Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att mäta in vitro Ca2 + flussen i midbrain nervceller och deras nedströms effekter på caspase-3 med hjälp av primära mus midbrain kulturer. Denna modell kan användas för att studera pathophysiologic förändringar relaterade till onormal Ca2 + aktivitet i midbrain nervceller, och att skärmen nya therapeutics för anti-apoptotiska egenskaper.
Abstract
Parkinsons sjukdom (PD) är en förödande neurodegenerativa störning som orsakas av degeneration av dopaminerga (DA) nervceller. Överdriven Ca2 + tillströmningen på grund av onormal aktivering av glutamat receptorer resulterar i DA excitotoxicitet och har identifierats som en viktig mekanism för DA neuron förlust. I denna studie isolerar vi, separerar och odlar midbrain nervceller från musen ventrala mesencephalon (VM) av ED14 mus embryon. Vi infekterar sedan de långsiktiga primära mus midbrain kulturer med en adeno-associerade virus (AAV) uttrycker en genetiskt kodad kalcium indikator, GCaMP6f under kontroll av den mänskliga neuron-specifika synapsin promotorn, hSyn. Använda levande confocal imaging, vi visar att odlade mus midbrain nervceller visa spontana Ca2 + fluxes upptäckts av AAV-hSyn-GCaMP6f. Bad tillämpning av glutamat till midbrain kulturer orsakar onormala höjder i intracellulära Ca2 + inom nervceller och detta åtföljs av kaspas-3 aktivering i DA nervceller, vilket framgår av immunfärgning. De tekniker för att identifiera glutamat-medierad apoptos i primär mus DA nervceller har viktiga tillämpningar för hög halt screening av läkemedel som bevarar DA neuron hälsa.
Introduction
Parkinsons sjukdom (PD) är den näst vanligaste neurodegenerativa sjukdomen i världen, utan kända botemedel. Uppskattningar tyder på att PD prevalensen kommer att fortsätta att öka och beräknas överträffa 1 miljon diagnoser till år 2030 i USA ensam1. Med få effektiva behandlingar som för närvarande finns tillgängliga för att bekämpa PD, det finns ett trängande behov av att utveckla effektivare terapier. PD kännetecknas av en snabb och progressiv förlust av midbrain dopamin (DA) nervceller2. De mekanismer som ligger bakom neurodegeneration i PD är dåligt förstådda. Bevis tyder på en trolig konvergens av flera mekanismer, såsom oxidativ stress och mitokondriell dysfunktion, etc. som bidrar till inledandet av apoptotiska signalering kaskader och eventuell celldöd3.
En sådan konvergent mekanism, glutamat-medierad excitotoxicitet har varit inblandad i flera neurodegenerativa sjukdomar, inklusive PD4. Medan glutamat-medierad excitotoxicitet tros fungera främst genom stimulering av NMDA-receptorer via en överdriven ökning av intracellulära Ca2 + koncentration och eventuell initiering av apoptos, Ca2 +-permeabla AMPA receptorer har också varit inblandad i det excitotoxiska svaret5,6,7. Därför är det av intresse att bestämma bidraget av AMPA-receptorer till glutamat-medierad apoptos inom en PD-modell. Detta kan uppnås med hjälp av NBQX, en AMPA och kainate blockerare, som vid mikromolarkoncentrationer är selektiv för AMPA-receptorer8. Glutamat-medierad excitotoxicity och apoptotiska signalering kaskader är ett idealiskt nedströms mål att mäta omfattningen av celldöd, och en potentiell mål för terapeutisk intervention. Därför utveckla en hög innehållsmetod för att bedöma glutamat-medierad modulering av kalcium aktivitet och associerade nedströms signalering i primära ventrala mesencephalic (VM) nervceller skulle vara värdefullt för screening nya behandlingsmetoder på deras förmåga att bevara neuronal hälsa.
Här har vi utvecklat ett protokoll där vi uttrycker den genetiskt kodade kalciumindikatorn (GECI), GCaMP6f, med hjälp av AAV2/5 med human synapsin (hSyn) promotor för att mäta Ca2 + aktiviteten hos mus VM primära nervceller som svar på glutamat ansökan som kan mätas på den fysiologiska och molekylär nivå. Denna hög innehållsliga screening kan anpassas för att upptäcka läkemedel eller behandlingar som modulerar Ca2 + aktivitet för att bevara hälsan hos VM nervceller. Vi föreslår att denna primära kulturmodell är ett effektivt sätt att screena för nya PD-interventioner, baserat på deras förmåga att bevara hälsan hos VM nervceller och mildra utvecklingen av PD.
Protocol
Alla förfaranden som involverar användning av djurförsök har godkänts av Texas A & M University Institutional Animal Care and Use Committee (25th Nov 2019; AUP# 2019-0346).
OBS: Beredning av cellodlingslösningar bör göras med sterilt förfarande i ett biologiskt säkerhetsskåp och filtreras vid 0,2 μm för att förhindra kontaminering.
1. Beredning av lösningar och odlingsmedium
- Bered lamininbeläggningslösning genom att späda 20 μL av 1 mg/mL laminin-materiel till 2 mL steril destillerad H2O. Bered på dissektionsdagen.
- Bered 10 % es-stopps-lösning (equine) (häst) genom att tillsätta 5 mL ES till 45 mL av 1x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS). Sterilt filter med hjälp av ett filtersystem på 0,2 μm eller sprutafilterspets. Förvaras vid 4 °C.
- Bered 4% bovint serumalbumin (BSA) stamlösning genom att tillsätta 2 g BSA-pulver till 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och föra till en slutlig volym på 45 mL. Sterilt filter med hjälp av ett filtersystem på 0,2 μm eller sprutafilterspets. Förvaras vid 4 °C.
- Bered lösning av papain stam genom att späda papain till 3 mg/mL i 1x HBSS. Sterilt filter med hjälp av ett filtersystem på 0,2 μm eller sprutafilterspets. Förvaras vid -20 °C.
- Förbered deoxyribonuclease (DNase) lösning genom att tillsätta 20 mg DNase pulver till sterilA H2O och föra till en slutlig volym på 20 mL. Sterilt filter med hjälp av ett filtersystem på 0,2 μm eller sprutafilterspets. Förvaras vid -20 °C.
