Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

使用洗涤剂和酶无酶方法从整个组织进行核分离

doi: 10.3791/61471 Published: June 24, 2020

Summary

单核分离依赖于细胞膜的分离和基于洗涤剂的渗透,这些步骤需要优化,并且容易引入技术伪影。我们演示了一种洗涤剂和无酶协议,用于直接从整个组织中快速分离完整的核,产生适合单核RNA-seq(snRNA-Seq)或 ATAC-seq 的核。

Abstract

高通量转录组和表观基因组分析需要准备单个细胞或单核悬浮液。使用完整的细胞或核准备悬浮液涉及分离和渗透,这些步骤可能会引入不必要的噪音和不良损伤。特别是,某些细胞类型,如神经元是具有挑战性的分离成单个细胞。此外,细胞膜的渗透释放核需要通过试验和错误进行优化,这既耗时、劳动密集型且经济上不可行。为了提高高通量测序样品制备的鲁棒性和可重复性,我们描述了一种快速酶和无洗涤剂柱基分离方法。该协议可在20分钟内有效分离出整个斑马鱼大脑的核。分离的核显示完整的核形态和低聚集倾向。此外,流式细胞学允许细胞碎片的核富集和清除,用于下游应用。该协议应作用于软组织和培养细胞,为样品制备提供了一种简单易用的方法,可用于高通量分析,简化了成功单核RNA-seq和 ATAC-seq 实验所需的步骤。

Introduction

单细胞RNA-seq(scRNA-seq)和AC-seq是研究单细胞分辨率的复杂生物系统的多功能工具。它们被广泛用于定义细胞亚型和状态、基因网络以及评估细胞异质性。执行 scRNA-seq 的先决条件是通过组织分离制备单个细胞悬浮液。由于细胞外基质组成和机械性能的变化,单个组织需要优化分离协议,以制备单细胞悬浮液。

将组织分离成单细胞通常涉及在37°C1、2、3、4,2,3的消化酶(包括胶原酶、解胃或三辛)的治疗4。由于转录机械在37°C时保持活跃,酶分离可以引入mRNA表达伪影和噪声,5,6。值得注意的是,长时间的孵育可以以不均匀的方式诱导应激反应基因和热休克反应,导致实验7的技术变异性。

生成单个细胞悬浮的另一个缺点是难以获得具有复杂形态的可行和完整的细胞类型。特别是,神经元、脂肪细胞和豆瓣细胞在分离,,8、9、10、11方面具有挑战性8,910例如,吴和他的同事证明,在成年小鼠肾脏12的scRNA配置文件中,没有球状豆瓣细胞。对于从脑组织8、13、14中恢复相互关联的神经元也进行了类似的不理想观察。总之,分离协议可以引入检测偏差,倾向于更容易分离细胞类型,从而导致对器官细胞结构的歪曲。

为了克服在scRNA-Seq.样品制备过程中引入的技术噪声和偏差,分离和分析核提供了一个有吸引力的替代方案。由于核形态在不同细胞类型之间相似,核的分离绕过了用复杂形态分离完整和可行的细胞的问题。例如,吴和他的同事用成年小鼠肾脏的单核RNA-Seq.(snRNA-Seq.)成功地分析球状豆瓣细胞,从scRNA-Seq12中缺失。有趣的是,单细胞和单核RNA-seq之间的比较研究表明,使用snRNA-Seq12的应激和热休克反应基因的诱导率减少。研究进一步表明,这两种方法检测的基因之间高度相关。然而,最近一项有关人类微胶质的研究未能发现阿尔茨海默氏症的基因活化。因此,在某些情况下,snRNA-Seq是scRNA-Seq16,17,的合适替代品。此外,核隔离可用于单细胞 ATAC-Seq.,提供有关单个细胞内开放染色质区域的信息。

