Summary
साँस लेने के लिए शुष्क पाउडर योगों में श्वसन रोगों के इलाज में काफी संभावनाएं हैं। मानव अध्ययन में प्रवेश करने से पहले, प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में सूखे पाउडर फॉर्मूलेशन की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करना आवश्यक है। इंट्राचेल मार्ग के माध्यम से चूहों में सूखे पाउडर के प्रशासन की एक सरल और गैर-भेदभावपूर्ण विधि प्रस्तुत की जाती है।
Abstract
साँस लेने योग्य शुष्क पाउडर योगों के विकास में, प्रीक्लिनिकल पशु मॉडल में उनकी जैविक गतिविधियों का मूल्यांकन करना आवश्यक है। यह पेपर चूहों में सूखे पाउडर निर्माण के इंट्राचेल डिलीवरी की एक गैर-भेदभावपूर्ण विधि का परिचय देता है। एक सूखा पाउडर लोडिंग डिवाइस जिसमें तीन-तरह के स्टॉपकॉक के माध्यम से 1 एमएल सिरिंज से जुड़े 200 μL जेल लोडिंग पिपेट टिप शामिल हैं। सूखी पाउडर (1-2 मिलीग्राम) की एक छोटी मात्रा पिपेट टिप में लोड की जाती है और सिरिंज में 0.6 एमएल हवा से फैलाया जाता है। चूंकि पिपेट टिप्स डिस्पोजेबल और सस्ती हैं, इसलिए विभिन्न सूखे पाउडर फॉर्मूलेशन को पहले से अलग-अलग टिप् स में लोड किया जा सकता है। डिवाइस की सफाई और खुराक रिफिलिंग के बिना एक ही पशु प्रयोग में विभिन्न योगों का मूल्यांकन किया जा सकता है, जिससे समय की बचत होती है और अवशिष्ट पाउडर से क्रॉस-संदूषण के जोखिम को नष्ट किया जाता है। पाउडर फैलाव की सीमा का निरीक्षण पिपेट टिप में शेष पाउडर की मात्रा से किया जा सकता है। कस्टम-निर्मित प्रकाश स्रोत और मार्गदर्शक कैनुला के साथ माउस में इंस्टुबेशन का एक प्रोटोकॉल शामिल है। उचित इंटुबेशन उन प्रमुख कारकों में से एक है जो माउस के गहरे फेफड़ों के क्षेत्र में शुष्क पाउडर निर्माण के इंट्राचेल डिलीवरी को प्रभावित करता है।
Introduction
प्रशासन का फेफड़े का मार्ग स्थानीय और प्रणालीगत दोनों कार्यों के लिए चिकित्सीय प्रदान करने में विभिन्न लाभ प्रदान करता है। फेफड़ों की बीमारियों के उपचार के लिए, फेफड़े के वितरण द्वारा उच्च स्थानीय दवा एकाग्रता प्राप्त की जा सकती है, जिससे आवश्यक खुराक को कम किया जा सकता है और प्रणालीगत दुष्प्रभावों की घटनाओं को कम किया जा सकता है। इसके अलावा, फेफड़ों में अपेक्षाकृत कम एंजाइमेटिक गतिविधियों से समय से पहले दवा चयापचय को कम किया जा सकता है। फेफड़े बड़े और अच्छी तरह से परफ्यूस्ड सतह क्षेत्र, बेहद पतली एपिथेलियल सेल परत और फेफड़े के केशिकाओं में उच्च रक्त की मात्रा के कारण प्रणालीगत कार्रवाई के लिए दवा अवशोषण के लिए भी कुशल हैं1।
अस्थमा, क्रोनिक ऑब्सट्रक्टिव पल्मोनरी डिजीज, डायबिटीज मेलिटस और पल्मोनरी टीकाकरण2,3,4जैसे विभिन्न रोगों की रोकथाम और उपचार के लिए साँस सूखे पाउडर योगों की व्यापक रूप से जांच की गई है । ठोस स्थिति में दवाएं आम तौर पर तरल रूप की तुलना में अधिक स्थिर होती हैं, और सूखे पाउडर इनहेलर नेबुलाइजर5,6की तुलना में अधिक पोर्टेबल और उपयोगकर्ता के अनुकूल होते हैं। साँस सूखे पाउडर योगों के विकास में, सुरक्षा, फार्माकोकाइनेटिक प्रोफाइल और चिकित्सीय प्रभावकारिता को फेफड़े के प्रशासन7के बाद प्रीक्लिनिकल पशु मॉडल में मूल्यांकन करने की आवश्यकता है। मनुष्यों के विपरीत जो शुष्क पाउडर को सक्रिय रूप से श्वास ले सकते हैं, छोटे जानवरों को सूखे पाउडर की फेफड़े की डिलीवरी चुनौतीपूर्ण है। जानवरों के फेफड़ों तक ड्राई पाउडर पहुंचाने का एक कुशल प्रोटोकॉल स्थापित करना आवश्यक है।