- Bered askorbinsyra stamlösning genom att tillsätta 352 mg askorbinsyra till sterilt destillerat H2O och föra till en slutlig volym på 20 mL. Värm i 37 °C-bad för att lösa upp om det behövs. Sterilt filter med hjälp av ett filtersystem på 0,2 μm eller sprutafilterspets. Förvaras vid -20 °C.
- Förbered CellOdling Medium genom att tillsätta följande till 50 mL neurobasalt medium: 500 μL glutamax (100x), 500 μL hästserum, 1 mL av B-27, 100 μL av askorbinsyra, 500 μL av penicillin-streptomycin, 50 μL av kanamycin och 50 μL ampicillin. Sterilt filter med hjälp av ett 0,2 μm filtersystem. Förvaras vid 4 °C.
- Förbered 0,01% Triton X-100 Solution genom att lägga till 1 mL Triton X-100 i 9 mL av 1x PBS för att göra en 10% lösning. Som Triton X-100 är trögflytande, pipetter långsamt att låta spets fylla helt. Värm i 37 °C-bad för att lösa upp om det behövs. Förvaras vid 4 °C.
- För att späda ut 10% Triton X-100 lager till 0,01%, utför 3 seriell 1:10 utspädningar. Späd 1 mL av 10% lager i 9 mL av 1x PBS för att göra 1% lösning. Späd 1 mL av 1% lösning i 9 mL av 1x PBS för att göra 0,1% lösning. Späd 1 mL på 0,1% lösning i 9 mL av 1x PBS för att göra en 0,01% lösning.
- Förbered 10% och 1% normal get serum (NGS) lösning genom att lägga till 1 mL NGS till 9 mL av 1x PBS för en 10% lösning. Tillsätt 100 μL NGS till 9,9 mL 1x PBS för att göra 1% lösning.
- Bered glutamat stamlösning (100 mM) genom att tillsätta 735 mg L(+)-Glutaminsyra till steril destillerad H2O och föra till en slutlig volym på 50 mL. Löslighet vid denna koncentration kommer att vara ett problem. Att tillsätta små volymer (100 μL) av 1 M saltsyra är tillräckligt för att öka lösligheten.
- Förbered NBQX-stamlösning (10 mM) genom att tillsätta 50 mg NBQX till steril destillerad H2O och föra till en slutlig volym på 13 mL.
2. Beredning av kultur rätter och coverslips (Klar dagen före dissekering)
OBS: Vi har funnit att kombinera tre beläggningsmedel, poly-L-lysin, poly-L-ornitin, och laminin möjliggör idealisk celladhesion och livskraft.
- Placera 10 35 mm Petriskålar i ett biologiskt säkerhetsskåp. Placera två cirkulära 12 mm täcken i varje fat och fyll med 70% EtOH i 10 min. Använd en vakuumledning för att aspirera den återstående EtOH från varje maträtt, vilket gör att EtOH kan avdunsta helt.
- Pipett ~90-100 μL av 0,1% poly-L-lysinlösning på varje täckplatta, se till att hela täcks av poly-L-lysinlösningen. Täck disken med lock och lägg i en 37 °C-inkubator i 1 h.
- Aspirera återstående poly-L-lysinlösning från varje täckslip och skölj med steril H2O.
- Upprepa steg 2.2 – 2.3 med 0.1% poly-L-ornitinlösning.
- Återigen, upprepa steg 2,2 – 2,3 med 0,01% laminin lösning. Placera i en inkubator med 37 °C/5 % CO2 tills den är klar för cellplätering följande dag.
3. Mus embryonala dissektioner
OBS: Vi använder mellan 4 till 6 tidsanerade dräktiga möss per odling. Medan mycket av dissekeringsprocessen sker utanför ett biologiskt säkerhetsskåp är det fortfarande viktigt att upprätthålla steril förfarande. Riklig användning av 70% EtOH på ytor nära dissekeringsmikroskopet och på kirurgiska verktyg är idealisk. En mask kan också bäras under dissektionen för att ytterligare förhindra kontaminering. Dessutom använder vi 4 separata antibiotika i odlingsmediet, så kontaminering är osannolikt. Men om användningen av antibiotika är problematiskt, denna dissekering setup kan flyttas inuti en steril huva. För att bevara cellens livskraft bör alla dissektionslösningar förkyldas vid 4 °C, och dissektioner bör slutföras så snabbt som möjligt. Vi utför inte dissektionerna på is. Metoden för dissektion av mus embryonala mellanhjärnan nervceller är identisk med tidigare beskrivna metoder9,10.
- Förbered ett utrymme på en bänk nära ett dissekeringmikroskop med en absorberande pad och spraya frikostigt med 70% EtOH.
- Spraya två 100 x 15 mm glas Petriskålar och en 50 x 10 mm glas Petriskål med 70% EtOH och låt EtOH förångas. När du väl har förångats placerar du 50 mL steril 1x HBSS i varje 100 x 15 mm Petriskål.
- Submerge kirurgiska sax, tång, och mikrotom blad i 70% EtOH för 10 min minimum att sterilisera. Placera instrument på den absorberande dynan för att torka.
- Använda CO2 följt av livmoderhalscancer störningen, avliva 2-3 månader gamla tidsansed graviditet möss på embryonala dag 14.
- Spraya buken hos de avlivade mössen med 70% EtOH. Använda forceps ta tag i nedre delen av buken och öppna bukhålan med hjälp av kirurgiska sax. Börja skära nära där tången håller buken, vilket gör laterala nedskärningar på varje sida tills bukväggen kan vikas tillbaka och livmodern är tydligt synlig.
- Med hjälp av kirurgisk sax, skär båda ändarna av livmoderhornet. Ta sedan bort livmodern och placera i Petri-skålen med 1x HBSS.
- Använda rak spets tång försiktigt bort embryon från livmodern. Lämna embryon i HBSS under hela denna process. Använda antingen tärna eller en mikrotom blad, snabbt halshugga embryon genom att skära nära halsen. Att göra så nivå ett snitt som möjligt.
