Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Nuklei isolation fra hele væv ved hjælp af et vaskemiddel og enzym-Fri metode

doi: 10.3791/61471 Published: June 24, 2020

Summary

Enkelt kerner isolation er afhængig af dissociation og vaskemiddel-baserede permeabilisering af cellemembranen, trin, der har brug for optimering og er tilbøjelige til at indføre tekniske artefakter. Vi demonstrerer en vaske- og enzymfri protokol til hurtig isolering af intakte kerner direkte fra hele væv, hvilket giver kerner, der er egnede til enkelt-kerne RNA-seq (snRNA-Seq) eller ATAC-seq.

Abstract

Høj-gennemløb transskriptionome og epigenome profilering kræver forberedelse af en enkelt celle eller enkelt kerner suspension. Forberedelse af suspensionen med intakt celle eller kerner indebærer dissociation og permeabilisering, trin, der kan indføre uønsket støj og uønskede skader. Især, visse celle-typer såsom neuroner er udfordrende at adskille i de enkelte celler. Derudover, permeabilisering af cellulære membran til at frigive kerner kræver optimering af trial-and-error, som kan være tidskrævende, arbejdskrævende og økonomisk nonviable. For at forbedre robustheden og reproducerbarheden af prøveforberedelse til sekvensering med høj gennemløb beskriver vi en hurtig enzym- og vaskemiddelfri kolonnebaseret kerneisolationsmetode. Protokollen muliggør effektiv isolering af kerner fra hele zebrafiskhjernen inden for 20 minutter. De isolerede kerner viser intakt nuklear morfologi og lav tilbøjelighed til at samle. Yderligere, flow cytometri tillader kerner berigelse og clearance af cellulære snavs til downstream ansøgning. Protokollen, som skal arbejde på blødt væv og dyrkede celler, giver en enkel og tilgængelig metode til prøveforberedelse, der kan anvendes til høj-throughput profilering, forenkle de trin, der kræves for en vellykket single-nuclei RNA-seq og ATAC-seq eksperimenter.

Introduction

Encellede RNA-seq (scRNA-Seq) og ATAC-seq er alsidige værktøjer til at studere komplekse biologiske systemer ved encellede opløsning. De er bredt udnyttet til at definere celle undertyper og stater, gennetværk og til at vurdere cellulære heterogenitet. En forudsætning for at udføre scRNA-seq er forberedelsen af en enkelt celle suspension ved væv dissociation. På grund af variationen i den ekstracellulære matrixsammensætning og mekaniske egenskaber kræver individuelle væv optimering af dissociationsprotokollen til forberedelse af enkeltcellesuspension.

Dissociation af væv i enkelte celler indebærer typisk behandling med fordøjelsesenzymer, herunder kollagen, dispase eller trypsin, ved 37 °C1,2,3,4. Da transskriptionelle maskiner forbliver aktive ved 37 °C, kan enzymatisk dissociation introducere mRNA-udtryksartefakterog støj 5,6. Især kan langvarig inkubation fremkalde stress responsive gener og varmechok reaktion i en ikke-ensartet måde - fører til tekniske variabilitet i forsøget7.

En anden ulempe ved at generere en enkelt celle suspension er vanskeligheden ved at opnå levedygtige og intakte celle-typer med komplekse morfologier. Især neuroner, adipocytter og podocytter er udfordrende at isolere8,,9,,10,11. For eksempel, Wu og kolleger viste fraværet af glomerular podocytes i scRNA profiler fra en voksen mus nyre12. Lignende ikkeoptimale observationer er blevet foretaget vedrørende inddrivelse af indbyrdes forbundne neuroner frahjernevæv 8,13,14. Alt i alt kan dissociationsprotokoller indføre detektionsbias i retning af lettere at adskille celletyper, hvilket fører til en forvanskning af organets cellulære arkitektur.

