Her præsenterer vi en protokol til måling in vitro Ca2 + fluxes i midbrain neuroner og deres downstream virkninger på caspase-3 ved hjælp af primær mus midbrain kulturer. Denne model kan anvendes til at studere patofysiologic ændringer relateret til unormal Ca2 + aktivitet i midbrain neuroner, og at screene nye terapeutiske for anti-apoptotiske egenskaber.
Parkinsons sygdom (PD) er en ødelæggende neurodegenerative lidelse forårsaget af degeneration af dopaminerge (DA) neuroner. Overdreven Ca2 + tilstrømning på grund af den unormale aktivering af glutamat receptorer resulterer i DA excitotoxicity og er blevet identificeret som en vigtig mekanisme for DA neuron tab. I denne undersøgelse isolerer, tager vi afstand fra og kulturer midbrain neuroner fra musens ventrale mesencephalon (VM) af ED14 museembryoner. Vi inficerer derefter de langsigtede primære musemidthinkulturer med en adeno-associeret virus (AAV), der udtrykker en genetisk kodet calciumindikator, GCaMP6f under kontrol af den humane neuron-specifikke synapsin promotor, hSyn. Ved hjælp af levende konfokal billeddannelse, viser vi, at dyrkede mus midbrain neuroner vise spontane Ca2 + fluxes opdaget af AAV-hSyn-GCaMP6f. Bad anvendelse af glutamat til midbrain kulturer forårsager unormale stigninger i intracellulære Ca2 + i neuroner, og dette er ledsaget af caspase-3 aktivering i DA neuroner, som det fremgår af immunstaining. De teknikker til at identificere glutamat-medieret apoptose i primær mus DA neuroner har vigtige applikationer til det høje indhold screening af lægemidler, der bevarer DA neuron sundhed.
Parkinsons sygdom (PD) er den anden mest almindelige neurodegenerative lidelse på verdensplan, uden kendt kur. Skøn tyder på , at PD prævalens vil fortsætte med at stige og forventes at overgå 1 million diagnoser i år 2030 i USA alene1. Med få effektive behandlinger i øjeblikket til rådighed til bekæmpelse af PD, der er et presserende behov for at udvikle mere effektive behandlinger. PD er karakteriseret ved en hurtig og progressiv tab af midbrain dopamin (DA) neuroner2. De mekanismer, der ligger til grund for neurodegeneration i PD er dårligt forstået. Beviser tyder på en sandsynlig konvergens af flere mekanismer, såsom oxidativstress og mitokondriel dysfunktion, osv., der bidrager til indledningen af apoptotiske signalering kaskader og eventuel celledød3.
En sådan konvergerende mekanisme, glutamat-medieret excitotoxicity har været involveret i flere neurodegenerative sygdomme, herunder PD4. Mens glutamat-medieret excitotoxicity menes at arbejde primært gennem stimulering af NMDA receptorer via en overdreven stigning i intracellulære Ca2 + koncentration og eventuel indledning af apoptose, Ca2 +-permeable AMPA receptorer har også været involveret i excitotoksiske respons5,6,7. Derfor er det af interesse at bestemme bidraget fra AMPA-receptorer til glutamat-medieret apoptose inden for en PD-model. Dette kan opnås ved hjælp af NBQX, en AMPA og kainate blocker, som ved mikromolar koncentrationer er selektiv for AMPA receptorer8. Glutamat-medieret excitotoxicity og apoptotiske signalering kaskader er et ideelt downstream mål at måle omfanget af celledød, og et potentielt mål for terapeutisk intervention. Derfor, udvikle et højt indhold metode til vurdering glutamat-medieret graduering af calcium aktivitet og tilhørende downstream signalering i primær ventral mesencephalic (VM) neuroner ville være værdifuldt for screening nye behandlingsmetoder på deres evne til at bevare neuronal sundhed.
Her har vi udviklet en protokol, hvor vi udtrykker den genetisk kodede calciumindikator (GECI), GCaMP6f, ved hjælp af AAV2/5 med den menneskelige synapsin (hSyn) promotor til at måle Ca2 + aktiviteten af mus VM primære neuroner som reaktion på glutamat ansøgning, som kan måles på det fysiologiske og molekylære niveau. Denne screening med højt indhold kan tilpasses til at opdage lægemidler eller behandlinger, der modulerer Ca2+ aktivitet for at bevare sundheden for VM-neuroner. Vi foreslår, at denne primære kultur model er en effektiv måde at screene for nye PD interventioner, baseret på deres evne til at bevare sundheden for VM neuroner og afbøde udviklingen af PD.
Vi beskriver en langsigtet primær ventral mesencephalic (VM) cellekultur system til højt indhold analyse af glutamat-medieret apoptose i neuroner. Undersøgelser har anvendt primære midbrain dopaminerge kulturer til at belyse excitotoksiske mekanismer i forbindelse med PD model11,,12. I denne undersøgelse anvender vi en kombinatorisk tilgang ved hjælp af genetisk kodede calciumindikatorer (GECIs) til at måle Ca2+ aktivitet og yderligere forbinde denne aktivitet med downstream-molekylære ændringer, såsom indledning af apoptotiske signalkaskader4. Metoden har flere fordele til andre lignende cellekultursystemer. Da vi har særlig interesse i excitotoxicity i forbindelse med Parkinsons sygdom, ved hjælp af primære VM-celle kulturer er ideel. Ved hjælp af forskellige felt flytning teknikker, såsom gridded coverslips eller en motoriseret XY mikroskop fase kombineret med TH immunostaining, kan vi direkte studere celletype specifikke virkninger af glutamat-medieret apoptose i ventral midbrain neuroner. Derudover, den 3-ugers cellekultur model giver mulighed for neuroner til at udvikle deres fulde, modne molekylære profil, der afspejler voksne DA neuroner9. Tidligere metoder har hovedsagelig fokuseret på molekylære ændringer efter glutamat-medieret excitotoxicity13,14. Modellen er unik i sin evne til at korrelere akutte ændringer i neuronal fysiologi med downstream molekylære hændelser i identificerede celletyper. En begrænsning af den primære kultur model er, at dissektion teknik indfanger hele ventrale midbrain, herunder DA og GABAergic neuroner samt neuroner fra SNc og VTA. Beviser tyder nu på, at DA neuroner af SNc har selektiv sårbarhed over for calcium og eventuel celledød i forhold til DA neuroner af de omkringliggende VTA15. Desværre har det vist sig vanskeligt at skelne SNC fra VTA-neuroner i embryonale kulturer med få anatomiske vartegn for at definere disse strukturer i embryonale hjerner.
Vi viser, at den primære kulturteknik giver mulighed for kvantificering af heterogen spontan Ca2+ aktivitet (figur 1). Derfor er dette en ideel cellekultur system model til at studere tonisk aktive celler, såsom pacemaking dopaminerge neuroner i midbrain, neocortical neuroner, og GABAergic neuroner af suprachiasmatic kernen (SCN)16,17. I de fleste applikationer opnår Ca2+ billeddannelse ikke den samme tidsmæssige opløsning som elektrofysiologi. Derfor er det sandsynligt, at en enkelt Ca2 + begivenhed svarer til en byge af neuronal handling potentialer. Dette kan fortolkes således, at Ca2+ billeddannelse giver mulighed for relativt nøjagtige målinger af unormal sprængningsaktivitet i tempogivende celler og derfor er velegnet til en skærm med højt indhold af Ca2+-medieret excitoxisk celledød.
For at opnå og opretholde spontan Ca2+ aktivitet er det vigtigt at tage fat på to centrale punkter i protokollen. For det første er plating tæthed af cellerne efter dissektion. For primære VM neuroner, tidligere undersøgelser har brugt omkring 100,000 celler/cm29,,10. Vi har tilpasset protokollen til plade en tæthed på 200.000 celler/cm2,hvilket skaber en heterogen vifte af spontan aktivitet og øger antallet af dopaminerge VM neuroner til stede på hver coverslip. Da forskellige pacemaking neuroner har forskellige fyring egenskaber16,den plating tæthed skal tilpasses til den celletype, der studeres og optimeres for at opnå ideelle niveauer af spontan aktivitet. For det andet er inkubationstiden efter virusinfektion af AAVs. Ligesom plating tæthed, vil dette være afhængig af den specifikke sammenhæng med forskning spørgsmål og type AAV bliver brugt. For den specifikke AAV, der anvendes her, 5 dages inkubation efter virusinfektion er ideel til at opnå de ønskede proteinudsetryksniveauer, hvilket giver mulighed for dynamiske ændringer i GCaMP fluorescens for at registrere Ca2+ aktivitet. Mange faktorer bestemmer, hvor hurtigt og effektivt en AAV vil udtrykke sin last, hvoraf en stor del er uden for rammerne af denne metode, men kort, er det vigtigt at overveje initiativtageraktivitet og den hastighed, hvormed fragtproteinet modnes og foldes.
En anden fordel ved metoden er, at den giver mulighed for betydelig fleksibilitet i format, udtryksvektorer, brug af billedbehandlingsudstyr og den række af videnskabelige spørgsmål, der kan løses. Desuden gør metoden det muligt at undersøge en lang række specifikke spørgsmål, der omgiver glutamat-medieret excitotoksicitet i PD, og andre modeller af nervesystemet dysfunktion. For eksempel, glutamat-medieret excitotoxicity indebærer flere receptorer og signalering kaskader5. Ved at bruge metoden, og som påvist med AMPAR-blokkeren, NBQX i figur 1, er det muligt at dissekere specifikke komponenter i excitotoksisk glutamatrespons på et fysiologisk og molekylært niveau. Man kan forestille sig, at en lignende fremgangsmåde ved hjælp af hæmmere af anden messenger-systemer kan bruges til at bestemme deres bidrag til excitotoxicity. Desuden kunne de ARO’er, der anvendes her, tilpasses til at udtrykke GECI’er med cellespecifikke promotorer eller AAV-udtrykte optogenetiske sensorer, der kan anvendes til at måle andre parametre såsom neurotransmitterudgivelse.
Bortset fra primære embryonale dissektioner og konfokal billeddannelse, meget af protokollen bruger grundlæggende laboratoriefærdigheder, der ikke kræver specialiseret uddannelse. Derfor omfatter begrænsningerne for modellen vanskeligheden ved den embryonale dissektionsteknik, hvor lang tid cellerne skal dyrkes for at modnes, og adgang til et konfokalt mikroskop eller lignende billeddannelsesapparat. De mange fordele og fleksibilitet af metoden opvejer disse begrænsninger, hvilket gør dette til en ideel model til at studere den rolle glutamat-medieret excitotoxicity i nervesystemet lidelser. Endelig, denne model kunne være et effektivt redskab til at screene nye forbindelser for anti-apoptotiske effekter og deres evne til at bevare DA neuron sundhed.
The authors have nothing to disclose.
Støttet af tilskud fra American Parkinson Disease Association (APDA) og NIH R01NS115809-01 til RS. Vi takker Texas A & M Institute for Genomic Medicine (TIGM) for at give timede gravide mus til at generere primære dopaminerge kulturer.
10% Formalin/PBS | VWR | 100496-506 | |
10X NA 0.3 water-immersion objective | Olympus | UMPLFLN10XW | |
12 mm circular cover glass No. 1 | Phenix Research Products | MS20-121 | |
20X NA 0.85 oil-immersion objective | Olympus | UPLSAPO20XO | |
35 mm uncoated plastic cell culture dishes | VWR | 25382-348 | |
40X NA 0.3 water-immersion objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
60X NA 1.35 oil-immersion objective | Olympus | UPLSAPO60XO | |
Ampicillin (sodium) | Gold Bio | A-301-25 | |
B-27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | 50x stock |
Binolcular Microscope | Kent Scientific | KSCXTS-1121 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | |
Calcium Chloride (CaCl2), anhydrous | Sigma-Aldrich | 746495 | |
Chicken polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase | Abcam | ab76442 | |
Deoxyribonuclease I (DNase) | Sigma-Aldrich | DN25 | |
D-glucose, andydrous | Sigma-Aldrich | RDD016 | |
DMEM + GlutaMAX medium | ThermoFisher | 10569010 | 500 mL |
Equine serum | ThermoFisher | 26050088 | heat-inactivated |
Fiber Optic Illuminator, 100V | Kent Scientific | KSC5410 | |
Filter System, PES 22UM 250ML | VWR | 28199-764 | |
Fluoview 1000 confocal microscope | Olympus | ||
Fluoview 1200 confocal microscope | Olympus | ||
GlutaMAX supplement | ThermoFisher | 35050061 | |
Goat polyclonal anti-chicken Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150176 | |
Goat polyclonal anti-rabbit Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150077 | |
Hanks-balanced Salt Solution (HBSS) 1x | ThermoFisher | 14175095 | 500 mL |
HEPES | VWR | 101170-478 | |
HeraCell 150 CO2 incubator | Heraeus (ThermoFisher) | ||
ImageJ v1.52e | NIH | ||
IRIS-Fine Scissors (Round Type)-S/S Str/31*8mm/13cm | RWD | S12014-13 | |
Kanamycin monosulfate | Gold Bio | K-120-25 | |
Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A7506 | |
L-glutamic acid | VWR | 97061-634 | |
Magnesium Chloride (MgCl2), andydrous | Sigma-Aldrich | M8266 | |
MPII Mini-Peristaltic Pump, 115/230 VAC, 50/60 Hz | Harvard Apparatus | 70-2027 | |
MULLER Micro Forceps-Str, 0.15mm Tips, 11cm | RWD | F11014-11 | |
NBQX | Hello Bio | HB0443 | |
Neurobasal medium | ThermoFisher | 21103049 | 500 mL |
Normal goat serum (NGS) | Abcam | ab7481 | |
Origin 2020 | OriginLab | ||
pAAV.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40 | Addgene | 100837-AAV1 | Titer: 1.00E+13 gc/ml |
Papain | Worthington Biomedical Corporation | LS003126 | |
Penicillin streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | 10,000 U/mL |
Phosphate-buffered saline (PBS) 1x | ThermoFisher | 10010049 | 500 mL |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4832 | |
Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | |
Potassium Chloride (KCl), anhydrous | Sigma-Aldrich | 746436 | |
Pump Head Tubing Pieces For MPII | Harvard Apparatus | 55-4148 | |
Rabbit monoclonal anti-caspase-3 | Abcam | ab32351 | |
Sodium Chloride (NaCl), anhydrous | Sigma-Aldrich | 746398 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | BioXtra, ≥99.5% (GC) |
Time-pregnant female C57BL/6 mice | Texas A&M Institue for Genomic Medicine | ||
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | 500 mL |
Wide-bore blue pipette tips P1000 | VWR | 83007-380 |