चूहों को व्यापक रूप से अनुसंधान पशु मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है क्योंकि वे किफायती होते हैं और वे अच्छी तरह से प्रजनन करते हैं। इन्हें संभालना भी आसान होता है और कई डिजीज मॉडल ्स अच्छी तरह से स्थापित होते हैं। माउस के फेफड़ों में सूखे पाउडर को प्रशासित करने के लिए दो प्रमुख दृष्टिकोण हैं: साँस लेना और इंट्राचेल प्रशासन। साँस लेने के लिए, माउस को पूरे शरीर या नाक-केवल कक्ष में रखा जाता है जहां सूखा पाउडर एयरोसोल किया जाता है और जानवर बिना किसी स्किशन8,9के एयरोसोल में सांस लेते हैं। महंगे उपकरणों की आवश्यकता होती है और दवा वितरण दक्षता कम होती है। जबकि पूरे शरीर कक्ष तकनीकी रूप से कम चुनौतीपूर्ण हो सकता है, नाक केवल जोखिम कक्ष शरीर की सतह के लिए दवाओं के जोखिम को कम कर सकता है । बावजूद, यह अभी भी ठीक नियंत्रण और फेफड़ों को दिया खुराक निर्धारित करने के लिए मुश्किल है । ड्राई पाउडर मुख्य रूप से नासोफेरिनेक्स क्षेत्र में जमा किया जाता है जहां म्यूकोसिलिएरी क्लीयरेंस प्रमुख10है । इसके अलावा, कक्ष के अंदर चूहों प्रशासन की प्रक्रिया के दौरान महत्वपूर्ण तनाव में हैं क्योंकि वे विवश और भोजन और पानी की आपूर्ति11से वंचित हैं । इंट्राचेल प्रशासन के लिए, यह आम तौर पर सीधे श्वासनली में पदार्थ की शुरूआत को संदर्भित करता है। इसे प्राप्त करने के लिए दो अलग-अलग तकनीकें हैं: ट्रेकिओटॉमी और ओरोट्रेक्शियल इंस्टुबेशन। पूर्व में एक शल्य प्रक्रिया की आवश्यकता होती है जो श्वासनली में एक चीरा लगाती है, जो आक्रामक है और शायद ही कभी पाउडर प्रशासन के लिए उपयोग की जाती है। यहां सिर्फ दूसरी तकनीक बताई गई है। साँस लेने की विधि की तुलना में, इंट्राचेल प्रशासन माउस में फेफड़े की डिलीवरी के लिए अधिक सामान्य रूप से उपयोग की जाने वाली विधि है क्योंकि इसकी उच्च वितरण दक्षता न्यूनतम दवा हानि12,13के साथ है। यह माउस को कुछ मिलीग्राम के भीतर पाउडर की एक छोटी राशि को ठीक से वितरित करने के लिए एक सरल और तेज विधि है। यद्यपि माउस शारीरिक रूप से और शारीरिक रूप से मनुष्यों के लिए अलग है और इंट्राचेल प्रशासन ऊपरी श्वसन तंत्र को नजरअंदाज करता है और सूखे पाउडर निर्माण की जैविक गतिविधियों जैसे फेफड़े के अवशोषण, जैव उपलब्धता और चिकित्सीय प्रभाव14,15का आकलन करने के लिए एक अधिक प्रभावी तरीका प्रदान करता है।
सूखे पाउडर को इंट्राचेली प्रशासित करने के लिए, माउस को इंटुबेट किया जाना चाहिए, जो चुनौतीपूर्ण हो सकता है। इस पेपर में कस्टम मेड ड्राई पाउडर इनस्फलेटर और इंटुबेशन डिवाइस का फैब्रिकेशन बताया गया है। माउस के फेफड़ों में सूखे पाउडर के इंस्टुबेशन और इनस्फलेशन की प्रक्रियाओं का प्रदर्शन किया जाता है।
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Protocol
इस अध्ययन में किए गए प्रयोगों को हांगकांग विश्वविद्यालय के लाइव एनिमल्स फॉर टीचिंग एंड रिसर्च (CULATR) के उपयोग पर समिति ने मंजूरी दे दी है । स्प्रे फ्रीज सुखाने (एसएफडी) द्वारा तैयार सूखे पाउडर योगों जिसमें लूसिफ़ेरेस मैसेंजर आरएनए (एमआरएनए), 5% सिंथेटिक पेप्टाइड खूंटी12केएल 4 और 94.5% मैनिटॉल (डब्ल्यू/डब्ल्यू) शामिल हैं, इस अध्ययन में फेफड़ों में एमआरएनए अभिव्यक्ति प्रदर्शित करने के लिए उपयोग किया जाता है16। एसएफडी पाउडर का द्रव्यमान औसत एयरोडायनामिक व्यास (एमएमएडी) 2.4 माइक्रोन है। स्प्रे सूखे (एसडी) मैनिटोल पाउडर का उपयोग पाउडर फैलाव16में उपयोग की जाने वाली हवा की मात्रा के प्रभाव की जांच करने के लिए किया जाता है। एसडी पाउडर का एमएमएडी 1.5 माइक्रोन है।
1. ड्राई पाउडर इन्सफलेटर का निर्माण और सूखे पाउडर की लोडिंग
- (वैकल्पिक) ड्राई पाउडर (एक शीशी में) और 200 माइक्रोन नॉन-फिल्टर राउंड जेल-लोडिंग पिपेट टिप के स्थिर शुल्क को बेअसर करें। निर्माता के निर्देश के अनुसार एक एंटी-स्टेटिक बंदूक या डिएकिंग फ़ंक्शन के साथ संतुलन का उपयोग करें।
- लगभग 4 सेमी x 4 सेमी के आकार के साथ एक वजनी कागज तैयार करें। पेपर को आधे तिरछे में मोड़ें और फिर उसे उधेड़बुन करें ।
- वजनी कागज पर 1-2 मिलीग्राम सूखा पाउडर तौलें।
- टिप के व्यापक उद्घाटन के माध्यम से पाउडर के साथ एक जेल-लोडिंग पिपेट टिप भरें। पाउडर को पैक करने के लिए धीरे-धीरे टैप करें जब तक कि पाउडर टिप के संकीर्ण अंत(चित्रा 1 ए)के पास ढीला समूह न बन जाए। पाउडर को बहुत कसकर पैक करने से बचें क्योंकि यह पाउडर फैलाव में बाधा डाल सकता है।
- पाउडर से भरी नोक को तीन तरह के स्टॉपकॉक(चित्रा 1B)के माध्यम से 1 एमएल सिरिंज से कनेक्ट करें। पाउडर को तितर-बितर करने के लिए इस्तेमाल की जाने वाली हवा की मात्रा के अनुसार सिरिंज का आकार बदला जा सकता है। पाउडर के बिखराव को रोकने के लिए कनेक्शन के दौरान टिप और सिरिंज को लंबवत रखें। यदि प्रशासन तुरंत प्रदर्शन नहीं किया जाता है, तो टिप के उद्घाटन को सील करने के लिए पैराफिल्म का उपयोग करें और इसे अस्थायी रूप से प्रशासन तक उपयुक्त स्थिति के तहत स्टोर करें।
2. इंडबेशन डिवाइस का निर्माण
- प्रकाश स्रोत(चित्र 2)
- एक प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) मशाल और 0.8-1 मिमी व्यास के साथ एक लचीला ऑप्टिकल फाइबर के साथ एक कस्टम निर्मित प्रकाश स्रोत तैयार करें।
- एक हाथ ड्रिल या एक ड्रिल बिट के साथ एलईडी मशाल के स्पष्ट लेंस पर एक केंद्रित छिद्र बनाओ ताकि ऑप्टिकल फाइबर मुश्किल से गुजर सके।
- छिद्र के माध्यम से ऑप्टिकल फाइबर डालें। ऑप्टिकल फाइबर के दूसरे छोर पर अधिकतम चमक के लिए स्थिति और प्रविष्टि की गहराई को समायोजित करने के लिए एलईडी टॉर्च पर स्विच करें।
- स्पष्ट एपॉक्सी गोंद के साथ स्थिति में ऑप्टिकल फाइबर प्रत्यय।
- मार्गदर्शक कैनुला(चित्र 3)
- 1 एमएल प्लास्टिक पाश्चर पिपेट(चित्रा 3 ए)लें और दोनों सिरों पर पिपेट रखें।
- एक अल्कोहल लैंप (या प्रयोगशाला में अन्य गर्मी स्रोतों जैसे बुनसेन बर्नर) का उपयोग करें ताकि पिपेट के बीच को लौ(चित्रा 3B)के ऊपर 5-10 सेमी पर रखकर गर्म किया जा सके। यह सुनिश्चित करने के लिए पिपेट घुमाएं कि इसे समान रूप से गर्म किया जाए।
- जब प्लास्टिक नरम और विकृत हो जाता है, तो पिपेट को लौ से दूर ले जाएं और पिपेट को धीरे-धीरे फैलाएं।
- पार्ट ए और पार्ट बी(चित्रा 3सी-ई)में कैंची की एक जोड़ी के साथ बीच में फैला पिपेट काटें। एक मार्गदर्शक कैनुला के रूप में एक ठीक टिप पिपेट और भाग बी के रूप में भाग ए का उपयोग करें। मार्गदर्शक कैनुला के साथ सफल इंस्टुबेशन की संभावना को बढ़ाने के लिए, पार्ट बी(चित्रा 3F)के अंत में एक बेवेल (बहुत तेज नहीं जो जानवर को घायल करने का खतरा बढ़ा सकता है) बनाएं। जब एक 200 μL जेल-लोडिंग पिपेट टिप (पाउडर लोडिंग के लिए) मार्गदर्शक कैनुला में डाला जाता है, तो इसे कैनुला को 1-2 मिमी तक फैलाना चाहिए।
नोट: इंडबेशन के लिए उपयुक्त आयाम (आंतरिक और बाहरी व्यास) के साथ एक मार्गदर्शक कैनुला (भाग बी) में इसके अंदर 21 गेज सुई फिट हो सकती है जबकि यह 17 गेज सुई के अंदर भी फिट हो सकती है। उपयुक्त आयाम प्राप्त करने के लिए पिपेट को खींचने में कई प्रयासों की आवश्यकता हो सकती है। - (वैकल्पिक): इसे और अधिक लचीला बनाने के लिए मार्गदर्शक कैनुला के व्यापक अंत में एक छोटे से उद्घाटन में कटौती ताकि ऑप्टिकल फाइबर(चित्रा 3F)को पकड़ना आसान हो। यह उद्घाटन तरल एयरोसोल के प्रशासन के लिए माइक्रोस्प्रेयर की फिटिंग की भी अनुमति देता है।
3. इंडबेशन
