Summary
Изоляция одноядерных тел опирается на диссоциацию и пермяцию на основе моющих средств, шаги, которые нуждаются в оптимизации и склонны к внедрению технических артефактов. Мы демонстрируем моющее средство и протокол, свободный от ферментов, для быстрой изоляции нетронутых ядер непосредственно из целых тканей, что дает ядра, пригодные для одноядерного РНК-сек (snRNA-Seq) или ATAC-seq.
Abstract
Профилирование с высокой пропускной способностью и эпигеномом требует подготовки одной клетки или одноядерной подвески. Подготовка подвески с неповрежденными клетками или ядрами включает в себя диссоциацию и пермякацию, шаги, которые могут ввести нежелательный шум и нежелательные повреждения. В частности, некоторые типы клеток, такие как нейроны являются сложными для разобщенности в отдельных клетках. Кроме того, permeabilization клеточной мембраны для выпуска ядер требует оптимизации путем проб и ошибок, которые могут быть трудоемкими, трудоемким и финансово нежизнеспособным. Для повышения надежности и воспроизводимости подготовки образца для секвенирования высокой пропускной способности мы описываем быстрый метод изоляции основных столбцов на основе ферментов. Протокол позволяет эффективно изолировать ядра от всего мозга зебры в течение 20 минут. Изолированные ядра отображают неповрежденную ядерную морфологию и низкую склонность к агрегированию. Кроме того, цитометрия потока позволяет нуклеи обогащения и очистки клеточного мусора для вниз по течению применения. Протокол, который должен работать на мягких тканях и культивируемых клетках, обеспечивает простой и доступный метод для подготовки образца, который может быть использован для высокопроизводительного профилирования, упрощая шаги, необходимые для успешных экспериментов с одноядерной РНК-сек и ATAC-seq.
Introduction
Одноклеточные РНК-сек (scRNA-Seq) и ATAC-seq являются универсальными инструментами для изучения сложных биологических систем с одноклеточным разрешением. Они широко используются для определения подтипов и состояний клеток, генных сетей и оценки клеточной неоднородности. Предпосылкой для выполнения scRNA-seq является подготовка одноклеточной подвески путем диссоциации тканей. В связи с изменением внеклеточного матричного состава и механических свойств, отдельные ткани требуют оптимизации диссоциационного протокола для подготовки одноклеточной подвески.
Диссоциация тканей в одиночные клетки обычно включает в себя лечение пищеварительными ферментами, включая коллагеназу, диспазу или трипсин, при 37 градусах по Цельсию1,,2,,3,4. Поскольку транскрипционная техника остается активной при 37 градусах Цельсия, ферментальная диссоциация может ввести артефакты экспрессии мРНК и шум5,6. Примечательно, что длительная инкубация может вызвать стресс отзывчивые гены и тепло-шоковую реакцию в несенсуативной манере , что приводит к технической изменчивости в эксперименте7.
Еще одним недостатком генерации одной клеточной подвески является трудность в получении жизнеспособных и нетронутых типов клеток со сложными морфологиями. В частности, нейроны, адипоциты и подоциты сложно изолировать8,,9,,10,11. Например, Ву и его коллеги продемонстрировали отсутствие гломерулярных подоцитов в профилях скрРНК от почки для взрослых мышей12. Аналогичные неоптимальные наблюдения были сделаны в отношении восстановления взаимосвязанных нейронов из ткани мозга8,,13,14. В целом, протоколы диссоциации могут привести к смещению обнаружения к более легкому рассечению к типам клеток, что приводит к искажению клеточной архитектуры органа.
Для преодоления технического шума и смещения, введенных при подготовке образца в scRNA-Seq., изоляция и профилирование ядра является привлекательной альтернативой. Поскольку ядерная морфология аналогична между различными типами клеток, изоляция ядер обходит вопрос об изоляции нетронутых и жизнеспособных клеток со сложными морфологиями. Например, Ву и его коллеги продемонстрировали успешное профилирование гломерулярных подоцитов с однофренчатой РНК-сек. (snRNA-Seq.) почки взрослой мыши, которая отсутствовала в scRNA-Seq12. Интересно, что сравнительные исследования между одноклеточными и одноядрными РНК-сек предложили снижение индукции стрессов и генов теплового шока с snRNA-Seq12. Исследования также показывают высокую корреляцию между генами, обнаруженными этими двумя методами. Тем не менее, недавнее исследование микроглии человека не удалось обнаружить генетическую активацию при болезни Альцгеймера15. Таким образом, в определенных контекстах, snRNA-Seq является подходящей альтернативой для scRNA-Seq16,17. Кроме того, ядерная изоляция может быть использована для одноклеточного ATAC-Seq., предоставляя информацию о регионах открытого хроматина в отдельных клетках.
Протокол изоляции ядер включает в себя три основных шага: i) лизис на основе моющих средств клеточной мембраны для высвобождения ядра; ii) гомогенизация тканей с помощью гомогенизатора Dounce; и iii) обогащение ядер и удаление клеточного мусора с использованием градиентной центрифугации или цитометрии потока18,,19,,20,,21,,22. Среди них первые два шага зависят от типа ткани и должны быть эмпирически оптимизированы. Мягкое моющее средство приводит к частичному разрыву клеточной мембраны и неэффективному извлечению ядер из ткани23. С другой стороны, высокий уровень моющего средства и жесткая гомогенизация приводит к разрыву ядерной мембраны и их потере24,,25. Разорванные ядра далее имеют тенденцию слипаться и формировать агрегаты, которые, если их не удалить, могут привести к артефактам в эксперименте по профилированию ниже по течению.
Чтобы обойти проблемы, связанные с оптимизацией моющих средств для изоляции ядер, мы вводим протокол для изоляции нетронутых ядер из свежих образцов с использованием метода, свободного от моющих средств и спин-колонки. Протокол дает ядра от всего органа в течение 20 минут, ограничивая индукцию артефактной транскрипции. Изолированные ядра могут быть обогащены FACS для одноядерных РНК-сек. и ATAC-seq, обеспечивая простой и универсальный метод, который позволяет надежное и воспроизводимое высокопроизводительное профилирование.
Protocol
Все процедуры, представленные ниже, были выполнены в соответствии с институциональными (УниверситетОм Libre de Bruxelles (ULB)) и национальными руководящими принципами и правилами по защите животных, которые были одобрены этическим комитетом по защите животных (CEBEA) от Университета Либре де Бруксель (протоколы 578N-579N).
1. Подготовка перед вскрытием ткани
- Подготовка 0,2% Tricaine решение в PBS для эвтаназии зебры. Охладите раствор на льду.
- Приготовьте 30-мм чашку Петри для измельчения ткани.
- Подготовка льда холодной 1x PBS (10 мл на образец ткани).
- Охладите центрифугу до 4 градусов по Цельсию.
- Для изоляции ядер используйте изолированный набор для ядер без моющих средств(Таблица материалов).
- Перед началом протокола, предварительно охлажда буфер A и B, предусмотренных в комплекте, поместив их на лед, по крайней мере 30 минут до изоляции ядер.
- Для обработки изолированных ядер, пальто пластиковых реагентов, таких как трубки и пипетки советы с 5% BSA решение. Для этого подготовьте раствор, растворив 2 г BSA в 40 мл PBS. Покрытие пластиковых изделий с 5% BSA уменьшает ядра, прилипающие к пластику. Этот шаг усиливает восстановление изолированных ядер.
- Пальто пипетки советы по трубоуборку 5% BSA решение 2-3 раза. Воздух-сухой советы в течение 2 часов. Подготовка 10 пластмасс советы на образец.
- Пальто трубки для сбора ядер, заполнив их 5% BSA. Инвертировать трубки 3 раза, чтобы обеспечить эффективное покрытие. Удалите раствор и высушите трубки вверх дном на чистой тканевой бумаге в течение 2 часов. На образец, пальто одной коллекции трубки, предусмотренные в комплекте. Кроме того, подготовить покрытием 1,5 мл трубки для сбора ядер после FACS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стеклянные наконечники настоятельно рекомендуется альтернатива пластиковых пипетки советы, чтобы свести к минимуму прилипания.
2. Вскрытие мозга зебры
- Для усыпления зебры приготовьте 90-мм чашку Петри с 25-миллиметровым раствором Tricaine.
- Осторожно, возьмите зебру из бака с помощью рыболовной сети и поместите его в чашку Петри.
- Euthanize рыбы, оставив его в Tricaine в течение 5 минут.
- Обезглавить животное острым лезвием бритвы.
- Используя щипцы, осторожно разокройте череп и удалите мягкие ткани, кожу и кости из брюшной и спинной стороны черепа.
- Аккуратно, перенесите мозг в свежее 30-мм блюдо, содержащее ледяной PBS.
- Фарш мозга на мелкие кусочки с помощью лезвия бритвы, чтобы облегчить загрузку образца на колонке спина.
3. Изоляция одиночных ядер
- Перенесите фарш в фильтр картридж, представленный в комплекте изоляции ядер, и добавьте 200 мл холодного буфера А, чтобы ознать ткани. Измельчить ткань с помощью пластикового стержня, предоставляемого комплектом в течение 2 минут.
- Добавьте 300 мл холодного буфера А и инкубировать фильтр картридж на льду с крышкой, открытой в течение 10 минут.
- Cap картриджа и resuspend ткани путем инвертирования трубки 5 раз.
- Центрифуга на 16000 х г на 30 с. На этом этапе клетки разрываются при прохождении через фильтр и применяется высокоскоростная центробежная сила. Поток через содержит нетронутые ядра, которые гранулы в нижней части трубки.
- Отбросьте фильтр и повторно гранулы, вихревое энергично в течение 10 с.
- Гранулированные ядра путем центробежить раствор на 500 х г в течение 3 мин. Отбросьте супернатант тщательно, как ядра гранулы бесцветные.
- Resuspend гранулы в 0,8 мл холодного буфера B и центрифуги на 600 х г в течение 10 мин. На этом этапе ядра отделяются от мембранных обломков. Полученные бесцветные гранулы содержат изолированные ядра.
- Resuspend изолированных ядер в 500 МЛ PBS с 5% BSA. Держите подвеску ядер на льду для выполнения FACS после количественной оценки.
4. Визуализация морфологии ядер
- Подтвердите ядерную морфологию путем окрашивания Hoechst. Для этого удалите 100 мл одноядерной подвески в новой трубке с помощью наконечников с покрытием BSA. Чтобы окрашивать ядра, добавьте 0,1 л Хл Хёхста (1 мг/мл). Аккуратно вихрь трубки.
- Перенесите подвеску ядер на стеклянное нижнее блюдо для визуализации.
- Изображение ядер с помощью флуоресценции микроскоп с лазерной возбуждения настройки 405 нм (фиолетовый) длины волны.
5. ФАС на основе обогащения ядер
- Перед выполнением FACS, фильтровать ядра с помощью 40-м клеточного ситека в BSA покрытием трубки.
- Разбавить отфильтрованную подвеску, добавив PBS с 5% BSA до конечного объема 1000 мл.
- Этикетка два круглых нижней трубки FACS как "контроль" и "окрашенные". Трубка «управления» будет содержать не запятнанные ядра, в то время как «запятнанная» трубка будет иметь окрашенные ядра Hoechst.
- Передача 250 мл ядер подвески в "контроль" трубки с помощью BSA покрытием пипетки отзыв.
- Перенесите оставшийся 750 МЛ раствор в трубку FACS, помеченную как «запятнанная», и добавьте 1 мл красителя Hoechst, чтобы окрашивать ядра. Смешайте медленно вихрем.
- Загрузите неокрашенный образец управления в сортировочный элемент ячейки. Запись 5000 событий.
- Загрузите окрашенные образцы и запишите 5000 событий.
- Нарисуйте ворота FACS, что позволяет идентифицировать одиночные ядра. Ядра могут быть выбраны путем сравнения сигнала флуоресценции Hoechst между контролем и окрашенным образцом.
- Сортировать Hoechst-положительные ядра из витражей в новую 1,5 мл трубки, содержащей 50 мл PBS с 5% BSA.
ПРИМЕЧАНИЕ: Изолированные ядра могут быть собраны в желаемую среду в соответствии с требованиями приложения вниз по течению.
Representative Results
--Протокол, описанный выше, был использован для генерации одноямленной подвески ядра непосредственно из ткани мозга зебры. Изоляция обычно требует 20 минут и избежать использования моющего средства или пищеварительного фермента. Схема, подведомная к отдельным шагам протокола, приведена на рисунке 1,который может быть напечатан для использования для руководства.
Рисунок 1: Схема моющего средства без моющих средств спин-колонки на основе метода для изоляции ядер.
Графическое представление отдельных шагов, выполняемых при извлечении ядер из свежей ткани мозга зебры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Визуализация ядерной морфологии
Для качественного подтверждения ядерной морфологии изолированные ядра были запятнаны Хёхтом и визуализированы с помощью флуоресценции микроскопии. Ядра появились нетронутыми, круглые и хорошо отделены (Рисунок 2). Важно отметить, что ядерная агрегация, признак разрыва ядерной мембраны, отсутствовала.
Рисунок 2: Изоляция одного ядра от мозга зебры.
Флуоресценция микроскопии изображение Hoechst окрашенных ядер, демонстрирующих их нетронутой морфологии. Масштабная панель: 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
ФАС на основе обогащения нетронутых ядер
Обогащение изолированных ядер и удаление клеточного мусора осуществлялось путем цитометрии потока путем gating на наличие сигнала флуоресценции Hoechst. Сигнал Hoechst был обнаружен при возбуждении фиолетовым, 405 нм, лазером (Brilliant Violet 421 - BV421). Неокрашенные ядра отображаются фон флуоресценции(Рисунок 3A, Дополнительный рисунок 1A), в то время как окрашенные ядра выставлены сильный флуоресцентный сигнал (Рисунок 3B, Дополнительный рисунок 1B). Как показано на рисунке 3C, неокрашенные и Hoechst окрашенных ядер были хорошо разделены в фиолетовый канал.
Рисунок 3: Изолированные ядра отображают сильный и специфический флуоресцентный сигнал Hoechst в цитометрии потока.
Гистограмма участков для одиночных ядер подвески отображения распределения Hoechst окрашивания. Hoechst возбужденных фиолетовый, 405 нм, лазер (Бриллиант фиолетовый 421 - BV421). Неокрашенный образец (A) отображает сигнал в диапазоне 100-103,в то время как Хёхст окрашенные ядра (B) излучают сигнал в диапазоне 103-105. Наложение интенсивности флуоресценции, испускаемое неокрашенными (серыми) и окрашенными (синими) образцами(C)демонстрирует четкое разделение между двумя популяциями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительный рисунок 1: Стратегия цитометрии потока для изолированных ядер. Представительный поток участков для изолированных ядер подвески. Изолированные ядра были проанализированы с помощью передних рассеяния и фиолетового лазера BV421, который возбуждает Hoechst на 405 нм. Неокрашенный образец(A) отображается сигнал BV421 в диапазоне 100-103. Из 13130 событий 141 события были обнаружены как одиночные ядра на основе FSC-A (1,07% от общего числа), а 0 событий для неокрашенных ядер на основе сигнала BV421 (0% от общего числа). Окрашенные ядра Hoechst(B)отображаются BV421 сигнала в 103-105 диапазона. Из 50000 событий 2418 событий были обнаружены как одиночные ядра на основе FSC-A (4,84% от общего числа) и 2414 событий для хёхst-позитивных ядер на основе сигнала BV421 (4,83% от общего числа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Discussion
Профилирование транскриптома и эпигенома при одноклеточном разрешении произвело революцию в изучении биологических систем. Исследования по разрешению одной клетки для твердой ткани зависят от диссоциации органа в отдельные клетки или ядра. Диссоциация является разрушительной процедурой, которая может ввести технические артефакты, которые могут помешать разработке точного представления системы5,,6. Например, ферментатическая диссоциация может нанести вред клеткам со сложными морфологиями, такими как нейроны или подоциты, и может вызвать экспрессию гена реакции на стресс и тепло-шок7,,12. Кроме того, использование моющего средства во время диссоциации может разорвать ядерную мембрану и привести к агрегации23,,25. Таким образом, оптимизация диссоциации для получения одной клетки или ядер подвески самого высокого качества имеет первостепенное значение для успеха высокопроизводительных экспериментов профилирования.
Здесь мы демонстрируем метод изоляции моющих средств и без ферментов, который позволяет извлечь нетронутые ядра из мозга зебры менее чем за 20 минут. Протокол дает ядра с типичной морфологией и надежной целостностью(рисунок 2). Из одного мозга зебры весом 6 мг, протокол дает в общей сложности 60000 ядер определяется гемоцитометра кол. Изолированные ядра могут быть использованы для нескольких приложений вниз по течению, в том числе snRNA-seq, ATAC-seq и иммуносхемы. Изолированные ядра могут включать перекрестное загрязнение от цитоплазматических фракций, особенно от компонентов эндоплазмического ретикулума и митохондрий. Для экспериментов по профилированию с высокой пропускной способностью настоятельно рекомендуется расчистка клеточного мусора, особенно митохондрий. Цитометрия потока(рисунок 3) обеспечивает жизнеспособный вариант для очищения ядер. Кроме того, градиент сахарозы может также использоваться для удаления мусора.
Протокол был протестирован на щитовидной железе мыши (данные не показаны) и дает результаты, аналогичные ткани мозга зебры. В целом, протокол обеспечивает надежный, воспроизводимый и универсальный метод подготовки однофочную подвеску, помогая упростить логистику для экспериментов по профилированию высокой пропускной способности.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов. Оплата за то, чтобы статья была открыта доступ был сделан Invent Biotechnologies Inc., США.
Acknowledgments
Мы благодарим членов лаборатории доктора Сабины Костаглиоли и Сингха за комментарии по поводу рукописи. Эта работа была поддержана Фондом наукоемки-FNRS при Гранте No 34772792 - MISU к S.P.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine serum albumin (BSA) | Carl Roth | 90604-29-8 | Albumin fraction V |
| Cell sorter | BD Biosciences | FACSAria III | |
| Centrifuge | Sartorius | A-14C | |
| Eppendorf tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 22363204 | |
| Falcon (15 mL) | Corning | 352096 | Polypropylene centrifuge tubes |
| Falcon (5 mL ) | Corning | 352052 | Polystyrene round bottom test tubes |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Flowmi cell strainer (40 μm) | Sigma | BAH136800040 | |
| Fluorescence microscope | Leica | DMI6000 B | |
| Glass bottle (250 mL) | VWR | 215-1593 | |
| Glass bottomed dish | World Precision Instruments | FD3510-100 | Fluorodish 35 mm |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 612-1701 | |
| Glass pipette socket | Carl Roth | 388.1 | Pipetting aid pi-pump 2500 |
| Hoechst staining dye solution | Abcam | ab228551 | Hoechst 33342 |
| Minute Detergent-Free Nuclei Isolation Kit | Invent Biotechnologies | NI-024 | |
| PBS (10X) | ThermoFisher | 70011069 | |
| Petri dish (30 mm) | FisherScientific | 11333704 | Pyrex |
| Petri dish (90 mm) | Corning | 758-10178-CS | Gosselin |
| Pipette tips | VWR | 89079 | 10 μL, 200 μL, 1000 μL |
| Pipettes | Gilson | F167380 | Pipetman |
| Razor blade | Swann-Morton | 7981809 | |
| Tricaine methane sulfonate | Sigma | E10521 | |
| Vortex machine | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex-Genie 2 |
References
- Ebrahimi Dastgurdi, M., Ejeian, F., Nematollahi, M., Motaghi, A., Nasr-Esfahani, M. H. Comparison of two digestion strategies on characteristics and differentiation potential of human dental pulp stem cells. Archives of Oral Biology. 93, 74-79 (2018).
- Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. Dispase, a neutral protease from Bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase. Journal of Investigative Dermatology. 93 (2), 287-290 (1989).
- Khan, M. R., Chandrashekran, A., Smith, R. K. W., Dudhia, J. Immunophenotypic characterization of ovine mesenchymal stem cells. Cytometry Part A. 89 (5), 443-450 (2016).
- Cavanagh, T. J., Lakey, J. R. T., Wright, M. J., Fetterhoff, T., Wile, K. Crude collagenase loses islet-isolating efficacy regardless of storage conditions. Transplantation Proceedings. 29 (4), 1942-1944 (1997).
- Massoni-Badosa, R., et al. Sampling artifacts in single-cell genomics cohort studies. bioRxiv. , (2020).
- Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- O'Flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumour tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Bioarxiv. 683227, (2019).
- Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. Plos One. 13 (12), 0209648 (2018).
- Lake, B. B., et al. A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys. Nature Communications. 10 (1), (2019).
- Rajbhandari, P., et al. Single cell analysis reveals immune cell-adipocyte crosstalk regulating the transcription of thermogenic adipocytes. eLife. 8, (2019).
- Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24 (10), 2746-2756 (2018).
- Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: Rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis. Journal of the American Society of Nephrology. 30 (1), 23-32 (2019).
- Lacar, B., et al. Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation. Nature Communications. 7 (1), 1-13 (2016).
- Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353 (6302), 925-928 (2016).
- Thrupp, N., et al. Single nucleus sequencing fails to detect microglial activation in human tissue. bioRxiv. , (2020).
- Selewa, A., et al. Systematic Comparison of High-throughput Single-Cell and Single-Nucleus Transcriptomes during Cardiomyocyte Differentiation. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
- Lake, B. B., et al. A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA. Scientific Reports. 7 (1), 1-8 (2017).
- Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. Isolation of neuronal chromatin from brain tissue. BMC Neuroscience. 9, 42 (2008).
- Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).
- Birnie, G. D. Isolation of Nuclei from Animal Cells in Culture. Methods in Cell Biology. 17, 13-26 (1978).
- Dounce, A. L., Witter, R. F., Monty, K. J., Pate, S., Cottone, M. A. A method for isolating intact mitochondria and nuclei from the same homogenate, and the influence of mitochondrial destruction on the properties of cell nuclei. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 1 (2), 139-153 (1955).
- Hymer, W. C., Kuff, E. L. Isolation of Nuclei From Mammalian Tissues Through the Use of Triton X-100. The journal of Histochemistry and Cytochemistry. 12, 359-363 (1964).
- Johnson, M. Detergents: Triton X-100, Tween-20, and More. Materials and Methods. 3, (2013).
- Sikorskaite, S., Rajamäki, M. L., Baniulis, D., Stanys, V., Valkonen, J. P. T. Protocol: Optimised methodology for isolation of nuclei from leaves of species in the Solanaceae and Rosaceae families. Plant Methods. 9 (1), 31 (2013).
- Graham, J., Rickwood, D. Subcellular fractionation: a practical approach. , IRL Press. (1997).
