Summary
Enda atomkärna isolering bygger på dissociation och tvättmedel-baserade permeabilisering av cellmembranet, steg som behöver optimering och är benägna att införa tekniska artefakter. Vi visar ett tvättmedel och enzym-fria protokoll för snabb isolering av intakt kärnor direkt från hela vävnaden, vilket ger kärnor lämpliga för single-nucleus RNA-seq (snRNA-Seq) eller ATAC-seq.
Abstract
Hög genomströmning transkriptom och epigenom profilering kräver beredning av en enda cell eller enstaka kärnor suspension. Beredning av suspensionen med intakt cell eller kärnor innebär dissociation och permeabilisering, steg som kan införa oönskat buller och oönskade skador. Särskilt, vissa celltyper såsom nervceller är utmanande att separera till enskilda celler. Dessutom, permeabilization av det cellulära membranet för att frigöra kärnor kräver optimering av trial-and-error, vilket kan vara tidskrävande, arbetsintensiva och ekonomiskt nonviable. För att öka robustheten och reproducerbarheten hos provberedning för sekvensering med hög genomströmning beskriver vi en snabb enzym- och tvättmedelsfri pelarbaserad kärnisoleringsmetod. Protokollet möjliggör effektiv isolering av kärnor från hela zebrafiskhjärna inom 20 minuter. De isolerade kärnorna visar intakt nukleär morfologi och låg benägenhet att aggregera. Vidare, flöde cytometri tillåter kärnor anrikning och clearance av cellulära skräp för nedströms tillämpning. Protokollet, som bör fungera på mjuka vävnader och odlade celler, ger en enkel och tillgänglig metod för provberedning som kan användas för hög genomströmning profilering, förenkla de steg som krävs för framgångsrika single-kärnor RNA-seq och ATAC-seq experiment.
Introduction
Single-cell RNA-seq (scRNA-Seq) och ATAC-seq är mångsidiga verktyg för att studera komplexa biologiska system med encellig upplösning. De används allmänt för att definiera cell subtyper och tillstånd, gennätverk och att bedöma cellulär heterogenitet. En förutsättning för att utföra scRNA-seq är beredningen av en enda cell suspension genom vävnad dissociation. På grund av variationen i den extracellulära matrissammansättningen och mekaniska egenskaper kräver enskilda vävnader optimering av dissociationsprotokollet för beredning av single cell suspension.
Dissociation av vävnader till enstaka celler innebär vanligtvis behandling med matsmältningsenzymer, inklusive kollagen, dispase eller trypsin, vid 37 °C1,2,3,4. Eftersom transkriptionsmaskiner förblir aktiva vid 37 °C kan enzymatisk dissociation införa mRNA-uttrycksartefakter och buller5,6. Framför allt kan långvarig inkubation framkalla stressresponsiva gener och värmechocksrespons på ett ojämnt sätt – vilket leder till tekniska variationer i experimentet7.
En annan nackdel med att generera en enda cell suspension är svårigheten att få livskraftiga och intakta cell-typer med komplexa morfologier. I synnerhet är nervceller, adipocyter och podocyter utmanande att isolera8,,9,,10,11. Till exempel, Wu och kollegor visade avsaknaden av glomerular podocytes i scRNA profiler från en vuxen mus njure12. Liknande icke-optimala observationer har gjorts när det gäller återvinning av sammankopplade nervceller från hjärnvävnad8,,13,14. Sammanfattningsvis kan dissociation protokoll införa upptäckt bias mot lättare att separera cell-typer, vilket leder till en förvrängning av cellulära arkitektur av organet.
För att övervinna det tekniska brus och bias som infördes under provberedning i scRNA-Seq., isolering och profilering kärnan ger ett attraktivt alternativ. Eftersom nukleär morfologi är liknande mellan olika celltyper, isolering av kärnorna kringgår frågan om att isolera intakta och livskraftiga celler med komplexa morfologier. Till exempel visade Wu och kollegor framgångsrik profilering av glomerular podocytes med enkärnan RNA-Seq. (snRNA-Seq.) av en vuxen mus njure, som saknades från scRNA-Seq12. Spännande, jämförande studier mellan encelliga och enstaka kärnan RNA-seq har föreslagit en minskning av induktion av stress och värme-chock respons gener med snRNA-Seq12. Studierna tyder vidare på en hög korrelation mellan de gener som detekteras av de två metoderna. Emellertid, en nyligen genomförd studie på mänskliga mikroglia misslyckades med att upptäcka genetisk aktivering vid Alzheimers sjukdom15. Således i vissa sammanhang är snRNA-Seq ett lämpligt alternativ för scRNA-Seq16,17. Dessutom kan den nukleära isoleringen användas för encelliga ATAC-Seq., som ger information om regionerna av öppen kromatin inom enskilda celler.
Protokollet för kärnisolering omfattar tre huvudsteg: i) tvättmedelsbaserad lys av cellmembranet för att frigöra kärnan; ii) vävnadshomogenisering med hjälp av en Dounce-homogenisator. och iii) anrikning av kärnor och avlägsnande av cellskräp med hjälp av gradientcentrifugering eller flödescytometri18,,19,,20,,21,22. Bland detta beror de två första stegen på vävnadstypen och måste empiriskt optimeras. Milt rengöringsmedel leder till partiell bristning av cellmembran och ineffektiv hämtning av kärnor från vävnaden23. Å andra sidan leder hög tvättmedel och hård homogenisering till bristning av det nukleära membranet och deras förlust24,25. Brusten kärnor tenderar ytterligare att klumpa ihop sig och bilda aggregat, som om inte tas bort kan leda till artefakter i nedströms profilering experiment.
För att kringgå de frågor som rör tvättmedel optimering för kärnor isolering, introducerar vi ett protokoll för att isolera intakta kärnor från färska prover med hjälp av en detergent-free och spin-kolumn-baserad metod. Protokollet ger kärnor från hela organet inom 20 minuter, vilket begränsar induktion av artifactual transkription. De isolerade kärnorna kan berikas med FACS för single-nuclei RNA-Seq. och ATAC-seq, vilket ger en enkel och universell metod som möjliggör robust och reproducerbar höggenomströmningsprofilering.
Protocol
Alla förfaranden som presenteras nedan utfördes i enlighet med institutionella (Université Libre de Bruxelles (ULB)) och nationella riktlinjer och förordningar om etiskt och djurskydd, som godkändes av den etiska kommittén för djurskydd (CEBEA) från Université Libre de Bruxelles (protokollen 578N-579N).
1. Beredning före dissekering av vävnader
- Förbered 0,2% Tricaine lösning i PBS för avlivning av zebrafisk. Kyl lösningen på is.
- Förbered en 30 mm petriskål för malning av vävnaden.
- Förbered iskall 1x PBS (10 ml per vävnadsprov).
- Kyl centrifugen till 4 °C.
- För isolering av kärnor, använd en tvättmedelsfri isoleringssats för kärnor (Tabell över material).
- Innan protokollet påbörjas ska bufferten A och B före kylningen som finns i satsen placeras på is i minst 30 minuter före isolering av kärnor.
- För hantering av isolerade kärnor, belägga plastreagenser som rör och pipettspetsar med 5% BSA-lösning. För detta, förbered lösningen genom att lösa upp 2 g BSA i 40 ml PBS. Beläggning av plastartiklar med 5% BSA minskar kärnorna fastnar på plast. Detta steg förbättrar återvinningen av isolerade kärnor.
- Täck pipettspetsarna genom pipettering 5% BSA-lösning 2-3 gånger. Lufttorka tipsen i 2 timmar. Förbered 10 plasttips per prov.
- Täck rören för insamling av kärnor genom att fylla dem med 5% BSA. Vänd rören 3 gånger för att säkerställa en effektiv beläggning. Ta bort lösningen och lufttorka rören upp och ner på ett rent mjukpapper i 2 timmar. Per prov, coat ett uppsamlingsrör som finns i satsen. Förbered dessutom belagda 1,5 ml-rör för kärnors uppsamling efter FACS.
OBS: Glasspetsar rekommenderas starkt alternativ till plastpipetsarna för att minimera fastnar.
2. Dissekering av zebrafisk hjärna
- För att avliva zebrafisken, förbered en 90 mm petriskål med 25 ml iskall Tricaine-lösning.
- Ta försiktigt zebrafisken från tanken med hjälp av ett fiskenät och placera den i petriskålen.
- Avliva fisken genom att lämna den i Tricaine i 5 min.
- Halshugga djuret med ett vasst rakblad.
- Med hjälp av pincett, försiktigt bryta upp skallen och ta bort mjuka vävnader, hud och ben från ventrala och dorsala sidan av skallen.
- Försiktigt, överför hjärnan till en färsk 30 mm maträtt som innehåller iskall PBS.
- Finhacka hjärnan i små bitar med ett rakblad för att underlätta belastningen av provet på spinnkolumnen.
3. Enda isolering av kärnor
- Överför den malda vävnaden till filterpatronen som finns i kärnisoleringssatsen och tillsätt 200 μl kallbuffert A för att sensibilisera vävnaden. Slipa vävnaden med hjälp av plaststången som tillhandahålls av satsen i 2 min.
- Tillsätt 300 μL kallbuffert A och inkubera filterpatronen på is med lock öppet i 10 min.
- Täck patronen och återsuspend vävnaden genom att invertera röret 5 gånger.
- Centrifug på 16.000 x g för 30 s. I detta steg, celler brusten när de passerar genom filtret och hög hastighet centrifugalkraft appliceras. Flödet genom innehåller intakta kärnor, som pellet längst ner i röret.
- Kassera filtret och resuspend pelleten genom att virvla kraftigt i 10 s.
- Pellet kärnorna genom centrifuging lösningen på 500 x g i 3 min. Kassera supernatanten försiktigt eftersom kärnkulan pelleten är färglös.
- Resuspend pelleten i 0,8 ml kallbuffert B och centrifug på 600 x g i 10 min. I detta steg är kärnor separerade från membranskräp. Den färglösa pelleten som erhålls innehåller isolerade kärnor.
- Resuspend den isolerade kärnorna i 500 μL PBS med 5% BSA. Håll kärnfjädringen på is för att utföra FACS efter kvantifieringen.
4. Visualisering av kärnormorfologi
- Bekräfta kärnmorfologi genom Hoechst färgning. För detta, ta bort 100 μL enstaka kärnfjädring i ett nytt rör med BSA-belagda spetsar. För att färga kärnorna, tillsätt 0,1 μl Hoechst (1 mg/ml). Vänd försiktigt röret.
- Överför kärnfjädringen till glasbottensskålen för bildbehandling.
- Bild kärnorna med hjälp av en fluorescens mikroskop med laser excitation inställningar ~ 405 nm (Violet) våglängd.
5. FACS-baserad anrikning av kärnor
- Innan du utför FACS, filtrera kärnorna med en 40 μm cellsil i BSA-belagt rör.
- Späd den filtrerade suspensionen genom att tillsätta PBS med 5% BSA till en slutlig volym på 1 000 μL.
- Märk två runda botten FACS rör som "kontroll" och "färgade". Den "kontroll" röret kommer att innehålla un-färgade kärnor, medan "färgade" röret kommer att ha Hoechst färgade kärnor.
- Överför 250 μL av kärnfjädringen till "kontrollröret" med BSA-belagt pipettspets.
- Överför den återstående 750 μL-lösningen till FACS-röret märkt som "färgat" och tillsätt 1 μl Hoechst-färgämne för att färga kärnorna. Blanda genom långsam virvel.
- Läs in det ofläckade kontrollprovet till cellsorteringen. Spela in 5000 händelser.
- Ladda de färgade proverna och spela in 5000 händelser.
- Rita FACS-grindar som gör det möjligt att identifiera enstaka kärnor. Kärnor kan väljas genom att jämföra Hoechst fluorescenssignalen mellan kontroll och färgat prov.
- Sortera Hoechst-positiva kärnor från det färgade röret till nytt 1,5 ml-rör som innehåller 50 μl PBS med 5% BSA.
OBS: Isolerade kärnor kan samlas in i ett önskat medium enligt kraven i nedströmsapplikationen.
Representative Results
--Det protokoll som beskrivs ovan användes för att generera enstaka kärna suspension direkt från zebrafish hjärnvävnad. Isoleringen kräver vanligtvis 20 minuter och undvika användning av tvättmedel eller matsmältningsenzym. En schematisk sammanfattning av de enskilda stegen i protokollet finns i figur 1, som kan skrivas ut för att användas för vägledning.
Figur 1: Schematisk av tvättmedelsfri spin-kolumnbaserad metod för isolering av kärnor.
Grafisk representation av de enskilda steg som utförs under utvinning av kärnor från färska zebrafish hjärnvävnad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Visualisering av kärnmorfologi
För kvalitativ bekräftelse av kärn- morfologi, fläckades de isolerade kärnorna med Hoechst och visualized med hjälp av fluorescencemikroskopi. Kärnorna verkade intakta, runda och väl åtskilda (figur 2). Viktigt, nukleär aggregering, ett tecken på nukleära membran bristning, var frånvarande.
Figur 2: Enstaka kärnor isolering från zebrafisk hjärnan.
Fluorescensmikroskopi bild av Hoechst-färgade kärnor visar deras intaktmorfologi. Skala bar: 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
FACS-baserad anrikning av intakta kärnor
Anrikning av isolerade kärnor och avlägsnande av cellulära skräp utfördes genom flöde cytometri genom gating på förekomsten av en Hoechst fluorescens signal. Hoechst signalen upptäcktes vid excitation med violett, 405 nm, laser (Brilliant Violet 421 - BV421). Ofläckade kärnor visade bakgrundsfluorescens (figur 3A, Tilläggsbild 1A),medan färgade kärnor uppvisade stark fluorescerande signal (figur 3B, Tilläggsbild 1B). Som illustreras i figur 3C, den ofläckade och Hoechst färgade kärnor var väl segregerade i den violetta kanalen.
Figur 3: Isolerade kärnor visar stark och specifik Hoechst fluorescerande signal i flödescytometri.
Histogram tomter för enstaka kärnor suspension visar fördelningen av Hoechst färgning. Hoechst är upphetsad av violett, 405 nm, laser (Brilliant Violet 421 – BV421). Det ofläckade provet (A) visar signalen i intervallet 100-103, medan Hoechst färgade kärnor (B) avger signal i intervallet 10-1035. Ett överlägg av fluorescensintensitet som avges av ofläckade (grå) och färgade (blå) prover (C) visar en tydlig åtskillnad mellan de två populationerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tilläggs figur 1: Flödescytometri gating strategi för isolerade kärnor. Representativa flödesritplaner för isolerad kärnfjädring. Isolerade kärnor analyserades med hjälp av framåt scatter och Violet laser BV421 som retar Hoechst på 405 nm. Det ofläckade provet (A) visade BV421-signalen i intervallet 100-103. Av 13130 händelser upptäcktes 141 händelser som enstaka kärnor baserade på FSC-A (1,07% av det totala antalet) och 0 händelser för ofläckade kärnor baserat på BV421-signal (0% av det totala). Hoechst-färgade kärnor (B) visade BV421-signalen i intervallet 103-105. Av 50000 händelser upptäcktes 2418 händelser som enstaka kärnor baserat på FSC-A (4,84% av det totala antalet) och 2414 händelser för Hoechst-positiva kärnor baserade på BV421-signal (4,83% av det totala). Klicka här för att ladda ner denna siffra.
Discussion
Profilering av transkriptom och epigenom vid en encellig upplösning har revolutionerat studiet av biologiska system. Studier vid upplösningen av en enda cell för en fast vävnad beror på dissociation av organet i enskilda celler eller kärnor. Dissociation är ett destruktivt förfarande som kan införa tekniska artefakter, vilket kan förhindra utveckling av en korrekt representation av systemet5,6. Till exempel, enzymatisk dissociation kan skada celler med komplexa morfologier, såsom nervceller eller podocyter, och kan framkalla uttryck för stress och värme-chock respons gener7,12. Dessutom kan användning av tvättmedel under dissociation brista kärnmembranet och leda till aggregering23,25. Således, optimera dissociation för att få en enda cell eller kärnor suspension av högsta kvalitet är avgörande för framgången för hög genomströmning profilering experiment.
Här demonstrerar vi en tvättmedels- och enzymfri kärnisoleringsmetod som möjliggör extraktion av intakta kärnor från zebrafiskhjärna på mindre än 20 minuter. Protokollet ger kärnor med typisk morfologi och robust integritet (figur 2). Från en enda zebrafisk hjärna väger 6 mg, protokollet ger totalt 60.000 kärnor bestäms av en hemocytometer räkna. De isolerade kärnorna kan användas för flera nedströmsapplikationer, inklusive snRNA-seq, ATAC-seq och immunostaining. De isolerade kärnorna kan inkludera korskontaminering från cytoplasmatiska fraktioner, särskilt från komponenter av endoplasmatiska reticulum och mitokondrierna. För hög genomströmning profilering experiment, clearance av cellulära skräp, särskilt mitokondrierna, rekommenderas starkt. Flödescytometri (figur 3) ger ett lönsamt alternativ för rening av kärnor. Alternativt kan sackaros gradienten också användas för avlägsnande av skräp.
Protokollet har testats på mus sköldkörtel (data visas inte) och ger resultat som liknar zebrafish hjärnvävnad. Sammantaget ger protokollet en robust, reproducerbar och universell metod för förberedelse av single nucleus suspension, vilket hjälper till att förenkla logistiken för hög genomströmningsprofileringsexperiment.
Disclosures
Författarna har ingen intressekonflikt. Betalningen för att göra artikeln öppen tillgång gjordes av Invent Biotechnologies Inc., USA.
Acknowledgments
Vi tackar medlemmar av Dr Sabine Costagliola och Singh lab för kommentarer på manuskriptet. Detta arbete stöddes av Fonds de la Recherche Scientifique-FNRS under Grant nummer 34772792 - MISU till S.P.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine serum albumin (BSA) | Carl Roth | 90604-29-8 | Albumin fraction V |
| Cell sorter | BD Biosciences | FACSAria III | |
| Centrifuge | Sartorius | A-14C | |
| Eppendorf tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 22363204 | |
| Falcon (15 mL) | Corning | 352096 | Polypropylene centrifuge tubes |
| Falcon (5 mL ) | Corning | 352052 | Polystyrene round bottom test tubes |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Flowmi cell strainer (40 μm) | Sigma | BAH136800040 | |
| Fluorescence microscope | Leica | DMI6000 B | |
| Glass bottle (250 mL) | VWR | 215-1593 | |
| Glass bottomed dish | World Precision Instruments | FD3510-100 | Fluorodish 35 mm |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 612-1701 | |
| Glass pipette socket | Carl Roth | 388.1 | Pipetting aid pi-pump 2500 |
| Hoechst staining dye solution | Abcam | ab228551 | Hoechst 33342 |
| Minute Detergent-Free Nuclei Isolation Kit | Invent Biotechnologies | NI-024 | |
| PBS (10X) | ThermoFisher | 70011069 | |
| Petri dish (30 mm) | FisherScientific | 11333704 | Pyrex |
| Petri dish (90 mm) | Corning | 758-10178-CS | Gosselin |
| Pipette tips | VWR | 89079 | 10 μL, 200 μL, 1000 μL |
| Pipettes | Gilson | F167380 | Pipetman |
| Razor blade | Swann-Morton | 7981809 | |
| Tricaine methane sulfonate | Sigma | E10521 | |
| Vortex machine | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex-Genie 2 |
References
- Ebrahimi Dastgurdi, M., Ejeian, F., Nematollahi, M., Motaghi, A., Nasr-Esfahani, M. H. Comparison of two digestion strategies on characteristics and differentiation potential of human dental pulp stem cells. Archives of Oral Biology. 93, 74-79 (2018).
- Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. Dispase, a neutral protease from Bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase. Journal of Investigative Dermatology. 93 (2), 287-290 (1989).
- Khan, M. R., Chandrashekran, A., Smith, R. K. W., Dudhia, J. Immunophenotypic characterization of ovine mesenchymal stem cells. Cytometry Part A. 89 (5), 443-450 (2016).
- Cavanagh, T. J., Lakey, J. R. T., Wright, M. J., Fetterhoff, T., Wile, K. Crude collagenase loses islet-isolating efficacy regardless of storage conditions. Transplantation Proceedings. 29 (4), 1942-1944 (1997).
- Massoni-Badosa, R., et al. Sampling artifacts in single-cell genomics cohort studies. bioRxiv. , (2020).
- Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- O'Flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumour tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Bioarxiv. 683227, (2019).
- Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. Plos One. 13 (12), 0209648 (2018).
- Lake, B. B., et al. A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys. Nature Communications. 10 (1), (2019).
- Rajbhandari, P., et al. Single cell analysis reveals immune cell-adipocyte crosstalk regulating the transcription of thermogenic adipocytes. eLife. 8, (2019).
- Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24 (10), 2746-2756 (2018).
- Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: Rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis. Journal of the American Society of Nephrology. 30 (1), 23-32 (2019).
- Lacar, B., et al. Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation. Nature Communications. 7 (1), 1-13 (2016).
- Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353 (6302), 925-928 (2016).
- Thrupp, N., et al. Single nucleus sequencing fails to detect microglial activation in human tissue. bioRxiv. , (2020).
- Selewa, A., et al. Systematic Comparison of High-throughput Single-Cell and Single-Nucleus Transcriptomes during Cardiomyocyte Differentiation. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
- Lake, B. B., et al. A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA. Scientific Reports. 7 (1), 1-8 (2017).
- Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. Isolation of neuronal chromatin from brain tissue. BMC Neuroscience. 9, 42 (2008).
- Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).
- Birnie, G. D. Isolation of Nuclei from Animal Cells in Culture. Methods in Cell Biology. 17, 13-26 (1978).
- Dounce, A. L., Witter, R. F., Monty, K. J., Pate, S., Cottone, M. A. A method for isolating intact mitochondria and nuclei from the same homogenate, and the influence of mitochondrial destruction on the properties of cell nuclei. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 1 (2), 139-153 (1955).
- Hymer, W. C., Kuff, E. L. Isolation of Nuclei From Mammalian Tissues Through the Use of Triton X-100. The journal of Histochemistry and Cytochemistry. 12, 359-363 (1964).
- Johnson, M. Detergents: Triton X-100, Tween-20, and More. Materials and Methods. 3, (2013).
- Sikorskaite, S., Rajamäki, M. L., Baniulis, D., Stanys, V., Valkonen, J. P. T. Protocol: Optimised methodology for isolation of nuclei from leaves of species in the Solanaceae and Rosaceae families. Plant Methods. 9 (1), 31 (2013).
- Graham, J., Rickwood, D. Subcellular fractionation: a practical approach. , IRL Press. (1997).