- केटामाइन (100 मिलीग्राम/किलो) और जाइलाज़ीन (10 मिलीग्राम/किलो) के साथ इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा माउस (बाल्ब/सी, 7-9 सप्ताह) एनेस्थेटाइज करें।
- प्लेक्सीग्लास से बना एक मंच तैयार करें और इसे क्लैंप(चित्रा 4A)के साथ खड़े होने के लिए माउंट करें। एनेस्थेटाइज्ड माउस को मंच पर (झुकाव के लगभग 60 डिग्री पर) एक रीढ़ की स्थिति में रखें। मंच के झुकाव की ऊंचाई और कोण को स्टैंड पर क्लैंप की स्थिति से समायोजित किया जा सकता है।
- एक नायलॉन सोता(चित्रा 4B)पर अपने छेदक हुकिंग द्वारा माउस को निलंबित करें । टेप या रबर बैंड के एक टुकड़े द्वारा माउस की स्थिति को सुरक्षित करें।
- मार्गदर्शक कैनुला के उद्घाटन के साथ फाइबर स्तर की नोक के साथ इंडबेशन से पहले मार्गदर्शक कैनुला में ऑप्टिकल फाइबर डालें। रोशन करने के लिए एलईडी टॉर्च चालू करें।
- धीरे-धीरे माउस की जीभ को अपने श्वासनली को बेनकाब करने के लिए संदंश की एक जोड़ी के साथ फैलाएं।
- अंदर ऑप्टिकल फाइबर के साथ मार्गदर्शक कैनुला पकड़ करने के लिए दूसरे हाथ का प्रयोग करें। मौखिक गुहा के माध्यम से उन्हें डालें। ऑप्टिकल फाइबर से रोशनी के साथ, श्वासनली के उद्घाटन को मुखर रस्सियों के बीच एक छिद्र के रूप में कल्पना की जा सकती है।
- उद्घाटन के मिडलाइन(चित्रा 5A)की ओर मार्गदर्शक कैनुला के बेवेल को संरेखित करें। श्वासनली खोलने पर कैनुला के बेहतरीन टिप को लक्ष्य करके श्वासनली में ऑप्टिकल फाइबर के साथ मार्गदर्शक कैनुला को धीरे-धीरे डालें।
- इंडबेशन पर, तेजी से ऑप्टिकल फाइबर को हटा दें और श्वासनली(चित्रा 5B)के अंदर मार्गदर्शक कैनुला छोड़ दें। एक सामान्य श्वसन मनाया जाना चाहिए।
- मार्गदर्शक कैनुला के उद्घाटन पर ठीक टिप पिपेट (भाग ए) पकड़ो और माउस के फेफड़ों में हवा के एक छोटे कश (लगभग 0.2 एमएल) को इनसलेट करें। माउस के सीने में थोड़ी सी मुद्रास्फीति उचित इंस्टुबेशन को इंगित करती है। पाउडर प्रशासन से पहले ठीक टिप पिपेट निकालें।
4. पाउडर प्रशासन
- पाउडर लोड-टिप रखें जो सिरिंज से जुड़ा हुआ है जैसा कि चरण 1.5 में वर्णित है। सुनिश्चित करें कि सिरिंज के बीच एयरफ्लो और टिप काट दी गई है।
- हवा के 0.6 एमएल वापस लेने के लिए सिरिंज प्लंजर पीछे खींचो।
नोट: पाउडर को तितर-बितर करने के लिए उपयोग की जाने वाली हवा की मात्रा पाउडर के गुणों और लोड किए गए पाउडर की मात्रा पर निर्भर करती है। यह आगे रिजल्ट सेक्शन में बताया गया है। - सिरिंज और पाउडर से भरी नोक के बीच एयरफ्लो को जोड़ने के लिए तीन तरह के स्टॉपकॉक के वाल्व को चालू करें।
- पाउडर से भरी हुई टिप को मार्गदर्शक कैनुला में डालें जिसे पहले से ही माउस(चित्रा 5C)के श्वासनली में रखा गया है। मार्गदर्शक कैनुला पकड़ो और फेफड़ों में एयरोसोल के रूप में पाउडर को तितर-बितर करने के लिए एक निरंतर कार्रवाई में सिरिंज प्लंजर को जबरदस्ती पुश करें।
नोट: डिवाइस के किसी भी आगे की गति को कम किया जाना चाहिए ताकि जानवर को घायल होने से बचा जा सके । - टिप निकालें और जांच करें कि टिप के अंदर पाउडर खाली हो गया है या नहीं। यदि नहीं, तो 4.1 से 4.4 चरण दोहराएं।
नोट: यदि अत्यधिक दोहन के कारण पाउडर को बहुत कसकर पैक किया जाता है, तो यह ठीक से फैलाया नहीं जा सकता है। - प्रशासन पूरा हो जाने के बाद मार्गदर्शक कैनुला को श्वासनली से हटा दें।
- वायुमार्ग की नाकेबंदी से बचने के लिए माउस को अपनी जीभ के साथ एक रीढ़ की स्थिति में क्षैतिज रूप से ठीक होने दें।
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Representative Results
जब एक सूखी पाउडर इन्सफ्Lेटर का उपयोग किसी जानवर के फेफड़ों में पाउडर एयरोसोल देने के लिए किया जाता है, तो उपयोग की जाने वाली हवा की मात्रा महत्वपूर्ण होती है क्योंकि यह सुरक्षा के साथ-साथ पाउडर फैलाव दक्षता को प्रभावित करता है। विधि को अनुकूलित करने के लिए, शुष्क पाउडर (1 मिलीग्राम स्प्रे सूखे मैनिटोल) को तितर-बितर करने के लिए हवा की विभिन्न मात्रा (0.3 एमएल, 0.6 एमएल और1.0एमएल) का उपयोग किया गया था और प्रशासन (चित्र 6) के बाद चूहों के वजन की 48 घंटे तक निगरानी की गई थी। 03 एमएल और 06 एमएल हवा के इस्तेमाल से चूहों का वजन 48 घंटे तक प्रशासन के बाद तक नहीं हुआ। 1 मिली हुई हवा के साथ पाउडर को फैलाने के परिणामस्वरूप 24 घंटे के भीतर वजन घटाने का 5% से अधिक हो गया, जो 48 घंटे के बाद पूरी तरह से बरामद नहीं हुआ। इस प्रोटोकॉल में 7-9 हफ्ते पुराने बाल्ब/सी चूहों का इस्तेमाल किया गया। प्रजातियों, जानवरों के तनाव और उम्र के आधार पर, पाउडर गुण (जैसे, कण आकार वितरण, सामंजस्य और घनत्व) और पाउडर के द्रव्यमान को प्रशासित किया जाना है, कुशल पाउडर फैलाव और पशु सहिष्णुता के लिए उपयोग की जाने वाली हवा की मात्रा को विभिन्न पशु मॉडलों के लिए जांचकर्ताओं द्वारा अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है।
स्प्रे फ्रीज सुखाने (एसएफडी) द्वारा तैयार ड्राई पाउडर फॉर्मूलेशन ऊपर वर्णित विधि का उपयोग करके चूहों को दिया गया था। एसएफडी फॉर्मूलेशन में 0.5% एमआरएनए होता था जिसमें लूसिफ़ेरेस प्रोटीन, डिलीवरी वेक्टर के रूप में सिंथेटिक पेप्टाइड का 5% और मैनिटॉल16 का 94.5%शामिल था। BALB/c चूहों को 1 मिलीग्राम एसएफडी पाउडर के साथ प्रशासित किया गया था जिसमें 5 माइक्रोग्राम एमआरएनए और फेफड़ों में लूसिफ़ेरेस अभिव्यक्ति का मूल्यांकन वीवो इमेजिंग सिस्टम (आईडब्ल्यूआईएस)(चित्रा 7)में उपयोग करके 24 घंटे के बाद प्रशासन में किया गया था । एसएफडी पाउडर गहरे फेफड़ों में फैलाया गया था और लूसिफ़ेरेस अभिव्यक्ति देखी गई थी। तुलना के रूप में, एसएफडी पाउडर को पीबीएस (75 माइक्रोन की अंतिम मात्रा में) में पुनर्गठित किया गया था और चूहों को उसी यूटबेशन प्रक्रिया के साथ तरल के रूप में प्रशासित किया गया था लेकिन तरल एयरोसोल16उत्पन्न करने के बजाय एक माइक्रोस्प्रेयर का उपयोग किया गया था। पुनर्गठित निर्माण की लूसिफ़ेरेस अभिव्यक्ति सूखे पाउडर निर्माण की तुलना में काफी अधिक थी, जो पाउडर विघटन के मुद्दे या पाउडर और तरल रूप के बीच विभिन्न फार्माकोकाइनेटिक प्रोफ़ाइल के कारण हो सकती है। एमआरएनए ड्राई पाउडर एयरोसोल के साथ इलाज किए गए फेफड़ों की हिस्टोलॉजिकल विशेषताओं की तुलना अनुपचारित नियंत्रण और लिपोपोलिनासैकराइड (एलपीएस) उपचारित समूहों(चित्रा 8)से की गई थी। किसी भी उपचार के बिना फेफड़ों ने एक स्वस्थ प्रस्तुति को चित्रित किया जबकि फेफड़ों का इलाज एलपीएस के 10 माइक्रोन के साथ इलाज किया गया, जो इंटरस्टिशियल और अल्वेलर रिक्त स्थान में वायु क्षेत्र और भड़काऊ सेल घुसपैठ का अनियमित वितरण दिखा। एसएफडी पाउडर से इलाज किए गए फेफड़ों में सूजन के कोई संकेत नहीं दिखाई दिए ।
चित्रा 1: कस्टम निर्मित सूखा पाउडर इनसफलेटर।
(A)पाउडर टिप के संकीर्ण छोर के पास पैक किया जाता है। (ख)एक जेल-लोडिंग पिपेट टिप तीन तरह के स्टॉपकॉक के माध्यम से 1 मिलील सिरिंज से जुड़ा होता है। यह आंकड़ा लियाओ एट अल21से अनुकूलित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: इंडबेशन के लिए कस्टम-निर्मित प्रकाश स्रोत।
एक लचीला ऑप्टिकल फाइबर लेंस पर एक छोटा सा छेद बनाकर एक एलईडी टॉर्च से जुड़ा होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: मार्गदर्शक कैनुला।
(क)एक मार्गदर्शक कैनुला बनाने के लिए 1 एमएल प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोग किया जाता है। (ख)पिपेट को गर्म करने से नरमी आती है । (ग)गर्म पिपेट को बढ़ाया जाता है और काटा जाता है। (घ)पिपेट के भाग एक का उपयोग फाइन-टिप पिपेट के रूप में किया जाता है। (ईएंडएफ) पिपेट के भाग बी का उपयोग मार्गदर्शक कैनुला के रूप में किया जाता है। इंडिबेशन प्रक्रिया को सुविधाजनक बनाने के लिए एक बेवेल बनाया जाता है। कैनुला के लचीलेपन को बढ़ाने के लिए एक छोटा सा उद्घाटन (वैकल्पिक) बनाया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4: इंडुबेशन प्लेटफॉर्म।
(क)इंडबेशन के लिए मंच में एक प्लेक्सीग्लास प्लेट होती है जिसे स्टैंड पर रखा जाता है। (ख)एक एनेस्थेटाइज्ड माउस को एक रीढ़ की स्थिति में मंच पर रखा जाता है, जो नायलॉन सोता के साथ अपने छेदियों को हुक करके निलंबित कर दिया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5: योजनाबद्ध आरेख इंडिबेशन प्रक्रिया को दर्शाते हैं।
(क)मार्गदर्शक कैनुला का बेजल श्वासनली उद्घाटन के मिडलाइन के साथ गठबंधन किया गया है । (ख)मार्गदर्शक कैनुला को श्वासनली में डाला जाता है और पाउडर प्रशासन के लिए तैयार किया जाता है। (ग)पाउडर से भरी नोक (तीन तरह के स्टॉपकॉक के माध्यम से सिरिंज से जुड़ी) को मार्गदर्शक कैनुला में डाला जाता है जिसे पहले ही माउस के श्वासनली में रखा जा चुका है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 6: हवा की विभिन्न मात्रा के साथ शुष्क पाउडर का इंट्राचेल प्रशासन।
बाल्ब/सी चूहों को स्प्रे सूखे (एसडी) मैनिटोल पाउडर के साथ 0.3 एमएल, 0.6 एमएल और 1.0 एमएल हवा के फैलाए गए थे। चूहों के शरीर के वजन पर प्रशासन के सामने और 18 घंटे, 24 घंटे और ४८ घंटे के बाद प्रशासन पर नजर रखी गई । डेटा वजन परिवर्तन (n= 2) के प्रतिशत के औसत मूल्य के रूप में प्रस्तुत किया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 7: शुष्क पाउडर और पुनर्गठित तरल एयरोसोल के रूप में एमआरएनए निर्माण का इंट्राचेसल प्रशासन।
बाल्ब/सी चूहों को माइक्रोस्प्रेयर का उपयोग करके कस्टम-निर्मित शुष्क पाउडर इनस्फलेटर या पुनर्गठित तरल एयरोसोल (75 माइक्रोन एल पीबीएस में 1 मिलीग्राम) का उपयोग करके पाउडर एयरोसोल (1 मिलीग्राम) के रूप में स्प्रे फ्रीज सूखे (एसएफडी) 0.5% एमआरएनए (लूसिफ़ेरेस) के साथ इंट्राचेली प्रशासित किया गया था। प्रत्येक माउस को एमआरएनए के 5 माइक्रोग्राम की खुराक मिली। पीबीएस (75 माइक्रोन) का उपयोग नियंत्रण के रूप में किया गया था। 24 घंटे के बाद प्रशासन (ए) फेफड़ों को बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग के लिए अलग किया गया; (ख) फेफड़ों के ऊतकों की लूसिफ़ेरेस प्रोटीन अभिव्यक्ति को मापा गया । डेटा को प्रति मिलीग्राम प्रोटीन के सापेक्ष प्रकाश इकाई (आरएलयू) के औसत मूल्य के रूप में व्यक्त किया गया था, जो एक-तरफा एनोवा द्वारा विश्लेषण किया गया था, जिसके बाद तुकी के पोस्ट-हॉक परीक्षण, ***पी < 0.001 (एन= 4)। यह आंकड़ा Qiu एट अल से अनुकूलित कियागयाहै । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 8: एमआरएनए ड्राई पाउडर फॉर्मूलेशन के इंट्राचेल प्रशासन के बाद चूहों के फेफड़ों की हिस्ट्रोलॉजी।
(क)अनुपचारित नियंत्रण; चूहों को(बी)एलपीएस (25 माइक्रोन पीबीएस में 10 मिलीग्राम) और(सी)स्प्रे फ्रीज सूखे एमआरएनए पाउडर (1 मिलीग्राम) के साथ प्रशासित किया गया था। स्लाइड 20x आवर्धन (स्केल बार = 100 मिमी) में एक ईमानदार माइक्रोस्कोप का उपयोग कर देखा गया। यह आंकड़ा Qiu एट अल से अनुकूलित कियागयाहै । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
