Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

RNA interferens i akvatiske biller som et kraftig verktøy for manipulering av genuttrykk på spesifikke utviklingstidspunkter

Published: May 29, 2020 doi: 10.3791/61477
Automatic Translation
1, 1, 2,3, 1,4, 2, 1
1Department of Biological Sciences, University of Cincinnati, 2Department of Biology, Miami University, 3Department of Biology, University of North Carolina at Chapel Hill, 4Department of Neuroscience, The Scripps Research Institute

Summary

RNA-interferens er en allment anvendelig, kraftig teknikk for manipulering av genuttrykk på bestemte utviklingsstadier. Her beskriver vi de nødvendige trinnene for å implementere denne teknikken i den akvatiske dykkerboblen Thermonectus marmoratus, fra oppkjøpet av gensekvenser til knockdown av gener som påvirker struktur eller atferd.

Abstract

RNA interferens (RNAi) er fortsatt en kraftig teknikk som muliggjør målrettet reduksjon av genuttrykk gjennom mRNA nedbrytning. Denne teknikken gjelder for et bredt utvalg av organismer og er svært effektiv i den artsrike rekkefølgen Coleoptera (biller). Her oppsummerer vi de nødvendige trinnene for å utvikle denne teknikken i en ny organisme og illustrere dens anvendelse på de ulike utviklingsstadiene av den akvatiske dykkerboblen Thermonectus marmoratus. Målgensekvenser kan oppnås kostnadseffektivt gjennom montering av transkripsjoner mot en nær slektning med kjente genomikk eller de novo. Kandidatgenkloning benytter en bestemt kloningvektor (pCR4-TOPO plasmid), som gjør det mulig å syntese dobbelttrådet RNA (dsRNA) for ethvert gen ved bruk av en enkelt vanlig primer. Syntetisert dsRNA kan injiseres i enten embryoer for tidlige utviklingsprosesser eller larver for senere utviklingsprosesser. Vi illustrerer deretter hvordan RNAi kan injiseres i akvatiske larver ved hjelp av immobilisering i agarose. For å demonstrere teknikken gir vi flere eksempler på RNAi-eksperimenter, og genererer spesifikke knockdowns med spådde fenotyper. Spesielt fører RNAi for solingsgenet laccase2 til cuticle lightening hos både larver og voksne, og RNAi for øyet pigmentering genet hvit produserer en lightening / mangel på pigmentering i øyerør. I tillegg fører knockdown av et viktig linseprotein til larver med optiske mangler og redusert evne til å jakte byttedyr. Til sammen eksemplifiserer disse resultatene kraften til RNAi som et verktøy for å undersøke både morfologiske mønstre og atferdstrekk i organismer med bare transkripsjonsdatabaser.

Introduction

Spørsmålet om hvordan spesifikke gener bidrar til utviklingen av ulike egenskaper er et spennende tema i biologi. I løpet av de siste tiårene har det blitt gjort mye fremgang med hensyn til å dissekere de genetiske grunnlaget for utviklingsprosesser i noen få modellorganismer, som nematoden Caenorhabditis elegans, fruktfluen Drosophila melanogaster, og husmusen Mus musculus1. Mer nylig har oppfinnelsen av kraftige genredigeringsteknikker som gruppert regelmessig interspaced korte palindromic repetisjoner (CRISPR) / Cas92 gitt muligheten til å endre den genetiske koden til ikke-modellorganismer (for eksemplerse 3,4). Som et resultat har det vært en økning i genetiske studier på en rekke organismer som ikke tidligere hadde blitt kontaktet gjennom molekylære teknikker. Tatt i tanke på det enorme mangfoldet i vårt dyrerike, med mange interessante egenskaper eller egenskapsavvik som bare er representert i bestemte arter, har denne fremgangen gjort det til en spennende tid for evolusjonær utviklingsbiologi ("evo-devo") relatert arbeid. Genomredigeringsteknikker som er tilgjengelige for ikke-modellorganismer er imidlertid relativt begrenset med hensyn til utviklingstiden som de kan brukes på, noe som gjør det utfordrende å skjelne de timelige egenskapene knyttet til rollen som spesifikke gener spiller i enhver egenskap. I tillegg er transgene teknikker ofte begrenset til gener som ikke er essensielle for overlevelse (det vil si hvis knockout ikke resulterer i dødelighet). Derfor, mens genredigeringsteknikker har begynt å bli populære, er det fortsatt behov for effektive teknikker som gjelder for en rekke forskjellige organismer på bestemte utviklingstidspunkter og letter delvise knockdowns (i stedet for fullstendig tap av funksjon). Her trekker vi oppmerksomhet til RNA interferens (RNAi), en noe datert, men kraftig gen knockdown teknikk5 som er spesielt verdifull som en synergistisk tilnærming til genredigering. Spesielt utviklet vi prosedyrer som tillater bruk av RNAi til akvatiske dykkerbagler som et eksempel som illustrerer implementeringen av denne teknikken, fra oppkjøpet av de nødvendige molekylære sekvensene til vellykket injeksjon av dobbelttrådet RNA (dsRNA) i egg og larver.

RNAi-basert genbanke ned utnytter en medfødt forsvarsmekanisme av organismer, der dsRNA molekyler letter deaktivering av invaderende nukleinsyresekvenser, for eksempel virus og transposoner6. Kort sagt, dsRNA er tatt opp i cellen, hvor det er skåret i 20-25 nukleotid stykker av Dicer enzymet. Disse bitene aktiverer deretter dannelsen av RNA-indusert deaktiveringskomplekset (RISC), som hemmer målrettet mRNA ved å binde seg til den på bestemte steder ved hjelp av føringsstrengen. Denne prosessen fører til slutt til mRNA nedbrytning og dermed forstyrrer oversettelsen av mRNA til det respektiveproteinet 6. Den RNAi-baserte genbanketeknikken som presenteres her, er derfor avhengig av injeksjon av dsRNA. For dyremodeller ble denne teknikken opprinnelig utviklet i C. elegans7 og D. melanogaster8, men har siden dukket opp som et kraftig funksjonelt genetisk verktøy i ikke-modellorganismer 9,10. På grunn av sin svært effektive natur i noen insekter, kan RNAi til og med brukes i skadedyrsbekjempelse11.

Som et forskningsverktøy har RNAi blitt brukt til å undersøke hvordan viktige molekylære utviklingsveier fungerer i utradisjonelle insektmodeller. For eksempel har RNAi i melbillen Tribolium castaneum vært medvirkende til å bestemme hvor dypt bevarte gener bidrar til spesifikke egenskaper i den boblen, som eksemplifisert for utviklingen av spesielt formede vinger12,,13,,14 og øyne15,16. Teknikkene som ligger til grunn for manipulasjonene i T. castaneum har blitt godtbeskrevet 17 og er avhengige av evnen til å immobilisere relativt tørre egg og larver på en klebrig overflate. Slik immobilisering er imidlertid ikke mulig for de våte utviklingsformene for vannlevende organismer som Sunburst Diving Beetle Thermonectus marmoratus. Som tilfellet er for mange utradisjonelle modellorganismer, mangler det et kommentert genom. For å manipulere genuttrykk i enhver organisme uten genom, er et rimelig og kostnadseffektivt første skritt å generere transkripsjoner og identifisere de antatte nukleotidsekvensene av de uttrykte opprinnelsesgenene basert på sekvens likhet med relaterte, men mer etablerte modellorganismer, i dette tilfellet primært Tribolium (Coleoptera) og Drosophila gener.

Her, for å demonstrere hvordan RNAi kan brukes på en vannlevende organisme, diskuterer vi først protokoller og programvare for RNA-ekstraksjon og transkripsjonsgenerering og montering, noe som tillater identifisering av spesifikke målrettede gensekvenser. Deretter oppsummerer vi de nødvendige trinnene for å syntetisere genspesifikk dsRNA. Deretter illustrerer vi hvordan egg kan injiseres i et akvatisk miljø og demonstrere inkubasjonsprotokoller for å dyrke utvikle embryoer. I tillegg viser vi hvordan agarose gel kan brukes til å helt immobilisere larver under injeksjonsprosessen, en teknikk som generelt er nyttig under ulike prosedyrer og kan brukes på en rekke leddyr. For å demonstrere hvordan RNAi kan brukes på ulike utviklingsstadier, inkluderer vi et eksempel der vi dempet øyetpigmenteringsgenet hvitt i embryoer. I tillegg beskriver vi et eksempel der solingsgenet laccase2(lac2) ble dempet under både den andre larvalinstar (for å påvirke larver av den tredje larval instar) og den tredje larval instar (for å påvirke voksne). Til slutt viser vi at injeksjonen av en lavere konsentrasjon av dsRNA fører til delvis nedslag, noe som viser at denne teknikken også kan brukes på gener der tap av funksjon er kjent for å være dødelig.

Protocol

1. RNA isolasjon og de novo transkripsjonsenhet

  1. Utfør total RNA-isolasjon fra sen stadium tredje instar dykking bille larval øyerør og voksne biller ved hjelp av en RNA isolasjon kit (se Table of Materials) som er designet for lipid-rik vev. Isoler totalt RNA fra T. marmoratus og sekvenser den etter tidligere beskrevne metoder18.
  2. De novo transkripsjonsenhet
    MERK: For å montere transkripsjonsplattformene de novo kan ulike bioinformatikkplattformer brukes (se Materialtabell). Disse plattformene er kommersielt tilgjengelige, og finnes i noen tilfeller som Unix-baserte kommandolinjeskript. Siden monteringen er de novo, anbefales det å montere transkripsjonene uavhengig på to plattformer og sammenligne resultatene for å utelukke falske positiver eller falske negativer.
    1. For å begynne å montere transkripsjonene, last opp rå leser på den respektive bioinformatikk plattform.
      MERK: Disse filene er vanligvis komprimert og i formatet FASTQSANGER. Gz. Det er ikke nødvendig å dekomprimere filene, da dette formatet godtas i neste trinn.
    2. Bruk den trimmomatiske kommandolinjen til å trimme de rå lesingene for å fjerne kortsekvenser eller korte lesinger som faller under standardterskelen. Dekomprimer de trimmede rå leser; filene vil nå være i FASTQ-format. Sammenkoble FASTQ raw leser for hvert eksempel for å få filer som er klare for de novo montering.
    3. Sett sammen de sammenføyde rå leser de novo ved hjelp av et hvilket som helst kommandolinjeskript som kan montere transkripsjoner de novo. Lagre den monterte transkripsjonen, som nå vil ha en liste over kontinger med sine respektive sekvenser, som en FASTA-fil. For å øke dekningen av forsamlingen, kombinere og montere flere transkripsjoner for samme art.
      MERK: Denne prosessen øker sjansene for å generere mer nøyaktige kontinger og er spesielt viktig hvis gener med lavt kopinummer er av interesse.
    4. Når det er montert, kan du vurdere transkripsjonen for fullstendighet ved å beregne dekningspoeng (programvare for dekningsvurdering er fritt tilgjengelig, se Materials tabell).
      MERK: En transkripsjon med dekningspoeng > 75% anses som bra. Relevansen av denne poengsummen avhenger imidlertid av årsaken til transkripsjonsgenerering. Hvis transkripsjonen for eksempel brukes til å identifisere gener med lavt kopinummer, er en poengsum >85 % bedre, da det betyr større dekning.
    5. Kommenter de novo-montert transkripsjon ved hjelp av et grunnleggende lokalt justeringssøkeverktøy (BLAST; se Materialtabell).
      MERK: For dette eksperimentet ble transkripsjonen først og fremst kommentert mot en database med kjente Drosophila-proteiner og en database med kjente billeproteiner. Listen over merknader kan lastes ned som en regnearkfil og contig / contigs som indikerer sekvens likhet med proteiner av andre organismer kan lastes ned som en FASTA-fil.
    6. Identifiser kontignummer/tall av proteinet av interesse og trekk ut nukleotidsekvensene. Bruk BLAST til å identifisere om proteinspesifikke konserifikke konserbare områder (for eksempel homeobox-domener) finnes i den kommenterte nukleotidsekvensen av interesse. Kontroller andre kontinger med samme merknad for nukleotidsekvensoverlappinger for å generere sekvensen av en genspesifikk transkripsjon.
      MERK: Identifisering av kontinger med sekvensoverlapping er vanligvis ikke mulig for alle genene, spesielt for gener med lavt kopinummer.
    7. Hvis full lengde sekvensen av genet er nødvendig, start med contig som har den høyeste sekvensen likhet som et initieringspunkt for å identifisere nukleotid sekvensen av hele modne transkripsjon ved hjelp av teknikker som 3 'og 5 'rask forsterkning av cDNA ender (RACE19).
    8. Kommenter samlingen som er hentet fra den andre plattformen ved å følge trinn 1.2.4–1.2.7.
      MERK: Ideelt sett bør resultatene være like for proteiner av interesse; Dekningen kan imidlertid variere mellom plattformer til en viss grad.
    9. Bruk det sammensatte transkripsjonsomet til å syntetisere artsspesifikk dsRNA som beskrevet i avsnitt 2.

2. Kloning og genspesifikk dsRNA-syntese

MERK: Genspesifikk kloning og dsRNA-syntese er beskrevet i detalj for T. castaneum20,21,,22. Følgende trinn er en kort oversikt.

  1. Kloning, bakteriell transformasjon og plasmidsekvensering
    1. Isoler total RNA fra organismen (som beskrevet i trinn 1.1) og lag komplementært DNA (cDNA) ved hjelp av et omvendt transkripsjonssett (se Materialseksjonstabell). Identifiser en eller to 100–1000 bp nukleotidsekvenser fra kontinger som er spesifikke for interessens gener.
      1. Design primer par som strekker seg over hele den identifiserte strekningen av nukleotider og forsterker sekvensen gjennom en polymerase kjedereaksjon (PCR). Legg til en ekstra 30 min trinn på slutten for å lage 3 'adenin overheng i forsterket DNA-produkt. Rens dette produktet ved hjelp av et PCR-rensesett (se Materialse tabell).
    2. Klone det rensede produktet i en pCR4-TOPO plasmid vektor (se Materialse tabell) etter leverandørens protokoll som følger med kloningssettet. Ved hjelp av varmesjokkbehandling forvandle klonet plasmids til kompetente bakterielle celler (belastning: E.coli DH10B) etter leverandørens protokoll for kompetente celler (se Table of Materials), og skjermen for vellykket forvandlet celler.
      MERK: Plater med kolonier kan pakkes inn i parafinfilm for å beholde fuktighet og lagres ved 4 °C i opptil en måned.
    3. Plukk kolonier av forvandlede celler ved hjelp av en 10 μL pipettespiss og kultur i lysogeny buljong (LB) som inneholder ampicillin (50 μg/ml) i en shaker-inkubator ved 37 °C og 200 o/min i 24 timer.
      MERK: For langtidslagring kan kultiverte celler fortynnes 1:1 med 100% glyserol og frosset ved -80 °C som glyserollagre.
    4. Isoler plasmider som inneholder genet av interesse fra denne kulturen ved hjelp av et miniprep isolasjonssett (se Materialsekk). Oppbevar de isolerte plasmidene (minipreps) ved -20 °C etter vurdering av utbyttespektrofotometralt. Mål spesielt prøveabsorbansen ved 260 nm, 280 nm og 230 nm. Beregn forholdene A260/A280 for kvantifisering av DNA, og A260/A230 for kvantifisering av DNA-renhet.
      MERK: Et forhold på 260/280 på 1,8 er generelt akseptert som tilstrekkelig rent DNA, forhold lavere enn 1,5 indikerer tilstedeværelse av rester av ekstraksjonsreagenser som fenol. Forholdet mellom 260/230 bør være større enn eller lik forholdet mellom 260 og 280. Lavere forholdstall indikerer restreagenskontaminering. Utbyttet varierer vanligvis fra 100 til 500 ng/μL.
    5. Sekvens de isolerte minipreps å bekrefte at den genspesifikke fragment har blitt vellykket integrert, blir flankert mellom 5 'T7 og 3'T3 promotor regioner i plasmid; Dette kan gjøres ved hjelp av universellE T7 og T3 sekvensering primere22. Bruk minipreps med genspesifikk sekvens av interesse for dsRNA forberedelse.
  2. PCR-forsterkning og in vitro dsRNA-syntese
    1. PCR-forsterkning og produktrensing
      1. Design plasmid-spesifikke eller genspesifikke primere som har T7-promotorsekvensen på sine 5 sider (sereferanse 22 for detaljer) for å forsterke et lineært fragment av det innsatte genet. Optimaliser utbyttet ved å sette opp minst 10 reaksjoner på 20 μL hver.
        MERK: Det resulterende produktet er flankert av to 20 bp T7 polymerasebindingssteder.
      2. Rense PCR-produktet ved hjelp av et PCR-produktrensesett (se Materials tabell), etter leverandørens kolonnebaserte elutionprotokoll. For å øke utbyttet, gjenta det endelige elution trinnet opptil 3 ganger med samme eluent. Vurder utbyttespektrofotometralt.
        MERK: Utbyttet varierer vanligvis fra 100 til 700 ng/μL. Dette rensede produktet kan oppbevares ved -20 °C inntil videre bruk.
    2. In vitro dsRNA-syntese og rensing
      1. Bruk det genspesifikke PCR-rensede produktet til å syntetisere dsRNA in vitro i henhold til protokollen til et dsRNA-syntesesett. Om nødvendig, forlenge inkubasjonstiden for økt dsRNA-produksjon.
      2. Vurder reaksjonens progresjon basert på opasiteten til reaksjonsblandingen (jo større mengden dsRNA-produktet, desto høyere turbiditet). På slutten av inkubasjonen, stopp reaksjonen ved hjelp av en DNase-behandling. For å gjøre dette tilsett 1 μL fra en beholdning på 2 U / μL, til reaksjonsblandingen. Utvid denne behandlingen til 1–2 timer for å sikre optimal nedbrytning av malens DNA.
      3. Rens dsRNA med et rensesett eller via følgende trinn.
        1. Fortynn det resulterende produktet med 115 μL kjernefritt vann og tilsett 15 μL av 3 M natriumacetat. Tilsett 2 volumer iskaldt 100% etanol til denne reaksjonsblandingen og utfell dsRNA over natten ved -20 °C.
          MERK: På dette tidspunktet kan prøvene lagres trygt uten å påvirke den endelige avkastningen.
        2. Sentrifuge bunnspiss ved 0 °C i 20 min ved 9000 x g og kast supernatanten. Vask produktet én gang med iskaldt 70 % etanol og sentrifuge i 15 min ved 13000 x g.
        3. Fjern den overnaturlige og lufttørke pelleten i 5–15 min. Resuspend pelleten i opptil 40 μL kjernefritt vann (dette volumet kan justeres basert på den isolerte pelletstørrelsen) og vurdere utbyttet og renheten spektrofotometrisk, som beskrevet i 2.1.4.
        4. Oppbevar renset dsRNA ved -20 °C inntil videre bruk. Bruk renset dsRNA til injeksjon på ønsket utviklingsstadium.

3. Innsamling og fremstilling av tidlig stadium T. marmoratus embryoer for dsRNA injeksjoner

  1. Forbered en agaroseplate for inkubasjon av T. marmoratus embryoer.
    1. Oppløs først 20 mg lavtsmeltende agarosepulver i 100 ml autoklavet destillert vann (2 % agarose) og kok deretter denne blandingen i en mikrobølgeovn til en klar løsning oppnås. Vær forsiktig med den varme løsningen, da luftbobler kan føre til at den renner over.
    2. Dispenser denne løsningen i en liten petriskål. For å lage spor (som vil holde embryoene) på overflaten av agaroseplaten, legg tre 1-2 mm brede plastrør (for eksempel tuppene av plastoverføringspipetter) på overflaten av væsken som oppsto før den stivner.
    3. Når agarose stivner, bruk et par stumpe tang for å fjerne disse rørene. Tilsett 500 μL autoklavet destillert vann ved hjelp av en P1000 mikropipette for å dekke disse innrykkene i agarose.
  2. Bruk en fin naturlig hårbørste, samle T. marmoratus embryoer som er 5-8 timer gamle fra bille hekkende steder i et glass hulrom parabolen fylt med autoklavet destillert vann. Overvåk hekkestedene ofte for å sikre at de oppnådde eggene er av riktig alder.
  3. Dechorionate embryoene under et stereomikroskop ved hjelp av fine disseksjonskraft. For å gjøre dette, visualiser chorion under mikroskopet (ved ønsket forstørrelse) ved å plassere lyskilden i en passende vinkel, og ta deretter chorion fra to sider med skarpe tang, rive det åpent og forsiktig skyve embryoet ut. Siden det er to lag, må du sørge for at begge er fjernet.
  4. Ved hjelp av en fin naturlig hår pensel, forsiktig overføre embryoer fra glasshulen parabolen til agarose plate og ordne dem i sporene under et stereomikroskop. Vær veldig forsiktig under denne prosessen, da dehorionerte embryoer er svært skjøre. Bruk de forberedte embryoene til dsRNA-injeksjoner.
    MERK: Den litt tykkere enden er siden av embryoet der hodet vil utvikle seg.

4. dsRNA mikroinjeksjoner i tidlig stadium T. marmoratus embryoer

  1. For å injisere embryoer i tidlig stadium med genspesifikke dsRNA, klargjør mikroinjeksjonsnåler ved hjelp av en mikroinjeksjonsnåltrekker (se Materialtabell). Mens du visualiserer nålespissen under et stereomikroskop, bruk et par fine tang til å bryte nålespissen, og skape en skarp kant. Ideelt sett bryte nålespissen diagonalt slik at en skarpere kant forblir på den ene siden, noe som vil tillate det å komme inn i embryoet samtidig som den forårsaker minimal skade.
  2. Tin den rensede bestandsdsRNA-løsningen på is, tilsett 1 μL av 10x injeksjonsbufferen og topp den av med dobbelt destillert vann, for å lage 10 μL injeksjonsvæske. For injeksjoner er en dsRNA-konsentrasjon på 1 μg/μL vanligvis egnet, men kan justeres i henhold til fenotypisk alvorlighetsgrad av de resulterende dyrene).
    MERK: Klargjør 1 ml 10x injeksjonsbuffer22 ved å tilsette 10 μL på 0,1 M natriumfosfatbuffer (laget ved å blande 8,5 ml 1 M Na2HPO4 og 1,5 ml e.l 1 M Na2HPO4 og 1,5 ml e.l 2 M NaH2PO4 justert til pH 7,6 ved 25 °C med 100 μL på 0,5 M KCl), 100 μL matfargestoff og 790 μL dobbeltdestillert vann.
    1. Bruk en P10-pipette til å etterfylle mikroinjeksjonsnålen med den arbeidende dsRNA-oppløsningen. Når oppløsningen har fylt spissen av nålen, fest den til en mikronåleholder som er koblet til et mikroinjeksjonssystem som benytter trykkutstøtingsteknologi (se Materials tabell).
  3. Slå på mikroinjeksjonssystemet og trykklufttilførselen. Juster injeksjonstrykket til 15 psi ved hjelp av mikroventilen på mikroinjeksjonssystemet. Juster injeksjonsvarigheten ved hjelp av tidsjusteringsknappen (sett den til "Sekunder").
    1. Etter hvert som injeksjonsvarigheten avhenger av ønsket injeksjonsvolum, må du om nødvendig justere denne parameteren på mikroinjeksjonssystemet før hver injeksjon. Bruk et injeksjonsvolum på 1–2 nL til tidlig stadium T. marmoratus embryoer.
      MERK: Høyere injeksjonsvolumer har en tendens til å forstyrre embryooverlevelsesraten.
  4. For å måle volumet av injeksjonsvæske som dispenseres av mikroinjeksjonssystemet, kalibrer injeksjonsnålen ved å vurdere volumet av væskeboblen som dannes på spissen av nålen når den injiseres i luften. For T. marmoratus embryoer, bruk en optimal boblestørrelse på 100–200 μm. Injeksjonsnålen er av god kvalitet hvis dette kan oppnås ved 15 psi med en injeksjonsvarighet på ~ 3 s.
  5. Juster nålen og agaroseplaten som inneholder embryoene under et stereomikroskop, slik at nålen nærmer seg embryoene i en vinkel mellom 45° og 60°.
  6. Bruk mikromanipulatoren til å bevege mikroneedlet sakte mens du overvåker fremdriften gjennom stereomikroskopet. Når spissen av nålen berører overflaten av et embryo, må du forsiktig flytte nålen fremover til den pierces overflaten av embryoet. Ikke perforer embryoet dypt med nålespissen, da dette kan påvirke embryoets overlevelse. For å redusere variabiliteten, lever injeksjonen midt i embryoet.
  7. Når nålen er inne i embryoet, trykk forsiktig på injeksjonsknappen på mikroinjektoren for å levere dosen av dsRNA til embryoet. Etter injeksjon av 1–2 nL dsRNA trekkes nålen langsomt tilbake fra embryoet slik at det ikke får embryoet til å briste.
    1. Injiser de andre embryoene på en lignende måte. Hvis mikroinjeksjonsnålen blir blokkert under prosedyren, må du oppheve blokkeringen ved å øke injeksjonstrykket og varigheten. Visuelt identifisere vellykket injisert embryoer ved tilstedeværelse av et farget sted på injeksjonsstedet (siden injeksjonsbufferen inneholder matfarer).
  8. Plasser forsiktig parabolen med injiserte embryoer i et fuktighetskammer.
    1. For å konstruere et slikt kammer, ta en plastboks med lokk, steriliser den med 70% etanol, la det tørke og legg vev gjennomvåt i autoklavet vann nederst for å gi et fuktig miljø. Plasser dette fuktighetskammeret i en inkubator med passende temperatur (i dette tilfellet 25 °C) og lyssyklus på 14 t lys og 10 t mørkt.
  9. La injiserte embryoer utvikle seg til første instar larver, som krever 4-5 dager. Overvåk fremdriften av embryoutvikling daglig ved hjelp av et stereomikroskop for å identifisere morfologisk synlige knockdown fenotyper som avbildet i figur 2.
  10. Dokumenter denne fremgangen ved å ta digitale bilder ved hjelp av et høyoppløselig kamera. Fjern døde embryoer og etterfyll vannet på agaroseplaten daglig for å unngå utskalking og mulig spredning av mikrobiell forurensning til andre overlevende embryoer i inkubasjonsperioden.
  11. Utfør egnede kontroller for dsRNA-injeksjoner, inkludert bufferinjeksjoner, injeksjoner av dsRNA syntetisert mot følelsen av interessesgenet, og injeksjoner av dsRNA syntetisert mot sekvenser som ikke finnes i målorganismen. Bekreft RNAi knockdown ved hjelp av flere molekylæremetoder 22.

5. Fremstilling av T. marmoratus larver for dsRNA injeksjoner

MERK: I motsetning til embryoer i tidlig stadium er T. marmoratus larver relativt solide og kan injiseres med større volumer. For eksempel kan andre instars injiseres med opptil 2 μL dsRNA arbeidsløsning og tredje instars med minst 3 μL uten merkbare negative effekter på overlevelsesraten. For å injisere dsRNA er det nyttig å immobilisere larver ved å bygge dem inn i agarose.

  1. Før du samler larver, smelte 2% agarose og holde den i et vannbad på 60-70 ° C for å opprettholde den i flytende form. Forbered en immobiliseringsfat ved å helle smeltet 2% oppsto i en liten petriskål og deretter kjøle til størknet. Bruk stumpe tang for å lage et grunt spor i agaroseplaten (omtrent på størrelse med leddyret som skal bygges inn) for hvert dyr som skal injiseres.
  2. Samle unge larver på riktig utviklingsstadium (ett stadium før scenen ønsket for analyse). For å gjøre dette, tøm forsiktig vannet fra kulturkoppene som inneholder larver og følg trinnene nevnt nedenfor.
  3. Bedøves på is (plukk forsiktig larven ut fra vannkoppen og legg den forsiktig på is) til larven ikke viser noen bemerkelsesverdige bevegelser. Bruk sløve, myke tang til å løfte larven forsiktig fra isen og plassere den på immobiliseringsstadiet med nakke og kropp i sporet, men halen som ligger over agaroseoverflaten slik at den ikke kan dekkes, noe som gjør at larven kan fortsette å puste gjennom halespirakler.
  4. Dekk larven med et tykt lag med agarose som fortsatt er flytende, men ikke farlig varmt. Hvis det ved et uhell var dekket, bruk tangen til å frigjøre halen og de to segmentene under den fra agarose. Når agarose stivner, bruk larven til dsRNA injeksjoner.

6. dsRNA mikroinjeksjoner i T. marmoratus larver

  1. Forbered og fyll en mikroinjeksjonsnål med ønsket mengde genspesifikk dsRNA-arbeidsløsning (som beskrevet i trinn 4.1–4.2). Fest nålen til en nåleholder som er koblet til en manuelt kontrollert mikroinjeksjonssprøyte. Før du fester kanylen, må du trekke sprøytestempelet helt ut for å unngå å gå tom for injeksjonstrykk midt i prosedyren.
  2. Plasser den immobiliserte larven slik at injeksjonsstedet, som ligger dorsalt mellom tredje og fjerde kroppsplatesegmenter, er på linje med banen til mikroinjeksjonsnålen i relativt flat vinkel (nesten parallelt med scenen).
    MERK: Fiske nålen og larven i denne posisjonen er viktig, da det gir banen til minst motstand for nålespissen for å perforere larver med minimal skade.
  3. Når nålen og larven er plassert, må nålespissen forsiktig flyttes inn i larven ved hjelp av mikromanipulatoren mens du overvåker fremdriften gjennom et stereomikroskop.
  4. Etter at spissen har perforert vevet, må du sakte og forsiktig legge press på sprøyten. Juster injeksjonstrykket ved å observere bevegelsen av den fargede injeksjonsvæsken i nålen under mikroskopet.
  5. Trekk kanylen forsiktig tilbake etter injeksjonen. Bruk myke tang til å skrelle bort og dermed frigjøre larven fra agarose. Overfør larven tilbake til en beholder med vann (ved romtemperatur) og la den utvikle seg videre i en inkubator eller kulturrom ved 25\u201228 °C og en lyssyklus på 14 timer lys og 10 t mørkt.
  6. Bruk passende kontrollinjeksjoner og knockdown-kvantifiseringer, som beskrevet i trinn 4.10.

Representative Results

Ved hjelp av protokollen beskrevet ovenfor, slo vi ned tre forskjellige gener, nemlig hvit, laccase2 (lac2) og Lens3 (Tabell 1), på en rekke forskjellige utviklingsstadier av Sunburst Diving Beetle T. marmoratus. Vi utførte RNAi i T. marmoratus ved å injisere dsRNA på et svært tidlig stadium under embryogenese (figur 1A). Siden noen av embryoene ikke overlever prosessen og blir nekrotiske (figur 1B),må de fjernes for å holde de gjenværende embryoene sunne. Eksemplifisert her er injeksjoner av dsRNA mot det hvite genet. Dette genet er godt kjent i Drosophila som en av tre ATP-bindende kassett (ABC) transportører involvert i opptaket og lagring av forløperne til øyepigment23. Ldigvis resulterer tap av funksjon i en uskadelig, white-eye fenotype. Våre resultater viser at injeksjoner av dsRNA rettet mot det orthologøse hvite genet i T. marmoratus embryoer fører til tap av øyepigmentering i nyvoksende larver. I dette tilfellet er villtype larver preget av tungt pigmenterte øyne, og RNAi knockdown av hvitt fører til ulike nivåer av reduksjon og til og med fullstendig eliminering av øyepigment. Samlet sett observerte vi minst en viss reduksjon i øyefarge hos 34 % av de overlevende embryoene (n = 35). Figur 2A sammenligner en kontrollperson og en person med litt lysere øyenfarge. Figur 2B illustrerer en mer alvorlig knockdown hos en person, der de mer ventrale øynene (Eyes 2-5) av klyngen er helt uovertraktet, mens de dorsale øynene fortsatt viser noen pigmentering. Disse forskjellene fremhever hvordan effektiviteten av knockdown kan variere regionalt, noe som muligens er relatert til forskjeller i effekten av dsRNA penetrasjon i tett vev. En annen person viser i hovedsak fullstendig pigmenttap i alle øyne (Figur 2C).

For å undersøke hvor godt RNAi fungerer på larvalstadiet av T. marmoratus,injiserte vi dsRNA rettet mot tannisk gen lac2 i andre instar larver noen dager før de skulle smelte inn i tredje instars (Figur 3) og evaluerte effekten på cuticular fargestoffer av tredje instar larver. Lac2 er en type fenoloxidase som oksidativt konjugerer proteiner for å gjøre dem uoppløselige, hardere og mørkere. Knockdown i melbillen T. castaneum har vist seg å føre til lysere fargede individer i lave doser, men regnes som dødelig i høye doser24. Figur 4 illustrerer at denne behandlingen også fører til lysere fargede Sunburst Diving Beetle larver. Spesielt i dette eksperimentet hadde 75% av de overlevende injiserte larver (n = 12) redusert pigmentering (sammenlignet med 0% i kontrollgruppen). Figur 4A viser en person med relativt mild depigmentering, mens figur 4C illustrerer hodet til en T. marmoratus larve der den mørke fargen på skjellaget er nesten fraværende. Depigmentering var spesielt tydelig for det sentrale mørke mønsteret som er typisk for disse larver, mens dette mønsteret forble tydelig synlig i en kontrollinjisert person (figur 4B). I tillegg ble det observert en lightening av haletrachea, som avbildet i figur 4D. I tilfelle hvor lac2 dsRNA ble injisert i tredje instar larver, ble lettere voksne individer oppnådd (figur 5). Legg merke til at vingene på knockdown beetle er noe deformert, sannsynligvis på grunn av sin uvanlige mykhet.

I tillegg til å endre morfologiske egenskaper, er det mulig å bruke RNAi til å målrette gener som påvirker atferd. For å demonstrere dette utførte vi RNAi mot et nøkkellinseproteinkodingsgen, Lens318, og injiserte det i andre instar larver for å påvirke de optiske egenskapene til tredje instar larval øyne. Eventuelle effekter på linsen observert her er sannsynlig fordi øynene til T. marmoratus larver gjennomgår stor øyevekst ved denne overgangen, noe som også innebærer store optiske endringer i linsen25. RNAi knockdown i dette eksperimentet var svært effektiv. Verifisering gjennom qPCR viste en suksessrate på 100 %. av 13 testede personer ble 12 slått ned til mindre enn 10 % av uttrykksnivået for kontrollpersoner, og den gjenværende personen hadde et uttrykksnivå på 17 % av kontrollnivået (upublisert observasjon). På fenotypisk nivå var bare noen individer alvorlig handikappet eller ute av stand til byttedyrfangst, som det er illustrert i figur 6 for en person som gjentatte ganger nærmet seg byttet fra svært nær avstand, men konsekvent overshot det.

Tabell 1: Primer sekvenser og amplicons for hvite, lac2, og Lens3 proteiner. Vennligst klikk her for å laste ned denne tabellen.

Figure 1
Figur 1: Illustrasjon av embryoinjeksjoner. (A)Dehorionated embryoer stilt opp på en agarose plate og injisert nær sentrum ved hjelp av en mikroinjeksjon nål fylt med dsRNA og mat-fargestoff-inneholdende injeksjon buffer. Skaleringslinjen representerer 500 μm. (B) En person med en mer alvorlig knockdown. Injiserte embryoer holdes i et fuktighetskammer og overvåkes daglig for å score fenotyper og fjerne døde individer (som blir brune). Skalalinjen representerer 5 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Eksempel på fullt utviklede embryoer som ble injisert med dsRNA mot hvitt. (A) Sammenligning av en person med en reduksjon i øyepigmentering (venstre) og en kontrollinjisert person (høyre). E1–E6 viser til Øyne 1–6. (B) En person med en mer alvorlig knockdown fenotype, som illustrerer at noen av øynene i klyngen til tider påvirkes av knockdown enn andre. (C) Individ med nesten fullstendig tap av øyepigmentering. Skalalinjen representerer 200 μm; Panel B og C er representert i samme skala. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Illustrasjon av larveinjeksjoner. (A)Flere larver immobilisert ved å bygge inn i 2% oppsto med halen spirakler igjen klar av noen agarose. (B)Mikroelektrod som inneholder injeksjonsoppløsningen som er plassert slik at spissen kan trenge inn i den fine membranen mellom to segmenter. (C) Blått injeksjonsfargestoff synlig på injeksjonsstedet etter injeksjonen. Skala barer representerer 1 cm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: RNAi for laccase2 brukes på andre instar larver som resulterer i redusert cuticle fargestoff i tredje instar larver. (A)Relativt mildt tap av fargestoffer i en lac2 RNAi individuell (bunn) sammenlignet med en kontrollinjisert person (topp). Vektstangen representerer 5 mm. (B) Leder av en kontrollperson som viser det karakteristiske mørke fargede mønsteret i midten av hodet. (C) Relativt alvorlig knockdown av lac2 fører til et nesten fullstendig tap av sentrale hodet fargestoffer. (D) Tap av fargestoff i den store halesekken på en lac2 RNAi individuell (bunn) sammenlignet med en kontrollinjisert person (topp). Skaleringsstolper i B\u2012D representerer 1 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: RNAi for laccase2 påført en tredje instar larve som resulterer i redusert skjellaget farge hos en voksen. Knockdown individuell (venstre) er også preget av svært myk elytra sammenlignet med kontrollen (høyre). Skalalinjen representerer 5 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Knockdown av et stort linseprotein som fører til mangler i byttedyrfangst. (A–C). Tre eksempler hvor en Sunburst Diving Beetle larve, der optiske underskudd ble indusert gjennom RNAi, var ikke i stand til å fange byttedyr (mygglarver). Representative stillbilder ble valgt fra et videoopptak av karakteristiske byttedyropptak. KontrollDlarve fange byttedyr. Alle skala barer representerer 2 cm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Vårt mål er at denne samlingen av metoder vil gjøre RNAi allment tilgjengelig, spesielt etter hvert som dette verktøyet forblir en kraftig synergistisk teknikk til CRISPR/Cas9-basert genredigering, med den fordelen at det kan brukes på de ønskede utviklingsstadiene av studerte organismer. For å eksemplifisere denne styrken injiserte vi dsRNA i embryoer og inn i forskjellige larvestadier. Injeksjoner i egg påvirket utviklingen av embryoer (figur 2), injeksjoner i det andre larvalstadiet hadde tilsynelatende effekter på det tredje larvalstadiet (figur 4 og figur 6), og injeksjoner i tredje larvalstadium viste effekter hos de voksne (figur 5). Mens den nøyaktige timingen må etableres eksperimentelt, vanligvis, injeksjoner trer i kraft i løpet av få dager. Suksessen til denne prosessen kan påvirkes av lengden på dsRNA-sekvensen. Her presenterte vi eksempler med litt over 200 bp til mer enn 800 bp. Som en generell regel foretrekkes sekvenser mellom 100 og 600 bp for å begrense off-target effekter, men sekvenser opp til 1000 bp gir gode resultater22. Et spørsmål i forhold til RNAi er varigheten av knockdown som kan oppnås gjennom denne teknikken. Siden fenotypene var terminale på hvert trinn, kan vi ikke kommentere dette problemet basert på våre presenterte resultater. Det har imidlertid tidligere vært bemerket at RNAi effekter er generelt relativt lang levd, og at høyere konsentrasjoner føre til lengre varige knockdowns20.

En begrensning av denne teknikken er at den fungerer bedre for noen organismer enn for andre, og det synes ikke å være noen direkte måte å forutsi hvor godt det vil fungere a priori. Likevel har det blitt funnet å fungere godt for et stort spekter av forskjellige organismer. Innenfor leddyr inkluderer dette arachnids26,krepsdyr27, og en rekke insekter, med spesielt høye suksessrater hos biller28. En ytterligere komplikasjon er at forskjeller i fenotype alvorlighetsgrad ofte forekommer mellom individer til tross for anvendelsen av samme mengde dsRNA. Som illustrert i figur 2Bkan variasjon til og med forekomme i en person. I våre RNAi-studier rettet mot ulike gener som er involvert i T. marmoratus larval øyeutvikling, har vi ofte funnet ut at noen øyne påvirkes mer alvorlig enn andre. Dette fenomenet kan være relatert til det relativt tette vevet i øyeklyngen, med dsRNA bedre i stand til å nå noen av enhetene.

For vellykket gjennomføring av RNAi-eksperimenter er det avgjørende at flere parametere er optimalisert for målgenet. For eksempel kan konsentrasjonen av dsRNA og lengden på det målrettede genet sterkt påvirke utfallet20. En annen kritisk parameter er hvordan injeksjonene utføres, da denne prosessen i stor grad kan påvirke overlevelsesraten. For embryoer oppnådde vi de beste resultatene ved å målrette midten av embryoet. En godt lagt ut plate gjør det mulig å injeksjon av 100 eller flere embryoer i en enkelt økt. For larver er det viktig å sette inn injeksjonsnålen mellom segmentene. Disse injeksjonene krever mer dsRNA, og basert på larver tilgjengelighet, våre injeksjonssett her vanligvis bare besto av noen få dyr om gangen. For alle injeksjoner er det viktig å forhindre at luft kommer inn i organismen.

I noen tilfeller kan tilbakemeldingssløyfene til et genregulatorisk nettverk og genetisk redundans påvirke penetreringen av RNAi fenotyper, til tross for konsistente knockdowns. Dette synes å være tilfelle for våre atferdsobservasjoner av larver med svært vellykkede knockdowns av et fremtredende linseprotein, Lens318. Selv om vi bekreftet den høye effektiviteten av disse knockdowns gjennom qPCR, ble det observert betydelig variasjon i de tilknyttede fenotypene. Dette resultatet understreker nødvendigheten av å kvantifisere RNAi knockdowns (for detaljer om alternativer, se22). Hvis det ikke er noen klar forventning om en priori i forhold til de resulterende fenotypene, er en god måte å kontrollere for off-target effektene av RNAi å målrette det samme genet med to ikke-overlappende sekvenser av dsRNA og å evaluere resultatene for vanlige fenotyper.

I motsetning til genredigeringsteknikker er RNAi også et kraftig verktøy for å studere dødelige gener, og det er to måter å gjøre det på. For eksempel, hvis man er interessert i det funksjonelle bidraget til et gen hvor tap av funksjon tidlig i utviklingen er kjent for å være dødelig, kan en funksjonell undersøkelse av et slikt gen oppnås ved ganske enkelt å la dyret utvikle seg normalt og deretter slå ned genet via RNAi senere i utvikling (det vil si hos den voksne). Alternativt kan et gen der fullstendig funksjonstap er kjent for å være dødelig undersøkes gjennom en delvis knockdown, som kan oppnås ved å injisere en rekke dsRNA-konsentrasjoner. Noen av våre resultater viser knockdowns av lac2, som er kjent for å være dødelig hvis skjellaget i insekter blir altfor myk24. Selv lac2 RNAi beetle avbildet i figur 5 ville være usannsynlig å overleve utenfor laboratorieforhold. Et annet dødelig gen er kuttet, som koder for en transkripsjonsfaktor som er grunnleggende for celle-skjebne spesifikasjon i ulike organsystemer i leddyr og har vært knyttet til glia utvikling i Drosophila visuelle system29. Basert på vår erfaring med kutt RNAi i T. marmoratus embryoer, kan vi fremkalle informative øye fenotyper i embryoer som er i stand til å fullføre sin embryonale øyeutvikling (upubliserte observasjoner). Her, høyere doser synes å føre til høyere dødelighet, mens lavere doser resultere i observerbare og informative fenotyper.

Vår protokoll viser ikke bare de nødvendige trinnene for en forsker å forfølge RNAi eksperimenter på T. marmoratus, som illustrert, men også er generelt aktuelt for andre organismer, spesielt vannlevende organismer. Blant vannlevende organismer er det allerede flere eksempler innen krepsdyr som vannlopper Daphnia30 og reker (for en nylig gjennomgang, se referanse31). Det er gode muligheter blant akvatiske insekter, da de har blitt anslått å utgjøre ca 6% av alt insektmangfold, med sannsynligvis mer enn 200.000 arter32. Videre har RNAi allerede blitt utført på vann striders som har en tendens til å bebo overflaten av vannmiljøer33. Hvis det ikke finnes noe genom, kan det monteres en transkripsjonsome de novo. Så lenge denne prosessen avslører kontinger av noen få hundre nukleotider, kan dsRNA mot bestemte gener utformes. Vår protokoll for immobiliserende insekter i agarose vil trolig også være nyttig for andre prosedyrer, spesielt for myke, formbare og vannlevende organismer. Samlet sett er RNAi fortsatt en kraftig teknikk for å manipulere genuttrykk i en mangfoldig gruppe organismer, selv når ingen andre molekylære og genetiske verktøy er tilgjengelige.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke Dr. Josh Benoit for hans hjelp med bioinformatikk Hailey Tobler for hennes hjelp til å heve Sunburst Diving Beetles og Tamara Pace for redaksjonell hjelp. Denne forskningen ble støttet av National Science Foundation under tilskudd IOS-1456757 og IOS-1856341 til EKB og IOS1557936 til YT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. RNA isolation and de novo transcriptome assembly
liquid nitrogen University Stockroom Typically locally available at research institutions
pipette tips Fisher Scientific size dependent Products from other vendors would work equally well
RNeasy lipid tissue mini kit (RNA isolation kit) Qiagen 74804 Detailed specific protocol is provided with the kit
spectrophotometer (NnanoDrop) Thermo Fisher 9836674 Other models would work equally well
1.2. De novo transcriptome assembly.
BUSCO.v3 https://busco.ezlab.org/ Any freely available software for assessing trasncriptome completeness can be used.
CLC Genomics workbench Qiagen 832021 Other equivalent software packages are also available
Galaxy workbench https://usegalaxy.org/ An open source online transcriptome assembly & annotation pipeline
NCBI BLASTx https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?LINK_LOC=blasthome&PAGE_TYPE=BlastSearch&PROGRAM=blastx An open source online alignment and annotation pipeline
2. cDNA synthesis, Cloning & Miniprep isolation
ampicillin sodium salt Gibco 11593-027 Products from other vendors would work equally well
glycerol Fisher Scientific G33-500 Products from other vendors would work equally well
LB broth Fisher Scientific BP1426-500 Products from other vendors would work equally well
Omniscript RT (reverse trasncription) kit Qiagen 205111 Detailed specific protocol is provided with the kit
One Shot™ TOP10 Chemically Competent E. coli Invitrogen C404010 Detailed specific protocol is provided with the kit
Petri dishes Fisher Scientific FB0875713 Products from other vendors would work equally well
PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit ThermoFischer 771471 Detailed specific protocol is provided with the kit
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104 Detailed specific protocol is provided with the kit
shaker-incubator Labnet 211DS Other models would work equally well
spectrophotometer (NnanoDrop) Thermo Fisher 9836674 Other models would work equally well
thermal cycler for PCR BioRad T100 Other models would work equally well
TOPO TA Cloning kit Invitrogen 1845069 Detailed specific protocol is provided with the kit
X-Gal Solution Thermo Scientific R0941 Products from other vendors would work equally well
2.2 PCR amplification & in vitro dsRNA synthesis
Centrifuge Fisher Scientific accuSpin Micro 17R Other models would work equally well
ethanol Fisher Scientific A4094 Products from other vendors would work equally well
FastTaq DNA Polymerase, dNTPack Roche 13873432 This kit contains all the reagents necessary for a PCR
MEGAclear Transcriiption clean up kit ThermoFischer AM1908 Detailed specific protocol is provided with the kit
MEGAscript T7 Transcription kit ThermoFischer AM1334 Detailed specific protocol is provided with the kit
nuclease-free water Fisher Scientific AM9932 Products from other vendors would work equally well
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104 Detailed specific protocol is provided with the kit
sodium acetate Fisher Scientific BP333-500 Make 3M working solution
Spectrophotometer (NnanoDrop) Thermo Fisher 9836674 Other models would work equally well
3. Collecting and preparing early stage T. marmoratus embryos for dsRNA injections
agarose Fisher Scientific 9012-36-6 Products from other vendors would work equally well
distilled water Fisher Scientific 9180 Products from other vendors would work equally well
forceps (Dumon #4 Biology) Fine Science Tools 11242-40 Products from other vendors would work equally well
glass cavity dish (3 well-dish) Fisher Scientific 50-243-43 Products from other vendors would work equally well
microwave Welbilt turn-table Other models would work equally well
natural hair paintbrush Amazon Any fine brush will do
P1000 micro-pipetter Gilson F123602 Other models would work equally well
Petri dishes Fisher Scientific FB0875713 Products from other vendors would work equally well
stereomicroscope Microsocope Central 10446293 Any good stereomicroscope will work
transfer pipettes Fisher Scientific 21-200-109 Products from other vendors would work equally well
4. dsRNA micro-injections in early stage T. marmoratus embryos
digital camera Edmund optics (Qimaging) Retiga 2000R Other models would work equally well
ethanol Fisher Scientific A4094 Products from other vendors would work equally well
food dye Kroger Any available food dye should work fine
humidity chamber take any plastic box with a lid, sterilize it with 70% ethanol and let it dry
incubator Labline 203 Other models would work equally well
injection buffer Prepared for 1 mL following reference #22 : Mix 10 µL of 0.1 M sodium phosphate buffer, 100 µL of 0.5 M potassium chloride solution, 100 µL of food dye and 790 µL of double-distilled water. Store in 4 °C.
intracellular Microinjection Systems (Picospritzer) Parker 052-0500-900 Currently the model III is available, but older models work also
micro needle holder A-M Systems 672441 Other products would work equally well
microinjection needles (1.2 mm x 0.68 mm, 4 inches) A-M Systems 603000 Other models would work equally well
micromanipulator Drummond Scientific Company 3-000-024-R Any quality micromanipulator will work
monosodium phosphate Fischer scientific 7558-80-7 To make 10 mL of 1 M working solution: Add 1.2 g of monosodium phosphate powder to 10 mL of Double distilled water and mix until clear solution is obtained
P-1000 Micropipette Puller Sutter Instrument P-1000 Puller settings:Heat 575, Pull 60, Velocity 75 Delay 110, Pressure 700.
P10 micro-pipetter Gilson F144802 Other models would work equally well
P1000 micro-pipetter Gilson F123602 Other models would work equally well
potassium chloride Fischer scientific 7447-40-7 To make 100 mL of 0.5 M potassium chloride solution: Add 3.73 g of potassium chloride crystals to 100 mL of double distilled water and mix until clear solution is obtained.
sodium phosphate buffer (0.1M) To make 10 mL of 0.1 M of this buffer: Mix 8.5 mL of 1 M sodium phosphate dibasic solution with 1.5 mL of 1 M monosodium phosphate solution. Check the pH with a pH meter and adjust accordingly to pH 7.6 at room temprature.
sodium phosphate dibasic Fischer scientific 7558-79-4 To make 10 mL of 1 M working solution: Add 1.42 g of sodium phosphate dibasic powder to 10 mL of Double distilled water and mix until clear solution is obtained
stereomicroscope Microsocope Central 10446293 Any good stereomicroscope will work
5. Preparing T. marmoratus larvae for dsRNA injections
agarose Fisher Scientific 9012-36-6 Products from other vendors would work equally well
forceps (Dumon #4 Biology) Fine Science Tools 11242-40 Products from other vendors would work equally well
Petri dishes Fisher Scientific FB0875713 Products from other vendors would work equally well
6. dsRNA micro-injections in T. marmoratus larvae
injection buffer (10x) See section 4
microinjection needles (1.2 mm x 0.68 mm, 4 inches) A-M Systems 603000 Other models would work equally well
microinjection syringe A-M Systems 603000 Other models would work equally well
micro needle holder A-M Systems 672441 Other products would work equally well
P-1000 Micropipette Puller Sutter Instrument P-1000 Puller settings:Heat 575, Pull 60, Velocity 75 Delay 110, Pressure 700.
stereomicroscope Microsocope Central 10446293 Any good stereomicroscope will work

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Muller, B., Grossniklaus, U. Model organisms - A historical perspective. Journal of Proteomics. 73, 2054-2063 (2010).
  2. Gilbert, L. A., et al. CRISPR-Mediated Modular RNA-Guided Regulation of Transcription in Eukaryotes. Cell. 154, 442-451 (2013).
  3. Westerman, E. L., et al. Aristaless Controls Butterfly Wing Color Variation Used in Mimicry and Mate Choice. Current Biology. 28, 3469 (2018).
  4. Perry, M., et al. Molecular logic behind the three-way stochastic choices that expand butterfly colour vision. Nature. 535, 280 (2016).
  5. Boettcher, M., McManus, M. T. Choosing the Right Tool for the Job: RNAi, TALEN, or CRISPR. Molecular Cell. 58, 575-585 (2015).
  6. Meister, G., Tuschl, T. Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA. Nature. 431, 343-349 (2004).
  7. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  8. Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95, 1017-1026 (1998).
  9. Mello, C. C., Conte, D. Revealing the world of RNA interference. Nature. 431, 338-342 (2004).
  10. Agrawal, N., et al. RNA interference: Biology, mechanism, and applications. Microbiol. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67, 657 (2003).
  11. Gu, L. Q., Knipple, D. C. Recent advances in RNA interference research in insects: Implications for future insect pest management strategies. Crop Protection. 45, 36-40 (2013).
  12. Ravisankar, P., Lai, Y. T., Sambrani, N., Tomoyasu, Y. Comparative developmental analysis of Drosophila and Tribolium reveals conserved and diverged roles of abrupt in insect wing evolution. Developmental Biology. 409, 518-529 (2016).
  13. Tomoyasu, Y., Wheeler, S. R., Denell, R. E. Ultrabithorax is required for membranous wing identity in the beetle Tribolium castaneum. Nature. 433, 643-647 (2005).
  14. Tomoyasu, Y., Arakane, Y., Kramer, K. J., Denell, R. E. Repeated Co-options of Exoskeleton Formation during Wing-to-Elytron Evolution in Beetles. Current Biology. 19, 2057-2065 (2009).
  15. Yang, X., et al. Probing the Drosophila retinal determination gene network in Tribolium (II): The Pax6 genes eyeless and twin of eyeless. Developmental Biology. 333, 215-227 (2009).
  16. ZarinKamar, N., et al. The Pax gene eyegone facilitates repression of eye development in Tribolium. Evodevo. 2, 15 (2011).
  17. Linz, D. M., Clark-Hachtel, C. M., Borras-Castells, F., Tomoyasu, Y. Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum. Journal of Visualized Experiments. , e52059 (2014).
  18. Stahl, A., S, B. R., Cook, T. A., Buschbeck, E. K. A complex lens for a complex eye. Integrative and Comparative Biology. 57, 1071-1081 (2017).
  19. Yeku, O., Frohman, M. A. Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE). RNA, Methods In Molecular Biology. , Springer. 107-122 (2011).
  20. Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Dissecting Systemic RNA Interference in the Red Flour Beetle Tribolium castaneum: Parameters Affecting the Efficiency of RNAi. Plos One. 7, (2012).
  21. Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Development Genes and Evolution. 214, 575-578 (2004).
  22. Philip, B. N., Tomoyasu, Y. Molecular Methods for Evolutionary Genetics. Orgogozo, V., Rockman, M. V. , Humana Press. 471-497 (2011).
  23. Mackenzie, S. M., Howells, A. J., Cox, G. B., Ewart, G. D. Sub-cellular localisation of the White/Scarlet ABC transporter to pigment granule membranes within the compound eye of Drosophila melanogaster. Genetica. 108, 239-252 (2000).
  24. Arakane, Y., Muthukrishnan, S., Beeman, R. W., Kanost, M. R., Kramer, K. J. Laccase 2 is the phenoloxidase gene required for beetle cuticle tanning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 11337-11342 (2005).
  25. Werner, S., Buschbeck, E. K. Rapid and step-wise eye growth in molting diving beetle larvae. Journal of Comparative Physiology. 201, 1091-1102 (2015).
  26. Prpic, N. M., Schoppmeier, M., Damen, W. G. Gene Silencing via Embryonic RNAi in Spider Embryos. Cold Spring Harbor protocols. 3, 1-4 (2008).
  27. Sagi, A., Manor, R., Ventura, T. Gene Silencing in Crustaceans: From Basic Research to Biotechnologies. Genes. 4, 620-645 (2013).
  28. Zhu, K. Y., Palli, S. R. Annual Review of Entomology. Douglas, A. E. 65, Annual Reviews. 293-311 (2020).
  29. Bauke, A. C., Sasse, S., Matzat, T., Klaembt, C. A transcriptional network controlling glial development in the Drosophila visual system. Development. 142, 2184 (2015).
  30. Lin, C. Y., et al. RNAi analysis of doublesex1 expression in Daphnia pulex Leydig, 1860 (Cladocera). Crustaceana. 92, 137-154 (2019).
  31. Nguyen, D. V., Christiaens, O., Bossier, P., Smagghe, G. RNA interference in shrimp and potential applications in aquaculture. Reviews in Aquaculture. 10, 573-584 (2018).
  32. Dijkstra, K. D. B., Monaghan, M. T., Pauls, S. U. Annual Review of Entomology. Berenbaum, M. R. 59, Annual Reviews. 143-163 (2014).
  33. Crumiere, A. J. J., Khila, A. Hox genes mediate the escalation of sexually antagonistic traits in water striders. Biology. Letters. 15, 5 (2019).

Tags

Miljøvitenskap Utgave 159 RNA-interferens dobbelttrådet RNA dsRNA insekter tap av funksjon bille
RNA interferens i akvatiske biller som et kraftig verktøy for manipulering av genuttrykk på spesifikke utviklingstidspunkter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rathore, S., Hassert, J.,… More

Rathore, S., Hassert, J., Clark-Hachtel, C. M., Stahl, A., Tomoyasu, Y., Bushbeck, E. K. RNA Interference in Aquatic Beetles as a Powerful Tool for Manipulating Gene Expression at Specific Developmental Time Points. J. Vis. Exp. (159), e61477, doi:10.3791/61477 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter