellen Sie sicher, dass der Luftstrom zwischen der Spritze und der Spitze getrennt ist.
- Ziehen Sie den Spritzenkolben nach hinten, um 0,6 ml Luft zurückzuziehen.
HINWEIS: Das Volumen der Luft, die verwendet wird, um das Pulver zu dispergieren, hängt von den Eigenschaften des Pulvers und der Menge des geladenen Pulvers ab. Dies wird im Ergebnisabschnitt weiter beschrieben. - Drehen Sie das Ventil des Drei-Wege-Stopphahns, um den Luftstrom zwischen der Spritze und der pulverbelasteten Spitze zu verbinden.
- Setzen Sie die pulverbelastete Spitze in die Führungskanüle ein, die bereits in die Luftröhre der Maus gelegt wurde (Abbildung 5C). Halten Sie die Führungskanüle und drücken Sie den Spritzenkolben in einer kontinuierlichen Aktion, um das Pulver als Aerosole in die Lunge zu zerstreuen.
HINWEIS: Jede Vorwärtsbewegung des Geräts sollte minimiert werden, um eine Verletzung des Tieres zu vermeiden. - Entfernen Sie die Spitze und überprüfen Sie, ob das Pulver in der Spitze geleert wurde. Wenn dies nicht der Fall ist, wiederholen Sie Schritt 4.1 bis 4.4.
HINWEIS: Wenn das Pulver aufgrund übermäßigen Abklopfens zu fest verpackt ist, wird es möglicherweise nicht richtig dispergiert. - Sobald die Verabreichung abgeschlossen ist, entfernen Sie die Führungskanüle aus der Luftröhre.
- Lassen Sie die Maus sich erholen, indem Sie sie horizontal in einer Supine-Position positionieren, wobei die Zunge halb hervorsteht, um die Blockade der Atemwege zu vermeiden.
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Representative Results
Wenn ein Trockenpulver-Insufflator verwendet wird, um Pulveraerosol in die Lunge eines Tieres zu liefern, ist das verwendete Luftvolumen entscheidend, da es sowohl die Sicherheit als auch die Pulverdispersionseffizienz beeinflusst. Zur Optimierung der Methode wurden verschiedene Luftmengen (0,3 ml, 0,6 ml und 1,0 ml) verwendet, um das Trockenepulver (1 mg sprühgetrocknetes Mannitol) zu dispergieren, und das Gewicht von Mäusen wurde 48 Stunden nach der Verabreichung überwacht(Abbildung 6). Die Verwendung von 0,3 ml und 0,6 ml Luft verursachte keinen Gewichtsverlust der Mäuse bis zu 48 h nach der Verabreichung. Die Dispergierung des Pulvers mit 1 ml Luft führte zu über 5% Gewichtsverlust innerhalb von 24 h, die nach 48 h nicht vollständig zurückgewonnen wurde. In diesem Protokoll wurden BALB/c-Mäuse im Alter von 7-9 Wochen verwendet. Je nach Art, Stamm und Alter des Tieres, den Pulvereigenschaften (z. B. Partikelgrößenverteilung, Kohäsivität und Dichte) und der zu verabreichenden Pulvermasse kann das für eine effiziente Pulverdispersion und Tiertoleranz zu verwendende Luftvolumen von den Forschern für verschiedene Tiermodelle optimiert werden.
Trockenpulverformulierung, die durch Sprühgefriertrocknung (SFD) hergestellt wird, wurde den Mäusen mit dem oben beschriebenen Verfahren geliefert. Die SFD-Formulierung enthielt 0,5% mRNA, die Luziferase-Protein, 5% des synthetischen Peptids als Abgabevektor und 94,5% von Mannitol16. BALB/c-Mäuse wurden intratracheal mit 1 mg SFD-Pulver verabreicht, das 5 g mRNA enthielt, und die Luziferase-Expression in der Lunge wurde nach der Verabreichung nach der Verabreichung mit einem In-vivo-Bildgebungssystem (IVIS) bei 24 h bewertet (Abbildung 7). Das SFD-Pulver wurden in der tiefen Lunge dispergiert und Luziferase-Expression wurde beobachtet. Zum Vergleich: Das SFD-Pulver wurde in PBS (bis zu einem Endvolumen von 75 l) rekonstituiert und Mäusen als Flüssigkeit mit dem gleichen Intubationsverfahren verabreicht, aber stattdessen wurde ein Mikrosprayer verwendet, um flüssiges Aerosol zu erzeugen16. Die Luziferase-Expression der rekonstituierten Formulierung war signifikant höher als die Trockenpulverformulierung, die auf die Pulverauflösung sende oder ein anderes pharmakokinetisches Profil zwischen Pulver und flüssiger Form zurückzuführen sein könnte. Die histologischen Eigenschaften der mit mRNA-Trockenpulver-Aerosol behandelten Lunge wurden mit unbehandelten Kontroll- und Lipopolysaccharid-Behandelten (LPS) verglichen (Abbildung 8). Die Lunge ohne jegliche Behandlung illustrierte eine gesunde Darstellung, während die mit 10 g LPS behandelte Lunge intratracheal eine unregelmäßige Verteilung des Luftraums und die inflammatorische Zellinfiltration in die interstitiellen und alveolaren Räume zeigte. Die mit SFD-Pulver behandelten Lungen zeigten keine Anzeichen einer Entzündung.
Abbildung 1: Maßgeschneiderter Trockenpulver-Insufflator.
(A) Pulver wird in der Nähe des schmalen Endes der Spitze verpackt. (B) Eine Gel-Ladepipettenspitze wird über einen Dreiwege-Stopphahn mit einer 1 ml Spritze verbunden. Die Figur ist von Liao et al.21adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Maßgeschneiderte Lichtquelle für intubation.
Eine flexible Glasfaser wird mit einem LED-Brenner verbunden, indem ein kleines Loch auf der Linse entsteht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Führungskanüle.
(A) Eine 1 ml Kunststoff Pasteur Pipette wird verwendet, um eine Führungskanüle zu machen. (B) Die Pipette wird durch Erhitzen aufgeweicht. (C) Die beheizte Pipette wird gedehnt und geschnitten. (D) Teil A der Pipette wird als Feinspitzenpipette verwendet. (E&F) Teil B der Pipette wird als Führungskanüle verwendet. Eine Abschrägung wird erstellt, um den Intubation-Vorgang zu erleichtern. Eine kleine Öffnung (optional) kann gemacht werden, um die Flexibilität der Kanüle zu erhöhen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Intubationsplattform.
(A) Die Plattform für die Intubation besteht aus einer Plexiglasplatte, die an einem Ständer montiert ist. (B) Eine beästhesierte Maus wird auf der Plattform in einer Rückenposition platziert, die durch Daseinhaken ihrer Schneidezähne mit einer Nylonseide aufgehängt wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Schemadiagramm zur Veranschaulichung des Intubationsvorgangs.
(A) Die Abschrägung der Führungskanüle ist an der Mittellinie der Trachealöffnung ausgerichtet. (B) Die Führungskanüle wird in die Luftröhre eingeführt und zur Pulververabreichung bereit. (C) Die pulverbelastete Spitze (verbunden mit der Spritze durch einen Dreiwege-Stopphahn) wird in die Führungskanüle eingeführt, die bereits in die Luftröhre der Maus gelegt wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Intratracheale Verabreichung von Trockenepulver mit unterschiedlichem Luftvolumen.
BALB/c-Mäuse wurden intratracheal mit sprühgetrocknetem (SD) Mannitolpulver verabreicht, das mit 0,3 ml, 0,6 ml und 1,0 ml Luft dispergiert wurde. Das Körpergewicht der Mäuse wurde vor der Verabreichung und bei 18 h, 24 h und 48 h nach der Verabreichung überwacht. Die Daten wurden als Mittelwert des Prozentsatzes der Gewichtsänderung (n=2) dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Intratracheale Verabreichung der mRNA-Formulierung als Trockenpulver und rekonstituiertes flüssiges Aerosol.
BALB/c-Mäuse wurden intratracheal mit sprühgefriergetrockneten (SFD) 0,5% mRNA (Luciferase) Formulierung als Pulveraerosol (1 mg) mit maßgeschneidertem Trockenpulver-Insufflator oder rekonstituiertem flüssigem Aerosol (1 mg in 75 l PBS) mit Mikrosprayer verabreicht. Jede Maus erhielt eine Dosis von 5 g mRNA. PBS (75 l) wurde als Steuerung verwendet. Bei 24 h nach der Verabreichung (A) wurde die Lunge für die Biolumineszenz-Bildgebung isoliert; (B) die Luciferase-Proteinexpression des Lungengewebes wurde gemessen. Die Daten wurden als Mittelwert der relativen Lichteinheit (RLU) pro mg Protein ausgedrückt, analysiert durch einwegs ANOVA, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test, ***p < 0,001 (n=4). Die Figur ist von Qiu et al.16adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8: Histologie der Lunge von Mäusen nach intratrachealer Verabreichung der mRNA-Trockenpulverformulierung.