- Under ett dissekerande mikroskop, flytta ett embryohuvud till en torr 50 mm Petriskål och placera på den ventrala sidan. Stabilisera huvudet med tärnor genom att placera och tränga in nära ögonen/nosen. Tcett ska vinklas nedåt vid ~ 45° för att undvika att tränga in i mesencephalon.
- Med hjälp av tänjarna i den andra handen, försiktigt bort det genomskinliga lagret av hud och skalle strax före den framträdande åsen av mesencephalon. Börja nära mittlinjen och ta bort hud och skalle caudally tills mesencephalon är fullt exponerad.
- Håll tärna vinkelrät mot den exponerade mesencephalon med en spets mellan cortex och mesencephalon och den andra nära lillhjärnan. Tryck ner och nypa ihop tycket för att ta bort hela mellanhjärnan. Mellanhjärnsegmentet ska vara cirka 0,5 mm tjockt. Placera mellanhjärnsegmentet i den andra Petri-skålen fylld med färsk 1x HBSS. Upprepa denna process för varje embryo.
- Med hjälp av dissekering mikroskop, placera hjärnan segmentet med den ventrala sidan uppåt. Om hjärnhinnorna fortfarande är fastsatta, ta försiktigt bort det genom att ta tag i med tämparna och lyfta upp och bort från hjärnsegmentet.
- Hjärnsegmentet ska ha 4 synliga kvadranter. Placera segmentet på ett sådant sätt att de två mindre kvadranterna är placerade överlägsna de två större kvadranterna. Det finns en framträdande ås som skiljer de överlägsna två (små) kvadranterna från de underlägsna två (stora) kvadranterna.
- Använda kraftknip nyp och separera de överlägsna kvadranterna från de sämre kvadranterna, och sedan kasta de överlägsna kvadranterna. De återstående sämre kvadranterna kommer att ha överskott vävnad i sidled på dorsala sidan, kommer denna vävnad ser mindre ogenomskinlig än de återstående ventrala vävnad. Ta bort den mindre täta ryggvävnaden och kasta. Det återstående segmentet bör innehålla både Substantia nigra pars compacta (SNc) och det ventrala tegmentalområdet (VTA).
- Med hjälp av krafttopparna skär den återstående ventrala vävnad segmentet i 4 mindre bitar och med hjälp av en 1mL bred bore pipetten överföra dessa segment i en 15 mL koniska röret med 1x HBSS. Håll det koniska röret med hjärnsegment på is under hela proceduren.
- Upprepa denna process för alla återstående hjärnsegment.
4. Dissociation av celler
- Enzymatisk nedbrytning av celler
- Aspirera försiktigt HBSS från det koniska röret på 15 mL som innehåller mellanhjärnsegment, och lämnar segmenten i botten av röret.
- Tillsätt ~800 μL papainlösning till röret och lägg i en 37 °C inkubator i 7 min. Resuspend celler genom att snärta röret och ersätta till 37 °C inkubatorn för ytterligare 7 min.
- Med en bred-bore 1 mL pipett spets bort endast mellanhjärnan segmenten i en 1 mL alikvot av DNase. Låt segmenten att nå botten av alikvoten eller ca 1 min exponering.
- Med en bredborrad 1 mL pipettspets avlägsnas endast mellanhjärnsegmenten i ett koniskt rör på 15 mL som innehåller 2 mL stopplösning. Låt segmenten lägga sig i botten av röret och upprepa sköljningen i ett extra koniskt rör fyllt med stopplösning.
- Mekanisk trituration av cellupphängning
- I den andra stopplösningen sköljröret, med hjälp av en bredborrad 1 mL pipett spets, pipetter cellerna upp och ner 10 gånger tills det inte finns några stora vävnadssegment synliga. Det är viktigt att undvika över trituration för minimal celllys.
- Långsamt pipettera 300 μL av 4% BSA lösning till botten av 15 mL koniska röret som innehåller hjärnan segment. Ta försiktigt bort pipettspetsen för att bibehålla ett upphängningslager. Centrifugera vid 0,4 x g i 3 min. Därefter aspirera försiktigt supernatant- och resuspendcellerna i 400 μL av cellodlingsmedium.
5. Bordläggning av cellerna
OBS: Baserat på erfarenhet samlas cirka 100 000 livskraftiga celler per embryo. 2-3 månader gamla tidsbefriade dräktiga möss har typiskt kullstorlekar på 8-10 embryon; därför är en grov uppskattning för total avkastning av celler per tidsbeskattad gravidmus cirka 1 miljon celler.
- Med hjälp av en hemocytometer preform en cellräkning och späd sedan suspensionen till 2.000 celler / μL med hjälp av cellodling medium. Triturate kort att blanda.
- Ta bort täckslip med lamininlösning från steg 2 från inkubatorn och aspirera den återstående lamininlösningen från de belagda täcken med hjälp av ett vakuum. Platta snabbt för att undvika att täcken torkar helt. Pipett 100 μL (2,0 x 105 celler/täckskydd) på varje täckslip och placera Petriskålar i en 37 °C inkubator i 1 h.
- Tillsätt försiktigt 3 mL cellodlingsmedium till varje maträtt och placera tillbaka i inkubatorn på 37 °C. Förforma halv medium ändras 2 gånger per vecka i 2 veckor.
6. Infektion av cellkultur vid 14 DIV med adeno-associerade viral (AAV) vektorer
- För varje maträtt förbereda 1 mL serum fri DMEM medium med 1 μL av hSyn-GCaMP6f AAV (1,0 x 1013 titer)
- Aspirera cellkulturmediet från varje rätt och ersätt med 1 mL serumfritt DMEM innehållande hSyn-GCaMP6f. Placera tillbaka rätter i inkubatorn på 37 °C i 1 h.
- Aspirera serumet fria medium som innehåller AAV och ersätta med 3 mL cell odling medium. Placera tillbaka rätter i inkubatorn på 37 °C. Vi har funnit att 5-7 dagar av AAV infektion möjliggör idealiska nivåer av GCaMP uttryck. Fortsätt att byta medium var 2-3 dagar under hela denna period av virusinfektion.
7. Live confocal Ca2 + bildframställning mellan 19-21 DIV
OBS: Som nämnts i steg 6.3 kan bildtagning göras mellan 5-7 dagar efter virusinfektion. Detta är det idealiska fönstret för att uppnå synligt uttryck för fluorofore på nivåer som möjliggör detektion av spontana Ca2 + aktivitet.
- Förberedelse av inspelningsbuffertar
- För att göra 1 L av HEPES-inspelningsbuffert, lägg till: 9.009 g NaCl, 0,3728 g KCl, 0,901 g D-glukos, 2,381 g HEPES, 2 mL av 1 M CaCl2 stamlösning, och 500 μL av 1 M MgCl2 stamlösning till 800 mL steril destillerad H2O. Ta med pH till 7,4 med NaOH. Ta med till en sista volym på 1 L.
- För att göra 200 mL av 20 μM glutamatregistreringsbuffert, späd 40 μL av 100 mM glutamatlagerlösning till 200 mL HEPES-inspelningsbuffert som beskrivs ovan.
- För att göra 200 mL på 10 μM NBQX-registreringsbuffert, späd 200 μL på 10 mM NBQX-lagerlösning till 200 mL HEPES-registreringsbuffert.
- Konfokal avbildning
- Fyll en steril 35 mm Petriskål med 3 mL av inspelningsbuffert.
- Ta bort en 35 mm petriskål med infekterade kulturer från inkubatorn med 37 °C. Med hjälp av fina spetstips, ta försiktigt tag i kanten av en täckskydd och överför den snabbt i Petri-skålen fylld med inspelningsbuffert. Placera den återstående täckslipen i medium tillbaka i inkubatorn på 37 °C. Transportera skålen med inspelningsbuffert till konfokalmikroskopet.
- Starta bildhanteringsprogrammet. Fortsätt till nästa steg medan den initieras.
- Starta den peristaltiska pumpen och placera linjen i inspelningsbufferten. Kalibrera hastigheten på flödet till att vara 2 mL/min.
- Överför det infekterade täcket från 35 mm Petriskålen i inspelningsbadet.
- Med hjälp av 10x vatten nedsänkning objektiv och BF ljus, hitta plan för fokus och leta efter en region med en hög densitet av neuron cell organ. Byt till 40x vatten nedsänkning objektiv och med hjälp av BF ljus fokusera provet.
- I "Dyes lista" fönstret inom FluoView välj AlexaFluor 488 och tillämpa den.
- AAV-uttryck kan vara variabel; därför, för att förhindra överexponering och fotobleaching av fluoroforerna, börja med låga HV och laser makt inställningar. För AlexaFluor 488-kanalen, ställ in högspänningen (HV) till 500, förstärkningen till 1x, och offset till 0. För 488 laserlinjen ställa in strömmen till 5%. För att öka den effektiva volym som avbildas i z-planet, öka tapphålsstorleken till 300 μm. Använd "focus x2"-skanningsalternativet för att optimalt justera emissionssignaler till submättnadsnivåer. Härifrån kan inställningar justeras tills ideal synlighet för varje kanal uppnås.
OBS: För att exakt fånga hela utbudet av Ca2+ fluss med GCaMP, justera baslinjen HV och laser makt inställningar för att möjliggöra en ökning av fluorescerande intensitet utan att överstrikta detektorn. - När mikroskopinställningarna har optimerats flyttar du scenen för att lokalisera en region med flera celler som visar spontana förändringar i GCaMP6f fluorescens och fokus på önskat plan för avbildning.
- Använd verktyget "Clip rect" för att klippa bildrutan till en storlek som kan uppnå ett ramintervall på knappt 1 sekund. Detta är nödvändigt för att ställa in bildbehandlingsintervallet med 1 bildruta per sekund.
- Ställ in "Interval"-fönstret till ett värde av 1,0 och "Num"-fönstret till 600.
OBS: För att kunna leverera olika inspelningsbuffertar vid önskad tidpunkt (300 s) är det viktigt att kalibrera svarstiden för pumpen för att leverera den nya lösningen till badet. Detta kommer att vara beroende av lösningsperfusionshastigheten (2 mL/min) och längden på den linje som används för att pumpa lösning. - För att fånga en t-serie film välj alternativet "Tid" och sedan använda "XYt" skanningsalternativet för att börja bildbehandling.
- Titta på imaging förloppsindikatorn och flytta linjen från HEPES-inspelningsbufferten till 20 μM-registreringsbufferten för glutamat vid lämplig tidpunkt (t.ex. om pumpens latens är kalibrerad för att leverera lösning vid 60 s, flytta linjen in i glutamatbufferten vid 240 bildrutor för att leverera glutamat vid 300 s).
- När avbildningen är klar väljer du knappen Serie klar och sparar den färdiga filmen i T-serien. Fortsätt att understâ 20 μM Glutamat i ytterligare 5 min, så att de odlade neuronerna har utsatts för glutamat i totalt 10 min. Upprepa denna process för varje coverslip som ska avbildas.
- Efter den ytterligare 5 min exponering för 20 μM Glutamat, ta bort täckplattan från badet och placera tillbaka till 35mm Petriskålen som innehåller inspelningsbuffert tills dagen för avbildning är avslutad. När du är klar, fortsätt till steg 8.
- Ca2+ spårningsanalys
- Utför bildanalys i ImageJ. Installera BIO-FORMATs plugin för ImageJ, som kommer att tillåta . OIB bildfiler att öppna.
- Klicka på Analysera i verktygsfältet ImageJ | Ange Mått, och välj rutan för Medelgråvärde (MGV).
- Öppna en t-seriefilm i ImageJ som en hyperstack.
- Dra reglaget för filmen och identifiera ramen med maximal glutamat svar att visualisera alla nervceller som svarar på glutamat. Använd polygon verktyget för att spåra alla synliga neuron cell organ, lägga till deras ROIs till "ROI manager" lista.
- När du är klar med spårning och tillägg av ROIs, välj alla ROIs inom fönstret ROI Manager och använda multi måttval i den mer listan med alternativ. Kopiera och klistra in dessa data i ett kalkylblad. Slutför den här processen för alla filmer som ska analyseras.