इस पेपर में ड्राई पाउडर इन्स्फलेशन और इंट्राचेल इंटुबेशन के लिए कस्टम मेड डिवाइस पेश किए जाते हैं । पाउडर लोडिंग चरण में, सूखे पाउडर को 200 माइक्रोल जेल-लोडिंग पिपेट टिप में लोड किया जाता है। टिप के संकीर्ण छोर पर पाउडर की ढीली पैकिंग की अनुमति देने के लिए टिप को धीरे-धीरे टैप करना महत्वपूर्ण है। हालांकि, अगर पाउडर को बहुत कसकर पैक किया जाता है, तो वे टिप में फंस जाएंगे और ठीक से फैलाया नहीं जा सकता है। पाउडर लोडिंग की सुविधा के लिए पाउडर और पिपेट टिप के स्थिर शुल्कों को बेअसर करने की सिफारिश की जाती है, विशेष रूप से कम घनत्व वाले पाउडर के लिए और कम सापेक्ष आर्द्रता में। मार्गदर्शक कैनुला डिवाइस का एक महत्वपूर्ण घटक है। इसका उपयोग माउस के श्वासनली में पाउडर-लोडेड पिपेट टिप के डालने की सुविधा के लिए किया जाता है। मार्गदर्शक कैनुला का व्यास बहुत चौड़ा नहीं होना चाहिए; अन्यथा इसे श्वासनली में डालने में मुश्किल होगी और माउस को घायल कर सकता है। मार्गदर्शक कैनुला का व्यास ऑप्टिकल फाइबर और पाउडर-लोडेड पिपेट टिप को फिट करने के लिए पर्याप्त रूप से चौड़ा होना चाहिए, और पिपेट टिप को मार्गदर्शक कैनुला को लगभग 1-2 मिमी तक फैलाना चाहिए।
श्वासनली के उद्घाटन की कल्पना करने की क्षमता इंस्टुबेशन प्रक्रिया में महत्वपूर्ण है, जिससे मार्गदर्शक कैनुला को सही ढंग से डाला जा सकता है। श्वासनली उद्घाटन में गले के पीछे नियमित रूप से खोलने और समापन गति के साथ सफेद आर्यटेनॉइड उपास्थि होते हैं। फाइबर ऑप्टिक रोशनी के साथ, श्वासनली के उद्घाटन को आसानी से कल्पना की जा सकती है। ठीक टिप प्लास्टिक पिपेट के माध्यम से हवा की एक छोटी मात्रा को puffing द्वारा, छाती पर एक मुद्रास्फीति एक उचित intubation इंगित करता है । यदि छाती पर मुद्रास्फीति नहीं देखी जाती है या प्रविष्टि के दौरान प्रतिरोध महसूस किया जाता है, तो मार्गदर्शक कैनुला को तेजी से वापस लें और कदमों को फिर से दोहराएं।
12, 17,18(सामग्री की तालिका)में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध शुष्क पाउडर का व्यापक रूप से उपयोग कियागया था, यह उपकरण अब बंद कर दिया गया है।) सूखे पाउडर को डिवाइस के नमूना कक्ष में लोड किया जाता है और 3 एमएल प्लास्टिक एयर सिरिंज या एक एयर पंप से हवा से फैलाया जाता है। उत्सर्जित खुराक को मापने के लिए, डिवाइस को पाउडर प्रशासन से पहले और बाद में तौला जाना चाहिए, जो पाउडर की खुराक को ध्यान में रखते हुए अशुद्धि की ओर जाता है आमतौर पर बहुत छोटा होता है (डिवाइस के द्रव्यमान के सापेक्ष)। वाणिज्यिक इन्स्फलेटर की तुलना में, कस्टम-निर्मित डिवाइस का सबसे बड़ा लाभ यह है कि पारदर्शी जेल-लोडिंग पिपेट टिप्स में पाउडर की अनुपस्थिति से पाउडर फैलाव की सफलता देखी जा सकती है। चूंकि पिपेट टिप हल्का होता है, इसलिए उत्सर्जित खुराक को मापने के लिए प्रशासन से पहले और बाद में इसे सही ढंग से तौला जा सकता है। पिपेट टिप जानवर के श्वासनली के संपर्क में आने के बजाय मार्गदर्शक कैनुला में डाला जाता है। श्वासनली में नमी या स्राव के साथ टिप को दूषित करने का न्यूनतम जोखिम होता है (जो उत्सर्जित खुराक माप की सटीकता को प्रभावित कर सकता है)। चूंकि पिपेट टिप्स डिस्पोजेबल और सस्ती हैं, इसलिए विभिन्न सूखे पाउडर फॉर्मूलेशन को पहले से अलग-अलग टिप्स में लोड किया जा सकता है। डिवाइस की सफाई और खुराक रिफिलिंग की आवश्यकता के बिना एक ही पशु प्रयोग में विभिन्न योगों का मूल्यांकन किया जा सकता है, जिससे समय की बचत होती है और अवशिष्ट पाउडर से क्रॉस-संदूषण के जोखिम को नष्ट किया जाता है। इसके अलावा, वाणिज्यिक इन्सफलेटर द्वारा उत्पन्न पाउडर फैलाव पैटर्न विभिन्न योगों के बीच भिन्न होता है। कई अध्ययनों में बताया गया है कि वाणिज्यिक इंसफलेटर द्वारा फैलाए गए सूखे पाउडर को आसानी से समूहीकृत किया गया था और वे प्रशासन19,20पर गहरे फेफड़ों तक पहुंचने में विफल रहे थे । इसके विपरीत, हमारे समान उपकरणों द्वारा बिखरे अन्य योगों में फेफड़ों का उच्च जमाव15 , 21,22बतायागयाहै ।
जानवर के फेफड़ों के लिए पाउडर एयरोसोल के प्रशासन के लिए साहित्य में सूचित अन्य समान कस्टम-निर्मित उपकरण हैं। उदाहरण के लिए, चौरासी एट अल ने23के लिए इंडबेशन के बाद कैनुला ट्यूब से जुड़ी सिरिंज के साथ इंडुबेशन के साथ-साथ पाउडर लोडिंग के लिए कैनुला ट्यूब के उपयोग का वर्णन किया। जबकि उनका दृष्टिकोण कम अनुकूलन के साथ मानकीकृत उपकरण और सामग्री (जैसे, ओटोस्कोप, कैनुला और सिरिंज) का उपयोग करता है, यहां विधि कुछ अलग फायदे प्रदान करती है। सबसे पहले, यह दवा प्रशासन के सामने सही इंडिबेशन की पुष्टि की अनुमति देता है। यह कदम कम अनुभवी उपयोगकर्ता के लिए विशेष रूप से उपयोगी है। दूसरे, मार्गदर्शक कैनुला एक सुरक्षा कवच के रूप में कार्य कर सकते हैं ताकि श्वासनली में किसी भी स्राव या नमी को जेल-लोडिंग पिपेट टिप को दूषित करने से रोका जा सके, जिससे वजन करके अधिक सटीक उत्सर्जित खुराक माप की अनुमति मिल सके। अंत में, ऑप्टिकल फाइबर के साथ अधिक लचीला मार्गदर्शक कैनुला आसान इंडबेशन को सक्षम कर सकता है।
संक्षेप में, एक कस्टम-निर्मित शुष्क पाउडर इन्सफलेटर जो सस्ती, डिस्पोजेबल, प्रजनन योग्य और पाउडर की छोटी मात्रा को फैलाने में कुशल है, ठीक इस पेपर में पेश किया जाता है। उल्लिखित इंटुबेशन प्रक्रिया गैर-निवास, त्वरित है और चूहों को सुरक्षित और सटीक रूप से पाउडर फॉर्मूलेशन वितरित कर सकती है। इसे फेफड़े की डिलीवरी के लिए तरल निर्माण को प्रशासित करने के लिए भी अपनाया जा सकता है।
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Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है ।
Acknowledgments
लेखकों को प्रकाश स्रोत और पाउडर इन्सफलेटर बनाने में अपनी तरह की सहायता के लिए श्री रे ली, श्री एचसी Leung और श्री वालेस तो शुक्रिया अदा करना चाहते हैं; और पशु इमेजिंग में सहायता के लिए संकाय कोर सुविधा । इस काम को रिसर्च ग्रांट काउंसिल, हांगकांग (17300319) ने सपोर्ट किया ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BALB/c mouse | Female; 7-9 weeks old; Body weight 20-25 g | ||
| CleanCap Firefly Luciferase mRNA | TriLink Biotechnology | L-7602 | |
| Dry Powder Insufflator | PennCentury | Model DP-4M | |
| Ketamine 10% | Alfasan International B.V. | NA | |
| Light emitting diode (LED) torch | Unilite Internation | PS-K1 | |
| Mannitol (Pearlitol 160C) | Roquette | 450001 | |
| Non-filter round gel loading pipette tip (200 µL) | Labcon | 1034-800-000 | |
| Nylon floss | Reach | 30017050 | |
| One milliliter syringe without needle | Terumo | SS-01T | |
| Optical fibre | Fibre Data | OMPF1000 | |
| PEG12KL4 peptide | EZ Biolab | (PEG12)-KLLLLKLLLLKLLLLKLLLLK-NH2 | |
| Plastic Pasteur fine tip pipette | Alpha Labotatories | LW4061 | |
| Three-way stopcock | Braun | D201 | |
| Xylazine 2% | Alfasan International B.V. | NA | |
| Zerostat 3 anti-static gun | MILTY | 5036694022153 |
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