(A) unbehandelte Kontrolle; Mäuse wurden intratracheal mit (B) LPS (10 mg in 25 L PBS) und (C) sprühgefriergetrocknetem mRNA-Pulver (1 mg) verabreicht. Die Dias wurden mit einem aufrechten Mikroskop bei 20-facher Vergrößerung (Skalenbalken = 100 mm) betrachtet. Die Figur ist von Qiu et al.16adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
In diesem Papier werden maßgeschneiderte Geräte zur Trockenpulverinsufflation und intratrachealen Intubation vorgestellt. Im Pulverladeschritt wird Trockenpulver in eine 200-L-Gel-Ladepipettenspitze geladen. Es ist wichtig, vorsichtig auf die Spitze zu tippen, um die lose Verpackung von Pulver am schmalen Ende der Spitze zu ermöglichen. Wenn das Pulver jedoch zu fest verpackt ist, bleiben sie in der Spitze stecken und können nicht richtig dispergiert werden. Es wird empfohlen, die statischen Aufladungen des Pulvers und der Pipettenspitze zu neutralisieren, um die Pulverbelastung zu erleichtern, insbesondere bei Pulver mit geringer Dichte und geringer relativer Luftfeuchtigkeit. Die Führungskanüle ist eine kritische Komponente des Geräts. Es wird verwendet, um die Intubation von pulverbelasteten Pipettenspitzen in die Luftröhre der Maus zu erleichtern. Der Durchmesser der Führungskanüle sollte nicht zu breit sein; andernfalls wird es schwierig sein, es in die Luftröhre einzufügen und kann die Maus verletzen. Der Durchmesser der Führungskanüle sollte gerade breit genug sein, um die optische Faser und die pulverbelastete Pipettenspitze zu passen, und die Pipettenspitze sollte die Führungskanüle um ca. 1-2 mm herausragen.
Die Möglichkeit, die Öffnung der Luftröhre zu visualisieren, ist entscheidend im Intubationsprozess, so dass die Führungskanüle richtig eingesetzt werden kann. Die Trachealöffnung besteht aus weißem Arytenoidknorpel mit regelmäßiger Öffnungs- und Schließbewegung an der Rückseite des Rachens. Mit der Glasfaserbeleuchtung ließe sich die Öffnung der Luftröhre leicht visualisieren. Durch das Puffen eines winzigen Luftvolumens durch die feine Spitze Kunststoffpipette, eine Inflation an der Brust zeigt eine richtige Intubation. Wenn die Inflation an der Brust nicht beobachtet wird oder Widerstand während des Einsetzens zu spüren ist, ziehen Sie die Führungskanüle schnell zurück und wiederholen Sie die Schritte erneut.
Es gab eine weit verbreitete kommerziell erhältliche Trockenpulver-Insufflator12,17,18 ( Tabelle derMaterialien; dieses Gerät ist jetzt eingestellt). Das Trockenepulver wird in die Probenkammer des Gerätes geladen und durch Luft aus einer 3 ml Kunststoffluftspritze oder einer Luftpumpe dispergiert. Um die emittierte Dosis zu messen, muss das Gerät vor und nach der Pulververabreichung gewogen werden, was zu Ungenauigkeiten führt, wenn man bedenkt, dass die Pulverdosis in der Regel sehr gering ist (bezogen auf die Masse des Geräts). Im Vergleich zum kommerziellen Insufflator besteht der größte Vorteil des kundenspezifischen Gerätes darin, dass der Erfolg der Pulverdispersion durch das Fehlen von Pulver in den transparenten Gel-Ladepipettenspitzen beobachtet werden konnte. Da die Pipettenspitze leicht ist, kann sie auch vor und nach der Verabreichung genau gewogen werden, um die emittierte Dosis zu messen. Die Pipettenspitze wird in die Führungskanüle eingeführt, anstatt der Luftröhre des Tieres ausgesetzt zu sein. Es besteht ein minimales Risiko, die Spitze mit der Feuchtigkeit oder Sekretion in der Luftröhre zu kontaminieren (was die Genauigkeit der emittierten Dosismessung beeinträchtigen kann). Da die Pipettenspitzen Einweg- und Preisprodukte sind, können verschiedene Trockenpulverformulierungen im Voraus in verschiedene Spitzen geladen werden. Verschiedene Formulierungen können im selben Tierexperiment ohne Gerätereinigung und Dosennachfüllen bewertet werden, wodurch Zeit gespart und das Risiko einer Kreuzkontamination durch Restpulver vermieden wird. Darüber hinaus variierte das pulverdispersionsmuster, das durch den kommerziellen Insufflator erzeugt wird, zwischen verschiedenen Formulierungen. Eine Reihe von Studien berichteten, dass trockenes Pulver, das durch den kommerziellen Insufflator dispergiert wurde, leicht agglomeriert waren und die tiefe Lunge nach Verabreichung nicht erreichten19,20. Im Gegensatz dazu haben andere Formulierungen, die von Geräten wie unsere dispergiert werden, eine hohe Lungenabscheidung15,21,22.
Es gibt andere ähnliche maßgeschneiderte Geräte in der Literatur für die Verabreichung von Pulver-Aerosol auf die Lunge des Tieres berichtet. Zum Beispiel beschrieben Chaurasiya et al. die Verwendung eines Kanülenrohrs zur Intubation sowie pulverbelastet, wobei eine Spritze nach intubation für Pulverdispersion mit dem Kanülenrohr verbunden ist23. Während ihr Ansatz standardisierte Geräte und Materialien (z.B. Otoscope, Kanüle und Spritze) mit weniger Anpassungsfähigkeit verwendet, bietet die Methode hier einige deutliche Vorteile. Erstens, Es ermöglicht die Bestätigung der korrekten Intubation vor der Verabreichung von Medikamenten. Dieser Schritt ist besonders hilfreich für weniger erfahrene Benutzer. Zweitens kann die Führungskanüle als Schutzschild fungieren, um zu verhindern, dass eine Sekretion oder Feuchtigkeit in der Luftröhre die Gel-Ladepipettenspitze verunreinigt, was eine genauere Emittierte Dosismessung durch Wiegen ermöglicht. Schließlich kann die flexiblere Führungskanüle zusammen mit der Optischen Faser eine einfachere Intubation ermöglichen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in diesem Papier ein maßgeschneiderter Trockenpulver-Insufflator eingeführt wird, der kostengünstig, einwegbar, reproduzierbar und effizient bei der Zerstreuung kleiner Mengen Pulver präzise ist. Der erwähnte Intubationsprozess ist nicht invasiv, schnell und könnte den Mäusen Pulverformulierungen sicher und genau liefern. Es kann auch angenommen werden, um flüssige Formulierung für die Lungenabgabe zu verabreichen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Die Autoren danken Herrn Ray Lee, Herrn HC Leung und Mr. Wallace So für ihre freundliche Unterstützung bei der Herstellung der Lichtquelle und des Pulverinsufflators; und die Fakultät senkernde Einrichtung für die Unterstützung bei der Tierbildgebung. Die Arbeit wurde vom Research Grant Council, Hong Kong (17300319) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BALB/c mouse | Female; 7-9 weeks old; Body weight 20-25 g | ||
| CleanCap Firefly Luciferase mRNA | TriLink Biotechnology | L-7602 | |
| Dry Powder Insufflator | PennCentury | Model DP-4M | |
| Ketamine 10% | Alfasan International B.V. | NA | |
| Light emitting diode (LED) torch | Unilite Internation | PS-K1 | |
| Mannitol (Pearlitol 160C) | Roquette | 450001 | |
| Non-filter round gel loading pipette tip (200 µL) | Labcon | 1034-800-000 | |
| Nylon floss | Reach | 30017050 | |
| One milliliter syringe without needle | Terumo | SS-01T | |
| Optical fibre | Fibre Data | OMPF1000 | |
| PEG12KL4 peptide | EZ Biolab | (PEG12)-KLLLLKLLLLKLLLLKLLLLK-NH2 | |
| Plastic Pasteur fine tip pipette | Alpha Labotatories | LW4061 | |
| Three-way stopcock | Braun | D201 | |
| Xylazine 2% | Alfasan International B.V. | NA | |
| Zerostat 3 anti-static gun | MILTY | 5036694022153 |
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