Summary
Soluma için kuru toz formülasyonları solunum yolu hastalıklarının tedavisinde büyük potansiyele sahiptir. İnsan çalışmalarına girmeden önce, preklinik çalışmalarda kuru toz formülasyonunun etkinliğini değerlendirmek gerekir. Farelerde intratrakiel yoldan kuru tozun yönetiminin basit ve invaziv bir yöntemi sunulmuştur.
Abstract
Solunabilir kuru toz formülasyonlarının geliştirilmesinde, biyolojik faaliyetlerini preklinik hayvan modellerinde değerlendirmek esastır. Bu makale, farelerde kuru toz formülasyonunun intratraskial teslimatının noninvaziv bir yöntemini tanıtmaktadır. Üç yönlü bir stopcock aracılığıyla 1 mL şırındıya bağlı 200 μL jel yükleme pipet ucundan oluşan kuru toz yükleme cihazı sunulur. Pipet ucuna az miktarda kuru toz (1-2 mg) yüklenir ve şırınnada 0,6 mL hava ile dağılır. Pipet uçları tek kullanımlık ve ucuz olduğundan, farklı kuru toz formülasyonları önceden farklı uçlara yüklenebilir. Çeşitli formülasyonlar, cihaz temizliği ve doz doldurma olmadan aynı hayvan deneyinde değerlendirilebilir, böylece zamandan tasarruf edilir ve artık tozdan çapraz bulaşma riski ortadan kalkar. Toz dağılımının kapsamı pipet ucunda kalan toz miktarına göre incelenebilir. Farede özel yapım ışık kaynağı ve yol gösterici bir canül içeren bir entübasyon protokolü dahildir. Uygun entübasyon, kuru toz formülasyonunun farenin derin akciğer bölgesine intratrakial olarak teslimini etkileyen önemli faktörlerden biridir.
Introduction
Pulmoner uygulama yolu, hem lokal hem de sistemik eylemler için terapötiklerin sağlanmasında çeşitli faydalar sunmaktadır. Akciğer hastalıklarının tedavisi için, pulmoner doğumla yüksek lokal ilaç konsantrasyonu elde edilebilir, böylece gerekli doz azaltılabilir ve sistemik yan etkilerin insidansı düşürülebilir. Ayrıca, akciğerdeki nispeten düşük enzimamatik aktiviteler erken ilaç metabolizmasını azaltabilir. Akciğerler ayrıca büyük ve iyi perfüzyonlu yüzey alanı, son derece ince epitel hücre tabakası ve pulmoner kılcal damarlardaki yüksek kan hacmi nedeniyle sistemik etki için ilaç emilimi için de etkilidir1.
Solunan kuru toz formülasyonları astım, kronik obstrüktif akciğer hastalığı, diabetes mellitus ve pulmoner aşılama 2,3 ,4gibi çeşitli hastalıkların önlenmesi ve tedavisi için yaygın olarak araştırılmıştır. Katı durumdaki ilaçlar genellikle sıvı formda olduğundan daha kararlıdır ve kuru toz inhalatörleri nebülizörlerden daha taşınabilir ve kullanıcı dostudur5,6. Solunan kuru toz formülasyonlarının geliştirilmesinde, pulmoner uygulamadan sonra preklinik hayvan modellerinde güvenlik, farmakokinetik profil ve terapötik etkinliğin değerlendirilmesi gerekir7. Kuru tozu aktif olarak soluyabilen insanların aksine, kuru tozun küçük hayvanlara pulmoner teslimatı zordur. Hayvanların akciğerlerine kuru toz teslim etmek için verimli bir protokol oluşturmak gerekir.
Fareler, ekonomik oldukları ve iyi üredikleri için araştırma hayvanı modelleri olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Ayrıca kullanımı kolaydır ve birçok hastalık modeli iyi kurulmuştur. Kuru tozu farenin akciğerine uygulamak için iki ana yaklaşım vardır: soluma ve intratrakiyeal uygulama. Soluma için, fare kuru tozun aerosolleştirildiği ve hayvanların sakinleştirilmeden aerosolde nefes aldığı tüm vücut veya sadece burun odasına yerleştirilir8,9. Pahalı ekipman gereklidir ve ilaç dağıtım verimliliği düşüktür. Tüm vücut odası teknik olarak daha az zorlu olsa da, sadece burun maruziyet odası ilaçların vücut yüzeyine maruz kalmasını en aza indirebilir. Ne olursa olsun, akciğerlere teslim edilen dozu hassas bir şekilde kontrol etmek ve belirlemek hala zordur. Kuru toz esas olarak mukozal boşluğun belirgin olduğu nazofarenks bölgesinde biriktirilir10. Ayrıca, odanın içindeki fareler yönetim sürecinde önemli bir stres altındadır, çünkü kısıtlanmış ve yiyecek ve su temininden mahrumdurlar11. Intratraseral uygulama için, genellikle maddenin doğrudan nefes borusuna girmesini ifade eder. Bunu başarmak için iki farklı teknik vardır: trakeotomi ve orotrakeal entübasyon. Birincisi, trakeada bir kesi yapan cerrahi bir prosedür gerektirir, bu da invazivdir ve nadiren toz uygulama için kullanılır. Burada sadece ikinci teknik açıklanmıştır. Soluma yöntemi ile karşılaştırıldığında, intratrakiel uygulama, minimum ilaç kaybı ile yüksek teslimat verimliliği nedeniyle farede pulmoner doğum için daha yaygın kullanılan yöntemdir12,13. Fareye birkaç miligram içinde az miktarda toz teslim etmek basit ve hızlı bir yöntemdir. Fare anatomik ve fizyolojik olarak insanlara farklı olmasına ve entübasyon işlemi sırasında anestezi yapılması gerekmesine rağmen, intratrakimyasal uygulama üst solunum yollarını atlar ve pulmoner emilim, biyoyararlanım ve terapötik etkiler gibi kuru toz formülasyonunun biyolojik aktivitelerini değerlendirmek için daha etkili bir yol sunar14,15.
Kuru tozu intratrakisel olarak uygulamak için, farenin entübe edilmesi gerekir, bu da zor olabilir. Bu yazıda, özel yapım kuru toz insufflator ve entübasyon cihazının imalatı açıklanmıştır. Farenin akciğerinde kuru tozun entübasyon ve insufflation işlemleri gösterilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmada yapılan deneyler, Hong Kong Üniversitesi Öğretim ve Araştırma için Canlı Hayvanların Kullanımı Komitesi (CULATR) tarafından onaylanmıştır. Luciferaz messenger RNA'nın (mRNA), %5 sentetik peptit PEG12KL4'ünü ve mannitolün %94,5'ini (w/w) içeren sprey dondurma kurutma (SFD) ile hazırlanan kuru toz formülasyonları akciğerde mRNA ekspresyonunun16. SFD tozunun kütle ortanca aerodinamik çapı (MMAD) 2,4 μm'dir. Sprey kurutulmuş (SD) mannitol tozu, toz dağılımında kullanılan hava hacminin etkisini araştırmak için kullanılır16. SD tozunun MMAD'si 1,5 μm'dir.
1. Kuru toz insufflator imalatı ve kuru tozun yüklenmesi
- (İsteğe bağlı) Kuru tozun statik yüklerini (bir şişede) ve 200 μL filtresiz yuvarlak jel yükleme pipet ucunu nötralize edin. Üreticinin talimatına göre anti-statik bir top veya deiyonizasyon işlevine sahip bir terazi kullanın.
- Yaklaşık 4 cm x 4 cm büyüklüğünde bir tartım kağıdı hazırlayın. Kağıdı çapraz olarak ikiye katlayın ve açın.
- Tartım kağıdında 1-2 mg kuru toz ağırlığındadır.
- Jel yükleme pipet ucunu ucun daha geniş açıklığı boyunca tozla doldurun. Toz, ucun dar ucuna yakın gevşek aglomeralar oluşturana kadar tozu paketlemek için hafifçe dokunun (Şekil 1A). Toz dağılımını engelleyebileceğinden tozu çok sıkı paketlemekten kaçının.
- Toz yüklü ucu üç yönlü bir stopcock aracılığıyla 1 mL şırındıya bağlayın (Şekil 1B). Şırındın boyutu tozu dağıtmak için kullanılan hava hacmine göre değiştirilebilir. Tozun dökülmesini önlemek için bağlantı sırasında ucu ve şırınnayı dikey olarak tutun. Uygulama hemen yapılmazsa, ucun açıklıklarını kapatmak için parafilm kullanın ve idareye kadar geçici olarak uygun durumda saklayın.
2. Entübasyon cihazının imalatı
- Işık kaynağı (Şekil 2)
- Işık yayan diyot (LED) torcu ve 0,8-1 mm çapında esnek bir optik fiber ile özel yapım bir ışık kaynağı hazırlayın.
- Led torcunun net lensine bir el matkabı veya matkap ucu ile ortalanmış bir delik yapın, böylece optik fiber zar zor geçebilir.
- Optik fiberi delikten geçirin. Optik fiberin diğer ucundaki maksimum parlaklık için yerleştirmenin konumunu ve derinliğini ayarlamak için LED torcu kapatın.
- Optik fiberi net epoksi tutkal ile yerine yapıştırın.
- Kılavuzak canül (Şekil 3)
- 1 mL plastik Pasteur pipet (Şekil 3A) alın ve pipeti her iki ucunda tutun.
- Pipet ortasını alevin 5-10 cm üzerine yerleştirerek ısıtmak için bir alkol lambası (veya Bunsen brülörü gibi laboratuvardaki diğer ısı kaynakları) kullanın (Şekil 3B). Pipetleri eşit şekilde ısıtıldığından emin olmak için döndürün.
- Plastik yumuşak ve deforme olduğunda, pipeti alevden uzaklaştırın ve pipeti hafifçe uzatın.
- Ortadaki gerilmiş pipetleri bir çift makasla A ve Bölüm B'ye kesin (Şekil 3C-E). Bölüm A'yı ince uç pipet, Bölüm B'yi ise yol gösterici bir kaval kemiği olarak kullanın. Kılavuz ampul ile başarılı entübasyon şansını artırmak için, Bölüm B'nin sonunda(Şekil 3F)bir eğim yapın (hayvanın yaralanma riskini artırabilecek çok keskin değil). Kılavuz kanüle 200 μL jel yükleme pipet ucu (toz yükleme için) yerleştirildiğinde, kanülü 1-2 mm çıkıntı yapmalıdır.
NOT: Entübasyon için uygun boyuta (iç ve dış çap) sahip kılavuz bir kanül (Bölüm B), içine 21 kalibrelik bir iğne sığabilirken, 17 kalibrelik bir iğnenin içine de sığabilir. Uygun boyuta ulaşmak için pipetlerin gerilmesinde birden fazla girişim gerekebilir. - (İsteğe bağlı): Optik fiberi tutmanın daha kolay olması için daha esnek hale getirmek için kılavuz kolayın geniş ucunda küçük bir açıklık kesin (Şekil 3F). Bu açıklık ayrıca sıvı aerosolun yönetimi için bir mikrosprayer takılmasına izin verir.
3. Entübasyon
- Fareyi (BALB/c, 7-9 hafta) ketamin (100 mg/kg) ve ksilazin (10 mg/kg) ile intraperitoneal enjeksiyonla uyuşturun.
- Pleksiglastan yapılmış bir platform hazırlayın ve bir kelepçe ile bir standa monte etmenin (Şekil 4A). Anestezi edilmiş fareyi platforma (yaklaşık 60° eğimde) bir destek pozisyonunda yerleştirin. Platformun eğim yüksekliği ve açısı, standın üzerindeki kelepçenin konumuna göre ayarlanabilir.
- Kesici dişlerini naylon bir diş ipi üzerine bağlayarak fareyi askıya alın (Şekil 4B). Farenin konumunu bir bant parçası veya lastik bantla sabitleyin.
- Optik fiberi, kılavuz kanülün açılmasıyla fiber seviyesinin ucuyla entübasyondan önce kılavuz kanüle yerleştirin. Aydınlatmak için LED torcu açın.
- Nefes nefese bırakmak için farenin dilini bir çift asa ile hafifçe çıkıntılayın.
- Diğer yandan, içinde optik fiber olan kılavuzlu canülleri tutmak için kullanın. Ağız boşluğundan yerleştirin. Optik fiberden gelen aydınlatma ile nefes borusunun açılması ses telleri arasında bir delik olarak görselleştirilebilir.
- Kılavuz canüllerin eğimini açıklığın orta çizgisine doğru hizalayın (Şekil 5A). Trakeal açıklığındaki canülün en iyi ucunu hedef alarak kılavuzlu kanolü optik fiberle nefes borusuna hafifçe entübe edin.
- Entübasyon üzerine, optik fiberi hızla çıkarın ve kılavuz damarı nefes borusunun içinde bırakın (Şekil 5B). Normal bir solunum gözlenmelidir.
- Kılavuzlu kaval kemiğinin (Bölüm A) açılışında ince uç pipetini (Bölüm A) tutun ve farenin akciğerine küçük bir hava kabarcığım (yaklaşık 0,2 mL) insufflate edin. Farenin göğsünde hafif bir enflasyon uygun entübasyonu gösterir. İnce uç pipetini toz uygulamadan önce çıkarın.
4. Toz yönetimi
- Şırınna bağlı toz yüklü ucu adım 1.5'te açıklandığı gibi tutun. Şırınd ile uç arasındaki hava akışının kesildiğini sağlayın.
- Şırınd pistonu geriye doğru çekerek 0,6 mL havayı geri çekin.
NOT: Tozu dağıtmak için kullanılan hava hacmi tozun özelliklerine ve yüklenen toz miktarına bağlıdır. Bu, sonuç bölümünde daha ayrıntılı olarak açıklanmıştır. - Şırıngam ile toz yüklü uç arasındaki hava akışını bağlamak için üç yönlü stopcock'un vanasını çevirin.
- Toz yüklü ucu farenin nefes borusuna yerleştirilmiş kılavuz kanüle yerleştirin (Şekil 5C). Kılavuz kanül tutun ve tozu aerosol olarak akciğere dağıtmak için şırıngan pistonu tek bir sürekli eylemde zorla itin.
NOT: Hayvanın yaralanmasını önlemek için cihazın ileriye doğru hareketi en aza indirilmelidir. - Ucu çıkarın ve ucun içindeki tozun boşaltılıp boşaltıldığını kontrol edin. Değilse, 4.1 ile 4.4 arasında olan adımı yineleyin.
NOT: Toz aşırı dokunma nedeniyle çok sıkı paketlenmişse, düzgün dağıtılamayabilir. - Yönetim tamamlandıktan sonra, kılavuzlu mayayı nefes borusundan çıkarın.
- Farenin, hava yollarının tıkanmasını önlemek için dilinin yarısı çıkıntılı bir şekilde yatay olarak konumlandırarak iyileşmesine izin verin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bir hayvanın akciğerine toz aerosol sağlamak için kuru bir toz oyucu kullanıldığında, kullanılan hava hacmi, toz dağılımı verimliliğinin yanı sıra güvenliği de etkilediği için kritik öneme sahiptir. Yöntemi optimize etmek için, kuru tozu dağıtmak için farklı hava hacimleri (0,3 mL, 0,6 mL ve 1,0 mL) kullanıldı (1 mg sprey kurutulmuş mannitol) ve farelerin ağırlığı uygulamadan sonra 48 saat boyunca izlendi(Şekil 6). 0.3 mL ve 0.6 mL hava kullanımı, farelerin uygulama sonrası 48 saate kadar kilo kaybına neden olmadı. Tozun 1 mL hava ile dağıtılması, 24 saat içinde kilo kaybının% 5'inden fazlasına neden oldu ve bu da 48 saat sonra tam olarak kurtarılamadı. Bu protokolde 7-9 haftalık BALB/c fareleri kullanılmıştır. Türlere, hayvanın suşuna ve yaşına, toz özelliklerine (örneğin, parçacık boyutu dağılımı, yapışkanlık ve yoğunluk) ve uygulanacak toz kütlesine bağlı olarak, verimli toz dağılımı ve hayvan toleransı için kullanılacak hava hacmi, farklı hayvan modelleri için araştırmacılar tarafından optimizasyon gerektirebilir.
Sprey dondurma kurutma (SFD) ile hazırlanan kuru toz formülasyonu yukarıda açıklanan yöntem kullanılarak farelere teslim edildi. SFD formülasyonu, luciferaz proteinini ifade eden mRNA'nın% 0.5'ini, doğum vektörü olarak sentetik peptitin% 5'ini ve mannitol16'nın%94.5'ini içeriyordu. BALB/c fareleri intratrakisel olarak 5 μg mRNA içeren 1 mg SFD tozu ile uygulandı ve akciğerlerdeki luciferaz ekspresyolü in vivo görüntüleme sistemi (IVIS) kullanılarak uygulama sonrası 24 saat olarak değerlendirildi (Şekil 7). SFD tozu derin akciğere dağılmış ve luciferaz ekspresyali gözlenmiştir. Bir karşılaştırma olarak, SFD tozu PBS'de (75 μL'lik son bir hacme kadar) yeniden oluşturulmuş ve farelere aynı entübasyon prosedürüne sahip sıvı olarak uygulanmıştır, ancak bunun yerine sıvı aerosol16üretmek için bir mikrosprayer kullanılmıştır. Yeniden oluşturulan formülasyonun luciferaz ekspresyolu, toz çözünmesi sorunu veya toz ve sıvı form arasındaki farklı farmakokinetik profilden kaynaklanabilecek kuru toz formülasyonundan önemli ölçüde daha yüksekti. mRNA kuru toz aerosol ile tedavi edilen akciğerlerin histolojik özellikleri tedavi edilmeyen kontrol ve lipopolisakkarit (LPS) tedavi grupları ile karşılaştırıldı(Şekil 8). Herhangi bir tedavisi olmayan akciğerler sağlıklı bir sunum gösterirken, 10 μg LPS intratracheally ile tedavi edilen akciğer, interstisyel ve alveolar alanlara düzensiz hava alanı dağılımı ve enflamatuar hücre infiltrasyonunu gösterdi. SFD tozu ile tedavi edilen akciğerlerde herhangi bir iltihap belirtisi görülmedi.
Şekil 1: Özel yapım kuru toz insufflator.
(A) Toz ucun dar ucuna yakın bir yerde paketlenir. (B) Jel yüklemeli pipet ucu, üç yönlü bir stopcock aracılığıyla 1 mL şırındıya bağlanır. Şekil Liao ve ark.21'denuyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Entübasyon için özel yapım ışık kaynağı.
Lenste küçük bir delik oluşturarak bir LED torcuna esnek bir optik fiber bağlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Yol gösterici cannula.
(A) Kılavuz bir kavun yapmak için 1 mL plastik Pasteur pipet kullanılır. (B) Pipet ısıtılarak yumuşatılır. (C) Isıtılan pipet gerilir ve kesilir. (D) Pipet A kısmı ince uçlu pipet olarak kullanılır. (E&F) Pipet B kısmı yol gösterici bir kavun olarak kullanılır. Entübasyon prosedürünü kolaylaştırmak için bir eğim oluşturulur. Canül esnekliğini artırmak için küçük bir açıklık (isteğe bağlı) yapılabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Entübasyon platformu.
(A) Entübasyon platformu, bir standa monte edilmiş pleksiglas plakadan oluşur. (B) Anestezi edilmiş bir fare, kesici dişlerini naylon diş ipi ile bağlayarak askıya alınmış, supine pozisyonda platforma yerleştirilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Entübasyon prosedürünü gösteren şematik diyagram.
(A) Kılavuzlu canül eğimi trakeal açıklığın orta çizgisi ile hizalanır. (B) Kılavuz kanül nefes borusuna yerleştirilir ve toz işlemine hazırdır. (C) Toz yüklü uç (şırınna üç yönlü bir stopcock ile bağlanır) farenin nefes borusuna yerleştirilmiş olan kılavuz kanüle yerleştirilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Kuru tozun farklı hacimli hava ile intratraksal uygulaması.
BALB/c fareleri intratrakisel olarak 0.3 mL, 0.6 mL ve 1.0 mL hava ile dağılmış sprey kurutulmuş (SD) mannitol tozu ile uygulandı. Farelerin vücut ağırlığı uygulamadan önce ve uygulama sonrası 18 saat, 24 saat ve 48 saat olarak izlendi. Veriler, ağırlık değişim yüzdesinin ortalama değeri olarak sunuldu (n=2). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: mRNA formülasyonunun kuru toz ve yeniden oluşturulmuş sıvı aerosol olarak intratraskiyal olarak yönetilmesi.
BALB/c fareleri, sprey dondurularak kurutulmuş (SFD) %0,5 mRNA (lucifeze) formülasyonu ile özel yapım kuru toz insufflator veya mikrosprayer kullanılarak yeniden oluşturulmuş sıvı aerosol (75 μLS'de 1 mg) kullanılarak toz aerosol (1 mg) olarak intratrakisel olarak uygulandı. Her fare 5 μg mRNA dozu aldı. Kontrol olarak PBS (75 μL) kullanılmıştır. Uygulama sonrası (A) 24 saatte akciğerler biyolüminesans görüntüleme için izole edildi; (B) akciğer dokularının luciferaz protein ekspresy kullanımı ölçüldü. Veriler, protein mg'ı başına bağıl ışık biriminin (RLU) ortalama değeri olarak ifade edildi, tek yönlü ANOVA tarafından analiz edildi ve ardından Tukey'in geçici sonrası testi, ***p < 0.001 (n=4). Şekil Qiu ve ark.16'dan uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: mRNA kuru toz formülasyonunun intratrakial yönetimini takiben farelerin akciğerlerinin histolojisi.
(A)işlenmemiş kontrol; fareler intratrakisel olarak (B) LPS (25 μL PBS'de 10 mg) ve (C) sprey dondurma kurutulmuş mRNA tozu (1 mg) ile uygulandı. Slaytlar 20x büyütmede (ölçek çubuğu = 100 mm) dik mikroskop kullanılarak izlendi. Şekil Qiu ve ark.16'dan uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazıda kuru toz insufflation ve intratrakial entübasyon için özel yapım cihazlar sunulmuştur. Toz yükleme adımında, kuru toz 200 μL jel yükleme pipet ucuna yüklenir. Ucun dar ucunda gevşek toz paketlemeye izin vermek için uca hafifçe dokunmak önemlidir. Bununla birlikte, toz çok sıkı paketlenirse, ucuna sıkışırlar ve düzgün bir şekilde dağılamazlar. Özellikle düşük yoğunluklu ve düşük bağıl nemde toz yüklemesini kolaylaştırmak için tozun ve pipet ucunun statik yüklerinin nötralize etmesi önerilir. Kılavuzlu canül, cihazın kritik bir bileşenidir. Toz yüklü pipet ucunun farenin nefes borusuna entübasyonunu kolaylaştırmak için kullanılır. Kılavuzlu canül çapı çok geniş olmamalıdır; aksi takdirde nefes borusuna takmak zor olacaktır ve fareye yara verebilir. Kılavuz kanül çapı optik fibere ve toz yüklü pipet ucuna uyacak kadar geniş olmalı ve pipet ucu kılavuz kanüle yaklaşık 1-2 mm çıkıntı yapmalıdır.
Trakeanın açılmasını görselleştirme yeteneği entübasyon sürecinde çok önemlidir ve kılavuz damarın doğru yerleştirilmesini sağlar. Trakeal açıklık, boğazın arkasında düzenli açma ve kapama hareketi olan beyaz arytenoid kıkırdaktan oluşur. Fiber optik aydınlatma ile trakeanın açılması kolayca görselleştirilebiliyor. İnce uçlu plastik pipetten küçük bir hava hacmini şişirerek, göğüsteki bir şişirme uygun bir entübasyonu gösterir. Göğüste enflasyon gözlenmezse veya yerleştirme sırasında direnç hissedilirse, kılavuzluğu hızla geri çekin ve adımları tekrarlayın.
Piyasada yaygın olarak kullanılan12 , 17,18(Malzeme Masası; bu cihaz artık durdurulmuştur) yaygın olarak kullanılan bir kuru toz insufflatoru vardı. Kuru toz cihazın numune haznesine yüklenir ve 3 mL plastik hava şırıncığı veya bir hava pompasından hava ile dağılır. Yayılan dozu ölçmek için, cihazın toz uygulamadan önce ve sonra tartılması gerekir, bu da toz dozunun genellikle çok küçük olduğu göz önüne alındığında yanlışlığa yol açar (cihazın kütlesine göre). Ticari insufflator ile karşılaştırıldığında, özel yapım cihazın en büyük avantajı, toz dağılımının başarısının şeffaf jel yükleme pipet uçlarında toz bulunmaması ile gözlemlenebiliyor olmasıdır. Pipet ucu hafif olduğundan, yayılan dozu ölçmek için uygulamadan önce ve sonra doğru bir şekilde tartılabilir. Pipet ucu, hayvanın nefes borusuna maruz kalmak yerine kılavuz kalıbın içine yerleştirilir. Ucun nefes borusundaki nem veya salgı ile kontamine etme riski minimumdur (bu da yayılan doz ölçümünün doğruluğunu etkileyebilir). Pipet uçları tek kullanımlık ve ucuz olduğundan, farklı kuru toz formülasyonları önceden farklı uçlara yüklenebilir. Çeşitli formülasyonlar, cihaz temizliğine ve doz doldurmaya gerek kalmadan aynı hayvan deneyinde değerlendirilebilir, böylece zamandan tasarruf edilir ve artık tozdan çapraz bulaşma riski ortadan kalkar. Ayrıca, ticari insufflator tarafından oluşturulan toz dispersiyon deseni farklı formülasyonlar arasında değişmektedir. Bir dizi çalışma, ticari insufflator tarafından dağılan kuru tozun kolayca aglomeralandığını ve19,20. Buna karşılık, bizimkine benzer cihazlar tarafından dağılan diğer formülasyonların akciğer birikiminin yüksek olduğu bildirilmektedir15,21,22.
Toz aerosollerin hayvanın akciğerine verilmesi için literatürde bildirilen diğer benzer özel yapım cihazlar vardır. Örneğin, Chaurasiya ve arkadaşları, toz dağılımı için entübasyondan sonra kanül tüpüne bağlı bir şırıng ile entübasyon için bir kanül tüpünün kullanımını ve toz yüklemesini tanımladı23. Yaklaşımları daha az özelleştirme ile standart ekipman ve malzeme (örneğin otoskop, kanül ve şırıngar) kullanırken, buradaki yöntem bazı farklı avantajlar sunmaktadır. İlk olarak, ilaç uygulamadan önce doğru entübasyonun onaylanmasına izin verir. Bu adım özellikle daha az deneyimli kullanıcı için yararlıdır. İkincisi, kılavuz kanül, nefes borusundaki herhangi bir salgı veya nemin jel yükleme pipet ucunu kirletmesini önlemek için bir koruma kalkanı görevi görerek tartılarak daha doğru yayılan bir doz ölçümü sağlar. Son olarak, optik fiber ile birlikte daha esnek kılavuzluk kolaylaşma entübasyon sağlayabilir.
Özetle, ucuz, tek kullanımlık, tekrarlanabilir ve az miktarda tozun tam olarak dağıtılmasında verimli olan özel yapım kuru toz altlık bu makalede tanıtılmıştır. Bahsedilen entübasyon işlemi noninvaziv, hızlıdır ve farelere güvenli ve doğru bir şekilde toz formülasyonları sağlayabilir. Pulmoner doğum için sıvı formülasyonunun uygulanması için de benimsenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar, bay Ray Lee, Bay HC Leung ve Bay Wallace So'ya ışık kaynağı ve toz oytucusu yapma konusundaki nazik yardımları için teşekkür etmek istiyor; ve hayvan görüntüleme yardımı için Fakülte Çekirdek Tesisi. Çalışma, Hong Kong Araştırma Hibe Konseyi (17300319) tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BALB/c mouse | Female; 7-9 weeks old; Body weight 20-25 g | ||
| CleanCap Firefly Luciferase mRNA | TriLink Biotechnology | L-7602 | |
| Dry Powder Insufflator | PennCentury | Model DP-4M | |
| Ketamine 10% | Alfasan International B.V. | NA | |
| Light emitting diode (LED) torch | Unilite Internation | PS-K1 | |
| Mannitol (Pearlitol 160C) | Roquette | 450001 | |
| Non-filter round gel loading pipette tip (200 µL) | Labcon | 1034-800-000 | |
| Nylon floss | Reach | 30017050 | |
| One milliliter syringe without needle | Terumo | SS-01T | |
| Optical fibre | Fibre Data | OMPF1000 | |
| PEG12KL4 peptide | EZ Biolab | (PEG12)-KLLLLKLLLLKLLLLKLLLLK-NH2 | |
| Plastic Pasteur fine tip pipette | Alpha Labotatories | LW4061 | |
| Three-way stopcock | Braun | D201 | |
| Xylazine 2% | Alfasan International B.V. | NA | |
| Zerostat 3 anti-static gun | MILTY | 5036694022153 |
References
- Newman, S. P. Drug delivery to the lungs: challenges and opportunities. Therapeutic Delivery. 8 (8), 647-661 (2017).
- Setter, S. M., et al. Inhaled dry powder insulin for the treatment of diabetes mellitus. Clinical Therapeutics. 29 (5), 795-813 (2007).
- Muralidharan, P., Hayes, D., Mansour, H. M. Dry powder inhalers in COPD, lung inflammation and pulmonary infections. Expert Opinion on Drug Delivery. 12 (6), 947-962 (2015).
- de Boer, A. H., et al. Dry powder inhalation: past, present and future. Expert Opinion on Drug Delivery. 14 (4), 499-512 (2017).
- Das, S., Tucker, I., Stewart, P. Inhaled dry powder formulations for treating tuberculosis. Current Drug Delivery. 12 (1), 26-39 (2015).
- Okamoto, H., et al. Stability of chitosan-pDNA complex powder prepared by supercritical carbon dioxide process. International Journal of Pharmaceutics. 290 (1-2), 73-81 (2005).
- He, J., et al. Evaluation of inhaled recombinant human insulin dry powders: pharmacokinetics, pharmacodynamics and 14-day inhalation. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 71 (2), 176-184 (2019).
- Durham, P. G., Young, E. F., Braunstein, M. S., Welch, J. T., Hickey, A. J. A dry powder combination of pyrazinoic acid and its n-propyl ester for aerosol administration to animals. International Journal of Pharmaceutics. 514 (2), 384-391 (2016).
- Phillips, J. E., Zhang, X., Johnston, J. A. Dry powder and nebulized aerosol inhalation of pharmaceuticals delivered to mice using a nose-only exposure system. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (122), e55454 (2017).
- Nahar, K., et al. In vitro, in vivo and ex vivo models for studying particle deposition and drug absorption of inhaled pharmaceuticals). European Journal of Pharmaceutical Sciences. 49 (5), 805-818 (2013).
- Price, D. N., Muttil, P. Delivery of Therapeutics to the Lung. Methods in Molecular Biology. 1809, 415-429 (2018).
- Chang, R. Y. K., et al. Proof-of-Principle Study in a Murine Lung Infection Model of Antipseudomonal Activity of Phage PEV20 in a Dry-Powder Formulation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (2), (2018).
- Ito, T., Okuda, T., Takayama, R., Okamoto, H. Establishment of an Evaluation Method for Gene Silencing by Serial Pulmonary Administration of siRNA and pDNA Powders: Naked siRNA Inhalation Powder Suppresses Luciferase Gene Expression in the Lung. Journal of pharmaceutical sciences. 108 (8), 2661-2667 (2019).
- Patil, J. S., Sarasija, S. Pulmonary drug delivery strategies: A concise, systematic review. Lung India. 29 (1), 44-49 (2012).
- Ihara, D., et al. Histological Quantification of Gene Silencing by Intratracheal Administration of Dry Powdered Small-Interfering RNA/Chitosan Complexes in the Murine Lung. Pharmaceutical Research. 32 (12), 3877-3885 (2015).
- Qiu, Y., et al. Effective mRNA pulmonary delivery by dry powder formulation of PEGylated synthetic KL4 peptide. Journal of Controlled Release. 314, 102-115 (2019).
- Pfeifer, C., et al. Dry powder aerosols of polyethylenimine (PEI)-based gene vectors mediate efficient gene delivery to the lung. Journal of Controlled Release. 154 (1), 69-76 (2011).
- Kim, I., et al. Doxorubicin-loaded highly porous large PLGA microparticles as a sustained- release inhalation system for the treatment of metastatic lung cancer. Biomaterials. 33 (22), 5574-5583 (2012).
- Tonnis, W. F., et al. A novel aerosol generator for homogenous distribution of powder over the lungs after pulmonary administration to small laboratory animals. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 88 (3), 1056-1063 (2014).
- Hoppentocht, M., Hoste, C., Hagedoorn, P., Frijlink, H. W., de Boer, A. H. In vitro evaluation of the DP-4M PennCentury insufflator. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 88 (1), 153-159 (2014).
- Liao, Q., et al. Porous and highly dispersible voriconazole dry powders produced by spray freeze drying for pulmonary delivery with efficient lung deposition. International Journal of Pharmaceutics. 560, 144-154 (2019).
- Ito, T., Okuda, T., Takashima, Y., Okamoto, H. Naked pDNA Inhalation Powder Composed of Hyaluronic Acid Exhibits High Gene Expression in the Lungs. Molecular Pharmaceutics. 16 (2), 489-497 (2019).
- Chaurasiya, B., Zhou, M., Tu, J., Sun, C. Design and validation of a simple device for insufflation of dry powders in a mice model. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 123, 495-501 (2018).