- För varje ROI, konvertera de råa MGV-data från varje ram till ΔF/F0-värden med hjälp av ekvationen: ΔF/F0 = [F(t) – F0] / F0. Där F(t) = MGV av en given ram, och F0 = genomsnittlig baslinje MGV på ~ 10 ramar där inga Ca2 + flussmedel finns.
- Med hjälp av en statistisk programvara som OriginPro 2020 kan konverterade ΔF/F0-spår göras till linjediagram. Funktionen "Peak analyzer" kan användas (eller liknande funktion om du använder en annan programvara) för att mäta toppamplituden av glutamatsvar, latens för att svara på glutamat och område under kurvan.
8. Immunfärgning av kulturer
OBS: Efter fixering med formalin kan täckslip förvaras i 1x PBS vid 4 °C tills det är klart att bearbetas för immunfärgning. Primära och sekundära antikroppar inkubation gjordes på ett seriellt sätt, som sådan inkubation med anti-Caspase-3 primära antikroppar och dess kompletterande sekundära antikropp föregås inkubation med anti-TH primära antikroppen och dess kompletterande sekundära antikropp.
- Omedelbart efter glutamatexponering, placera omslagen tillbaka till sin 35 mm Petriskål, aspirera inspelningen buffert, och tillsätt 3 mL av 10% formalin. Låt sitta i 40 min i rumstemperatur (RT).
- Skölj skålen 3 gånger med 1x PBS.
- Aspirera PBS och permeabilize celler i 1 mL av 0.01% Triton X-100 i PBS för 2 min.
- Skölj skålen 3 gånger med 1x PBS.
- Aspirera PBS och blockera celler i 1 mL av 10% NGS i PBS för 40 min.
- Skölj skålen 3 gånger med 1x PBS.
- Tillsätt 1 μL av kaninhämmande- Caspase-3 primär antikropp till 1 mL av 1% NGS i PBS (1:1000 utspädning). Aspirera PBS från skålen och ersätta med den primära antikroppslösningen. Placera på en skakmaskin och inkubera i 1,5 h vid RT.
- Skölj skålen 3 gånger med 1x PBS.
- Tillsätt 1 μL getantikan AlexaFluor 488 sekundär antikropp till 1 mL av 1% NGS i PBS (1:1000 utspädning). Aspirera PBS från skålen och ersätta med den sekundära antikroppslösningen. Placera på en skakmaskin och inkubera i 1 h vid RT. Förflyttning framåt skyddar proverna från ljus.
- Skölj skålen 3 gånger med 1x PBS.
- Upprepa steg 8.7 – 8.10, men med hjälp av den primära anti-TH-anti-TH-antikroppen för kyckling (1:1000) i steg 8.7 och geten anti-kyckling AlexaFluor 594 sekundär antikropp (1:1000) i steg 8.9.
- Efter den slutliga PBS skölj, placera 30 μL monteringsmedium på ett mikroskop objektglas. Använda tärnor ta tag i ett täckskydd från 35 mm Petri-skålen och placera täckplattan med cellerna nedåt i monteringsmediet. Båda coverslips kommer att passa på ett enda mikroskop glida om de placeras korrekt. Placera i ett torrt, mörkt område och låt monteringsmediet torka över natten.
9. Confocal avbildning av immunstained kulturer
- Konfokal avbildning
- Starta bildhanteringsprogrammet. Placera provet på mikroskopstadiet.
- Med mikroskopet okular, med hjälp av en 20x förstoring objektiv och epifluorescerande ljus med ett TRITC-filter, fokusera provet och söka efter en TH + cell kropp.
- När du väl lokaliserat en TH+ cellkropp, centrera den i synfältet och sedan flytta till 60x förstoringsmålet.
- Välj färgämnena AlexaFluor 488 och AlexaFluor 594 i fönstret "dye list".
- Som med live-avbildning, börja med låg HV, gain, offset, och laser power settings för att förhindra fotoblekning. Använd "fokus x2" skanning alternativet att bedöma fluorescerande intensiteten i varje kanal och justera därefter. Eftersom dessa bilder senare kommer att kvantifieras för fluorescerande intensitet är det nödvändigt att hålla bildframställningsinställningarna konsekventa över alla synfält. Därför är det bäst att titta på några exempel på varje villkor för att få en uppfattning om utbudet av fluorescerande intensitet över prover.
- När idealiska bildframställningsinställningar har bestämts väljer du "fokus x2"-skanningsalternativet och flyttar in intressecellen i synfältets mitt. Öka den digitala zoomen till 3x med hjälp av reglaget "zoom".
- Med hjälp av fokusratten, hitta plan av fokus med den ljusaste fluorescens och fånga ett enda plan XY bild. Spara bilden för att avsluta.
- Växla tillbaka till 20x förstoringsmålet för att söka efter en annan TH + cell. Upprepa denna process tills önskat antal celler har provats från varje villkor.
- Bildanalys
- Klicka på Analysera i verktygsfältet ImageJ | Ange Mått, och välj rutorna för Område, Integrerad densitet och Medelvärdet av grått värde.
- Öppna en bild som en hyperstack med varje kanal åtskilda genom att dra och släppa in i ImageJ-verktygsfältet eller välja bilden via arkivmenyn.
- Använd TH-kanalen (594 nm) för att rita upp ROIs runt cellkroppen. Med hjälp av polygonspårningsverktyget i ImageJ, noga spåra den yttre kanten av cellkroppen. Där avståndet mellan cellmembranet och cellkärnan är det minsta, spåra en rak linje genom cytosolen till kanten av kärnan och sedan noga följa konturerna av kärnan för att utesluta den. Spåra sedan en rak linje tillbaka till det yttre membranet, som gränsar till den inledande linjen så nära som möjligt, och fortsätt att följa konturerna av cellkroppen tills ROI är klar.
- Använda kortkommandot "T" eller med hjälp av verktygsfältets menybana Analysera | Verktyg | ROI Manager, öppna ROI-hanteraren och lägg till den ROI som precis har ritats till listan.
- Välj fönstret för kanalen caspase-3 (488 nm) och välj sedan den tillagda avkastningen på investeringen i listan "ROI Manager".
- I fönstret ROI Manager väljer du knappen Mät. Resultatfönstret kommer att visas med mätningarna som tidigare ställts in. Kopiera dessa till ett kalkylblad och upprepa den här processen för varje cell.
Representative Results
Efter inledande odling av celler, behandlade vi VM kultur rätter på 14 DIV med 1 μL av AAV hSyn-GCaMP6f och tillåts för 5 dagar av viral uttryck. På dagen för bildbehandling HEPES inspelningsbufferten var beredd färskt. Vi använde två villkor; i ett villkor 20 μM glutamat tillämpades för 10 min, medan i det andra villkoret 5 min av 10 μM NBQX ansökan föregick en 10 min co-tillämpning av 10 μM NBQX + 20 μM glutamat. I båda villkoren, vi observerade heterogena och spontana förändringar i GCaMP6f fluorescens, som indikerar spontana Ca2 + flussor, som visas i den representativa spår (Figur 1A,B, Kompletterande Movie 1-2). Tillämpning av 20 μM glutamat genererade en robust och ihållande Ca2 + svar i både spontant aktiva och quiescent nervceller (Figur 1A, Kompletterande Movie 1). Applicering av 10 μM NBQX reducerade spontan aktivitet, och blockerade delvis det glutamatiska svaret (Figur 1B, Supplemental Movie 2). I vilken utsträckning glutamat ansökan stimuleras en Ca2 + svar i varje villkor kvantifierades med hjälp av område under kurvan, topp amplitud och latens att svara. Både område under kurvan och toppamplitud var likartad för både glutamat och NBQX + glutamatbehandlade tillstånd (figur 1C), medan svarsfördröjningen ökade avsevärt i tillståndet NBQX + glutamat (Figur 2A,B). Förutom att kvantifiera Ca2 + svar på glutamat behandling, vi fast och färgade prover med en anti-caspase-3 antikropp som ett mått på glutamat-medierad apoptos. Vi observerade en rad kaspase-3 aktivering över villkoren (Figur 3A,B). Caspase-3 aktivering kvantifierades genom att mäta område och medelvärdet av caspase-3-intensitet. Vid jämförelse med obehandlade kontrollceller trendades det genomsnittliga området av celler med kaspas-3-aktivering under glutamat och NBQX + glutamatförhållanden mot signifikans (figur 3B). Medel-caspase-3-intensiteten var signifikant högre i glutamat och NBQX + glutamattillstånd jämfört med obehandlade kontroller (Figur 3B). Tillsammans visar dessa resultat en hög innehållsram där apoptos av nervceller kan mätas genom att kvantifiera Ca2 + svar på excitotoxiska medel och följas upp med en analys av nedströms apoptotiska händelser såsom caspase-3 aktivering i samma uppsättning kulturer.
Figur 1: Odlade ventrala mesencephalic nervceller visa spontana Ca2 + aktivitet och är robust stimuleras av glutamat ansökan. (A) Representativa spår av spontana Ca2 + aktivitet i VM nervceller och deras svar på 20 μM Glutamat ansökan. (B) Representativa spår av spontan Ca2+ aktivitet i VM nervceller och deras svar på 10 μM NBQX + 20 μM Glutamat ansökan. (C) Befolkningsdata som visar areal under kurvan och toppamplitud av Ca2+ spår. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: AMPAR blockad med NBQX förseningar svar på glutamat ansökan i odlade ventrala mesencephalic nervceller. (A) Representant Ca2+ spår av glutamat (grå) och NBQX + glutamat (blå) framkallade svar. Genomsnittliga Ca2+ spår av glutamat (svart) och NBQX + glutamat (röd) visas överlagrad. (B) Befolkningsdata som visar latens till svar för glutamat och NBQX + glutamat framkallat svar. Procentuell förändring mellan glutamat och NBQX + glutamatförhållanden visas i den högra panelen. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Glutamat ansökan ökar caspase-3 uttryck i tyrosin hydroxylas (TH) positiva ventrala mesencephalic nervceller. (A) Representativa confocal bilder av VM kulturer immunstained för caspase-3 (grön) och TH (röd), skala bar = 10 μm. (B) Befolkningsdata som visar DA neuron område och medelvärdet grå värdet av caspase-3 uttryck i varje villkor. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Kompletterande Film 1: Spontan Ca2 + aktivitet och svar på glutamat ansökan.
Spontana Ca2+ flussen i närvaro av HEPES-inspelningsbuffert (0-300 s) följt av applicering av 20 μM glutamat (301-600 s). Skala bar = 50 μm. Vänligen klicka här för att ladda ner den här videon.
Kompletterande Movie 2: Spontan Ca2 + aktivitet och svar på NBQX + glutamat ansökan.
Spontana Ca2+ flussor i närvaro av HEPES-inspelningsbuffert (0-300 s) följt av applicering av 10 μM NBQX (301-600 s), och 10 μM NBQX + 20 μM glutamat (601-900 s). Skala bar = 50 μm. Vänligen klicka här för att ladda ner den här videon.
Discussion
Vi beskriver en långsiktig primära ventrala mesencephalic (VM) cell kultur system för hög innehållsinnehåll analys av glutamat-medierad apoptos i nervceller. Studier har anställt primära midbrain dopaminerga kulturer att belysa excitotoxiska mekanismer i samband med PD-modeller11,12. I denna studie använder vi en kombinatorisk metod med hjälp av genetiskt kodade Kalcium indikatorer (GECIs) för att mäta Ca2 + aktivitet och ytterligare associera denna verksamhet med nedströms molekylära förändringar, såsom inledande av apoptotiska signalering kaskader4. Metoden har flera fördelar med andra liknande cellodlingssystem. Som vi har särskilt intresse för excitotoxicitet inom ramen för Parkinsons sjukdom, med hjälp av primära VM cellkulturer är idealisk. Genom att använda olika fält omlokalisering tekniker, såsom gridded coverslips eller en motoriserad XY mikroskop skede kombinerat med TH immunfärgning, kan vi direkt studera celltyp specifika effekter av glutamat-medierad apoptos i ventrala mellanhjärnan nervceller. Dessutom, den 3-veckors cellkultur modell gör det möjligt för nervceller att utveckla sin fulla, mogna molekylär profil, vilket återspeglar vuxna DA nervceller9. Tidigare metoder har främst fokuserat på molekylära förändringar efter glutamat-medierad excitotoxicitet13,14. Modellen är unik i sin förmåga att korrelera akuta förändringar i neuronal fysiologi med nedströms molekylära händelser i identifierade celltyper. En begränsning av den primära odlingsmodellen är att dissektionstekniken fångar hela ventrala mellanhjärnan, inklusive DA och GABAergic nervceller samt nervceller från SNc och VTA. Bevis tyder nu på att DA nervceller av SNc har selektiv sårbarhet för kalcium och eventuell celldöd jämfört med DA nervceller i angränsande VTA15. Tyvärr har differentiering SNc från VTA nervceller i embryonala kulturer visat sig svårt med få anatomiska landmärken att definiera dessa strukturer i den embryonala hjärnan.
Vi visar att den primära odlingstekniken möjliggör kvantifiering av heterogen spontan Ca2+ aktivitet (Figur 1). Därför är detta en idealisk cellkultur systemmodell för att studera tonically aktiva celler, såsom pacemaking dopaminerga nervceller i mellanhjärnan, neokortikala nervceller, och GABAergic nervceller av suprachiasmatic kärnan (SCN)16,17. I de flesta tillämpningar uppnår Ca2+ imaging inte samma temporala upplösning som elektrofysiologi. Därför är det troligt att en enda Ca2 + händelse är analog med en explosion av neuronala åtgärder potentialer. Detta kan tolkas som att Ca2 + imaging möjliggör relativt korrekta åtgärder av onormal sprängning verksamhet i pacemaking celler och är därför lämpligt för en hög halt skärm av Ca2 +-medierad excitotoxiska celldöd.
För att uppnå och upprätthålla spontan Ca2+-aktivitet är det viktigt att ta itu med två viktiga punkter i protokollet. Först är plätering densitet av cellerna efter dissektion. För primära VM nervceller, tidigare studier har använt runt 100.000 celler/cm29,10. Vi har anpassat protokollet till plattan en densitet av 200.000 celler/cm2, vilket skapar ett heterogent utbud av spontan aktivitet och ökar antalet dopaminerga VM nervceller som finns på varje täckplatta. Eftersom olika pacemaking nervceller har distinkta bränning egenskaper16, den plätering densitet måste anpassas till celltyp som studeras och optimeras för att uppnå idealiska nivåer av spontan aktivitet. Andra är inkubationstiden efter virusinfektion av AAV. Liksom plätering densitet, kommer detta att vara beroende av det specifika sammanhanget för forskningen fråga och typ av AAV som används. För de specifika AAV som används här, 5 dagar av inkubation efter virusinfektion är idealisk för att uppnå de önskade proteinuttryck nivåer, vilket möjliggör dynamiska förändringar i GCaMP fluorescens i syfte att registrera Ca2 + aktivitet. Många faktorer avgör hur snabbt och effektivt en AAV kommer att uttrycka sin last, varav mycket ligger utanför ramen för denna metod, men kortfattat, det är viktigt att överväga promotor aktivitet och den hastighet med vilken lastprotein mognar och veck.
En annan fördel med metoden är att den möjliggör avsevärd flexibilitet i format, uttrycksvektorer, användning av bildåtergivningsutrustning, och den rad vetenskapliga frågor som kan behandlas. Dessutom möjliggör metoden utredning av ett brett spektrum av specifika frågor som omger glutamat-medierad excitotoxicitet i PD, och andra modeller av nervsystemet dysfunktion. Till exempel, glutamat-medierad excitotoxicitet innebär flera receptorer och signalering kaskader5. Genom att använda metoden, och som visats med AMPAR-blockeraren, NBQX i figur 1, är det möjligt att dissekera ut specifika komponenter i det excitotoxiska glutamatsvaret på en fysiologisk och molekylär nivå. Möjligen, en liknande metod med hjälp av hämmare av andra budbärare system kan användas för att bestämma deras bidrag till excitotoxicity. Dessutom kan de AAV som används här anpassas för att uttrycka GECIs med cellspecifika initiativtagare eller AAV-uttryckta optogenetiska sensorer som kan användas för att mäta andra parametrar såsom signalsubstansfrigöring.
Bortsett från primära embryonala dissektioner och confocal bildbehandling, mycket av protokollet använder grundläggande laboratoriekunskaper som inte kräver specialiserad utbildning. Därför är begränsningarna för modellen inkluderar svårigheten av den embryonala dissekeringstekniken, den tidslängd cellerna måste odlas för att nå mognad, och tillgång till en konfokal mikroskop, eller liknande bildåtergivningsapparat. Metodens många fördelar och flexibilitet överväger dessa begränsningar, vilket gör detta till en idealisk modell för att studera rollen glutamat-medierad excitotoxicitet vid störningar i nervsystemet. Slutligen, denna modell kan vara ett effektivt verktyg för att skärmen nya föreningar för anti-apoptotiska effekter och deras förmåga att bevara DA neuron hälsa.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Stöds av bidrag från American Parkinson Disease Association (APDA) och NIH R01NS115809-01 till RS. Vi tackar Texas A & M Institute for Genomic Medicine (TIGM) för att tillhandahålla tidsfördredande dräktiga möss för att generera primära dopaminerga kulturer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Formalin/PBS | VWR | 100496-506 | |
| 10X NA 0.3 water-immersion objective | Olympus | UMPLFLN10XW | |
| 12 mm circular cover glass No. 1 | Phenix Research Products | MS20-121 | |
| 20X NA 0.85 oil-immersion objective | Olympus | UPLSAPO20XO | |
| 35 mm uncoated plastic cell culture dishes | VWR | 25382-348 | |
| 40X NA 0.3 water-immersion objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 60X NA 1.35 oil-immersion objective | Olympus | UPLSAPO60XO | |
| Ampicillin (sodium) | Gold Bio | A-301-25 | |
| B-27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | 50x stock |
| Binolcular Microscope | Kent Scientific | KSCXTS-1121 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Calcium Chloride (CaCl2), anhydrous | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| Chicken polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase | Abcam | ab76442 | |
| Deoxyribonuclease I (DNase) | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| D-glucose, andydrous | Sigma-Aldrich | RDD016 | |
| DMEM + GlutaMAX medium | ThermoFisher | 10569010 | 500 mL |
| Equine serum | ThermoFisher | 26050088 | heat-inactivated |
| Fiber Optic Illuminator, 100V | Kent Scientific | KSC5410 | |
| Filter System, PES 22UM 250ML | VWR | 28199-764 | |
| Fluoview 1000 confocal microscope | Olympus | ||
| Fluoview 1200 confocal microscope | Olympus | ||
| GlutaMAX supplement | ThermoFisher | 35050061 | |
| Goat polyclonal anti-chicken Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150176 | |
| Goat polyclonal anti-rabbit Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150077 | |
| Hanks-balanced Salt Solution (HBSS) 1x | ThermoFisher | 14175095 | 500 mL |
| HEPES | VWR | 101170-478 | |
| HeraCell 150 CO2 incubator | Heraeus (ThermoFisher) | ||
| ImageJ v1.52e | NIH | ||
| IRIS-Fine Scissors (Round Type)-S/S Str/31*8mm/13cm | RWD | S12014-13 | |
| Kanamycin monosulfate | Gold Bio | K-120-25 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A7506 | |
| L-glutamic acid | VWR | 97061-634 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2), andydrous | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| MPII Mini-Peristaltic Pump, 115/230 VAC, 50/60 Hz | Harvard Apparatus | 70-2027 | |
| MULLER Micro Forceps-Str, 0.15mm Tips, 11cm | RWD | F11014-11 | |
| NBQX | Hello Bio | HB0443 | |
| Neurobasal medium | ThermoFisher | 21103049 | 500 mL |
| Normal goat serum (NGS) | Abcam | ab7481 | |
| Origin 2020 | OriginLab | ||
| pAAV.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40 | Addgene | 100837-AAV1 | Titer: 1.00E+13 gc/ml |
| Papain | Worthington Biomedical Corporation | LS003126 | |
| Penicillin streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | 10,000 U/mL |
| Phosphate-buffered saline (PBS) 1x | ThermoFisher | 10010049 | 500 mL |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4832 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Potassium Chloride (KCl), anhydrous | Sigma-Aldrich | 746436 | |
| Pump Head Tubing Pieces For MPII | Harvard Apparatus | 55-4148 | |
| Rabbit monoclonal anti-caspase-3 | Abcam | ab32351 | |
| Sodium Chloride (NaCl), anhydrous | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | BioXtra, ≥99.5% (GC) |
| Time-pregnant female C57BL/6 mice | Texas A&M Institue for Genomic Medicine | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | 500 mL |
| Wide-bore blue pipette tips P1000 | VWR | 83007-380 |
References
- Marras, C., et al. Prevalence of Parkinson's disease across North America. NPJ Parkinson's Disease. 4, 21 (2018).
- Poewe, W., et al. Parkinson disease. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17013 (2017).
- Mehta, A., Prabhakar, M., Kumar, P., Deshmukh, R., Sharma, P. L. Excitotoxicity: bridge to various triggers in neurodegenerative disorders. European Journal of Pharmacology. 698 (1-3), 6-18 (2013).
- Ambrosi, G., Cerri, S., Blandini, F. A further update on the role of excitotoxicity in the pathogenesis of Parkinson's disease. Journal of Neural Transmission (Vienna). 121 (8), 849-859 (2014).
- Dong, X. X., Wang, Y., Qin, Z. H. Molecular mechanisms of excitotoxicity and their relevance to pathogenesis of neurodegenerative diseases. Acta Pharmaceutica Sinica B. 30 (4), 379-387 (2009).
- Vieira, M., et al. Excitotoxicity through Ca2+-permeable AMPA receptors requires Ca2+-dependent JNK activation. Neurobiology of Disease. 40 (3), 645-655 (2010).
- Sebe, J. Y., et al. Ca(2+)-Permeable AMPARs Mediate Glutamatergic Transmission and Excitotoxic Damage at the Hair Cell Ribbon Synapse. Journal of Neuroscience. 37 (25), 6162-6175 (2017).
- Brickley, S. G., Farrant, M., Swanson, G. T., Cull-Candy, S. G. CNQX increases GABA-mediated synaptic transmission in the cerebellum by an AMPA/kainate receptor-independent mechanism. Neuropharmacology. 41 (6), 730-736 (2001).
- Srinivasan, R., et al. Smoking-Relevant Nicotine Concentration Attenuates the Unfolded Protein Response in Dopaminergic Neurons. Journal of Neuroscience. 36 (1), 65-79 (2016).
- Henley, B. M., et al. Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression. Journal of Visualized Experiments. (120), e54981 (2017).
- Douhou, A., Troadec, J. D., Ruberg, M., Raisman-Vozari, R., Michel, P. P. Survival promotion of mesencephalic dopaminergic neurons by depolarizing concentrations of K+ requires concurrent inactivation of NMDA or AMPA/kainate receptors. Journal of Neurochemistry. 78 (1), 163-174 (2001).
- Lavaur, J., et al. The noble gas xenon provides protection and trophic stimulation to midbrain dopamine neurons. Journal of Neurochemistry. 142 (1), 14-28 (2017).
- Kritis, A. A., Stamoula, E. G., Paniskaki, K. A., Vavilis, T. D. Researching glutamate - induced cytotoxicity in different cell lines: a comparative/collective analysis/study. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 91 (2015).
- Gupta, K., Hardingham, G. E., Chandran, S. NMDA receptor-dependent glutamate excitotoxicity in human embryonic stem cell-derived neurons. Neuroscience Letters. 543, 95-100 (2013).
- Surmeier, D. J., Obeso, J. A., Halliday, G. M. Selective neuronal vulnerability in Parkinson disease. Nature Reviews Neuroscience. 18 (2), 101-113 (2017).
- Ramirez, J. M., Tryba, A. K., Pena, F. Pacemaker neurons and neuronal networks: an integrative view. Current Opinion in Neurobiology. 14 (6), 665-674 (2004).
- Guzman, J. N., Sanchez-Padilla, J., Chan, C. S., Surmeier, D. J. Robust pacemaking in substantia nigra dopaminergic neurons. Journal of Neuroscience. 29 (35), 11011-11019 (2009).