For at overvinde den tekniske støj og bias, der blev indført under prøveforberedelse i scRNA-Seq., er isolering og profilering af kernen et attraktivt alternativ. Da nuklear morfologi er den samme mellem forskellige celletyper, omgår isolationen af kernerne spørgsmålet om at isolere intakte og levedygtige celler med komplekse morfologier. For eksempel, Wu og kolleger demonstreret vellykket profilering af glomerular podocytes med single-nucleus RNA-Seq. (snRNA-Seq.) af en voksen mus nyre, som manglede fra scRNA-Seq12. Interessant nok har sammenlignende undersøgelser mellem enkeltcelle- og enkeltpunkts-RNA-seq antydet et fald i induktion af stress- og varmechok-responsgener med snRNA-Seq12. Undersøgelserne tyder endvidere på en høj korrelation mellem de gener, der påvises ved de to metoder. Men, en nylig undersøgelse af humane mikroglia undladt at opdage genetisk aktivering i Alzheimers sygdom15. I visse sammenhænge er snRNA-Seq således et egnet alternativ til scRNA-Seq16,17. Derudover kan den nukleare isolation anvendes til encellede ATAC-Seq., der giver oplysninger om regionerne af åben kromatin i de enkelte celler.

Protokollen for kerneisolation omfatter tre vigtige trin: i) vaskemiddelbaseret lysis af cellemembran til frigivelse af kernen; ii) vævshomogenisering ved hjælp af en Dounce-homogenisator og iii) berigelse af kerner og fjernelse af celleaffald ved hjælp af gradientcentrifugation eller flowcytometri18,19,20,21,22. Blandt dette, de første to trin afhænger af vævstype og skal empirisk optimeret. Mildt rengøringsmiddel fører til delvis brud på cellemembranen og ineffektiv udtagning af kerner fravævet 23. På den anden side fører et højt niveau af vaskemiddel og hård homogenisering til brud på den nukleare membran ogderes tab 24,25. Bristede kerner yderligere tendens til at klumpe sammen og danne aggregater, som hvis ikke fjernet kan føre til artefakter i downstream profilering eksperiment.

For at omgå problemerne i forbindelse med optimering af vaskemiddel til nukleiisolation indfører vi en protokol for at isolere intakte kerner fra friske prøver ved hjælp af en vaskemiddelfri og spin-kolonnebaseret metode. Protokollen giver kerner fra hele orgel inden for 20 minutter, hvilket begrænser induktion af artefaktuel transskription. De isolerede kerner kan beriges med FACS til single-nuclei RNA-Seq. og ATAC-seq, hvilket giver en enkel og universel metode, der muliggør robust og reproducerbar høj-gennemløbsprofilering.

Protocol

Alle nedenstående procedurer blev udført i overensstemmelse med institutionelle (Université Libre de Bruxelles (ULB)) og nationale retningslinjer og bestemmelser om etisk og dyrevelfærd, som blev godkendt af Det Etiske Udvalg for Dyrevelfærd (CEBEA) fra Université Libre de Bruxelles (protokol 578N-579N).

1. Forberedelse før vævsdissektion

  1. Forbered 0,2% Tricaine opløsning i PBS for euthanizing zebrafisk. Chill opløsningen på is.
  2. Forbered en 30 mm petriskål til hakning af vævet.
  3. Der tilberedes iskold 1x PBS (10 ml pr. vævsprøve).
  4. Centrifugeringen afkøles til 4 °C.
  5. Til isoleret kerner skal der anvendes et isolationssæt, der er fri for vaskemiddel (Materialetabel).
  6. Før protokollen påbegyndes, skal der i sættets buffer A og B fortrædes ved at anbringe dem på is i mindst 30 minutter før isoleret kerner.
  7. Til håndtering af de isolerede kerner skal plastreagenserne, såsom rør og pipettespidser, belægges med 5 % BSA-opløsning. Til dette klargør opløsningen ved at opløse 2 g BSA i 40 ml PBS. Belægning plastemner med 5% BSA reducerer kerner klæber til plast. Dette trin øger inddrivelsen af isolerede kerner.
  8. Coat pipettespidserne ved at pipettere 5% BSA-opløsning 2-3 gange. Lufttørre spidserne i 2 timer. Forbered 10 plast tips pr prøve.
  9. Coat rørene til indsamling af kerner ved at fylde dem med 5% BSA. Vend rørene 3 gange for at sikre en effektiv belægning. Fjern opløsningen, og lufttørre rørene på hovedet på et rent silkepapir i 2 timer. Pr. prøve, pels en samling rør, der er fastsat i sættet. Derudover forberedes belagte 1,5 ml rør til kerner indsamling efter FACS.
    BEMÆRK: Glasspidser er stærkt anbefalede alternativ til plastpipettespidserne for at minimere stikning.

2. Dissektion af zebrafisk hjerne

  1. For euthanizing zebrafisk, forberede en 90 mm petriskål med 25 ml iskold Tricaine opløsning.
  2. Tag forsigtigt zebrafisken fra tanken ved hjælp af et fiskenet og læg den i petriskålen.
  3. Afliv fisken ved at efterlade den i Tricaine i 5 min.
  4. Halshug dyret med et skarpt barberblad.
  5. Brug af tandbanker, forsigtigt bryde åbne kraniet og fjerne blødt væv, hud og knogler fra ventrale og dorsale side af kraniet.
  6. Forsigtigt overføre hjernen til en frisk 30 mm skål indeholdende iskold PBS.
  7. Hak hjernen i små stykker ved hjælp af et barberblad for at lette belastningen af prøven på spin kolonnen.

3. Isolation af enkelte kerner

  1. Det hakkede væv overføres til den filterpatron, der findes i kerneisolationssættet, og der tilsættes 200 μL kold buffer A for at sensibilisere vævet. Grind vævet ved hjælp af plaststang, der leveres af sættet i 2 min.
  2. Der tilsættes 300 μL kold buffer A, og filterpatronen inkuberes på indlandsisen med en hætte åben i 10 min.
  3. Hætten af patronen, og opslæm dem igen ved at vende røret 5 gange.
  4. Centrifuge ved 16.000 x g i 30 s. I dette trin bristes cellerne, når de passerer gennem filteret, og højhastighedscentrifugalkraften påføres. Strømmen gennem indeholder intakte kerner, som pellet i bunden af røret.
  5. Filtret kasseres, og pelleten genbruges ved at hvirvle kraftigt i 10 s.
  6. Pellet kerner ved centrifugering opløsningen ved 500 x g i 3 min. Kassér supernatanten omhyggeligt, da kernepellet er farveløs.
  7. Pellets pellet genanvendes igen i 0,8 ml kold buffer B og centrifuge ved 600 x g i 10 min. I dette trin, kerner er adskilt fra membran snavs. Den farveløse pellet opnået indeholder isolerede kerner.
  8. Opsiv de isolerede kerner i 500 μL PBS med 5% BSA. Hold kernen opsuspende på is for at udføre FACS efter kvantificeringen.

4. Visualisering af nuklei morfologi

  1. Bekræft nuklear morfologi ved Hoechst farvning. Til dette fjernes 100 μL enkeltkernesuspension i et nyt rør ved hjælp af BSA-belagte spidser. For at plette kernerne tilsættes 0,1 μL Hoechst (1 mg/ml). Forsigtigt vortex røret.
  2. Overfør kerneaffjedringen til glasbundsskålen til billedbehandling.
  3. Billede kerner ved hjælp af en fluorescens mikroskop med laser excitation indstillinger på ~ 405 nm (Violet) bølgelængde.

5. FACS-baseret berigelse af kerner

  1. Før FACS udføres, filtreres kernerne med en 40 μm cellesyr i BSA-belagt rør.
  2. Den filtrerede suspension fortyndes ved at tilsætte PBS med 5 % BSA til et endeligt volumen på 1.000 μL.
  3. Mærk to runde bund FACS rør som 'kontrol' og 'farves'. Kontrolrøret vil indeholde ikke-farvede kerner, mens det "farvede" rør vil have Hoechst farvede kerner.
  4. 250 μL af kerneaffjedringen overføres til kontrolrøret ved hjælp af BSA-belagt pipettespids.
  5. Den resterende 750 μL opløsning overføres til FACS-rør mærket som »plettet« og tilsættes 1 μL Hoechst-farvestof for at plette kernerne. Bland ved langsom vortexing.
  6. Indlæs det ikke-tilbageholdte kontroleksempel på cellesortering. Optag 5000 begivenheder.
  7. Indlæs de farvede prøver, og registrer 5000 hændelser.
  8. Tegn FACS porte, der gør det muligt at identificere enkelte kerner. Kerner kan vælges ved at sammenligne Hoechst fluorescenssignalet mellem kontrol og farvesprøve.
  9. Sorter Hoechst-positive kerner fra det farvede rør til nyt 1,5 ml rør indeholdende 50 μL PBS med 5% BSA.
    BEMÆRK: Isolerede kerner kan opsamles i et ønsket medium i henhold til kravene i downstream-applikationen.

Representative Results

--Protokollen beskrevet ovenfor blev brugt til at generere enkelt kerne suspension direkte fra zebrafisk hjernevæv. Isolationen kræver typisk 20 minutter og undgår brug af vaskemiddel eller fordøjelsesenzym. En skematisk oversigt over de enkelte trin i protokollen findes i figur 1, som kan udskrives til brug som vejledning.

Figure 1
Figur 1: Skematisk af vaskemiddelfri spin-kolonnebaseret metode til nukleiisolation.
Grafisk repræsentation af de enkelte trin udført under udvinding af kerner fra frisk zebrafisk hjernevæv. Klik her for at se en større version af dette tal.

Visualisering af nuklear morfologi

For kvalitativ bekræftelse af den nukleare morfologi blev de isolerede kerner plettet med Hoechst og visualiseret ved hjælp af fluorescensmikroskopi. Kerner syntes intakt, rund og godt adskilt (Figur 2). Det er vigtigt, at der ikke er noget at gøre med den nukleare sammenlægning, et tegn på brud på atomhinden.

Figure 2
Figur 2: Enkelt kerner isolation fra zebrafisk hjerne.
Fluorescensmikroskopi billede af Hoechst-farvede kerner demonstrerer deres intakte morfologi. Skalabar: 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

FACS-baseret berigelse af de intakte kerner

Berigelse af isolerede kerner og fjernelse af cellulært affald blev udført ved flowcytometri ved gating på tilstedeværelsen af et Hoechst fluorescenssignal. Den Hoechst signal blev opdaget ved excitation med violet, 405 nm, laser (Brilliant Violet 421 – BV421). Ikke-farvede kerner udviste baggrundslysstofiker (figur 3A, supplerende figur 1A), mens farvede kerner udviste stærkt fluorescerende signal (Figur 3B, Supplerende figur 1B). Som illustreret i figur 3C, de ikke-farvede og Hoechst farvede kerner var godt adskilt i den violette kanal.

Figure 3
Figur 3: Isolerede kerner viser stærkt og specifikt Fluorescerende Hoechst-signal i flowcytometri.
Histogram plots for enkelt kerner suspension viser fordelingen af Hoechst farvning. Hoechst er begejstret ved violet, 405 nm, laser (Brilliant Violet 421 - BV421). Den ikke-plettede prøve (A) viser signal i området 100-103, mens Hoechst farvede kerner (B) udsender signal i intervallet 103-105. En overlejring af fluorescensintensitet, der udsendes af ikke-farvede (grå) og farvede (blå) prøver (C),viser en klar adskillelse mellem de to populationer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Supplerende figur 1: Flow cytometrigating strategi for isolerede kerner. Repræsentative flowområder til isolerede kerneruspension. Isolerede kerner blev analyseret ved hjælp af fremadspredning og Violet laser BV421, som ophidser Hoechst ved 405 nm. Det ikke-plettede prøve (A) viste BV421-signalet i området 100-103. Ud af 13130 hændelser blev der registreret 141 hændelser som enkelt kerner baseret på FSC-A (1,07% af det samlede antal) og 0 hændelser for ikke-tilbageholdte kerner baseret på BV421-signal (0% af det samlede antal). Hoechst farvede kerner (B) viste BV421 signal i 103-105 rækkevidde. Ud af 50000 hændelser blev der påvist 2418 hændelser som enkelt kerner baseret på FSC-A (4,84 % af det samlede antal) og 2414 hændelser for Hoechst-positive kerner baseret på BV421-signal (4,83 % af det samlede antal). Klik her for at downloade dette tal.

Discussion

Profilering af transcriptome og epigenome på en enkelt celle opløsning har revolutioneret studiet af biologiske systemer. Undersøgelser ved opløsningen af en enkelt celle for et fast væv afhænger af dissociation af organet i individuelle celler eller kerner. Dissociation er en destruktiv procedure, der kan indføre tekniske artefakter, som kan forhindre udviklingen af en nøjagtig repræsentation af systemet5,6. For eksempel kan enzymatisk dissociation skade celler med komplekse morfologier, såsom neuroner eller podocytter, og kan fremkalde udtryk for stress og varmechokrespons gener 7,12. Desuden kan brug af vaskemiddel under afkoskning briste den nukleare membran og føre tilaggregering 23,25. Således er optimering af dissociation at opnå en enkelt celle eller kerner suspension af højeste kvalitet altafgørende for succes en høj-throughput profilering eksperimenter.

Her demonstrerer vi en vaskemiddel- og enzymfri kerneisolationsmetode, der tillader udvinding af intakte kerner fra zebrafiskhjerne på mindre end 20 minutter. Protokollen giver kerner med typisk morfologi og robust integritet (Figur 2). Fra en enkelt zebrafisk hjerne vejer 6 mg, protokollen giver i alt 60.000 kerner bestemmes af en hæmocytometer tæller. De isolerede kerner kan anvendes til flere downstream applikationer, herunder snRNA-seq, ATAC-seq og immunsinde. De isolerede kerner kan omfatte krydskontaminering fra cytoplasmatiske fraktioner, især fra komponenter af endoplasmic reticulum og mitokondrier. For høj-throughput profilering eksperimenter, clearance af cellulære vragrester, især mitokondrier, anbefales kraftigt. Flowcytometri (Figur 3) giver en farbar vej til rensning af kerner. Alternativt kan saccharosegradienten også anvendes til fjernelse af snavs.

Protokollen er blevet testet på mus skjoldbruskkirtlen (data ikke vist) og giver resultater svarende til zebrafisk hjernevæv. Samlet set giver protokollen en robust, reproducerbar og universel metode til forberedelse af enkelt kerneaffjedring, hvilket er med til at forenkle logistikken til eksperimenter med profilering med høj kapacitet.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikt. Betalingen for at gøre artiklen åben adgang blev foretaget af Invent Biotechnologies Inc., USA.

Acknowledgments

Vi takker medlemmer af Dr. Sabine Costagliola og Singh lab for kommentarer til manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af Fonds de la Recherche Scientifique-FNRS under Tilskud nummer 34772792 – MISU til S.P.S.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine serum albumin (BSA) Carl Roth 90604-29-8 Albumin fraction V
Cell sorter BD Biosciences FACSAria III
Centrifuge Sartorius A-14C
Eppendorf tubes (1.5 mL) Eppendorf 22363204
Falcon (15 mL) Corning 352096 Polypropylene centrifuge tubes
Falcon (5 mL ) Corning 352052 Polystyrene round bottom test tubes
Fine forceps Fine Science Tools 11295-10
Flowmi cell strainer (40 μm) Sigma BAH136800040
Fluorescence microscope Leica DMI6000 B
Glass bottle (250 mL) VWR 215-1593
Glass bottomed dish World Precision Instruments FD3510-100 Fluorodish 35 mm
Glass Pasteur pipettes VWR 612-1701
Glass pipette socket Carl Roth 388.1 Pipetting aid pi-pump 2500
Hoechst staining dye solution Abcam ab228551 Hoechst 33342
Minute Detergent-Free Nuclei Isolation Kit Invent Biotechnologies NI-024
PBS (10X) ThermoFisher 70011069
Petri dish (30 mm) FisherScientific 11333704 Pyrex
Petri dish (90 mm) Corning 758-10178-CS Gosselin
Pipette tips VWR 89079 10 μL, 200 μL, 1000 μL
Pipettes Gilson F167380 Pipetman
Razor blade Swann-Morton 7981809
Tricaine methane sulfonate Sigma E10521
Vortex machine Scientific Industries SI-0236 Vortex-Genie 2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ebrahimi Dastgurdi, M., Ejeian, F., Nematollahi, M., Motaghi, A., Nasr-Esfahani, M. H. Comparison of two digestion strategies on characteristics and differentiation potential of human dental pulp stem cells. Archives of Oral Biology. 93, 74-79 (2018).
  2. Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. Dispase, a neutral protease from Bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase. Journal of Investigative Dermatology. 93, (2), 287-290 (1989).
  3. Khan, M. R., Chandrashekran, A., Smith, R. K. W., Dudhia, J. Immunophenotypic characterization of ovine mesenchymal stem cells. Cytometry Part A. 89, (5), 443-450 (2016).
  4. Cavanagh, T. J., Lakey, J. R. T., Wright, M. J., Fetterhoff, T., Wile, K. Crude collagenase loses islet-isolating efficacy regardless of storage conditions. Transplantation Proceedings. 29, (4), 1942-1944 (1997).
  5. Massoni-Badosa, R., et al. Sampling artifacts in single-cell genomics cohort studies. bioRxiv. (2020).
  6. Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14, (10), 935-936 (2017).
  7. O'Flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumour tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Bioarxiv. 683227, (2019).
  8. Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. Plos One. 13, (12), 0209648 (2018).
  9. Lake, B. B., et al. A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys. Nature Communications. 10, (1), (2019).
  10. Rajbhandari, P., et al. Single cell analysis reveals immune cell-adipocyte crosstalk regulating the transcription of thermogenic adipocytes. eLife. 8, (2019).
  11. Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24, (10), 2746-2756 (2018).
  12. Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: Rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis. Journal of the American Society of Nephrology. 30, (1), 23-32 (2019).
  13. Lacar, B., et al. Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation. Nature Communications. 7, (1), 1-13 (2016).
  14. Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353, (6302), 925-928 (2016).
  15. Thrupp, N., et al. Single nucleus sequencing fails to detect microglial activation in human tissue. bioRxiv. (2020).
  16. Selewa, A., et al. Systematic Comparison of High-throughput Single-Cell and Single-Nucleus Transcriptomes during Cardiomyocyte Differentiation. Scientific Reports. 10, (1), 1-13 (2020).
  17. Lake, B. B., et al. A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA. Scientific Reports. 7, (1), 1-8 (2017).
  18. Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. Isolation of neuronal chromatin from brain tissue. BMC Neuroscience. 9, 42 (2008).
  19. Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nature Protocols. 11, (3), 499-524 (2016).
  20. Birnie, G. D. Isolation of Nuclei from Animal Cells in Culture. Methods in Cell Biology. 17, 13-26 (1978).
  21. Dounce, A. L., Witter, R. F., Monty, K. J., Pate, S., Cottone, M. A. A method for isolating intact mitochondria and nuclei from the same homogenate, and the influence of mitochondrial destruction on the properties of cell nuclei. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 1, (2), 139-153 (1955).
  22. Hymer, W. C., Kuff, E. L. Isolation of Nuclei From Mammalian Tissues Through the Use of Triton X-100. The journal of Histochemistry and Cytochemistry. 12, 359-363 (1964).
  23. Johnson, M. Detergents: Triton X-100, Tween-20, and More. Materials and Methods. 3, (2013).
  24. Sikorskaite, S., Rajamäki, M. L., Baniulis, D., Stanys, V., Valkonen, J. P. T. Protocol: Optimised methodology for isolation of nuclei from leaves of species in the Solanaceae and Rosaceae families. Plant Methods. 9, (1), 31 (2013).
  25. Graham, J., Rickwood, D. Subcellular fractionation: a practical approach. IRL Press. (1997).
Nuklei isolation fra hele væv ved hjælp af et vaskemiddel og enzym-Fri metode
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Eski, S. E., Dubois, C., Singh, S. P. Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method. J. Vis. Exp. (160), e61471, doi:10.3791/61471 (2020).More

Eski, S. E., Dubois, C., Singh, S. P. Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method. J. Vis. Exp. (160), e61471, doi:10.3791/61471 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter