Summary
تعتمد العزلة أحادية النوى على التحلل والتحلل القائم على المنظفات لغشاء الخلية ، وهي خطوات تحتاج إلى التحسين وعرضة لإدخال التحف الفنية. نحن نبرهن على بروتوكول المنظفات والخالية من الإنزيمات من أجل العزل السريع للنيات سليمة مباشرة من الأنسجة كلها، مما يؤدي إلى نواة مناسبة للنواة واحدة RNA-seq (snRNA-SEQ) أو ATAC-seq.
Abstract
يتطلب النسخ الصوتي عالي الإنتاجية والتنميط epigenome إعداد خلية واحدة أو تعليق نوات واحدة. إعداد التعليق مع خلية سليمة أو نوى ينطوي على التفكك و Permeabilization، والخطوات التي يمكن أن تؤدي إلى الضوضاء غير المرغوب فيها والضرر غير المرغوب فيه. خاصة, بعض أنواع الخلايا مثل الخلايا العصبية هي صعبة للتفكك في الخلايا الفردية. بالإضافة إلى ذلك، يتطلب تحقيق الغشاء الخلوي لإطلاق نوى التحسين من خلال التجربة والخطأ، والتي يمكن أن تكون مضيعة للوقت، والعمالة المكثفة وغير قابلة للحياة ماليا. لتعزيز قوة و قابلية إعادة إنتاج إعداد العينة لتسلسل عالي الإنتاجية، فإننا نصف أسلوب عزل سريع للأنزيم والمنظفات القائمة على الأعمدة. البروتوكول تمكن من عزل فعال للنيات من الدماغ حمار وحشي كامل في غضون 20 دقيقة. تعرض النوى المعزولة مورفولوجيا نووية سليمة وميلاً منخفضاً إلى التراكم. وعلاوة على ذلك، يسمح تدفق الخلايا إثراء الخلايا وإزالة الحطام الخلوية لتطبيق المصب. ويوفر البروتوكول، الذي ينبغي أن يعمل على الأنسجة الرخوة والخلايا المستزرعة، طريقة بسيطة وسهلة الاستخدام لإعداد العينات يمكن استخدامها في تحديد سمات عالية الإنتاجية، وتبسيط الخطوات المطلوبة لنجاح التجارب أحادية النوى RNA-seq و ATAC-seq.
Introduction
رنا- سكين أحادي الخلية (SCRNA-SEQ) و ATAC-seq هي أدوات متعددة الاستخدامات لدراسة الأنظمة البيولوجية المعقدة بدقة خلية واحدة. وتستخدم على نطاق واسع لتحديد الأنواع الفرعية للخلية والدول، والشبكات الجينية، وتقييم التغاير الخلوي. شرط أساسي لأداء scRNA-seq هو إعداد تعليق خلية واحدة عن طريق تفكك الأنسجة. بسبب الاختلاف في تكوين المصفوفة خارج الخلية والخواص الميكانيكية ، تتطلب الأنسجة الفردية تحسين بروتوكول الانفصام لإعداد تعليق الخلية المفردة.
تفكك الأنسجة في خلايا مفردة عادة ما ينطوي على العلاج مع الإنزيمات الهضمية، بما في ذلك الكولاجين، dispase أو التربسين، في 37 درجة مئوية1،,2،,3،,4. كما آلات النسخ لا تزال نشطة في 37 درجة مئوية، يمكن للانفصام الأنزيمي إدخال التحف التعبير مرنا والضوضاء5،6. وتجدر الإشارة إلى أن الحضانة المطولة يمكن أن تحفز الجينات استجابة الإجهاد والاستجابة لصدمة الحرارة بطريقة غير موحدة – مما يؤدي إلى التقلبات التقنية في التجربة7.
عيب آخر من توليد تعليق خلية واحدة هو صعوبة في الحصول على خلايا قابلة للحياة وسليمة أنواع مع morphologies معقدة. على وجه الخصوص، والخلايا العصبية، adipocytes وpodocytes تشكل تحديا لعزل8،9،10،11. على سبيل المثال، أظهر وو وزملاؤه غياب podocytes الكبيبية في ملفات تعريف scRNA من كلية فأرة بالغة12. وقد أجريت ملاحظات غير الأمثل مماثلة فيما يتعلق باستعادة الخلايا العصبية المترابطة من أنسجة المخ8,13,14. باختصار ، يمكن أن تؤدي بروتوكولات الانفصام إلى إدخال التحيز للكشف عن أسهل في فصل أنواع الخلايا ، مما يؤدي إلى تحريف البنية الخلوية للجهاز.
للتغلب على الضوضاء التقنية والتحيز المقدمة خلال إعداد العينة في SCRNA-Seq.، يوفر عزل وتوصيف النواة بديلا جذابا. وبما أن المورفولوجيا النووية متشابهة بين أنواع الخلايا المختلفة، فإن عزل النواة يتحايل على مسألة عزل الخلايا السليمة والقابلة للحياة مع أنواع المورفورولوجيا المعقدة. على سبيل المثال، أظهر وو وزملاؤه التنميط الناجح للكبوسيات الكبيبية مع نواة واحدة RNA-Seq. (snRNA-Seq.) من كلية فأرة بالغة، والتي كانت مفقودة من scRNA-SEQ12. ومن المثير للاهتمام أن الدراسات المقارنة بين الخلية الواحدة والنواة الواحدة RNA-seq قد اقترحت انخفاضًا في تحريض جينات الاستجابة للإجهاد والصدمة الحرارية مع snRNA-SEQ12. وتشير الدراسات كذلك إلى وجود ارتباط كبير بين الجينات التي تم اكتشافها من خلال الطريقتين. ومع ذلك، فشلت دراسة حديثة على ميكروجليا الإنسان للكشف عن التنشيط الوراثي في مرض الزهايمر15. وهكذا في سياقات معينة، snRNA-Seq هو بديل مناسب لSnRNA-SEQ16،17. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام العزلة النووية لـ ATAC-Seq أحادي الخلية، مما يوفر معلومات عن مناطق الكروماتين المفتوح داخل الخلايا الفردية.
بروتوكول عزل النوى ينطوي على ثلاث خطوات رئيسية: 1) التحلل القائم على المنظفات من غشاء الخلية لإطلاق النواة; 2) تجانس الأنسجة باستخدام التجانس Dounce؛ و3) إثراء النوى وإزالة حطام الخلية باستخدام الطرد المركزي التدرج أو تدفق18،19،20،21،22. من بين هذا, أول خطوتين تعتمد على نوع الأنسجة وتحتاج إلى أن تكون الأمثل تجريبيا. المنظفات الخفيفة يؤدي إلى تمزق جزئي في غشاء الخلية واسترجاع غير فعال من النوى من الأنسجة23. من ناحية أخرى ، وارتفاع مستوى المنظفات والتجانس القاسي يؤدي إلى تمزق الغشاء النووي وفقدانها24،25. تمزق النوى تميل كذلك إلى تكتل معا وتشكيل المجاميع، والتي إذا لم تتم إزالتها يمكن أن يؤدي إلى القطع الأثرية في تجربة التنميط المصب.
للتحايل على القضايا المتعلقة بتحسين المنظفات لعزل النوى ، نقدم بروتوكولًا لعزل النوى السليمة عن العينات الطازجة باستخدام طريقة خالية من المنظفات والقائمة على العمود الدوار. البروتوكول تسفر عن نواة من الجهاز كله في غضون 20 دقيقة ، والحد من تحريض النسخ artifactual. ويمكن إثراء النوى المعزولة باستخدام FACS للنيوية الواحدة RNA-SEQ و ATAC-seq، مما يوفر طريقة بسيطة وعالمية تمكن من التنميط القوي والقابل للاستنساخ عالي الإنتاجية.
Protocol
11- وقد تم تنفيذ جميع الإجراءات الواردة أدناه وفقاً للمؤسسات (Université Libre de Bruxelles )ULB() والمبادئ التوجيهية والتنظيمات الوطنية للأخلاق ورعاية الحيوان، والتي وافقت عليها اللجنة الأخلاقية لرعاية الحيوان (CEBEA) من جامعة ليبر دو بروكسل (البروتوكولات 578N-579N).
1. التحضير قبل تشريح الأنسجة
- إعداد 0.2٪ حل Tricaine في برنامج تلفزيوني للقتل الرحيم الحمار الوحشي. هدئ من قشعريرة الحل على الجليد.
- إعداد طبق بيتري 30 ملم ل mincing الأنسجة.
- إعداد الجليد البارد 1X PBS (10 مل لكل عينة الأنسجة).
- تبريد الطرد المركزي إلى 4 درجة مئوية.
- لعزل نوى، استخدام طقم العزل النيوكلي خالية من المنظفات (جدول المواد).
- قبل البدء في البروتوكول، قبل البرد العازلة A و B المقدمة في مجموعة من خلال وضعها على الجليد لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل عزل النوى.
- للتعامل مع نوى معزولة، معطف الكواشف البلاستيكية مثل الأنابيب ونصائح ماصة مع 5٪ حل BSA. لهذا، إعداد الحل عن طريق حل 2 غرام من BSA في 40 مل من برنامج تلفزيوني. طلاء المواد البلاستيكية مع 5٪ BSA يقلل من النوى التمسك البلاستيك. هذه الخطوة يعزز الانتعاش من النوى المعزولة.
- معطف نصائح الماصات عن طريق pipetting 5٪ BSA الحل 2-3 مرات. الهواء الجافة نصائح لمدة 2 ساعة. إعداد 10 نصائح البلاستيك لكل عينة.
- معطف أنابيب لجمع نوات عن طريق ملئها بنسبة 5٪ BSA. عكس الأنابيب 3 مرات لضمان طلاء كفاءة. إزالة الحل والهواء الجاف الأنابيب رأسا على عقب على ورق الأنسجة النظيفة لمدة 2 ساعة. لكل عينة، معطف واحد أنبوب جمع المقدمة في عدة. بالإضافة إلى ذلك، قم بإعداد أنابيب 1.5 مل مغلفة لجمع النوى بعد FACS.
ملاحظة: نصائح الزجاج هي البديلة الموصى بها للغاية لنصائح ماصة بلاستيكية للحد من الالتصاق.
2. تشريح الدماغ حمار وحشي
- للقتل الرحيم الحمار الوحشي، وإعداد طبق بيتري 90 ملم مع 25 مل من الجليد الباردة محلول Tricaine.
- بعناية، خذ حمار وحشي من الخزان باستخدام شبكة صيد ووضعها في طبق بيتري.
- القتل الرحيم الأسماك عن طريق تركها في Tricaine لمدة 5 دقائق.
- قطع رأس الحيوان مع شفرة حلاقة حادة.
- باستخدام ملقط، كسر بلطف فتح الجمجمة وإزالة الأنسجة الرخوة والجلد والعظام من الجانب البطني والثمال من الجمجمة.
- بلطف، نقل الدماغ إلى طبق 30 مم الطازجة التي تحتوي على الجليد البارد برنامج تلفزيوني.
- اِنُمِّر الدماغ إلى قطع صغيرة باستخدام شفرة حلاقة لتسهيل تحميل العينة على عمود الدوران.
3. عزلة أحادية النوى
- نقل الأنسجة المفروم إلى خرطوشة مرشح المقدمة في طقم العزل نوى وإضافة 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت البارد ألف لتوعية الأنسجة. طحن الأنسجة باستخدام قضيب من البلاستيك التي تقدمها مجموعة لمدة 2 دقيقة.
- إضافة 300 μL من المخزن المؤقت البارد A واحتضان خرطوشة تصفية على الجليد مع غطاء مفتوح لمدة 10 دقيقة.
- اِكْبَ الخراطيش و إعادة تعليق الأنسجة عن طريق عكس الأنبوب 5 مرات.
- أجهزة الطرد المركزي عند 000 16 x غم لمدة 30 س. في هذه الخطوة، يتم تمزق الخلايا عند المرور من خلال مرشح ويتم تطبيق قوة الطرد المركزي عالية السرعة. التدفق من خلال يحتوي على نوى سليمة، والتي بيليه في الجزء السفلي من الأنبوب.
- تجاهل مرشح وإعادة تعليق بيليه من دوامة بقوة لمدة 10 ق.
- بيليه النوى عن طريق الطرد المركزي للحل في 500 × ز لمدة 3 دقائق. تجاهل supernatant بعناية كما بيليه نوات عديم اللون.
- إعادة بناء بيليه في 0.8 مل من الباردة العازلة B والطرد المركزي في 600 × ز لمدة 10 دقيقة. في هذه الخطوة، يتم فصل النوى من الحطام الغشاء. بيليه عديم اللون التي تم الحصول عليها تحتوي على نواة معزولة.
- إعادة تعليق النوى المعزولة في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني مع 5٪ BSA. الحفاظ على تعليق النوى على الجليد لأداء FACS بعد القياس الكمي.
4. التصور من مورفولوجيا النوى
- تأكيد مورفولوجيا نووية بواسطة تلطيخ هويشت. لهذا, إزالة 100 ميكرولتر من تعليق نواة واحدة في أنبوب جديد باستخدام نصائح مغلفة BSA. لتلطيخ النوى، إضافة 0.1 ميكرولتر من Hoechst (1 ملغ / مل). دوامة بلطف الأنبوب.
- نقل تعليق النوى إلى طبق القاع الزجاجي للتصوير.
- صورة النوى باستخدام المجهر المفلور مع إعدادات الإثارة بالليزر من ~ 405 نانومتر (البنفسجي) الطول الموجي.
5 - إثراء النوى القائمة على FACS
- قبل إجراء FACS، قم بتصفية النوى باستخدام مصفاة خلايا 40 ميكرومتر في أنبوب مغلف بـ BSA.
- تخفيف التعليق الذي تمت تصفيته بإضافة PBS مع BSA 5٪ إلى حجم نهائي من 1000 μL.
- تسمية اثنين من أسفل أنبوب FACS جولة بأنها "السيطرة" و "ملطخة". سوف أنبوب "التحكم" تحتوي على نويات غير ملطخة، في حين أن أنبوب "الملون" سيكون لهوية ملونة النوى.
- نقل 250 ميكرولتر من تعليق نوات إلى أنبوب "التحكم" باستخدام تلميح ماصات مغلفة BSA.
- نقل المتبقية 750 μL حل إلى أنبوب FACS المسمى بأنها "ملطخة" وإضافة 1 ميكرولتر من الصبغة Hoechst لطخة النوى. مزيج من قبل دوامة بطيئة.
- قم بتحميل نموذج عنصر التحكم غير المُطَرَّد إلى مُزَزّر الخلية. سجل أحداث 5000.
- تحميل العينات الملطخة وسجل 5000 الأحداث.
- رسم بوابات FACS التي تسمح بتحديد النوى واحدة. يمكن اختيار النوى من خلال مقارنة إشارة الفلوريسنس Hoechst بين العينة الملطخة بالتحكم.
- فرز Hoechst إيجابية النوى من أنبوب الملون إلى أنبوب جديد 1.5 مل تحتوي على 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني مع 5٪ BSA.
ملاحظة: يمكن جمع النوى المعزولة في وسط مطلوب وفقا لمتطلبات تطبيق المصب.
Representative Results
-- تم استخدام البروتوكول المذكور أعلاه لتوليد تعليق نواة واحدة مباشرة من أنسجة الدماغ حمار وحشي. عادة ما تتطلب العزلة 20 دقيقة وتجنب استخدام المنظفات أو الانزيم الهضمي. يتم توفير مخطط يلخص الخطوات الفردية للبروتوكول في الشكل 1، والتي يمكن طباعتها لاستخدامها في التوجيه.
الشكل 1: تخطيطي من المنظفات خالية من المنظفات تدور العمود القائم على طريقة لعزل النوى.
تمثيل رسومي للخطوات الفردية التي يتم تنفيذها أثناء استخراج النوى من أنسجة الدماغ الحمار الوحشي الطازجة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
التصور من مورفولوجيا نووية
وللتأكيد النوعي للمورفولوجيا النووية، كانت النوى المعزولة ملطخة بـ Hoechst ومتخيلة باستخدام المجهر الفلوري. ظهرت النوى سليمة، مستديرة ومفصلة جيدا (الشكل 2). والأهم من ذلك، أن التجميع النووي، وهو علامة على تمزق الغشاء النووي، لم يكن غائباً.
الشكل 2: عزل نواة واحدة من دماغ الحمار الوحشي.
صورة مجهرية الفلوريسنس للنيات الملطخة بHoechst توضح مورفولوجيا سليمة. شريط مقياس: 10 μm. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
التخصيب القائم على FACS للنيات السليمة
تم إثراء النوى المعزولة وإزالة الحطام الخلوي عن طريق عملية استئصال الخلايا بالتدفق عن طريق البوابات على وجود إشارة فلورية Hoechst. تم الكشف عن إشارة Hoechst على الإثارة مع البنفسجي، 405 نانومتر، ليزر (فيوليت رائعة 421 – BV421). غير المطوع النوى عرض الفلورسي الخلفية (الشكل 3A، الشكل التكميلي 1A)، في حين أن النوى الملونه أظهرت إشارة فلورية قوية ( الشكل3B، الشكل التكميلي 1B). كما هو موضح في الشكل 3C، كانت نوىات الملطخة وغير الملطخة Hoechst منفصلة بشكل جيد في القناة البنفسجية.
الشكل 3: عرض نواة معزولة قوية ومحددة هويشست fluorescent إشارة في عملية تدفق
مخطط بياني لمؤامرات تعليق أحادية النوى عرض توزيع هويشست تلطيخ. هويشت متحمس من قبل البنفسجي, 405 نانومتر, ليزر (البلوتية فيوليت 421 – BV421). العينة غير المطهوة (A) يعرض إشارة في نطاق 100-103، في حين أن هويشست النوى الملطخة (B) تنبعث منها إشارة في نطاق 103-105. تراكب من كثافة الفلورس المنبعثة من عينات غير ملوثة (رمادي) وملطخة (زرقاء)(C)يدل على فصل واضح بين المجموعتين السكانيتين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: استراتيجية جسور الغواة في تيار التدفق للنيات المعزولة. مؤامرات تدفق تمثيلية لتعليق نوات معزولة. تم تحليل النوى المعزولة باستخدام مبعثر إلى الأمام والليزر البنفسجي BV421 الذي يثير Hoechst في 405 نانومتر. العينة غير المطّلع(A)عرض إشارة BV421 في نطاق 100-103. من بين 13130 حدثًا، تم اكتشاف 141 حدثًا كنوى واحدة استنادًا إلى FSC-A (1.07٪ من الإجمالي) ، و 0 أحداث للنيات غير المُطَهَرة استنادًا إلى إشارة BV421 (0٪ من الإجمالي). ال [هويشتّّةّ- لطختّة نوكليّيّيّة/ ب/ عرض-ب-إشارة BV421 في ال 103-105 مدى. من بين 50000 حدث، تم اكتشاف 2418 حدثًا كنوى واحدة استنادًا إلى FSC-A (4.84٪ من المجموع)، و 2414 حدثًا للنيات الإيجابية Hoechst استنادًا إلى إشارة BV421 (4.83٪ من الإجمالي). الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.
Discussion
وقد أحدث تحديد ملامح النسخ و الخاتمة في حل خلية واحدة ثورة في دراسة النظم البيولوجية. تعتمد الدراسات على تحليل خلية واحدة للأنسجة الصلبة على تفكك الجهاز في خلايا فردية أو نوات. الانفصام هو إجراء مدمر يمكن أن يدخل التحف الفنية، والتي يمكن أن تمنع تطوير تمثيل دقيق للنظام5،6. على سبيل المثال، يمكن أن يضر الانفصام الأنزيمي الخلايا ذات المورولوجي المعقدة، مثل الخلايا العصبية أو البودوسييت، ويمكن أن يحفز التعبير عن الإجهاد وجينات الاستجابة للصدمات الحرارية7،12. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام المنظفات أثناء فصل الغشاء النووي وتمزق يؤدي إلى تجميع23،25. وهكذا، فإن تحسين الانفصام للحصول على خلية واحدة أو تعليق نوات من أعلى مستويات الجودة هو أمر بالغ الأهمية لنجاح تجارب التنميط عالية الإنتاجية.
هنا، نُظهر طريقة عزل المنظفات والنياتية الخالية من الإنزيمات التي تسمح باستخراج النوى السليمة من دماغ الحمار الوحشي في أقل من 20 دقيقة. البروتوكول يعطي نوى مع مورفولوجيا نموذجية وسلامة قوية (الشكل 2). من دماغ حمار وحشي واحد يزن 6 ملغ، ينتج البروتوكول ما مجموعه 60,000 نواة يحددها عدد مقياس الدم. ويمكن استخدام النوى المعزولة لتطبيقات متعددة من المصب، بما في ذلك snRNA-seq، ATAC-seq، والمناعة. وقد تشمل النوى المعزولة التلوث المتبادل من الكسور السيتوبلازمية، ولا سيما من مكونات التشنج الوبوبلازمي والميتوكوندريا. وبالنسبة لتجارب التنميط العالية، يوصى بشدة بإزالة الحطام الخلوي، ولا سيما الميتوكوندريا. تدفق cytometry (الشكل 3) يوفر خيارا قابلا للتطبيق لتنقية النوى. وبدلا من ذلك، يمكن أيضا استخدام تدرج السكروز لإزالة الحطام.
وقد تم اختبار البروتوكول على الغدة الدرقية الماوس (البيانات غير مبينة) ويقدم نتائج مماثلة لالأنسجة الدماغي حمار وحشي. وبشكل عام، يوفر البروتوكول طريقة قوية وقابلة للاستنساخ والعالمية لإعداد التعليق نواة واحدة، مما يساعد على تبسيط الخدمات اللوجستية لتجارب التنميط عالية الإنتاجية.
Disclosures
ولا يوجد تضارب في المصالح بين أصحاب البلاغ. تم الدفع مقابل جعل المادة الوصول المفتوح من قبل شركة ابتكار التكنولوجيا الحيوية ، الولايات المتحدة الأمريكية.
Acknowledgments
نشكر أعضاء مختبر الدكتور سابين كوستاغليولا وسينغ على تعليقاتهم على المخطوطة. وقد دعم هذا العمل من قبل Fonds de la Recherche Scientifique-FNRS تحت رقم المنحة 34772792 - MISU إلى S.P.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine serum albumin (BSA) | Carl Roth | 90604-29-8 | Albumin fraction V |
| Cell sorter | BD Biosciences | FACSAria III | |
| Centrifuge | Sartorius | A-14C | |
| Eppendorf tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 22363204 | |
| Falcon (15 mL) | Corning | 352096 | Polypropylene centrifuge tubes |
| Falcon (5 mL ) | Corning | 352052 | Polystyrene round bottom test tubes |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Flowmi cell strainer (40 μm) | Sigma | BAH136800040 | |
| Fluorescence microscope | Leica | DMI6000 B | |
| Glass bottle (250 mL) | VWR | 215-1593 | |
| Glass bottomed dish | World Precision Instruments | FD3510-100 | Fluorodish 35 mm |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 612-1701 | |
| Glass pipette socket | Carl Roth | 388.1 | Pipetting aid pi-pump 2500 |
| Hoechst staining dye solution | Abcam | ab228551 | Hoechst 33342 |
| Minute Detergent-Free Nuclei Isolation Kit | Invent Biotechnologies | NI-024 | |
| PBS (10X) | ThermoFisher | 70011069 | |
| Petri dish (30 mm) | FisherScientific | 11333704 | Pyrex |
| Petri dish (90 mm) | Corning | 758-10178-CS | Gosselin |
| Pipette tips | VWR | 89079 | 10 μL, 200 μL, 1000 μL |
| Pipettes | Gilson | F167380 | Pipetman |
| Razor blade | Swann-Morton | 7981809 | |
| Tricaine methane sulfonate | Sigma | E10521 | |
| Vortex machine | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex-Genie 2 |
References
- Ebrahimi Dastgurdi, M., Ejeian, F., Nematollahi, M., Motaghi, A., Nasr-Esfahani, M. H. Comparison of two digestion strategies on characteristics and differentiation potential of human dental pulp stem cells. Archives of Oral Biology. 93, 74-79 (2018).
- Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. Dispase, a neutral protease from Bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase. Journal of Investigative Dermatology. 93 (2), 287-290 (1989).
- Khan, M. R., Chandrashekran, A., Smith, R. K. W., Dudhia, J. Immunophenotypic characterization of ovine mesenchymal stem cells. Cytometry Part A. 89 (5), 443-450 (2016).
- Cavanagh, T. J., Lakey, J. R. T., Wright, M. J., Fetterhoff, T., Wile, K. Crude collagenase loses islet-isolating efficacy regardless of storage conditions. Transplantation Proceedings. 29 (4), 1942-1944 (1997).
- Massoni-Badosa, R., et al. Sampling artifacts in single-cell genomics cohort studies. bioRxiv. , (2020).
- Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- O'Flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumour tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Bioarxiv. 683227, (2019).
- Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. Plos One. 13 (12), 0209648 (2018).
- Lake, B. B., et al. A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys. Nature Communications. 10 (1), (2019).
- Rajbhandari, P., et al. Single cell analysis reveals immune cell-adipocyte crosstalk regulating the transcription of thermogenic adipocytes. eLife. 8, (2019).
- Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24 (10), 2746-2756 (2018).
- Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: Rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis. Journal of the American Society of Nephrology. 30 (1), 23-32 (2019).
- Lacar, B., et al. Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation. Nature Communications. 7 (1), 1-13 (2016).
- Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353 (6302), 925-928 (2016).
- Thrupp, N., et al. Single nucleus sequencing fails to detect microglial activation in human tissue. bioRxiv. , (2020).
- Selewa, A., et al. Systematic Comparison of High-throughput Single-Cell and Single-Nucleus Transcriptomes during Cardiomyocyte Differentiation. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
- Lake, B. B., et al. A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA. Scientific Reports. 7 (1), 1-8 (2017).
- Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. Isolation of neuronal chromatin from brain tissue. BMC Neuroscience. 9, 42 (2008).
- Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).
- Birnie, G. D. Isolation of Nuclei from Animal Cells in Culture. Methods in Cell Biology. 17, 13-26 (1978).
- Dounce, A. L., Witter, R. F., Monty, K. J., Pate, S., Cottone, M. A. A method for isolating intact mitochondria and nuclei from the same homogenate, and the influence of mitochondrial destruction on the properties of cell nuclei. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 1 (2), 139-153 (1955).
- Hymer, W. C., Kuff, E. L. Isolation of Nuclei From Mammalian Tissues Through the Use of Triton X-100. The journal of Histochemistry and Cytochemistry. 12, 359-363 (1964).
- Johnson, M. Detergents: Triton X-100, Tween-20, and More. Materials and Methods. 3, (2013).
- Sikorskaite, S., Rajamäki, M. L., Baniulis, D., Stanys, V., Valkonen, J. P. T. Protocol: Optimised methodology for isolation of nuclei from leaves of species in the Solanaceae and Rosaceae families. Plant Methods. 9 (1), 31 (2013).
- Graham, J., Rickwood, D. Subcellular fractionation: a practical approach. , IRL Press. (1997).