核分离协议涉及三个主要步骤:(一) 基于洗涤剂的细胞膜解解释放细胞核;ii) 使用 Dounce 均质器组织均质化;和,iii) 利用梯度离心或流式细胞学18、19、20、21、22,,19,20富集和清除细胞碎片。其中,前两个步骤取决于组织类型,需要经验优化。轻度洗涤剂导致细胞膜部分破裂,从组织23中提取核效率低下。另一方面,高水平的洗涤剂和苛刻的同质化导致核膜破裂,其损失24,25。24,断裂的核进一步倾向于聚集在一起并形成聚合,如果不删除,可能导致下游分析实验中的伪影。

为了规避与核分离的洗涤剂优化相关的问题,我们引入了一种协议,使用无洗涤剂和自旋柱方法将完整的核从新鲜样品中分离。该协议在20分钟内从整个器官产生核,限制了神器转录的诱导。分离的核可与单核RNA-Seq.和 ATAC-seq 的 FACS 丰富,提供一种简单且通用的方法,可实现可靠且可重复的高通量分析。

Protocol

下面介绍的所有程序都是按照机构(布鲁塞尔自由大学)和国家伦理和动物福利准则和条例执行的,这些准则和条例由布鲁克斯莱斯自由大学动物福利伦理委员会(CeBEA)批准(协议578N-579N)。

1. 组织解剖前的准备

  1. 在 PBS 中准备 0.2% 三元三丁溶液,用于对斑马鱼进行安乐死。在冰上冷却溶液。
  2. 准备一个30毫米的培养皿,用于切碎组织。
  3. 准备冰冷 1x PBS(每个组织样本 10 mL)。
  4. 将离心机冷却至4°C。
  5. 对于核分离,请使用无洗涤剂核分离套件(材料表)。
  6. 在启动协议之前,在成套中提供预冷缓冲器 A 和 B,在核隔离之前将其放在冰上至少 30 分钟。
  7. 要处理分离的核,请用 5% BSA 溶液涂覆塑料试剂,如管和移液器尖端。为此,通过溶解 40 mL PBS 中的 2 g BSA 来准备解决方案。用 5% BSA 涂覆塑料物品可减少粘在塑料上的核。此步骤可增强分离核的恢复。
  8. 通过移液 5% BSA 溶液涂覆移液器尖端 2-3 次。风干尖端2小时。每个样品准备 10 个塑料提示。
  9. 用 5% BSA 填充原子核,覆盖管以收集核。反转管 3 次,确保涂层高效。取出溶液,将管子倒置在干净的纸巾上干燥管2小时。每个样品,涂一个收集管在套件中提供。此外,在 FACS 之后为核收集准备涂层 1.5 mL 管。
    注:强烈推荐玻璃尖端替代塑料移液器尖端,以尽量减少粘附。

2. 斑马鱼脑的解剖

  1. 为了对斑马鱼进行安乐死,请准备一个 90 毫米的培养皿,配以 25 mL 的冰冷三金溶液。
  2. 小心地,用渔网将斑马鱼从水箱中带走,然后放入培养皿中。
  3. 将鱼留在三河5分钟,使鱼安乐死。
  4. 用锋利的剃刀斩首动物。
  5. 使用钳子轻轻打破头骨,从头骨的腹侧和背侧取出软组织、皮肤和骨骼。
  6. 轻轻,将大脑转移到含有冰冷 PBS 的新鲜 30 mm 盘中。
  7. 使用剃刀刀片将大脑切成小块,以简化旋转柱上样品的加载。

3. 单核隔离

  1. 将切碎的组织转移到核隔离套件中提供的滤芯中,并加入 200 μL 的冷缓冲液 A,使组织敏感。使用套件提供的塑料棒研磨组织 2 分钟。
  2. 加入 300 μL 的冷缓冲液 A,在冰上孵育滤芯,盖打开 10 分钟。
  3. 盖上墨盒,通过倒置管子5次重新填充组织。
  4. 30 s 的离心机为 16,000 x g。在此步骤中,通过过滤器时细胞破裂,并应用高速离心力。流经含有完整的核,在管的底部颗粒。
  5. 丢弃过滤器,通过大力涡旋 10 s 重新暂停颗粒。
  6. 在500 x g下离心3分钟,将溶液中分块。当核颗粒无色时,小心丢弃上一提液。
  7. 将颗粒在0.8 mL的冷缓冲B中重新暂停,以600 x g离心10分钟。在此步骤中,核从膜碎片中分离。获得的无色颗粒含有分离的核。
  8. 用5%的BSA在500μL的PBS中重新增加分离的核。将原子核悬浮在冰上,在定量后执行 FACS。

4. 核形态的可视化

  1. 通过霍赫斯特染色确认核形态。为此,使用 BSA 涂层尖端去除新管中 100 μL 的单核悬浮液。要染色核,加入0.1μL的霍赫斯特(1毫克/mL)。轻轻旋转管子。
  2. 将核悬浮液转移到玻璃底盘进行成像。
  3. 使用荧光显微镜使用 ±405 nm(紫罗兰)波长的激光激发设置对核进行成像。

5. FACS基于富集核

  1. 在执行 FACS 之前,使用 40 μm 细胞滤株将核过滤到 BSA 涂层管中。
  2. 通过将 PBS 与 5% BSA 一起添加到 1,000 μL 的最终体积中,稀释过滤的悬浮液。
  3. 将两个圆形底部 FACS 管标记为"控制"和"染色"。"控制"管将包含未染色的核,而"染色"管将具有霍赫斯特染色核。
  4. 使用 BSA 涂层移液器尖端将 250 μL 的核悬浮液转移到"控制"管中。
  5. 将剩余的 750 μL 溶液转移到标有"染色"的 FACS 管中,并加入 1 μL 的 Hoechst 染料来染色核。通过慢涡混合。
  6. 将未污染的控制样本加载到单元格分拣机。记录 5000 个事件。
  7. 加载染色样本并记录 5000 个事件。
  8. 绘制允许识别单核的 FACS 门。通过比较控制和染色样品之间的 Hoechst 荧光信号,可以选择核。
  9. 将染色管中的 Hoechst 正核分拣成含有 50 μL PBS 的新 1.5 mL 管,其 BSA 为 5%。
    注:根据下游应用的要求,可将分离的核收集到所需的介质中。

Representative Results

--上述协议用于直接从斑马鱼脑组织中产生单核悬浮液。隔离通常需要20分钟,避免使用洗涤剂或消化酶。图1中提供了汇总协议各个步骤的原理图,可以打印以用于指导。

Figure 1
图1:无洗涤剂自旋柱基方法的示意图,用于核分离。
从新鲜斑马鱼脑组织提取核时执行的单个步骤的图形表示。请单击此处查看此图的较大版本。

核形态的可视化

为了对核形态进行定性确认,分离的核被染色在 Hoechst 上,并使用荧光显微镜进行可视化。原子核看起来完好无损,圆圆,分离良好(图2)。重要的是,核聚集,核膜破裂的迹象,是不存在的。

Figure 2
图2:与斑马鱼脑的单核分离。
霍赫斯特染色核的荧光显微镜图像,展示了其完整的形态。比例线: 10 μm. 请单击此处查看此图的较大版本。

基于 FACS 的完好核浓缩

通过流量细胞学对是否存在霍赫斯特荧光信号进行浇注,对分离核进行富集和清除细胞碎片。Hoechst 信号在用紫罗兰 405 nm、激光(亮紫光 421 + BV421)激发时检测到。未染色核显示背景荧光(图3A,补充图1A),而染色核则表现出强烈的荧光信号(图3B,辅助图1B)。如图3C所示,未染色和霍赫斯特染色的核在紫罗兰通道中被很好地隔离。

Figure 3
图3:分离核在流式细胞学中显示强而特定的霍奇斯特荧光信号。
显示霍赫斯特染色分布的单核悬浮液的直方图图。霍赫斯特兴奋的紫罗兰,405纳米,激光(明亮的紫罗兰421 + BV421)。未染色的样品(A)显示100-103范围内的信号,而霍赫斯特染色核(B)在103-105范围内发出信号。未染色(灰色)和染色(蓝色)样本(C)发出的荧光强度叠加表明两个组之间的明显分离。请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
补充图1:分离核的流式细胞仪浇注策略。隔离核悬浮的代表性流图。使用正向散射和紫光激光BV421对分离核进行分析,该激光在405纳米时激发霍赫斯特。未污染的样品 (A) 在 10 0 -103范围内显示 BV421 信号.0在 13130 个事件中,141 个事件被检测为基于 FSC-A 的单核(占总数的 1.07%),0 个事件检测为基于 BV421 信号的未污染核(占总数的 0%)。Hoechst 染色核 (B) 在 103-105范围内显示 BV421 信号.在 50000 个事件中,2418 个事件被检测为基于 FSC-A 的单核(占总数的 4.84%),2414 个事件检测为基于 BV421 信号的 Hoechst 阳性核事件(占总数的 4.83%)。请点击这里下载此图。

Discussion

以单细胞分辨率分析转录组和表观基因组,彻底改变了生物系统的研究。固体组织单个细胞的分辨率研究取决于器官分离成单个细胞或核。分离是一个破坏性的过程,可以引入技术工件,它可以阻止系统5,6的准确表示。例如,酶分离可以伤害具有复杂形态的细胞,如神经元或豆瓣细胞,并可诱导压力和热休克反应基因7,12,的表达。此外,在分离过程中使用洗涤剂可能会破裂核膜,并导致聚集23,25。23,因此,优化分离以获得最高质量的单细胞或核悬浮液对于高通量分析实验的成功至关重要。

在这里,我们演示一种洗涤剂和无酶核分离方法,允许在20分钟内从斑马鱼大脑中提取完整的核。该协议产生具有典型形态和强健完整性的核(图2)。从一只重达6毫克的斑马鱼大脑中,该协议总共产生60,000个核,由血细胞计计数确定。分离的核可用于多种下游应用,包括snRNA-seq、ATAC-seq和免疫污染。分离的核可能包括来自细胞质部分的交叉污染,特别是来自内质性细胞和线粒体的成分。对于高通量分析实验,强烈建议清除细胞碎片,特别是线粒体。流细胞学 (图3) 为核的纯化提供了可行的选择.或者,蔗糖梯度也可用于清除碎屑。

该协议已经测试在小鼠甲状腺(数据未显示),并提供的结果类似于斑马鱼脑组织。总体而言,该协议为制备单核悬浮提供了一种稳健、可重复和通用的方法,有助于简化高通量分析实验的物流。

Disclosures

提交人没有利益冲突。使文章开放访问的报酬是由美国发明生物技术公司支付。

Acknowledgments

我们感谢萨宾·科斯塔利奥拉博士和辛格实验室的成员对手稿的评论。这项工作得到了编号34772792-MISU至S.P.S.的"科学基金会"的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine serum albumin (BSA) Carl Roth 90604-29-8 Albumin fraction V
Cell sorter BD Biosciences FACSAria III
Centrifuge Sartorius A-14C
Eppendorf tubes (1.5 mL) Eppendorf 22363204
Falcon (15 mL) Corning 352096 Polypropylene centrifuge tubes
Falcon (5 mL ) Corning 352052 Polystyrene round bottom test tubes
Fine forceps Fine Science Tools 11295-10
Flowmi cell strainer (40 μm) Sigma BAH136800040
Fluorescence microscope Leica DMI6000 B
Glass bottle (250 mL) VWR 215-1593
Glass bottomed dish World Precision Instruments FD3510-100 Fluorodish 35 mm
Glass Pasteur pipettes VWR 612-1701
Glass pipette socket Carl Roth 388.1 Pipetting aid pi-pump 2500
Hoechst staining dye solution Abcam ab228551 Hoechst 33342
Minute Detergent-Free Nuclei Isolation Kit Invent Biotechnologies NI-024
PBS (10X) ThermoFisher 70011069
Petri dish (30 mm) FisherScientific 11333704 Pyrex
Petri dish (90 mm) Corning 758-10178-CS Gosselin
Pipette tips VWR 89079 10 μL, 200 μL, 1000 μL
Pipettes Gilson F167380 Pipetman
Razor blade Swann-Morton 7981809
Tricaine methane sulfonate Sigma E10521
Vortex machine Scientific Industries SI-0236 Vortex-Genie 2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ebrahimi Dastgurdi, M., Ejeian, F., Nematollahi, M., Motaghi, A., Nasr-Esfahani, M. H. Comparison of two digestion strategies on characteristics and differentiation potential of human dental pulp stem cells. Archives of Oral Biology. 93, 74-79 (2018).
  2. Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. Dispase, a neutral protease from Bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase. Journal of Investigative Dermatology. 93, (2), 287-290 (1989).
  3. Khan, M. R., Chandrashekran, A., Smith, R. K. W., Dudhia, J. Immunophenotypic characterization of ovine mesenchymal stem cells. Cytometry Part A. 89, (5), 443-450 (2016).
  4. Cavanagh, T. J., Lakey, J. R. T., Wright, M. J., Fetterhoff, T., Wile, K. Crude collagenase loses islet-isolating efficacy regardless of storage conditions. Transplantation Proceedings. 29, (4), 1942-1944 (1997).
  5. Massoni-Badosa, R., et al. Sampling artifacts in single-cell genomics cohort studies. bioRxiv. (2020).
  6. Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14, (10), 935-936 (2017).
  7. O'Flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumour tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Bioarxiv. 683227, (2019).
  8. Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. Plos One. 13, (12), 0209648 (2018).
  9. Lake, B. B., et al. A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys. Nature Communications. 10, (1), (2019).
  10. Rajbhandari, P., et al. Single cell analysis reveals immune cell-adipocyte crosstalk regulating the transcription of thermogenic adipocytes. eLife. 8, (2019).
  11. Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24, (10), 2746-2756 (2018).
  12. Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: Rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis. Journal of the American Society of Nephrology. 30, (1), 23-32 (2019).
  13. Lacar, B., et al. Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation. Nature Communications. 7, (1), 1-13 (2016).
  14. Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353, (6302), 925-928 (2016).
  15. Thrupp, N., et al. Single nucleus sequencing fails to detect microglial activation in human tissue. bioRxiv. (2020).
  16. Selewa, A., et al. Systematic Comparison of High-throughput Single-Cell and Single-Nucleus Transcriptomes during Cardiomyocyte Differentiation. Scientific Reports. 10, (1), 1-13 (2020).
  17. Lake, B. B., et al. A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA. Scientific Reports. 7, (1), 1-8 (2017).
  18. Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. Isolation of neuronal chromatin from brain tissue. BMC Neuroscience. 9, 42 (2008).
  19. Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nature Protocols. 11, (3), 499-524 (2016).
  20. Birnie, G. D. Isolation of Nuclei from Animal Cells in Culture. Methods in Cell Biology. 17, 13-26 (1978).
  21. Dounce, A. L., Witter, R. F., Monty, K. J., Pate, S., Cottone, M. A. A method for isolating intact mitochondria and nuclei from the same homogenate, and the influence of mitochondrial destruction on the properties of cell nuclei. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 1, (2), 139-153 (1955).
  22. Hymer, W. C., Kuff, E. L. Isolation of Nuclei From Mammalian Tissues Through the Use of Triton X-100. The journal of Histochemistry and Cytochemistry. 12, 359-363 (1964).
  23. Johnson, M. Detergents: Triton X-100, Tween-20, and More. Materials and Methods. 3, (2013).
  24. Sikorskaite, S., Rajamäki, M. L., Baniulis, D., Stanys, V., Valkonen, J. P. T. Protocol: Optimised methodology for isolation of nuclei from leaves of species in the Solanaceae and Rosaceae families. Plant Methods. 9, (1), 31 (2013).
  25. Graham, J., Rickwood, D. Subcellular fractionation: a practical approach. IRL Press. (1997).
使用洗涤剂和酶无酶方法从整个组织进行核分离
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Eski, S. E., Dubois, C., Singh, S. P. Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method. J. Vis. Exp. (160), e61471, doi:10.3791/61471 (2020).More

Eski, S. E., Dubois, C., Singh, S. P. Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method. J. Vis. Exp. (160), e61471, doi:10.3791/61471 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter