Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

डिटर्जेंट और एंजाइम मुक्त विधि का उपयोग कर पूरे ऊतक से नाभिक अलगाव

Published: June 24, 2020 doi: 10.3791/61471
Automatic Translation
1, 2, 1
1IRIBHM, Université Libre de Bruxelles (ULB), 2Medecine Faculty, Université Libre de Bruxelles (ULB)

Summary

एकल नाभिक अलगाव कोशिका झिल्ली के वियोजन और डिटर्जेंट आधारित परिवर्तन पर निर्भर करता है, ऐसे कदम जिन्हें अनुकूलन की आवश्यकता होती है और तकनीकी कलाकृतियों को पेश करने की संभावना होती है। हम पूरे ऊतक से सीधे बरकरार नाभिक के तेजी से अलगाव के लिए एक डिटर्जेंट और एंजाइम मुक्त प्रोटोकॉल प्रदर्शित करते हैं, जो एकल-नाभिक आरएनए-एसईक्यू (snRNA-Seq) या ATAC-seq के लिए उपयुक्त नाभिक उपज ।

Abstract

हाई-थ्रूपुट ट्रांसक्रिप्टोम और एपिजेनोम प्रोफाइलिंग के लिए सिंगल सेल या सिंगल न्यूक्लियी सस्पेंशन तैयार करने की जरूरत होती है । बरकरार कोशिका या नाभिक के साथ निलंबन की तैयारी में वियोजन और पारमेबिलाइजेशन शामिल है, ऐसे कदम जो अवांछित शोर और अवांछनीय क्षति को पेश कर सकते हैं। विशेष रूप से, कुछ सेल-प्रकार जैसे न्यूरॉन्स व्यक्तिगत कोशिकाओं में अलग-अलग होना चुनौतीपूर्ण हैं। इसके अतिरिक्त, नाभिक को छोड़ने के लिए सेलुलर झिल्ली के पारमेबिलाइजेशन को परीक्षण और त्रुटि द्वारा अनुकूलन की आवश्यकता होती है, जो समय लेने वाली, श्रम गहन और आर्थिक रूप से अव्यवहार्य हो सकती है। उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण के लिए नमूना तैयारी की मजबूती और प्रजनन क्षमता को बढ़ाने के लिए, हम एक रैपिड एंजाइम और डिटर्जेंट-मुक्त कॉलम-आधारित नाभिक अलगाव विधि का वर्णन करते हैं। प्रोटोकॉल 20 मिनट के भीतर पूरे जेब्राफिश मस्तिष्क से नाभिक के कुशल अलगाव को सक्षम बनाता है। अलग नाभिक प्रदर्शन बरकरार परमाणु आकृति विज्ञान और कुल करने के लिए कम प्रवृत्ति । इसके अलावा, फ्लो साइटोमेट्री नाभिक संवर्धन और डाउनस्ट्रीम आवेदन के लिए सेलुलर मलबे की निकासी की अनुमति देता है। प्रोटोकॉल, जो नरम ऊतकों और सुसंस्कृत कोशिकाओं पर काम करना चाहिए, नमूना तैयारी के लिए एक सरल और सुलभ विधि प्रदान करता है जिसका उपयोग उच्च थ्रूपुट प्रोफाइलिंग के लिए किया जा सकता है, सफल एकल-नाभिक आरएनए-एसईक्यू और ATAC-seq प्रयोगों के लिए आवश्यक कदमों को सरल बनाता है।

Introduction

एकल सेल आरएनए-एसईक्यू (स्क्रर्ना-सेक़) और एटीसी-सेक्यू एकल-कोशिका संकल्प पर जटिल जैविक प्रणालियों का अध्ययन करने के लिए बहुमुखी उपकरण हैं। वे व्यापक रूप से सेल उपप्रकारों और राज्यों, जीन नेटवर्क को परिभाषित करने और सेलुलर विषमता का आकलन करने के लिए उपयोग किया जाता है । स्क्रर्ना-सेक्यू प्रदर्शन के लिए एक शर्त ऊतक वियोजन द्वारा एकल कोशिका निलंबन की तैयारी है। एक्सेरसेलुलर मैट्रिक्स संरचना और यांत्रिक गुणों में भिन्नता के कारण, व्यक्तिगत ऊतकों को एकल सेल निलंबन की तैयारी के लिए वियोजन प्रोटोकॉल के अनुकूलन की आवश्यकता होती है।

एकल कोशिकाओं में ऊतकों के वियोजन में आमतौर पर पाचन एंजाइमों के साथ उपचार शामिल होता है, जिसमें कोलेजन, डिस्पास,या ट्राइप्सिन, 37 डिग्री सेल्सियस1,,2,,3,4पर होता है। चूंकि ट्रांसक्रिप्शनल मशीनरी 37 डिग्री सेल्सियस पर सक्रिय रहती है, इसलिए एंजाइमेटिक वियोजन एमआरएनए अभिव्यक्ति कलाकृतियों और शोर5,,6को पेश कर सकता है। विशेष रूप से, लंबे समय तक इनक्यूबेशन तनाव उत्तरदायी जीन और गर्मी-सदमे प्रतिक्रिया को गैर-समान तरीके से प्रेरित कर सकती है - जिससे प्रयोग7में तकनीकी परिवर्तनशीलता हो सकती है।

एकल सेल निलंबन उत्पन्न करने की एक और खामी जटिल मॉर्फोलोजी के साथ व्यवहार्य और अक्षुण्ण कोशिका-प्रकार प्राप्त करने में कठिनाई है। विशेष रूप से, न्यूरॉन्स, एडिपोसाइट्स और पोडोसाइट्स,8, 9,10, 11को अलग करना चुनौतीपूर्ण हैं।,9,11 उदाहरण के लिए, वू और उनके सहयोगियों ने एक वयस्क माउस किडनी12से स्क्रर्ना प्रोफाइल में ग्लोमेरुलर पोडोसाइट्स की अनुपस्थिति का प्रदर्शन किया। मस्तिष्क के ऊतकों 8 , 13,,14से परस्पर न्यूरॉन्स की वसूली के संबंध में इसी13तरहकी गैर - ऑप्टिमल टिप्पणियां की गई हैं . संक्षेप में, वियोजन प्रोटोकॉल सेल-प्रकारों को अलग करने के लिए आसान दिशा में पता लगाने पूर्वाग्रह शुरू कर सकते हैं, जिससे अंग के सेलुलर वास्तुकला का गलत बयानी हो सकता है।

स्क्रर्ना-सेक्यू में नमूना तैयारी के दौरान पेश किए गए तकनीकी शोर और पूर्वाग्रह को दूर करने के लिए, नाभिक को अलगाव और प्रोफाइलिंग एक आकर्षक विकल्प प्रदान करता है। चूंकि परमाणु आकृति विज्ञान विभिन्न कोशिका-प्रकारों के बीच समान है, इसलिए नाभिक का अलगाव जटिल मॉर्फोलोजी के साथ अक्षुण्ण और व्यवहार्य कोशिकाओं को अलग-थलग करने के मुद्दे को दरकिनार करता है। उदाहरण के लिए, वू और उनके सहयोगियों ने एक वयस्क माउस किडनी के एकल-नाभिक आरएनए-सेक्यू (snRNA-Seq.) के साथ ग्लोमेरुलर पोडोसाइट्स की सफल प्रोफाइलिंग का प्रदर्शन किया, जो scRNA-Seq12से गायब था । दिलचस्प बात यह है कि एकल कोशिका और एकल नाभिक आरएनए-एसईक्यू के बीच तुलनात्मक अध्ययनों ने एसएनएनए-सेक्यू12के साथ तनाव और हीट-शॉक रिस्पांस जीन को शामिल करने में कमी का सुझाव दिया है । अध्ययन आगे दो तरीकों से पता चला जीन के बीच एक उच्च संबंध का सुझाव देते हैं । हालांकि, मानव माइक्रोग्लिया पर हाल ही में एक अध्ययनअल्जाइमर रोग 15में आनुवंशिक सक्रियण का पता लगाने में विफल रहा । इस प्रकार कुछ संदर्भों में, snRNA-Seq scRNA-Seq16, 17,17के लिए एक उपयुक्त विकल्प है । इसके अतिरिक्त, परमाणु अलगाव का उपयोग एकल-कोशिका ATAC-Seq के लिए किया जा सकता है, जो व्यक्तिगत कोशिकाओं के भीतर खुले क्रोमेटिन के क्षेत्रों के बारे में जानकारी प्रदान करता है।

नाभिक अलगाव के लिए प्रोटोकॉल में नाभिक को छोड़ने के लिए कोशिका झिल्ली के तीन प्रमुख कदम शामिल हैं: i) डिटर्जेंट आधारित लाइसिस; ii) डोउंस होमोजेनाइजर का उपयोग करके ऊतक समरूपता; और iii) नाभिक का संवर्धन और ढाल अपकेंद्रित्र या प्रवाह साइटोमेट्री 18 ,19, 20,,,21,,22का उपयोग कर सेल मलबे को हटाने।18 इसमें से, पहले दो चरण ऊतक प्रकार पर निर्भर करते हैं और अनुभवजन्य रूप से अनुकूलित होने की आवश्यकता है। हल्के डिटर्जेंट से कोशिका झिल्ली का आंशिक टूटना होता है और23के ऊतकों से नाभिक की अक्षम पुनः प्राप्ति होती है । दूसरी ओर, डिटर्जेंट और कठोर समरूपता के उच्च स्तर से परमाणु झिल्ली टूट जाती है और उनका नुकसान24,,25हो जाता है । उठी नाभिक आगे एक साथ झुरमुट और समुच्चय बनाते हैं, जिसे यदि नहीं हटाया जाता है तो डाउनस्ट्रीम प्रोफाइलिंग प्रयोग में कलाकृतियों का कारण बन सकता है।

नाभिक अलगाव के लिए डिटर्जेंट अनुकूलन से संबंधित मुद्दों को दरकिनार करने के लिए, हम एक डिटर्जेंट मुक्त और स्पिन-कॉलम-आधारित विधि का उपयोग करके ताजा नमूनों से बरकरार नाभिक को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं। प्रोटोकॉल 20 मिनट के भीतर पूरे अंग से नाभिक पैदा करता है, जो विरूपण साक्ष्य प्रतिलेखन के प्रेरण को सीमित करता है। अलग नाभिक एकल नाभिक आरएनए-Seq. और ATAC-seq के लिए FACS के साथ समृद्ध किया जा सकता है, एक सरल और सार्वभौमिक विधि है कि मजबूत और प्रजनन उच्च थ्रूपुट प्रोफाइलिंग सक्षम बनाता है प्रदान करते हैं ।

Protocol

नीचे प्रस्तुत सभी प्रक्रियाओं को संस्थागत (यूनीवर्सिट लिबर डी ब्रुक्सेल्स (यूएलबी)) और राष्ट्रीय नैतिक और पशु कल्याण दिशानिर्देशों और विनियमन के अनुसार किया गया था, जिन्हें एथिकल कमेटी फॉर एनिमल वेलफेयर (सीईबीईए) द्वारा यूनीवर्सिट लिबर डी ब्रुक्सल्स (प्रोटोकॉल 578N-579N) से अनुमोदित किया गया था।

1. ऊतक विच्छेदन से पहले तैयारी

  1. जेब्राफिश को इच्छामृत्यु के लिए पीबीएस में 0.2% ट्राइकेन समाधान तैयार करें। बर्फ पर समाधान ठंडा।
  2. टिश्यू को कम करने के लिए 30 एमएम पेट्री डिश तैयार करें।
  3. बर्फ ठंडा 1x पीबीएस (ऊतक नमूना प्रति 10 मिलीएल) तैयार करें।
  4. सेंट्रलाइज को 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें।
  5. नाभिक अलगाव के लिए, डिटर्जेंट मुक्त नाभिक आइसोलेशन किट(सामग्री की तालिका) काउपयोग करें।
  6. प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले, प्री-चिल बफर ए और बी ने किट में उन्हें न्यूक्लिय अलगाव से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए बर्फ पर रखकर प्रदान किया।
  7. अलग नाभिक को संभालने के लिए, 5% बीएसए समाधान के साथ ट्यूब और पिपेट टिप्स जैसे प्लास्टिक रिएजेंट्स को कोट करें। इसके लिए पीबीएस के 40 एमएल में बीएसए के 2 जी को घोलकर घोल तैयार करें। 5% बीएसए के साथ प्लास्टिक की वस्तुओं को कोटिंग प्लास्टिक से चिपके नाभिक को कम कर देता है। यह कदम अलग नाभिक की वसूली को बढ़ाता है।
  8. 5% बीएसए समाधान को 2-3 बार पाइपिंग करके पिपेट टिप्स कोट करें। एयर- टिप्स को 2 घंटे तक सुखा लें। प्रति सैंपल 10 प्लास्टिक टिप्स तैयार करें।
  9. नाभिक के संग्रह के लिए ट्यूबों को 5% बीएसए के साथ भरकर कोट करें। एक कुशल कोटिंग सुनिश्चित करने के लिए ट्यूबों को 3 बार उलटा करें। घोल निकालें और हवा से लें- ट्यूबों को 2 घंटे तक साफ टिश्यू पेपर पर उल्टा करें। प्रति नमूना, किट में प्रदान की गई कोट वन कलेक्शन ट्यूब। इसके अतिरिक्त, FACS के बाद नाभिक संग्रह के लिए लेपित 1.5 एमएल ट्यूब तैयार करें।
    नोट: चिपके हुए को कम करने के लिए ग्लास टिप्स प्लास्टिक पिपेट युक्तियों के लिए अत्यधिक अनुशंसित विकल्प हैं।

2. जेब्राफिश मस्तिष्क का विच्छेदन

  1. जेब्राफिश को इच्छामृत्यु के लिए, 25 एमएल बर्फ-ठंडे ट्राइकेन समाधान के साथ 90 मिमी पेट्री डिश तैयार करें।
  2. ध्यान से, मछली पकड़ने के जाल का उपयोग करके टैंक से जेब्राफिश लें और इसे पेट्री डिश में रखें।
  3. मछली को 5 मिनट के लिए ट्राइकेन में छोड़कर इच्छामृत्यु दें।
  4. एक तेज रेजर ब्लेड के साथ जानवर को काटना।
  5. संदंश का उपयोग करके, धीरे-धीरे खोपड़ी को खोलें और खोपड़ी के वेंट्रल और पृष्ठीय पक्ष से नरम ऊतकों, त्वचा और हड्डियों को हटा दें।
  6. धीरे-धीरे, मस्तिष्क को बर्फ के ठंडे पीबीएस युक्त ताजा 30 मिमी पकवान में स्थानांतरित करें।
  7. स्पिन कॉलम पर नमूने की लोडिंग को कम करने के लिए एक रेजर ब्लेड का उपयोग करके मस्तिष्क को छोटे टुकड़ों में कीमा करें।

3. एकल नाभिक अलगाव

  1. न्यूक्लियी आइसोलेशन किट में प्रदान किए गए फिल्टर कारतूस में कीमा बनाया हुआ ऊतक स्थानांतरित करें और ऊतक को जागरूक करने के लिए कोल्ड बफर ए के 200 माइक्रोन जोड़ें। 2 मिनट के लिए किट द्वारा प्रदान की प्लास्टिक रॉड का उपयोग कर ऊतक पीसें।
  2. कोल्ड बफर ए के 300 माइक्रोन जोड़ें और 10 मिनट के लिए खुली टोपी के साथ बर्फ पर फिल्टर कारतूस को इनक्यूबेट करें।
  3. कारतूस को कैप करें और ट्यूब को 5 बार उलटा करके ऊतक को फिर से खर्च करें।
  4. 30 एस के लिए 16,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। इस चरण में, फ़िल्टर से गुजरने पर कोशिकाएं उठी जाती हैं और उच्च गति वाले अपकेंद्रित्र बल को लागू किया जाता है। प्रवाह के माध्यम से बरकरार नाभिक होता है, जो ट्यूब के तल पर गोली।
  5. फिल्टर को त्यागें और 10 एस के लिए सख्ती से भंवर से जोड़कर गोली को फिर से खर्च करें।
  6. 3 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर समाधान को अपकेंद्री करके नाभिक को गोली दें। नाभिक गोली बेरंग होने के साथ ही सुपरनैंट को सावधानी से त्यागें।
  7. 10 मिनट के लिए 600 x ग्राम पर कोल्ड बफर बी और सेंट्रलाइज के 0.8 मिलीलन में गोली को फिर से खर्च करें। इस चरण में नाभिक झिल्ली के मलबे से अलग हो जाता है। प्राप्त बेरंग गोली में अलग-थलग नाभिक होता है।
  8. 5% बीएसए के साथ पीबीएस के 500 माइक्रोन में अलग नाभिक को फिर से खर्च करें। परिमाणीकरण के बाद FACS प्रदर्शन करने के लिए बर्फ पर नाभिक निलंबन रखें।

4. नाभिक आकृति विज्ञान का दृश्य

  1. Hoechst धुंधला द्वारा परमाणु आकृति विज्ञान की पुष्टि करें। इसके लिए बीएसए कोटेड टिप्स का इस्तेमाल करते हुए नई ट्यूब में सिंगल न्यूक्लियी सस्पेंशन के 100 माइक्रोन निकालें। नाभिक को दागने के लिए, होचस्ट (1 मिलीग्राम/एमएल) का 0.1 माइक्रोल जोड़ें। धीरे-धीरे ट्यूब को भंवर से निकालें।
  2. इमेजिंग के लिए नाभिक निलंबन को ग्लास बॉटम डिश में स्थानांतरित करें।
  3. छवि नाभिक ~ 405 एनएम (वायलेट) तरंगदैर्ध्य की लेजर उत्तेजन सेटिंग्स के साथ एक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग कर।

5. एन्यूक्लिई का एफएएफएस आधारित संवर्धन

  1. FACS प्रदर्शन करने से पहले, बीएसए लेपित ट्यूब में 40 माइक्रोन सेल छलनी का उपयोग करके नाभिक को फ़िल्टर करें।
  2. 1,000 माइक्रोन की अंतिम मात्रा में 5% बीएसए के साथ पीबीएस जोड़कर फ़िल्टर किए गए निलंबन को पतला करें।
  3. दो गोल नीचे FACS ट्यूब को 'नियंत्रण' और 'दाग' के रूप में लेबल करें। 'नियंत्रण' ट्यूब में संयुक्त राष्ट्र-दाग नाभिक होगा, जबकि 'दाग' ट्यूब में होचस्ट सना हुआ नाभिक होगा।
  4. बीएसए कोटेड पिपेट टिप का उपयोग करके नाभिक निलंबन के 250 माइक्रोल को 'नियंत्रण' ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  5. शेष 750 माइक्रोल समाधान को 'दाग' के रूप में लेबल किए गए FACS ट्यूब में स्थानांतरित करें और नाभिक को दाग लगाने के लिए 1 माइक्रोन होचस्ट डाई जोड़ें। धीमी गति से भंवर से मिलाएं।
  6. असंरंजित नियंत्रण नमूने को सेल सॉर्टर पर लोड करें। रिकॉर्ड 5000 घटनाएं।
  7. दाग नमूने लोड और रिकॉर्ड 5000 घटनाओं।
  8. एकल नाभिक की पहचान की अनुमति देता है कि FACS फाटक ड्रा। नाभिक नियंत्रण और दाग नमूने के बीच Hoechst फ्लोरेसेंस संकेत की तुलना करके चुना जा सकता है।
  9. 5% बीएसए के साथ पीबीएस के 50 माइक्रोन युक्त नए 1.5 एमएल ट्यूब में दाग ट्यूब से Hoechst-सकारात्मक नाभिक सॉर्ट करें।
    नोट: अलग नाभिक डाउनस्ट्रीम आवेदन की आवश्यकताओं के अनुसार एक वांछित माध्यम में एकत्र किया जा सकता है।

Representative Results

--ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग जेब्राफिश मस्तिष्क के ऊतकों से सीधे एकल नाभिक निलंबन उत्पन्न करने के लिए किया गया था। अलगाव आमतौर पर 20 मिनट की आवश्यकता होती है और डिटर्जेंट या पाचन एंजाइम के उपयोग से बचें। प्रोटोकॉल के व्यक्तिगत चरणों का सारांश एक योजनाबद्ध चित्रा 1में प्रदान किया जाता है, जिसे मार्गदर्शन के लिए उपयोग करने के लिए मुद्रित किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: नाभिक अलगाव के लिए डिटर्जेंट-मुक्त स्पिन-कॉलम-आधारित विधि की योजनाबद्ध।
ताजा जेब्राफिश मस्तिष्क ऊतक से नाभिक की निकासी के दौरान किए गए व्यक्तिगत चरणों का चित्रमय प्रतिनिधित्व। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

परमाणु आकृति विज्ञान का दृश्य

परमाणु आकृति विज्ञान की गुणात्मक पुष्टि के लिए, अलग नाभिक Hoechst के साथ दाग और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर कल्पना थे । नाभिक बरकरार, गोल और अच्छी तरह से अलग(चित्रा 2)दिखाई दिया । महत्वपूर्ण बात यह है कि परमाणु एकत्रीकरण, परमाणु झिल्ली टूटने का संकेत, अनुपस्थित था ।

Figure 2
चित्रा 2: जेब्राफिश मस्तिष्क से एकल नाभिक अलगाव।
होचस्ट-दाग नाभिक की फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी छवि उनके अक्षुण्ण आकृति विज्ञान का प्रदर्शन करती है। स्केल बार: 10 माइक्रोन करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अक्षुण्ण नाभिक का एफएस आधारित संवर्धन

अलग नाभिक का संवर्धन और सेलुलर मलबे को हटाने के लिए एक Hoechst फ्लोरेसेंस संकेत की उपस्थिति पर गेटिंग द्वारा प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा किया गया था। वायलेट, 405 एनएम, लेजर (ब्रिलियंट वायलेट 421 - बीवी421) के साथ उत्तेजन पर Hoechst सिग्नल का पता चला था। अन दाग नाभिक ने पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस(चित्रा 3 ए, अनुपूरक चित्रा 1 ए)प्रदर्शित किया, जबकि दाग वाले नाभिक ने मजबूत फ्लोरोसेंट सिग्नल(चित्रा 3B, अनुपूरक चित्रा 1B) काप्रदर्शन किया । जैसा कि चित्रा 3सीमें दर्शाया गया है, वायलेट चैनल में अन दाग और होचस्ट दाग नाभिक को अच्छी तरह से अलग किया गया था।

Figure 3
चित्रा 3: अलग नाभिक प्रवाह साइटोमेट्री में मजबूत और विशिष्ट Hoechst फ्लोरोसेंट संकेत प्रदर्शन करते हैं।
एकल नाभिक निलंबन के लिए हिस्टोग्राम भूखंड Hoechst धुंधला के वितरण को प्रदर्शित करते हैं। Hoechst वायलेट, 405 एनएम, लेजर (शानदार वायलेट 421 - BV421) से उत्साहित है। अन दाग नमूना(ए)10 0 -103की सीमा में संकेत प्रदर्शित करता है, जबकि Hoechst दाग नाभिक(बी)10 3 -1005रेंज में संकेत उत्सर्जित करता है।5 फ्लोरेसेंस तीव्रता का एक ओवरले जो दाग (ग्रे) और दाग (नीला) नमूनों(सी)द्वारा उत्सर्जित होता है, दो आबादी के बीच स्पष्ट अलगाव को दर्शाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
अनुपूरक चित्रा 1: अलग नाभिक के लिए फ्लो साइटोमेट्री गेटिंग रणनीति। अलग नाभिक निलंबन के लिए प्रतिनिधि प्रवाह भूखंड। अलग नाभिक आगे तितर बितर और वायलेट लेजर BV421 जो ४०५ एनएम पर Hoechst उत्तेजित का उपयोग कर विश्लेषण किया गया । 10 0 -103 रेंज में बेदाग नमूना(ए)प्रदर्शित BV421 संकेत।0 13130 घटनाओं में से, एफएससी-ए (कुल का 1.07%) और बीवी 421 सिग्नल (कुल का 0%) के आधार पर अन दागदार नाभिक के लिए 0 घटनाओं के आधार पर एकल नाभिक के रूप में 141 घटनाओं का पता लगाया गया था। होचस्ट दाग नाभिक(बी)ने 103-105 रेंज में बीवी 421 सिग्नल प्रदर्शित किया। 50000 घटनाओं में से, एफएससी-ए (कुल का 4.84%) और बीवी 421 सिग्नल (कुल का 4.83%) के आधार पर होचस्ट-पॉजिटिव न्यूक्लियी के लिए 2414 घटनाओं के आधार पर एकल नाभिक के रूप में 2418 घटनाओं का पता लगाया गया। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

एक एकल कोशिका संकल्प पर ट्रांसक्रिप्टोम और एपिगेनोम प्रोफाइलिंग ने जैविक प्रणालियों के अध्ययन में क्रांतिकारी बदलाव किया है। एक ठोस ऊतक के लिए एक एकल कोशिका के संकल्प पर अध्ययन अलग-अलग कोशिकाओं या नाभिक में अंग के वियोजन पर निर्भर करता है। वियोजन एक विनाशकारी प्रक्रिया है जो तकनीकी कलाकृतियों को पेश कर सकती है, जो सिस्टम5,,6के सटीक प्रतिनिधित्व के विकास को रोक सकती है। उदाहरण के लिए, एंजाइमेटिक वियोजन जटिल मॉर्फोलोजी, जैसे न्यूरॉन्स या पोडोसाइट्स के साथ कोशिकाओं को नुकसान पहुंचा सकता है, और तनाव और गर्मी-सदमे प्रतिक्रिया जीन7,,12की अभिव्यक्ति को प्रेरित कर सकता है। इसके अतिरिक्त, वियोजन के दौरान डिटर्जेंट का उपयोग परमाणु झिल्ली को टूट सकता है और एकत्रीकरण23, 25,तक लेजासकता है। इस प्रकार, उच्चतम गुणवत्ता के एकल कोशिका या नाभिक निलंबन प्राप्त करने के लिए वियोजन का अनुकूलन उच्च-थ्रूपुट प्रोफाइलिंग प्रयोगों की सफलता के लिए सर्वोपरि है।

यहां, हम एक डिटर्जेंट और एंजाइम मुक्त नाभिक अलगाव विधि प्रदर्शित करते हैं जो 20 मिनट से भी कम समय में जेब्राफिश मस्तिष्क से बरकरार नाभिक को निकालने की अनुमति देता है। प्रोटोकॉल ठेठ आकृति विज्ञान और मजबूत अखंडता(चित्रा 2)के साथ नाभिक पैदावार । 6 मिलीग्राम वजनी एक जेब्राफिश मस्तिष्क से, प्रोटोकॉल एक हीमोसाइटोमीटर गिनती द्वारा निर्धारित कुल 60,000 नाभिक की पैदावार करता है। अलग नाभिक का उपयोग कई डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है, जिसमें snrna-seq, ATAC-seq और इम्यूनोदाता शामिल हैं। अलग नाभिक में साइटोप्लाज्मिक अंशों से क्रॉस-संदूषण शामिल हो सकता है, विशेष रूप से एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम और माइटोकॉन्ड्रिया के घटकों से। उच्च थ्रूपुट प्रोफाइलिंग प्रयोगों के लिए, सेलुलर मलबे, विशेष रूप से माइटोकॉन्ड्रिया की निकासी की दृढ़ता से सिफारिश की जाती है। फ्लो साइटोमेट्री(चित्र 3)नाभिक के शुद्धिकरण के लिए एक व्यवहार्य विकल्प प्रदान करता है। वैकल्पिक रूप से, मलबे को हटाने के लिए सुक्रोज ढाल का भी उपयोग किया जा सकता है।

प्रोटोकॉल माउस थायराइड ग्रंथि (डेटा नहीं दिखाया गया है) पर परीक्षण किया गया है और ज़ेब्राफ़िश मस्तिष्क ऊतक के समान परिणाम प्रदान करता है । कुल मिलाकर, प्रोटोकॉल एकल नाभिक निलंबन की तैयारी के लिए एक मजबूत, प्रजनन योग्य और सार्वभौमिक विधि प्रदान करता है, जो उच्च-थ्रूपुट प्रोफाइलिंग प्रयोगों के लिए रसद को सरल बनाने में मदद करता है।

Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है । लेख को खुली पहुंच बनाने के लिए भुगतान आविष्कार जैव प्रौद्योगिकी इंक, संयुक्त राज्य अमेरिका द्वारा किया गया था ।

Acknowledgments

हम पांडुलिपि पर टिप्पणी के लिए डॉ सबीन कोस्टाग्लिओला और सिंह लैब के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं । इस काम को ग्रांट नंबर 34772792 - एमआईएसयू से एसपीएस के तहत शौकीन्स डे ला रिचेचेस्के Scientifique-FNRS द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine serum albumin (BSA) Carl Roth 90604-29-8 Albumin fraction V
Cell sorter BD Biosciences FACSAria III
Centrifuge Sartorius A-14C
Eppendorf tubes (1.5 mL) Eppendorf 22363204
Falcon (15 mL) Corning 352096 Polypropylene centrifuge tubes
Falcon (5 mL ) Corning 352052 Polystyrene round bottom test tubes
Fine forceps Fine Science Tools 11295-10
Flowmi cell strainer (40 μm) Sigma BAH136800040
Fluorescence microscope Leica DMI6000 B
Glass bottle (250 mL) VWR 215-1593
Glass bottomed dish World Precision Instruments FD3510-100 Fluorodish 35 mm
Glass Pasteur pipettes VWR 612-1701
Glass pipette socket Carl Roth 388.1 Pipetting aid pi-pump 2500
Hoechst staining dye solution Abcam ab228551 Hoechst 33342
Minute Detergent-Free Nuclei Isolation Kit Invent Biotechnologies NI-024
PBS (10X) ThermoFisher 70011069
Petri dish (30 mm) FisherScientific 11333704 Pyrex
Petri dish (90 mm) Corning 758-10178-CS Gosselin
Pipette tips VWR 89079 10 μL, 200 μL, 1000 μL
Pipettes Gilson F167380 Pipetman
Razor blade Swann-Morton 7981809
Tricaine methane sulfonate Sigma E10521
Vortex machine Scientific Industries SI-0236 Vortex-Genie 2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ebrahimi Dastgurdi, M., Ejeian, F., Nematollahi, M., Motaghi, A., Nasr-Esfahani, M. H. Comparison of two digestion strategies on characteristics and differentiation potential of human dental pulp stem cells. Archives of Oral Biology. 93, 74-79 (2018).
  2. Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. Dispase, a neutral protease from Bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase. Journal of Investigative Dermatology. 93 (2), 287-290 (1989).
  3. Khan, M. R., Chandrashekran, A., Smith, R. K. W., Dudhia, J. Immunophenotypic characterization of ovine mesenchymal stem cells. Cytometry Part A. 89 (5), 443-450 (2016).
  4. Cavanagh, T. J., Lakey, J. R. T., Wright, M. J., Fetterhoff, T., Wile, K. Crude collagenase loses islet-isolating efficacy regardless of storage conditions. Transplantation Proceedings. 29 (4), 1942-1944 (1997).
  5. Massoni-Badosa, R., et al. Sampling artifacts in single-cell genomics cohort studies. bioRxiv. , (2020).
  6. Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  7. O'Flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumour tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Bioarxiv. 683227, (2019).
  8. Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. Plos One. 13 (12), 0209648 (2018).
  9. Lake, B. B., et al. A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys. Nature Communications. 10 (1), (2019).
  10. Rajbhandari, P., et al. Single cell analysis reveals immune cell-adipocyte crosstalk regulating the transcription of thermogenic adipocytes. eLife. 8, (2019).
  11. Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24 (10), 2746-2756 (2018).
  12. Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: Rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis. Journal of the American Society of Nephrology. 30 (1), 23-32 (2019).
  13. Lacar, B., et al. Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation. Nature Communications. 7 (1), 1-13 (2016).
  14. Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353 (6302), 925-928 (2016).
  15. Thrupp, N., et al. Single nucleus sequencing fails to detect microglial activation in human tissue. bioRxiv. , (2020).
  16. Selewa, A., et al. Systematic Comparison of High-throughput Single-Cell and Single-Nucleus Transcriptomes during Cardiomyocyte Differentiation. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
  17. Lake, B. B., et al. A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA. Scientific Reports. 7 (1), 1-8 (2017).
  18. Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. Isolation of neuronal chromatin from brain tissue. BMC Neuroscience. 9, 42 (2008).
  19. Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).
  20. Birnie, G. D. Isolation of Nuclei from Animal Cells in Culture. Methods in Cell Biology. 17, 13-26 (1978).
  21. Dounce, A. L., Witter, R. F., Monty, K. J., Pate, S., Cottone, M. A. A method for isolating intact mitochondria and nuclei from the same homogenate, and the influence of mitochondrial destruction on the properties of cell nuclei. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 1 (2), 139-153 (1955).
  22. Hymer, W. C., Kuff, E. L. Isolation of Nuclei From Mammalian Tissues Through the Use of Triton X-100. The journal of Histochemistry and Cytochemistry. 12, 359-363 (1964).
  23. Johnson, M. Detergents: Triton X-100, Tween-20, and More. Materials and Methods. 3, (2013).
  24. Sikorskaite, S., Rajamäki, M. L., Baniulis, D., Stanys, V., Valkonen, J. P. T. Protocol: Optimised methodology for isolation of nuclei from leaves of species in the Solanaceae and Rosaceae families. Plant Methods. 9 (1), 31 (2013).
  25. Graham, J., Rickwood, D. Subcellular fractionation: a practical approach. , IRL Press. (1997).

Tags

JoVE में इस महीने अंक १६० नाभिक अलगाव जेब्राफिश मस्तिष्क न्यूरॉन ताजा ऊतक डिटर्जेंट मुक्त एंजाइम मुक्त स्पिन कॉलम एकल नाभिक आरएनए-seq ATAC-seq FACS
डिटर्जेंट और एंजाइम मुक्त विधि का उपयोग कर पूरे ऊतक से नाभिक अलगाव
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Eski, S. E., Dubois, C., Singh, S.… More

Eski, S. E., Dubois, C., Singh, S. P. Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method. J. Vis. Exp. (160), e61471, doi:10.3791/61471 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter