Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

זיהוי של Phytophthora capsici במים השקיה באמצעות לולאה בתיווך איזותרמית

Published: June 25, 2020 doi: 10.3791/61478
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 4, 1
1Department of Plant Pathology, Coastal Plain Experiment Station, University of Georgia, 2University of Georgia Cooperative Extension, 3Department of Plant Pathology, Tropical Research & Education Center, University of Florida, 4Department of Agricultural and Environmental Sciences, Otis L. Floyd Nursery Research Center, Tennessee State University

Summary

פיתחנו שיטה לזיהוי zoospores capsici Phytophthora במקורות מים באמצעות שיטת הפקת DNA נייר מסנן יחד עם לולאה בתיווך isothermal תוגבר (LAMP) essay שניתן לנתח בתחום או במעבדה.

Abstract

Phytophthora capsici הוא פתוגן oomycete הרסני המשפיע על גידולים solanaceous ו cucurbit חשובים רבים גרימת הפסדים כלכליים משמעותיים בייצור ירקות מדי שנה. Phytophthora capsici הוא קרקע נישאת ובעיה מתמשכת בשדות ירקות בשל מבני ההישרדות ארוכת החיים שלה (oospores ו כלמידוספורים) המתנגדים לבליה והשפלה. שיטת הפיזור העיקרית היא באמצעות ייצור של zoospores, שהם חד-תאי, נבגים מנוקבים שיכולים לשחות דרך סרטים דקים של מים הנוכחים על משטחים או נקבוביות אדמה מלאות מים יכול להצטבר בשלוליות ובריכות. לכן, בריכות השקיה יכול להיות מקור של פתוגן ונקודות ראשוניות של התפרצויות מחלה. זיהוי של P. capsici במים השקיה קשה באמצעות שיטות מסורתיות מבוססות תרבות כי מיקרואורגניזמים אחרים נוכחים בסביבה, כגון Pythium spp., בדרך כלל overgrow P. capsici מה שהופך אותו בלתי ניתן לגילוי. כדי לקבוע את הנוכחות של נבגים P. capsici במקורות מים (מי השקיה, runoff, וכו '), פיתחנו עבודת נייר מסנן מבוססת משאבת יד (8-10 μm) שיטה הלוכדת נבגים של הפתוגן (zoospores) ומאוחר יותר משמש כדי להגביר את ה-DNA של הפתוגן באמצעות לולאה רומן מתווכת תוגרה (LAMP) essay שנועדה להגבר ספציפי של P capsici. שיטה זו יכולה להגביר ולזהות DNA מריכוז נמוך כמו 1.2 x 102 zoospores / מ"ל, שהוא 40 פעמים רגיש יותר מאשר PCR קונבנציונלי. לא הושגה ההגדלה צולבת בעת בדיקת מינים קרובים. LAMP בוצעה גם באמצעות צבע LAMP מאסטר לערבב צבע צבע, הצגת תוצאות כי ניתן לקרוא בעין בלתי לזיהוי מהיר באתר. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם פתוגנים אחרים השוכן, לצבור, או מפוזרים באמצעות מערכות השקיה מזוהמות.

Introduction

מיחזור מים בחוות ובפעוטונים הופך פופולרי יותר ויותר בשל העלייה בעלויות המים וחששות סביבתיים מאחורי השימוש במים. שיטות השקיה רבות פותחו עבור מגדלים כדי להפחית את ההתפשטות וההתרחשות של מחלת הצמח. ללא קשר למקור המים (השקיה או משקעים), ההתנקזות נוצרת, ומגדלי ירקות ופעוטונים רבים יש בריכה לאסוף ולמחזר runoff1. זה יוצר מאגר להצטברות פתוגן אפשרית לטובת התפשטות פתוגנים כאשר המים הממוחזרים משמשים להשקיהיבולים 2,,3,,4. פתוגנים צמחיים Oomycete במיוחד ליהנות מנהג זה כמו zoospores יצטברו במים נבגים פיזור העיקרי הוא מוטיב עצמי, אבל דורש מים פניהשטח 5,6,7. Phytophthora capsici הוא פתוגן oomycete המשפיע על מספר משמעותי של גידולי solanaceous ו cucurbit בדרכים שונות8. לעתים קרובות, הסימפטומים הם שיכוך-off של שתילים, שורש וכתר ריקבון; עם זאת, בגידולים כגון מלפפון, סקווש, מלון, דלעת, אבטיח, חצילים ופלפל, יבולים שלמים עלולים ללכת לאיבוד עקב ריקבון פירות9. למרות שיש שיטות ידועות של זיהוי פתוגן צמח זה, רוב דורשים זיהום כבר התרחש וזה מאוחר מדי עבור כל פטריות מונעות יש השפעה משמעותית10.

השיטה המסורתית כדי לבדוק מי השקיה לזיהוי ואבחן של מיקרואורגניזמים ממוקדים היא גישה מיושנת כאשר מהירות ורגישות הם קריטיים להצלחה וייצור יבולרווחי 11,12. רקמת הצמח רגישה לפתוגן ממוקד (למשל, חציל עבור P. capsici)מחובר למלכודת שונה כי הוא מושעה בבריכה השקיה לתקופה ממושכת לפני שהוסר ונבדק לזיהום. דגימות מרקמות הצמח מצופה לאחר מכן על מדיה סלקטיבית למחצה (PARPH) ודגירה לצמיחת תרבות, אז זיהוי מורפולוגי מתבצע באמצעות מיקרוסקופמורכב 13. ישנן שיטות זיהוי דומות אחרות עבור פתוגנים צמחיים אחרים באמצעות מדיה סלקטיבית ציפוי כמויות קטנות של מים מזוהמים לפני תת culturing14,15. שיטות אלה דורשות בין 2 ל 6 שבועות, מספר סיבובים של תת-culturing כדי לבודד את האורגניזם, וניסיון על אבחון Phytophthora כדי להיות מסוגל לזהות את התווים המורפולוגיים העיקריים של כל מין. שיטות מסורתיות אלה אינן פועלות היטב לזיהוי מי השקיה מזוהמים על ידי P. capsici בשל גורמים כגון הפרעה על ידי מיקרואורגניזמים אחרים כי הם גם נוכחים במקורות המים. כמה מיקרואורגניזמים הגדלים במהירות כמו Pythium spp. וחיידקים הנישאות במים יכולים לגדול יתר על המידה על הצלחת מה שהופך P. capsici בלתי ניתן לגילוי16,17.

מטרת מחקר זה הייתה לפתח שיטה מולקולרית רגישה וספציפית שניתן להשתמש בה הן בהגדרות שדה והן במעבדה כדי לזהות גני חיות P. capsici במים השקיה. הפרוטוקול כולל פיתוח של פריימר איזותרמי (LAMP) חדשני בתיווך לולאה (LAMP) מסוגל להגביר באופן ספציפי P. capsici, בהתבסס על 1121 בסיס זוג (bp) קטע של P. capsici18,19. פריימר LAMP שפותח בעבר מתוך דונג ואח '. (2015) שימש בהשוואה ל- assay שפותחה עבור מחקר זה20.

אביזר ה-LAMP הוא צורה חדשה יחסית של זיהוי מולקולרי שהוכח להיות מהיר יותר, רגיש, וספציפי יותר מאשר תגובת שרשרת פולימראז קונבנציונלית (PCR)21. באופן כללי, מחשבים קונבנציונליים PCR אין אפשרות לזהות תחת 500 עותקים (1.25 pg/μL); לעומת זאת, מחקרים קודמים הראו כי הרגישות של LAMP יכול להיות 10 עד 1,000 פעמים גבוה יותר מאשר PCR קונבנציונלי והוא יכול בקלות לזהות אפילו 1 fg / μL של DNAגנומי 22,23. בנוסף, ניתן לבצע את ההתאסה במהירות (לעתים קרובות ב-30 דקות) ובאתר (בשטח) באמצעות בלוק חימום נייד להגדלה וצבע צבעוני שמשנה צבע לדוגמה חיובית (הסרת הצורך באלקטרופורזה). במחקר זה, השווינו את הרגישות של PCR ו- LAMP assays באמצעות שיטת חילוץ מסנן. שיטת הזיהוי המוצעת מאפשרת לחוקרים ולסוכני הרחבה לזהות בקלות את נוכחותם של נבגים מסוג P. capsici ממקורות מים שונים בתוך פחות משעתיים. ההסתה הוכחה כרגישה יותר מאשר PCR קונבנציונלי, אומתה ב- situ על ידי זיהוי הנוכחות של הפתוגן במים השקיה בשימוש על ידי מגדל. שיטת איתור זו תאפשר למגדלים להעריך את הנוכחות וצפיפות האוכלוסין של הפתוגן במקורות מים שונים המשמשים להשקיה, מניעת התפרצויות הרסניות והפסדים כלכליים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. זיהוי באתר של Phytophthora capsici ממים השקיה באמצעות לולאה ניידת מתווכת

  1. הגדרת המשאבה והמסנן
    1. חבר בקבוקון סינון לצינור המחובר למשאבת יד כך שכאשר המשאבה תופעל, האוויר יימשך דרך הפה של בקבוקון הסינון.
    2. התאם את משפך בוכנר לתוך מעצור הגומי לפה בקבוקון הסינון והכנס את פיסת נייר הסינון בגודל המתאים למשפך בוכנר כך שאוויר נשלף דרך נייר הסינון. נייר המסנן צריך להיות בגודל שמירה של 15 μm.
      הערה: נייר המסנן חייב להתאים לקצוות של משפך Buchner כך שמים מינימליים יזרמו סביב נייר המסנן.
  2. דגימת מים וסינון
    1. קח דגימות מים מהמקור המיועד. מים עשויים להיות כמויות קטנות של פסולת אבל לא משקעים משמעותיים או אדמה.
    2. יוצקים עד 1,000 מ"ל (1 ליטר) של מי בדיקה על נייר המסנן הממוקם בתוך משפך Buchner לאט מספיק כדי למנוע גלישה, בעוד משאבת היד (או ואקום) משמש ליצירת יניקה כדי למשוך את המים דרך.
      הערה: אין כמות מינימלית של מים שניתן לבדוק בשיטה זו, ולמרות שזה לפחות 50 מ"ל מוצע, 1000 מ"ל הוא המקסימום עבור שיטה זו.
    3. בעזרת מקצות, הסר את נייר המסנן ממשפך בוכנר וחתוך אותו לחתיכות קטנות עם מספריים סטריליות. להוסיף כמו חתיכות רבות (8-12) כפי שניתן לשקוע בכמות של מאגר החילוץ (400 μL עבור מיצוי מבוסס חרוז מגנטי) הנדרש על ידי הפרוטוקול לתוך צינור 1.5 מ"ל. שמור את החלקים הנותרים של נייר סינון לעיבוד לאחר חילוץ הסט הראשון.
    4. מערבולת או אחרת להרגיז את חתיכות נייר מסנן ומאגר החילוץ במשך 10 s כל דקה במשך 5 דקות. לאחר מכן, באמצעות מפסים, הסר את נייר המסנן לאבד מעט ממאגר החילוץ ככל האפשר. חזור על שלב זה עם החלקים הנותרים של נייר סינון עד שכל החלקים יהיו מערבולת / נסער וספוג במאגר החילוץ.
  3. חילוץ מגנטי מבוסס חרוז של DNA מנייר סינון
    1. לצינור 1.5 מ"ל (אשר מכיל כעת כ 200-300 μL של מאגר החילוץ), להוסיף 20 μL של חלבון K ו 10 μL של 10 ng/μL RNase.
    2. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות, מערבולת או לנער את הצינור כל 3 דקות.
    3. להוסיף 500 μL של חרוזים מגנטיים עם מאגר האיגוד לדגימה ולערבב היטב על ידי טלטול. לאחר מכן דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. מניחים את הצינור במדף המפריד המגנטי למשך 2 דקות עד שכל החרוזים נמשכו למגנט. הסר וזרוק את הסופרנטנט.
    5. הסר את הצינור מהמפריד המגנטי. להוסיף 500 μL של מאגר כביסה 1 ולהשעות מחדש חרוזים על ידי ניעור הצינור במרץ. חכה 30 שניות ואז תמקם את הצינור בחזרה במפריד המגנטי. המתן 2 דקות עד כל החרוזים נמשכו לכיוון המגנט לפני הסרת ושליך supernatant.
      הערה: כאשר מחכים לחרוזים המגנטיים כדי למגנט את המפריד, אנו ממליצים להפוך את הצינור, אשר יכול לנתק חרוזים מגנטיים דבוקים לכובע והצדדים של הצינור וכתוצאה מכך מספר גדול יותר של חרוזים להיות מחובר.
    6. חזור על שלב 1.3.5 עם 500 μL של מאגר כביסה 2.
    7. חזור על שלב 1.3.5 עם 500 μL של 80% אתנול.
    8. Airdry גלולת חרוז מגנטי במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (18-27 ° C) עם המכסה פתוח. אם הטמפרטורות אינן מתירות, דגירה ביד עם כפפות עם הכובע פתוח במשך 15 דקות.
    9. הסר את הצינור מהמפריד המגנטי. להוסיף 50 μL של חוצץ חוצץ ולהשעות מחדש את החרוזים על ידי pipetting למעלה למטה במשך 1 דקות.
    10. המקם צינור בחזרה במפריד מגנטי. המתן 2 דקות לפני העברת supernatant מבלי להפריע את החרוזים צינור נפרד לאחסון DNA.
      הערה: כאן ניתן להשהות את הניסוי לפני שתמשיך הלאה. דנ"א שחולץ צריך להיות מאוחסן על קרח או במקפיא של -20 מעלות צלזיוס.
  4. יישום של תסוואי LAMP שפותח לאחרונה
    1. הכן את תערובת פריימר LAMP באמצעות 0.2 μM של כל פריימר F3 ו- B3, 0.8 μM של כל פריימר Loop-F ולולאה-B, ו- 1.6 μM של כל פרימר FIP ו BIP(טבלה 2).
    2. הוסף את פתרון LAMP הבא שפופרת PCR יחיד, או לכל צינור בודד ברצועת צינור 8: 2.5 μL של תערובת פריימר (שלב 1.4.1), 12.5 μL של תערובת מאסטר מנורת LAVA, 1 μL של ה-DNA שחולצו, ו 9 μL של ddH2O. הנפח הכולל הוא 25 μL.
      הערה: אם משתמשים בכלי ההגדלה הנייד (לדוגמה, Genie III) עם צבע צבעי (לדוגמה, התחלה חמה), עיין בסעיף 2.4.2- 2.4.3.
    3. ציין שני צינורות כפקדים חיוביים ושליליים. עבור פקד חיובי, להשתמש או פקד שסופק על ידי ערכת LAVA LAMP, או דגימת DNA חיובית ידועה. עבור פקד שלילי, השתמש ddH2O. עבור שניהם, להחליף את 1 μL של ה-DNA שחולצו עבור 1 μL של שליטה חיובית או ddH2O.
    4. הגדר את הדגימות לבלוק חום (או למכשיר ההגדלה הנייד) המוכן ל-64°C למשך 45 דקות.
      הערה: שיטות חילוץ אחרות ניתן להשתמש כאן במקום חילוץ מבוסס חרוז מגנטי. CTAB וערכת מיצוי DNA מסחרי נבדקו שניהם בהצלחה באמצעות הפרוטוקולים הסטנדרטיים והחלפה חתיכות נייר מסנן עבור דגימת הצמח24,25. התוצאות הושוו בטבלה 2. אם ניתן לכמת ריכוז של דנ"א, השתמשו בין 1-10 דנ"א גנומי.
  5. הדמיה של תוצאות
    1. אם מבוצע בהגדרת מעבדה, להציג את מוצרי ההגבהה על ידי טעינת 5 μL של כל מדגם לתוך 1% ג'ל agarose, הפעלתם במכונת אלקטרופורזה ג'ל, והדמיה אותם במכונת הדמיה UV.
    2. אם נעשה שימוש בצבע צבע (לדוגמה, Warmstart), הצג את שינוי הצבע כדי לקבוע את התוצאות כחיוביות או שליליות.
    3. אם נעשה שימוש בכלי ההגדלה נייד (לדוגמה, Genie III), הצג את גרף ההגדלה על המסך כדי לקבוע את התוצאות.
  6. יישום של אביזר PCR שפותח בעבר
    הערה: אם משתמש ב- PCR רגיל, שלבים 1-3 נשארים זהים, ויש להחיל את השלבים הבאים במקום שלבים 1.4 ו- 1.5.
    1. להוסיף 1 μL של כל הפקת DNA לצינורות בודדים המכילים את הרכיבים הבאים: 12.5 μL של תערובת PCR ירוקה, 9.5 μL של ddH2O, ו 1 μL של פריימרים קדימה והפוך(טבלה 2).
    2. סובבו כל דגימה באמצעות מיקרוצנטריפוגה והכנסו צינורות למחזור תרמי.
    3. השתמש בהגדרות המחזור התרמי הבאות בהתאם לפרסומים הקודמים: 94 °C למשך 5 דקות, 30 מחזורים של denaturation ב- 94 °C עבור 30 שניות, חיתוך ב- 54 °C עבור 30 שניות, הארכה ב- 72 °C למשך דקה אחת והארכה סופית ב- 72 °C למשך 10 דקות.
    4. הפעל את המוצר בג'ל agarose 1%. שים לב לנוכחות של להקות תחת אור UV שבו תגובות חיוביות יהיה גודל הלהקה של ~ 508 bp.
  7. שיטת זיהוי מסורתית
    הערה: קיימות שיטות מרובות של ציפוי סלקטיבי לזיהוי פתוגן, וההודעה הבאה היא פרוטוקול כללי עבור P. capsici.
    1. ראשית, להשיג פרי חצילים בריא (מארח רגיש P. capsici)ופני השטח לחטא על ידי שטיפת פני השטח של הפרי עם 70% אלכוהול isopropyl.
    2. מניחים את פרי החציל בגזי חלב עם מכשיר ציפה (קצף פוליאתילן או אחר) ופורסים בבריכות השקיה. אבטחו כל מלכודת פיתיון לנקודה אחת והשאירו את המלכודות במאגר המים (מי השקיה ממוחזרים) למשך 7 ימים לפחות או עד לתסמיני ריקבון פירות. לאסוף את הפרי ולהעביר אותו למעבדה.
    3. לשטוף ולתייבש את הפרי בקפוצ'ון סטרילי לפני הסרת חתיכות קטנות של רקמות נגועות ולמקם אותם על צלחת של PARPH בינוני תוקן עם 25 מ"ג / L pentachloronitrobenzene, 0.0005% pimaricin, 250 מ"ג / L אמפליקלין, 10 מ"ג / L rifampicin ו 50 מ"ג / L hymexazol. דגירה צלחות ב 25 ° C במשך 5 ימים.
    4. הצג לוחות מתחת למיקרוסקופ מורכב לזיהוי מורפולוגי מסורתי ב 4 ימים לאחר הבידוד.

2. קביעת מגבלת הגילוי של ריכוז zoospore

  1. ביצוע השעיית zoospore
    1. דגירה P. capsici על V8 agar (100 מ"ל של מיץ V8, 900 מ"ל של ddH2O, 1 גרם של CaCO3)צלחות במשך שבוע אחד ב 26 ° C. ניתן להשתמש במספר צלחות כדי לקבל כמות גדולה יותר של השעיית zoospore.
    2. דגירה את הצלחות תחת אור רציף בטמפרטורת החדר במשך 3 ימים כדי לעורר אידוי.
    3. להציף את הצלחות על ידי הוספת 15 מ"ל של ddH2O לכל צלחת ולמקם אותם במקרר 4 מעלות C במשך 25 דקות. לאחר מכן לחזור לטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
    4. להרגיז צלחות כדי לנתק zoospores ופיפטה הפתרון לתוך צינור יחיד 50 מ"ל מכל הצלחות.
    5. כדי לקבל הערכה מדויקת של ריכוז zoospore, להוסיף 10 μL של מתלה נבג על מד המוסיטומטר ולהתבונן תחת מיקרוסקופ לספור zoospores ולהעריך את הריכוז הממוצע.
  2. דילול טורי
    1. הוסף 1 מ"ל של מתלה נבוב ו 9 מ"ל של ddH2O לצינור נפרד. חזור על שלב זה עבור דילולים רבים פי 10 ככל הרצוי.
    2. לאחר מכן, פתרונות נסורים לחילוץ DNA בהתבסס על הפרוטוקול הקודם באמצעות שיטת הסינון.
      הערה: אם נפח גדול יותר של מתלים רצוי, להכפיל את עוצמת הקול: 2 מ"ל של מתלה נבוב ו 18 מ"ל של ddH2O.
  3. זיהוי מגבלת ריכוז זואספר
    1. להעריך את מגבלת זיהוי נבוב על ידי הפעלת כל דילול סדרתי בנפרד דרך ההסחה עד תוצאות חיוביות ברורות כבר לא נצפו. לאחר השגת דילול הסופי, לדלל על ידי גורם של 2 (4.8 כדי 2.4 בדוגמה זו) ולהפעיל את ההסמעה שוב כדי לקבל מגבלת זיהוי מדויקת יותר.
  4. פיתוח ואופטימיזציה של שיטת LAMP
    הערה: פריימרים LAMP תוכננו בהתבסס על 1121 בסיס זוג (bp) קטע של P. capsici (Li et al.19) כפי שמפורט באות משלימה 2.
    1. אם צבע צבע (למשל, Warmstart) משמש, השתמש בפתרון הבא: 2.5 μL של תערובת פריימר, 12.5 μL של צבע צבע, 0.5 μL של צבע פלורסנט ירוק, 1 μL של DNA שחולצו, ו 8.5 μL של ddH2O. הנפח הכולל הוא 25 μL.
    2. בעת שימוש במכשיר ההגדלה הנייד עם LAVALAMP mastermix, יש שלב ראשוני של 95 °C במשך 3 דקות כפי שהומלץ על ידי היצרן, אך הדבר אינו נדרש. שלב חיור סופי אינו נדרש כדי לבחון את שינוי הצבע או גרף ההגדלה. אין להפעיל שלב התחלה חמה אם יש להשתמש בצבע המסחרי.
    3. הצג את תוצאות ה-LAMP assay באחת מהשיטות הבאות: הפעל דוגמאות על ג'ל agarose 1% או תצוגה באמצעות מכונת הדמיה UV עם עין או תצוגה בלתי במסך ההגבורה בזמן אמת של ג'יני III.
    4. מטב את הטמפרטורה של אחסון LAMP באמצעות מכשיר ההגדלה הנייד וניתח באמצעות גרף ההגדלה בזמן אמת עבור מהירות ורמה של רגישות. הפעל דגימות עם טמפרטורות ייחודיות כדי לקבוע את ההגדלה המהירה ביותר עם רמת הרגישות הגבוהה ביותר.
    5. לקבוע את מגבלת הזיהוי של המנורה שפותחה על ידי ביצוע דילול סדרתי של DNA שחולץ (כמו עם מתלה נבוב בשלב 2.2.1) ושמירה על תנאי תגובה כפי שתואר קודם לכן עבור תגובת LAMP עבור כל דילול.
  5. קביעת מגבלת זיהוי והשוואה עם שיטת PCR רגילה
    1. השתמש ב-DNA שחולץ בשלבים בסעיף 1.3 כדי להשוות את רמת הזיהוי של PCR קונבנציונלי עם זה של אביזר LAMP.
    2. להוסיף 1 μL של DNA לצינור PCR שהכיל 1 μL של פריימרים PCR קדימה והפוך(טבלה 2),12.5 μL של PcR מאסטרמיקס ירוק, ו 9.5 μL של ddH2O עבור סך של 25 μL.
    3. הגבירו דגימות במחזור תרמי בתנאים הבאים: 94°C למשך 5 דקות, 30 מחזורים של denaturation ב- 94 °C ל- 30 שניות, שינועים ב- 54 °C למשך 30 שניות, הארכה ב- 72 °C למשך דקה אחת והארכה סופית ב- 72 °C למשך 10 דקות.
    4. הפעל דגימות במכונת אלקטרופורזה על ג'ל agarose 1% וצפה על מכונת הדמיית UV. גודל הלהקה למעט היה 508 bp.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אופטימיזציה של שיטת LAMP
במחקר זה, זיהינו את הנוכחות של Phytophthora capsici במים השקיה באמצעות לולאה ניידת מתווכת גברה isothermal (LAMP) assay. ראשית, תסוואי LAMP המוצע היה אופטימיזציה על ידי בדיקת ריכוזי פריימר LAMP שונים [F3, B3 (0.1–0.5 μM כל אחד); LF, LB (0.5–1.0 μM כל אחד) ו- FIP, BIP (0.8–2.4 μM כל אחד)], משכים (30-70 דקות) וטמפרטורות (55-70 °C). תמהיל פריימר LAMP הסופי בשימוש במחקר זה היה: 0.2 μM של כל פריימר F3 ו B3, 0.8 μM של כל פריימר Loop-F ולולאה-B, 1.6 μM של כל פריימר FIP ו BIP. אופטימיזציה של טמפרטורת התגובה בוצעה במכשיר ההגדלה הנייד (למשל, ג'יני III) על ידי קביעת הטמפרטורה שביצעה את התגובה המהירה ביותר ללא כל עלייה שלילית נוספת. הטמפרטורה האופטימלית אושרה להיות 64 °C (הנתונים לא מוצגים). הזמן האופטימלי להפעלת ההסדה ב-64 °C היה 45 דקות, כאשר הריכוזים הנמוכים ביותר שהיו חיוביים לזיהוי (1.2 x 10 2 נבגים/מ"ל) עדיין מוגברים ב-40 דקות, בעוד ריכוזים גבוהים יותר מוגברים ב-20 דקות(איור 2D).2 מוצרי LAMP מוגבר נצפו עוד על 1% ג'ל agarose מוכתם עם כתם חומצה גרעין כדי לאשר את ההגברה. כל התגובות חזרו על עצמן לפחות שלוש פעמים.

מבודדים של P. capsici נלקחו מטנסי, פלורידה, וג'ורג'יה והוגשו לאותו פרוטוקול המתואר בשיטות. כל הדגימות של P. capsici מבודדים היו מוגברים בהצלחה בכל הריצות של assay (איור 3).

איתור ורגישות בדיקות של Phytophthora capsici במים השקיה באמצעות תסיסה LAMP נייד
אנו סטנדרטיים את שיטת LAMP מבוססת נייר מסנן זה בתנאי מעבדה באמצעות דילול סדרתי של P. capsici נבוב מתלים(איור 1). דילול סדרתי נעשו מתלה נבג P. capsici החל מ 4.8 x 104 zoospores / מ"ל ולרוץ עם תסיסה LAMP בשלושה פעמים. ריכוזי נבוב מוצגים ולא ריכוז DNA בשל השיטה המעורבת לחילוץ DNA. מיצוי ה-DNA CTAB של ריכוז הנבוב הגבוה ביותר היה 4.5 ng/μL נמדד על ידי Nanodrop, ואת פרוטוקול הפקת DNA חרוז מגנטי הניב 3.8 ng/μL26. סט פריימר LAMP החדש תוכנן יכול לזהות ריכוז נמוך כמו 1.2 x 102 נבגים / מ"ל (איור 2B, 2C, & 2D) עם כל שיטות החילוץ. הרגישות המוצגת בגרף ההגדלה על מכשיר ההגדלה הנייד הייתה זהה לזו המוצגת בתדמית ה-UV ללא רגישות נוספת. אותו דילול סדרתי נוהל בתגובת LAMP באמצעות הצבע הצבעי כדי לקבוע את רמת הרגישות לעין בלתי לזיהוי שדה. הריכוז הנמוך ביותר שנצפה היה 4.8 x 103 נבגים/מ"ל (איור 2C).

כדי להעריך את היכולת של תס"א זה באמצעות דגימות מהעולם האמיתי, דגימות מים נאספו משבע בריכות המשמשות לייצור ירקות מסחריים במחוז Tift, גאורגיה (טבלה 1, איור 5, ודמות משלימה 1). מתוך 7 בריכות, 3 הראה תוצאות LAMP חיוביות (P1, P4, ו P6) (איור 6A, 6B, & 6C). תוצאות אלה מצביעות על כך ששיטת LAMP מבוססת נייר מסנן נייד יכול להיות שימושי מאוד לזיהוי של הפתוגן אפילו עם ריכוז zoospore נמוך. זה מדגים את הישימות של LAMP כמו סיסוי זיהוי רגיש יותר מאשר PCR לסינון זיהום מי השקיה על ידי P. capsici.

ניתוח השוואתי של שיטות שונות: פיתיונות מסורתיים, PCR קונבנציונלי, ואסה ניידת מבוססת LAMP
על מנת להשוות את רגישות הזיהוי של LAMP עם PCR קונבנציונלי, ה-DNA שחולץ מהדילול הסדרתי של השעיות נבוב נוהלו בתגובת PCR. התוצאות הראו כי PCR קונבנציונלי היה 40x פחות רגיש מאשר LAMP, רק מסוגל לזהות ריכוז zoospore נמוך כמו 4.8 x 103 נבגים / מ"ל(איור 2A). בנוסף, דגימות ה-DNA שהתקבלו ממים בריכה השקיה מסוננים נבדקו באמצעות PCR קונבנציונלי, ורק אחת משלוש דגימות חיוביות (P4) היה מוגבר בהצלחה כצפוי גודל הלהקה בתוספת מזהמים משמעותיים וכתוצאה מכך כמה רצועות מריחה ולא ספציפיות(איור 6D). טבלה 3 מציגה את ההבדלים בין שיטות זיהוי המשתמשות במשתנים כגון זמן, עלות, רגישות והכנה הנדרשים. LAMP הייתה השיטה הפחות יקרה בין שלוש שיטות אלה וזה היה גם המהיר ביותר, החל 30-60 דקות להגדלה (הפקת DNA לא נכלל). PCR קונבנציונלי נע בין 120-180 דקות להגדלה (הפקת DNA לא כלול).

לבסוף, כדי לקבוע את ספציפיות הפרימרים, דגימות של פתוגנים אומיצטה קרובים (Phytophthora sansomeana, Phytophthora sojae, Phytophthora cinnamomi, פיטופטורה פלמיבורה, פיתיום אולטימטום VAR. אולטימטום, Phytopythium vexans, Phytopythium helicoides, ו Pythium aphanidermatum) הושגו, ה-DNA חולץ באמצעות אותו פרוטוקול לעקביות ומוערך על ידי תסחם LAMP החדש עם שליטהחיובית ושלילית (איור 4)כדי לקבוע את ספציפיות פריימרים. כל הדגימות שאינן יעד היו שליליות באמצעות 64 °C ממוטב במשך 45 דקות. זה נצפתה על גרף ההגבהה בזמן אמת ותמונה על 1% ג'ל agarose תחת אור UV.

Figure 1
איור 1: דיאגרמה המציגה את השלבים השונים המעורבים ב-Phytophthora capsici מתוך דילול סדרתי של מתלה נבוב מרוכז בתנאי מעבדה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: אופטימיזציה של המעבדה של המגבלה לזיהוי של capsici Phytophthora. (A)סיסאי PCR קונבנציונלי בוצע באמצעות פריימרים ספציפיים P. capsici על גורמי דילול סדרתי ודמיון על 1% ג'ל agarose. 1, סולם; 2-7, 4.8 x 104, 4.8 x10 3, 4.8 x 102, 2.4 x 102, 1.2 x10 2 נבגים/מ"ל, בהתאמה ו- 7, בקרת מים שלילית. (ב)מנורה אחסון גורמים דילול סדרתי הדמיה על 1% ג'ל agarose. 1-6, ריכוז נבגים יורד: 4.8 x 104, 4.8 x 103, 4.8 x 102, 2.4 x 102, 1.2 x 102 נבגים/מ"ל, ו 7, בקרת מים שלילית. (ג)תוצאות מנורה חזותית באמצעות הצבע הצבעי. 1-6, ריכוז נבגים יורד: 4.8 x 104, 4.8 x 103, 4.8 x 102, 2.4 x 102, 1.2 x 102 נבגים/מ"ל, ו 7, בקרת מים שלילית. (D)תוצאות LAMP חזותית בגרף ההגדלה. אדום = 4.8 x 104, כחול כהה = 4.8 x10 3, כתום = 4.8 x10 2, כחול בהיר = 2.4 x10 2, ירוק = 1.2 x 102 נבגים/ מ"ל, ורוד = שליטה שלילית (מינים אחרים של פיטופטורה), צהוב = ddH2O. (ה)עקומה סטנדרטית המציגה כימות הערכים המוצגים בתוצאות בזמן אמת. Ln (ספירת נבובים) מוצגת בציר ה- X, ודקות להגדלה בציר Y. (F)LAMP תסאג עם פריימר שפורסם (דונג ואח '. 2015) על גורמי דילול סדרתיים החזו על 1% ג'ל agarose. 1-6, ריכוז נבגים יורד: 4.8 x 104, 4.8 x 103, 4.8 x 102, 2.4 x 102, 1.2 x 102 נבגים/מ"ל, ו 7, בקרת מים שלילית. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: ההגדלה של P. capsici DNA ממקומות שונים. (A)תוצאות מנורה הדמיה על 1% ג'ל agarose. 1, PC_TN1; 2, PC_TN2; ג3, PC_FL1; מה-ר-ו-ה-PC_FL2; 5, PC_GA1; שש, PC_GA2; נ', שליטה שלילית. דגימות 1 ו-2 בודדו מ-TN; דגימות 3 ו-4 מבודדות מ-FL; דגימות 5 ו- 6 בודדו מ- GA. (B)תוצאות שדמיינו באמצעות הצבע הצבעי. 1, PC_TN1; ר.ג.ב.ב.נ2; 27. ג3, PC_FL1; מה-ר-ו-ה-PC_FL2; 5, PC_GA1; שש, PC_GA2. (ג)התוצאות מדמיינות את גרף ההגדלה. אדום, PC_TN1; כתום, PCTN2; צהוב, PC_FL1; ירוק, PC_FL2; כחול כהה, PC_GA1; כחול בהיר, PC_GA2; שליטה ורודה ושלילית. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: קביעת ספציפיות של תסוואי LAMP באמצעות DNA ממין שאינו היעד P. capsici. (A)תגובת אחסון מנורה עם מינים קשורים שאינם היעד על ג'ל agarose ודמיון על 1% ג'ל agarose. ל', סולם; 1, פיטופורה סנסואנה; 2, פיטופורה סוז'ה; 3, פיטוטורה קינמי; 4, פיטופורה פלמבורה; 5, פיתיום אולטימטום VAR. אולטימטום; 6, פיטופיתיום וקסנס; 7, שליטה שלילית; 8, Phytophthora capsica. (ב)תוצאות LAMP לדמיין באמצעות צבע. 1, פיטופורה סנסואנה; 2, פיטופורה סוז'ה; 3, פיטוטורה קינמי; 4, פיטופורה פלמבורה; 5, פיתיום אולטימטום VAR. אולטימטום; 6, פיטופיתיום וקסנס; 7, שליטה שלילית; 8, Phytophthora capsici (C) תוצאות LAMP חזותית על גרף ההגדלה. אדום = Phytophthora capcisi, כל דגימות מינים אחרים שאינם יעד לא היו מוגברים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: תמונות המציגות את הדגימה והעיבוד של מים ממוחזרים לזיהוי Phytophthora capsici בתחום. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 6
איור 6: תוצאות מזיהוי באתר של Phytophthora capsici במקורות מים השקיה. (A)ג'ל Agarose מראה תוצאות של המנורה ההגבהה של מים שנבדקו משבע חווה בדרום ג'ורג'יה. שמות לדוגמה משמאל לימין: P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, שליטה שלילית, N. (ב) תוצאות LAMP חזותית באמצעות צבע התחלה חמה של דגימות שדה: P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, שליטה שלילית, N. (C) תוצאות ההגדלה LAMP של דגימות שדה באמצעות גרף. אדום: P1, ירוק: P2, סגול: P3, צהוב: P4, כחול: P5, כתום: P6, ורוד: P7, שליטה שלילית, N. (ד) ג'ל Agarose מראה תוצאות PCR קונבנציונלי של הגברה באמצעות פריימרים ספציפיים PC-1/PC-2 (הערה מאשר רק אתר אחד נמצא חיובי בהשוואה לשלושה ב- LAMP). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

שם בריכה מחוז, מדינה גידולי יעד להשקיה זיהוי PCR זיהוי מנורה היסטוריה של מחלות (Y/N)
P1 (P1) טיפט, ג'ורג'יה ירקות ­ + N
P2 (P2) טיפט, ג'ורג'יה ירקות - - N
P3 (P3) טיפט, ג'ורג'יה ירקות - - N
P4 (P4) טיפט, ג'ורג'יה ירקות + + N
P5 (פי-5) טיפט, ג'ורג'יה ירקות - - N
P6 (פי 6) טיפט, ג'ורג'יה ירקות - + N
P7 (P7) טיפט, ג'ורג'יה ירקות - - N

טבלה 1: איתור מי השקיה מדרום ג'י.איי.

סוג פריימר שם פריימר רצף 1.70-3' מקור
המנורה PCA3-F3 ת.ג.ב. מחקר זה
PCA3-B3 דרג את ההתלבטה מחקר זה
PCA3-FIP ג'אקהקטקטקטקטקטקטקטטהאטגהטגגהגה מחקר זה
PCA3-BIP גאגאגה טאקטגגג'טגהאגאגהאקסקוג מחקר זה
PCA3-LF דרג את ההתפתל מחקר זה
PCA3-LB דרג את ההתלבטות מחקר זה
Pcr מחשב אישי-1 ג'י.טי.טי.ג'י.טי.קטיקטאג ג'אנג ואח', 2006
מחשב אישי-2 ג'קאקאגאגאאאקט ג'אנג ואח', 2006

טבלה 2: פריימרים המשמשים במחקר זה.

פרמטרים מסורתי PCR קונבנציונלי המנורה
רגישות נה 4.8 X 102 נבגים/מ"ל 1.2 X 102 נבגים/מ"ל
זמן שבועיים או יותר 2-3 שעות (לא כולל חילוץ DNA) 30 דקות - שעה אחת (לא כולל חילוץ דנ"א)
הכנה • יצירת מדיה
• ציפוי ובידוד ו
• עיצוב מלכודת		 • אוסף נבובים באמצעות נייר סינון
• חילוץ DNA ו
• אביזר PCR		 • אוסף נבובים באמצעות נייר סינון
• חילוץ DNA ו
• תסה מנורה
חומרים • אוטוקלב (אוטוקלב)
• מדיה וצלחות
• חדר דגירה
• מכסה מנוע זרימה
• חציל
• ארגז חלב		 • רוכב תרמי
• ג'ל אגר
• ג'ל דוק
• בלוק חום או
• ג'יני השלישי
עלות $5.00 למלכודת $0.60 לתגובה $0.75 לתגובה

טבלה 3: השוואת שיטות לזיהוי P. capsici.

איור משלים 1: המיקום של מחוז Tift, GA ודגימות של מי השקיה שנלקחו ממקומות שונים מתוך המדינה. דגימות חיוביות הוצגו כנקודות אדומות. אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו.

איור משלים 2: עיצוב סט פריימר LAMP. חצים מראים כיוון של אופן קריאת הפרימרים. אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הבדיקה של מי השקיה עבור phytopathogens הוא צעד מכריע עבור מגדלים באמצעות בריכות השקיה ומים ממוחזרים27. בריכות השקיה מספקות מאגר וקרקע פורייה עבור מספר פיטופטוגנים כמו מי השקיה עודפים מופנה מהשדה אל הבריכה נושאת איתו כל פתוגנים שאולי היהנוכח 16,27. השיטה המסורתית לזיהוי פתוגנים צמח במקור מים גדול היא להגדיר פיתיון לפתוגן באמצעות רקמת מארח רגיש (למשל, פרי, עלים) תלוי בבריכה ולחכות זיהום להתרחש, לאחר מכן להסיר את הפרי / עלים ולאשר את האבחנה עם מיקרוסקופיה או שיטות מולקולריות13,14. שיטות אלה מגבילות בשל משך הזמן הנדרש כדי להפעיל את בדיקת האיתור (שבועיים או יותר), והעבודה והציוד הנדרשים. בנוסף, נדרשים ניסיון רב וידע באבחון חזותי, מורפולוגיה פתוגן וקטונומיה לקבלת תוצאות מדויקות. טכניקות מולקולריות כגון PCR, qPCR, והכלאה DNA דורשים באופן משמעותי פחות זמן (3-4 h) מאשר שיטות הגילוי המסורתיות; עם זאת, הם דורשים ציוד יקר והגדרת מעבדה. בנוסף, טכניקות אלה אינן מאפשרות עיבוד של כמויות גדולות של מים. גם ההתאסה הסרולוגית לא מתקלקלת ביכולת הגילוי שלהם בשל תגובות חיוביות שאינן ממוקדות, ולא פותחו בדיקות ספציפיות למינים של פיטופותורה. לולאה בתיווך גברה isothermal (LAMP) שימש לאחרונה כנכיקת אבחון באתר לזיהוי מהיר ורגיש של פתוגנים מרובים כמו ההסדה דורש רק טמפרטורה אחת ולא מחזורתרמי 28,29. ניתן להפעיל את LAMP בשדה באמצעות צבע צבע לאישור חזותי או באמצעות מכונת ההגדלה בזמן אמת לתוצאות בפחות משעהו-30.

מטרת הניסוי היה לפתח שיטה מהירה ורגישה לזיהוי הנוכחות של Phytophthora capsici במקורות מים באתר או במעבדה. כדי להגביר את מהירות הזיהוי ולהילחם במגבלות של השיטות שהוזכרו קודם לכן לזיהוי P. capsici במים השקיה, עיצבנו שיטה באמצעות נייר סינון כדי ללכוד את הנבגים ולחלץ את ה-DNA שלהם מנפח גדול יותר של מים. לאחר נבגים נתפסו באמצעות טכניקת נייר מסנן ו- DNA חולץ, הנוכחות של הפתוגן אושרה בהתבסס על פריימר LAMP חדש תוכנן להגדיר ספציפי P. capsici. רגישות זיהוי וספנות הושוו באמצעות LAMP ו- PCR. בכל 3 השכפולים ועם כל ריכוזי zoospore, LAMP הייתה שיטת זיהוי מהירה ורגישה יותר(טבלה 3). שיטה זו אינה מוגבלת על ידי בעל נפח מדגם קטן כשיטות מסורתיות, כמו שיטה זו יכולה להיות מבחן עד 1 L של מים בבת אחת, הגדלת הסיכויים לזיהוי פתוגן. זה היה ידוע בבדיקות כי שפיכת מי השקיה לאט דרך משפך Buchner במהירות של לא יותר מ 40 מ"ל לשנייה הגדיל את יכולת לכידת נבוב של נייר המסנן.

כדי לאמת את פרוטוקול הזיהוי, דגימות מים מהשדה שבו P. capsici היה חשוד להיות נוכח נלקחו גם (איור משלים 1) כדי לבדוק את השיטה המתוכננת עם תרחיש מעשי. מתוך 7 החוות שנבדקו, 3 היו חיוביים לנוכחות של P. capsici באמצעות אביזר LAMP (איור 6A-6C) בעוד רק חווה אחת הייתה חיובית בעת שימוש בהסכם PCR קונבנציונלי (איור 6D), מראה מנורה כאסה רגישה יותר עבור שיטה זו של בדיקת מי השקיה. למרות, מסנן זה מבוסס מנורה essay יכול לזהות DNA מריכוז נמוך כמו 1.2 x 102 zoospores / מ"ל אשר היה באופן משמעותי פחות מהרגישות המקורית של הודעה זו (0.01 ng DNA גנומי שווה ערך ~ 5 נבגים) עם השעיית zoospore מסונן. ה-LAMP הקודם אמר על ידי דונג et. אל. (2015)20 היה לרוץ על אותו דילול סדרתי ואת רמת הרגישות היה זהה(איור 2F). רמת הזיהוי עבור סיסוי PCR עם פתרון נבגים לא מסונן הראו גם רמה גבוהה יותר של זיהוי (שווה ערך ~ 10 נבגים) אשר היה דומה מאוד לממצאים מבוססי PCRהקודם 10. מגבלת זיהוי נבוב של שיטת הזיהוי המסורתית של פיתיונות לא נבדקה בשם נבוב יחיד יכול לגרום לזיהום בהתאם ליכולת הפרט שלה. הרגישות הפוחתת שנמצאה הן ב-LAMP והן ב-PCR נובעת ככל הנראה מכך שנבגים מסוימים זורמים דרך נייר המסנן או בסביבתו, או לאחר מכן מחוברים לנייר המסנן, ללא אפשרות לחלץ אותם ביעילות של 100%. אף על פי כן, מערכת LAMP ומסננים חדשה זו יכולה לעבד ולנתח נפח מים גבוה בהרבה משיטות קודמות ומקנה רמה גבוהה יותר של ספציפיות ומהירות לזיהוי בשטח.

של שיטות החילוץ בשימוש, מיצוי מבוסס חרוז מגנטי היה המהיר ביותר ולא דרש את השימוש במכונות חיצוניות כגון מקציף חרוזים או צנטריפוגה מה שהופך אותו שימושי עבור עקירות בשדה ומחמיא התכונה הניידת של אחסון LAMP. השיטה מבוססת CTAB הניב את הריכוז הגבוה ביותר של ה-DNA אבל לקח את הזמן הארוך ביותר, בעוד ערכת הפקת DNA צמח מסחרי (למשל, DNeasy) היה שני הן בזמן הנדרש ריכוז ה-DNA נרכש.

עם CTAB והן ערכת הפקת DNA צמח מסחרי, במהלך homogenization של נייר מסנן זה היה ציין כי homogenization היה מוצלח יותר והניב ריכוז גבוה יותר אם תמיסת CTAB (או מאגר החילוץ) נוספה לצינור עם חתיכות נייר מסנן לפני הכאת חרוז או הומוגניזציה יד החלה. מכות חרוז נעשו 3 פעמים במשך דקה אחת כל אחד, אבל מערבולת ועריסת הצינור בין כל סיבוב היה הכרחי להומוגניזציה מלאה בכל שיטות החילוץ. חשוב לציין, נייר המסנן כפוף להיתקע בצדדים או בתחתית הצינור, לכן חיוני לוודא שניירת המסנן ירדה מהקירות כך שהיא תהיה הומוגנית.

הזמן הכולל הנדרש להגדלה הוא 90-120 דקות ותו לא ניתן לעשות זאת בקלות בשטח לאבחון באתר. שיטת סינון זו נועדה גם לסנן כמויות משמעותיות של מים כדי להגדיל את הסיכויים האפשריים לזיהוי הפתוגן. שיטה זו ישימה גם פתוגנים רבים שיכולים להצטבר במקור מים, במיוחד genera כגון: פיתיום, Phytophthora, Fusarium, וחיידקים; השינוי היחיד הנדרש יהיה פיתוח של פריימר LAMP ספציפי באותה מידה להגדיר עבור פתוגן ממוקד30.

תפוקה משמעותית של עבודה זו היא פיתוח של תסיסה LAMP מבוססת נייר מסנן רגישה ומהירה מאוד לזיהוי P. capsici במקורות מים השקיה. אנו צופים כי מחקר זה יוביל לעלייה במודעות לזיהום של מי השקיה ממוחזרים, בסופו של דבר שיפור הניהול של מחלות הקשורות Phytophthora, וכתוצאה מכך להפחית את עלויות הייצור ולהגדיל את תפוקת היבול. מידע כזה נחוץ מאוד כדי לשפר את הקיימות בייצור ירקות ולשפר את הרווחיות של ייצור ירקות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף או ניגודי עניינים.

Acknowledgments

עבודה זו זכתה לתמיכה כספית של הנציבות לסחורות של גאורגיה עבור מזהה פרויקט ירקות# FP00016659. המחברים מודים ד"ר Pingsheng ג'י, אוניברסיטת ג'ורג'יה וד"ר אן דורנס, אוהיו סטייט למתן תרבויות טהורות של Phytophthora spp. אנו מודים גם לי וואנג וDeloris Veney על הסיוע הטכני שלהם לאורך כל המחקר.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose gel powder Thomas Scientific C997J85
Buchner funnel Southern Labware JBF003
Bullet Blender Next Advance BBX24
Centrifuge 5430 Eppendorf 22620509
Chloroform Fischer Scientific C298-500
CTAB solution Biosciences 786-565
Dneasy Extraction Kit Qiagen 69104
Filter Flask United FHFL1000
Filter Paper United Scientific Supplies FPR009
Gel Green 10000X Thomas Scientific B003B68 (1/EA)
Genie III OptiGene
Hand pump Thomas Scientific 1163B06
Iso-amyl Alcohol Fischer Scientific BP1150-500
LAVA LAMP master mix Lucigen 30086-1
Magnetic bead DNA extraction Genesig genesigEASY-EK
Magnetic Separator Genesig genesigEASY-MR
polyvinylpyrrolidone Sigma Aldrich PVP40-500G
Primers Sigma Aldrich
Prism Mini Centrifuge Labnet C1801
T100 Thermal Cycler Bio-Rad 1861096
UV Gel Doc Analytik Jena 849-00502-2
Warmstart Colorimetric Dye Lucigen E1800m
Wide Mini ReadySub-Cell GT Cell Bio-Rad 1704489EDU
70% isopropanol Fischer Scientific A451-1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hong, C., Moorman, G. J. Plant pathogens in irrigation water: challenges and opportunities. Critical Reviews in Plant Sciences. 24 (3), 189-208 (2005).
  2. Malkawi, H. I., Mohammad, M. J. Physiology, Genetics, Morphology, & Microorganisms, E. o. Survival and accumulation of microorganisms in soils irrigated with secondary treated wastewater. Journal of Basic Microbiology. 43 (1), 47-55 (2003).
  3. Bush, E. A., Hong, C., Stromberg, E. L. Fluctuations of Phytophthora and Pythium spp. in components of a recycling irrigation system. Plant Disease. 87 (12), 1500-1506 (2003).
  4. Ghimire, S. R., et al. Distribution and diversity of Phytophthora species in nursery irrigation reservoir adopting water recycling system during winter months. Journal of Phytopathology. 159 (11-12), 713-719 (2011).
  5. Hausbeck, M. K., Lamour, K. H. Phytophthora capsici on vegetable crops: research progress and management challenges. Plant Disease. 88 (12), 1292-1303 (2004).
  6. Gevens, A., Donahoo, R., Lamour, K., Hausbeck, M. Characterization of Phytophthora capsici from Michigan surface irrigation water. Phytopathology. 97 (4), 421-428 (2007).
  7. Thomson, S., Allen, R. Occurrence of Phytophthora species and other potential plant pathogens in recycled irrigation water. Plant Disease Reporter. 58 (10), 945-949 (1974).
  8. Lamour, K. H., Stam, R., Jupe, J., Huitema, E. The oomycete broad-host-range pathogen Phytophthora capsici. Journal of Molecular Plant Pathology. 13 (4), 329-337 (2012).
  9. Sanogo, S., Ji, P. Water management in relation to control of Phytophthora capsici in vegetable crops. Agricultural Water Management. 129, 113-119 (2013).
  10. Zhang, Z., Li, Y., Fan, H., Wang, Y., Zheng, X. Molecular detection of Phytophthora capsici in infected plant tissues, soil and water. Plant Pathology. 55 (6), 770-775 (2006).
  11. Trout, C., Ristaino, J., Madritch, M., Wangsomboondee, T. Rapid detection of Phytophthora infestans in late blight-infected potato and tomato using PCR. Plant Disease. 81 (9), 1042-1048 (1997).
  12. Sankaran, S., Mishra, A., Ehsani, R., Davis, C. A review of advanced techniques for detecting plant diseases. Commputers and Electronics in Agriculture. 72 (1), 1-13 (2010).
  13. Wang, Z., et al. Development of an improved isolation approach and simple sequence repeat markers to characterize Phytophthora capsici populations in irrigation ponds in southern Georgia. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5467-5473 (2009).
  14. Ali-Shtayeh, M., MacDonald, J. Occurrence of Phytophthora species in irrigation water in the Nablus area (West Bank of Jordan). Phytopathologia Mediterranea. , 143-150 (1991).
  15. Pringsh, P. Comparison of serological and culture plate methods for detecting species of Phytophthora, Pythium, and Rhizoctonia in ornamental plants. Plant Disease. 74 (9), 655 (1990).
  16. Stewart-Wade, S. M. Plant pathogens in recycled irrigation water in commercial plant nurseries and greenhouses: their detection and management. Irrigation Science. 29 (4), 267-297 (2011).
  17. Aragaki, M., Uchida, J. Y. Morphological distinctions between Phytophthora capsici and P. tropicalis sp. nov. Mycologia. 93 (1), 137-145 (2001).
  18. Tomlinson, J., Boonham, N. Potential of LAMP for detection of plant pathogens. CAB Reviews Perspectives in Agriculture Veterinary Science Nutrition and Natural Resources. 3 (066), 1-7 (2008).
  19. Li, P., et al. A PCR-based assay for distinguishing between A1 and A2 mating types of Phytophthora capsici. Journal of the American Society for Horticultural Science. 142 (4), 260-264 (2017).
  20. Dong, Z., et al. Loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Phytophthora capsici. Canadian Journal of Plant Pathology. 37 (4), 485-494 (2015).
  21. Khan, M., et al. Comparative evaluation of the LAMP assay and PCR-based assays for the rapid detection of Alternaria solani. Frontiers in Microbiology. 9, 2089 (2018).
  22. Sowmya, N., Thakur, M., Manonmani, H. K. Rapid and simple DNA extraction method for the detection of enterotoxigenic Staphylococcus aureus directly from food samples: comparison of PCR and LAMP methods. Journal of Applied Microbiology. 113 (1), 106-113 (2012).
  23. Waliullah, S., et al. Comparative analysis of different molecular and serological methods for detection of Xylella fastidiosa in blueberry. PLOS ONE. 14 (9), 0221903 (2019).
  24. Böhm, J., et al. Real-time quantitative PCR: DNA determination in isolated spores of the mycorrhizal fungus Glomus mosseae and monitoring of Phytophthora infestans and Phytophthora citricola in their respective host plants. Journal of Phytopathology. 147, 409-416 (1999).
  25. Klimczak, L., Prell, H. J. C. Isolation and characterization of mitochondrial DNA of the oomycetous fungus Phytophthora infestans. Current Genetics. 8 (4), 323-326 (1984).
  26. Ghimire, S. R., et al. Detection of Phytophthora species in a run-off water retention basin at a commercial nursery in plant hardiness zones 7 b of Virginia in winter. Phytopathology. 96 (6), (2006).
  27. Feng, W., Hieno, A., Kusunoki, M., Suga, H., Kageyama, K. J. P. LAMP detection of four plant-pathogenic oomycetes and its application in lettuce fields. Plant Disease. 103 (2), 298-307 (2019).
  28. Aglietti, C., et al. Real-time loop-mediated isothermal amplification: an early-warning tool for quarantine plant pathogen detection. AMB Express. 9 (1), 50 (2019).
  29. Almasi, M. A. Development of a colorimetric loop-mediated isothermal amplification assay for the visual detection of Fusarium oxysporum f. sp. melonis. Horticultural Plant Journal. 5 (3), 129-136 (2019).
  30. Gill, D. J. Pathogenic Pythium from irrigation ponds. Plant Disease Reporter. 54 (12), 1077-1079 (1970).

Tags

החודש ב JoVE גיליון 160 Phytophthora capsici מי השקיה זיהוי Zoospore שקע LAMP נייר סינון זיהוי מהיר חילוץ DNA אבחון בשטח
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hudson, O., Waliullah, S., Hand, J., … More

Hudson, O., Waliullah, S., Hand, J., Gazis-Seregina, R., Baysal-Gurel, F., Ali, M. E. Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification. J. Vis. Exp. (160), e61478, doi:10.3791/61478 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter