Summary
氧气诱发的视网膜病变 （OIR） 可用于模拟缺血性视网膜疾病，如早熟和增殖性糖尿病视网膜病变的视网膜病变，并作为概念验证研究的模型，用于评估神经血管疾病的抗角原药物。OIR 在可量化的网膜中诱导强健和可重复的神经血管化。
Abstract
缺血性视网膜病变的常用模型之一是氧诱发的视网膜病变 （OIR） 模型。在这里，我们描述了OIR模型诱导的详细协议，以及它在小鼠和大鼠身上的读数。视网膜神经血管化通过让啮齿动物幼崽暴露在高氧（小鼠）或交替的超氧和缺氧水平（大鼠）中诱导。这些模型的主要读数是视网膜内血管 （NV） 和血管 （AVA） 区域的大小。这种前体模型可用于评估潜在抗血管生成药物的疗效，或使用基因操纵的动物解决特定基因在视网膜血管生成中的作用。该模型在 OIR 感应中具有一些应变和供应商特定的变化，在设计实验时应考虑这些变化。
Introduction
需要可靠和可重复的实验模型来研究血管原性眼病背后的病理学，并开发新的治疗这些破坏性疾病的方法。病理血管生成是湿年龄相关的黄斑变性（AMD）和许多缺血性视网膜疾病的标志，其中包括早产（ROP）、增殖性糖尿病视网膜病变（PDR）和视网膜静脉闭塞（RVO）1，2，3，4。人类和啮齿动物视网膜遵循类似的发展模式，因为人类和啮齿动物视网膜都是最后被血管化的组织之一。在视网膜血管完全发育之前，视网膜从透明体血管中接收其营养供应，当视网膜血管开始发育1、2时，直肠血管会退步。在人类中，视网膜血管发育在出生前完成，而在啮齿动物中，视网膜血管的生长发生在出生后。由于视网膜血管发育发生在啮齿动物产后，它提供了一个理想的模型系统来研究血管生成2，3。新生啮齿动物有一个血管性网膜，逐渐发展，直到到第三产后第4周结束时完成血管网膜发育。新生儿小鼠的血管生长是塑料的，它们在高氧刺激5期间会经历回归。
ROP是西方国家儿童失明的主要原因，因为它影响近70%的出生体重在1250克6，7以下的早产儿。ROP 发生在早产儿中，这些婴儿在视网膜血管完成正常生长之前出生。ROP进展分两个阶段：在第一阶段，早产延迟视网膜血管生长，在第二阶段之后，发育中的视网膜未完成血管化导致缺氧，从而诱发血管生长因子的表达，刺激新的和异常的血管生长8。OIR模型是研究ROP和其他缺血性视网膜病理学以及测试新药候选者2、3、9的一个广泛使用的模型。它被广泛认为是进行眼部和非眼部疾病潜在抗心原药物概念验证研究的可重复模型。两种啮齿动物模型，即小鼠和大鼠OIR在诱导模型和疾病表型上有所不同。大鼠模型更准确地模仿ROP表型，但小鼠模型为视网膜神经化（NV）提供了一个更坚固、更快、更可重复的模型。在鼠标模型中，NV 发展到中央视网膜。这种病理读出对于许多缺血性视网膜病变（如 PDR、RV 和渗出性 AMD）以及癌症等非眼性血管病的药理疗效研究非常重要。此外，基因操纵（转基因和淘汰）小鼠的可用性使小鼠OIR模型成为更受欢迎的选择。然而，无论是小鼠还是大鼠OIR模型都没有产生视网膜纤维化，这在人类疾病中是典型的。
认识到高氧水平有助于在20世纪50年代发展ROP10，11导致动物模型的发展。关于氧气对视网膜血管影响的第一批研究是在1950年12月12日、13日、14日进行的，直到20世纪90年代，OIR模型还进行了许多改进。史密斯等人在1994年的研究为目前的小鼠OIR模型设定了一个标准，该模型将透明质病与视网膜病变15分开。康纳等人广泛采用的血管抹杀和病理NV量化方法（2009年）进一步增加了其受欢迎程度16.在这个模型中，小鼠被放置在75%的氧气（O2）在P7 5天，然后5天在正常条件下。从 P7 到 P12 的超氧会导致视网膜血管在中央视网膜中退步。回到正常状态后，血管视网膜变得缺氧（图1A）。由于血管中央视网膜的缺氧刺激，一些视网膜血管发芽向视网膜，形成前视网膜NV，称为前视网膜塔夫茨2，3。这些塔夫特是不成熟的，而且透水性很强。NV 峰值量在 P17，之后会退步。视网膜完全重新血管化，NV由P23-P25（图2A）2，3完全回归。
大鼠OIR模型（使用不同级别的O2）在20世纪90年代首次描述，显示不同的O2水平在80%和40%导致更明显的NV比低于80%O2恒定接触17。后来发现间歇性缺氧模型，其中O2循环从超氧（50%）到缺氧（10-12%），导致更多的NV比80/40%O2模型18。在50/10%的模型中，大鼠幼崽在24小时内接触50%，随后在10%O2中接触24小时。这些周期一直持续到P14，当老鼠幼崽回到正常状态（图1B）。与人类ROP患者一样，在大鼠模型中，由于视网膜血管丛不成熟，血管区域发展到视网膜外围（图3）。
在这两种型号中，通常量化的主要参数是 AVA 和 NV 的大小。这些参数通常从视网膜平面坐骑中分析，其中内皮细胞被标记为4，16。以前，通过计数血管或血管细胞核延伸至内限膜上方的静脉，从视网膜横截面评估了视网膜NV的量。这种方法的主要局限性是无法量化 AVA。
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Protocol
此处描述的议定书已得到芬兰国家动物伦理委员会的批准（协议编号ESAVI/9520/2020和ESAVI/6421/04.10.07/2017）。
1. 实验动物和鼠标OIR模型感应
注：使用时间适应的动物，例如常用的C57BL/6J小鼠，让幼崽在同一天出生。使用培养水坝，例如129株（129S1/SvImJ或129S3/SvIM）哺乳水坝，在诱发超氧期间和之后给幼崽喂奶。或者，确保有额外的哺乳水坝可用的情况下，护理水坝需要更换由于疲惫。使用 C57BL/6J 小鼠/水坝时，将每个大坝的垃圾大小限制为 6-7 幼崽（如果垃圾大于幼崽往往限制体重增加）16。
- 记录动物在超氧诱导前后的重量，以及牺牲时的体重。
- 确保笼子底部有足够的食物，这样水坝就很容易获得食物。
- 在不使用过滤系统时，将带有颜色指示器的苏打石灰添加到腔室底部，以吸收多余的 CO2。
- 监测室内的湿度和温度，并将湿度保持在 40% 到 65% 之间。如果需要，通过在房间底部放置带水的菜肴（例如培养皿），增加室内的湿度。
- 校准 O2 传感器与 100% O2 和正常的房间空气。
- 将 P7 小鼠放入一个腔室，并将 O2 级别设置为 75%。将老鼠留在室内5天，直到P12。避免在超氧感应期间打开腔室。检查 O2 气缸的气体压力，并在需要时更换气缸。在上岗期间监测动物。
- 把老鼠笼子从房间里拿出来，称重所有的幼崽。根据体重对幼崽进行分组，使每个实验组在幼崽中的体重分布相似。
2. 实验动物和大鼠OIR模型诱导（使用半封闭系统）
注：使用时间适应的动物让幼崽在同一天出生。对于大鼠OIR，使用增加的垃圾大小，约18幼崽/大坝，以获得足够的NV感应在老鼠模型。从几个垃圾池幼崽获得足够的幼崽到每个垃圾。
- 记录动物在上岗前后的重量，以及牺牲时的体重。
- 确保笼子底部有足够的食物，这样水坝就很容易获得食物。
- 在不使用过滤系统时，将带有颜色指示器的苏打石灰添加到腔室底部，以吸收多余的 CO2。
- 监测室内的湿度和温度。通过在腔底添加二氧化硅凝胶来吸收额外的湿度（由多个数量的老鼠产生）。
- 用 100% N2 和普通房间空气校准 O2 传感器。
- 将大鼠放入P0室（出生后几个小时）。将 O2 级别设置为 50%，并将 O2 气缸连接到腔室 24 小时。之后，将设置切换到 10% O2， 并将氮气 （N2） 圆柱体连接到腔室 24 小时。继续 24 小时骑自行车在 50% 和 10% O2 水平之间 14 天。
- 在研究期间监测动物的气体消耗和健康。在 50/10% O2 之间的变化期间打开房间，并在需要时添加更多的食物和水。在诱导过程中将动物的笼子改为清洁笼子。
- 把老鼠笼从房间里拿出来，称重所有的幼崽。根据体重对幼崽进行分组，使每个实验组在幼崽中具有相似的体重分布。
3. 药物管理（可选）
注：OIR 中常用的药物管理路线是通过静脉注射治疗 （ivt），在 P12-P14 为小鼠，在 P14 为大鼠。根据实验设置确定治疗日。当实验中使用多只幼崽时，将治疗组从所有垃圾中分离出动物。最好将药物注射到一只眼睛，并保持反向眼睛作为控制。
- 称量动物，并在尾巴和/或耳朵上留下识别标记。
- 麻醉动物要么注射麻醉（例如氯胺酮和美多米丁的混合物，30毫克/公斤和0.4毫克/公斤的小鼠）或与吸入麻醉（异丙酮在2-3.5%异丙酮和200-350 mL/分钟气流）。捏脚趾检查麻醉深度。治疗期间将动物放在加热垫上。
- 对于局部麻醉，请将一滴镇痛药涂在眼睑上。在执行 ivt 之前，用钳子小心地打开眼睑，小鼠和大鼠在 P14 周围睁开眼睛。在角膜上涂抹一滴镇痛药（例如盐酸氧蛋白）。
- 在进行 ivt 注射之前，先涂抹一滴碘。
- 对于 ivt 注射，请使用带有 33-34 G 针头的玻璃注射器。按下眼睑，用钳子抓眼球。使注射后侧的跛行，大约在45° 角针指向视神经。
- 避免向内部空间注入超过 1.0 μL。注射药物后保持针头到位30s，以避免注射溶液倒流。
- 切除针头后，检查眼睛（例如，用眼镜）是否出现任何并发症，如出血或视网膜损伤。注射后在角膜上涂抹抗生素软膏。
注：小鼠的ivt注射量应为0.5-1.0μL。 - 逆转麻醉（例如，用+2拮抗剂进行美多米丁（2.5毫克/千克），将小狗送回笼子。通常把垃圾存放到研究结束。
4. 体内成像和电视网膜成像（可选）
- 如有需要，在随访期间对活体动物进行体内成像，以记录在血管反应期间视网膜发生的变化。例如，执行荧光素血管造影术 （FA） 或扫描激光结肠显微镜19以可视化血管（图 4）。使用光谱域光学相干断层扫描 （SD-OCT） 在体内可视化视网膜层 （图 4）。
- 如有需要，使用电视网膜成像（ERG）（图5）调查OIR诱导后不同视网膜细胞群的功能变化。
5. 视网膜平坐架的组织收集和准备
注：根据所需的研究假设收集组织。对于小鼠，收集样本，例如在P12（研究高氧化期后的血管消灭）或在缺氧期（P13-P17）。在 P17（最常见的取样时间点）收集鼠标 OIR 样本，以检测 NV 量的峰值。在大鼠OIR中，在P18-P21采集样本，以观察最高数量的NV（图3）。
- 取样前称量动物。
- 为了给视网膜血管贴上标签，深度麻醉动物可以用FITC-德克斯特兰进行心电图的注入。（或者，稍后用异黄素涂污视网膜平面坐骑）。
- 牺牲动物使用过量的麻醉药物（例如氯胺酮和美多米丁的混合物，300毫克/公斤和4毫克/公斤的小鼠）或二氧化碳 吸入。
- 用弯曲的钳子抓住眼球后面，切开眼睛周围的组织，把眼睛从轨道上抬起来，来收集动物的眼睛。
- 将眼球孵化在新鲜制作的、过滤的 4% 甲醛（磷酸盐缓冲盐水中，PBS）中，1-4 小时。取出固定剂，用PBS洗眼球3×10分钟。立即解剖视网膜，或在+4°C时将其存储在PBS中。
警告：甲醛是有毒的吸入，接触皮肤，如果吞咽。请在使用安全数据表之前阅读。
注意：如果完成整个眼球的横截面，在取样或组织处理的任何阶段不要对眼球施加压力，以避免视网膜分离。 - 准备视网膜平面安装，以量化NV的量和AVA的大小。或者，处理眼球/视网膜以进行组织学或RNA或蛋白质分析。使用微剪刀和钳子在立体显微镜下解剖视网膜。
- 将眼球放在PBS中，使其保持湿润，用针（23G）刺穿边缘的眼球，并用弯曲的微剪刀切开眼球，以去除虹膜和角膜。
- 小心地将剪刀尖放在硬皮和视网膜之间，并将硬皮切向视神经。对眼球的另一侧也这样做，并小心地切割/撕裂硬盘，直到视网膜杯暴露。将镜头从视网膜杯中取出，并将 PBS 添加到杯子中。
- 在不损坏视网膜的情况下清除所有透明质容器、残体和碎屑。通过将PBS添加到视网膜杯中来洗净视网膜。用直微剪刀对网膜进行四个切口（12点、3点、6点和9点），以制作花状结构。可选地，在安装样品之前用手术刀片进行切割。使用柔软的画笔将网膜提升到良好的板材上进行染色。
- 使用同位素 B4标记视网膜血管，该血管会弄脏内皮细胞的表面（如果动物没有注入 FITC-dextran）。在阻塞缓冲区（10% NGS = TBS 中 0.5% 特里顿）中孵化视网膜 1 小时，在 TBS 中用 1% NGS = 0.1% 三顿洗涤 10 分钟。将视网膜与荧光染料结合的异丙汀 B 4（5-10μg/ml）在 TBS 中孵育 1% NGS = 0.1% 特里顿过夜，在 +4 °C 下，同时防止光线照射。
注：如果需要，使用特定抗体标记其他细胞，如炎症细胞和小细胞。 - 用 TBS 中的 1% NGS = 0.1% 三顿洗净视网膜 3x 10 分钟，并在微观滑梯上抬起视网膜，内视网膜朝上。使用软画笔小心地展开网膜，并清除任何剩余的透明质容器或碎屑。将安装介质添加到盖滑，并将其放置在网膜顶部。将视网膜存储在+4°C，并防止光线照射。
6. 平坐架分析
- 使用具有 10 倍目标的荧光显微镜拍摄视网膜平面坐骑的图像。专注于表面血管丛和前视神经血管化。制作磁贴扫描图像以捕获整个视网膜并合并磁贴扫描
- 通过使用图像处理程序测量 AVA、NV 面积和总视网膜区域来量化图像（见 材料表）。
- 使用免费手绘工具绘制 AVA 和总视网膜区域，然后使用选择工具选择神经区。该软件测量对像素感兴趣的区域，AVA 和 NV 区域（以像素表示）可用于计算它们相对于视网膜总面积的百分比。此外，一些软件工具可用于量化NV。
注：最近，采用深度学习神经网络对OIR图像关键值进行量化的开源、全自动化程序已经推出，为视网膜AVA和NV（例如https://github.com/uw-biomedical-ml/oir/tree/bf75f9346064f1425b8b9408ab792b1531a86c64）20、21的可重复量化提供了可靠的工具。
- 使用免费手绘工具绘制 AVA 和总视网膜区域，然后使用选择工具选择神经区。该软件测量对像素感兴趣的区域，AVA 和 NV 区域（以像素表示）可用于计算它们相对于视网膜总面积的百分比。此外，一些软件工具可用于量化NV。
- 如果使用抗体对单个细胞群进行免疫组织化学检测，则可在需要时用手或自动图像分析系统从视网膜平面安装中量化染色细胞的数量（如微胶质、图2B）。
7. 统计
- 根据学生 t 测试或单向 ANOVA 分析通常分发的数据，然后酌情进行邓内特或图基的多次比较测试。使用非参数测试，如曼-惠特尼U测试或克鲁斯卡尔瓦利斯测试的非正常分布数据。考虑在 P < 0.05 级别具有统计显著性的差异。
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Representative Results
模型的主要结果是血管表型：AVA的大小和NV的量。在小鼠OIR模型中，血管抹杀发生在中央视网膜（图2A），而在大鼠模型中，它在外围发育，即类似于人类ROP22（图3A）。这是因为当小鼠暴露于高氧时，表面血管丛已经发育，而在大鼠模型中，网膜在OIR诱导（P0）时是血管性的。前视网膜血管化在血管区域附近发展，即小鼠的中央视网膜和大鼠的外围（图2A和图3A）。
使用横截面或扁平坐骑进行组织学分析，以评估OIR视网膜的形态变化或细胞类型的兴趣的存在，例如炎症细胞（图2B）。除视网膜外，还可以采集整个眼睛或视网膜样本，以便在OIR模型期间在不同时间点进行进一步的基因和蛋白质表达分析。基因或蛋白质表达水平可以用标准方法进行分析，如RT-qPCR或西方印迹。
可选地，可以在OIR后续期间进行非侵入性体内成像。视网膜和透明体血管可以用 FA （图 4A）可视化。SD-OCT可用于评估网膜的结构变化（图4B）。网膜的功能变化可以通过ERG（图5）来测量。
血管内皮生长因子（VEGF）的抑制剂常用于治疗人类血管性眼病。因此，抗 VEGF 经常用作 OIR 中的参考化合物。Aflibercept，作为可溶性VEGF陷阱，在高剂量和低剂量（在P14注射）抑制OIR的NV和生理再血管化。在P14注射高剂量的aflibercept的OIR眼睛比未经治疗的眼睛有更大的视网膜AVA（图6）。这表明，在缺氧的驱动下，黄斑还阻断生理视网膜再血管化。小鼠和大鼠模型均可用于评估不同抗血管原剂对视网膜NV和视网膜生理再血管化的影响（图3B和图6）。
图1：小鼠和大鼠标准OIR研究设计的图形概述。（A） 老鼠OIR模型是由小鼠从P7到P12暴露在75%O2 中，并返回正常房间空气引起的。前视网膜NV的峰值出现在P17，P17通常是实验的采样点。（B） 鼠OIR模型是由大鼠从P0到P14交替O2 级（50/10% O2）诱导的，并恢复到正常状态。当NV数量达到峰值时，老鼠通常会在P20上被牺牲。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图2：鼠标OIR模型中的血管表型。鼠标 OIR 模型生成图 1 中所述。（A） 表面血管丛在正常小鼠中发展，而OIR小鼠则从P7到P12暴露在75%的O2 中。在此期间，在中央视网膜（在定量图像中以蓝色标记为P12和P17）中发展了血管消解。小鼠恢复正常房间空气，血管视网膜变得缺氧，导致视网膜和病理NV功能血管再生（在下面板的P17标记为红色）。在视网膜中部的血管和血管区域之间发育的视网膜前神经管。NV 的数量在 P17 达到峰值，之后又退步。视网膜完全重新血管化，NV在P24-P25周围倒退。（B） 在P12和P17中显示视网膜Ib-1染色微胶质（绿色）和GS-IB4 染色血管（红色）的视网膜扁平安装的免疫组织化学污渍的例子。（C） 在 P17 的鼠标 OIR 眼睛的横截面， 其中前视塔夫特 （箭头） 正在向视网膜发芽。此外，还看到内部核层（INL）和外层有机体层（OPL）变薄。比例尺条为 A 中的 1 毫米、B 中的 50 μm 和 C. ILM 中的 100 μm。 ILM = 内部限制膜、GCL = 结石细胞层、IPL = 内质层、INL = 内核层、OPL = 外层有机体层、ONL = 外核层、RPE = 视网膜色素上部。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图3：血管表型及其在大鼠OIR模型中的发展。（A） 血管区域（以蓝色标记）和NV（红色标记）在视网膜外围发展，类似于人类ROP。（B） AVAs出现在OIR视网膜中，但不是在正常控制中。（C） NV面积的量化显示，在P20时，NV的量呈峰值趋势，但与OIR中的P18和P21相比，差异在统计学上并不显著。（学生的t测试，时间匹配正常和OIR视网膜之间，**p≤0.01，***p≤0.001，图中绘制的动物的双眼）。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图4：在鼠OIR模型中使用荧光素血管造影术（FA）和光谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）进行体内成像。（A） 与正常P19大鼠相比，在OIR大鼠的P18和P20中央视网膜（上排）拍摄的图像中可以看到血管侵权（箭头）。NV（箭头）和AVA（星号）发展到视网膜外围（中行），如P18和P20 OIR视网膜。回归透明质血管（下排）被FA.（B）血管生长到玻璃体被观察为OIR视网膜（箭头）中神经纤维层（NFL）和结石细胞层（GCL）的增厚。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图5：视网膜神经元的功能可以使用闪光电视网膜成像（fERG）进行测量。（A） a波来自视网膜锥体和杆光感受器，其振幅在大鼠OIR模型中显著降低。这种效应随着光强度的提高而增加，表明这些缺陷主要影响锥体光感受器的功能。（B） 与规范控制相比，来自OIR动物的B波振幅有所降低。B波来自双极细胞和穆勒细胞。请点击这里查看此数字的较大版本。
图 6： 静脉注射 PBS 可减少鼠标 OIR 模型中的 NV 和 AVA。（A） 视网膜平坐架的代表性图像未经处理，并经过非受体处理（P14 时为 20μg），PBS 在 P17 注射 OIR 眼睛。与未经处理的对照相比，高剂量的 aflibercept （20 μg） 使 AVA 的大小增加了 47% （以白色勾勒）和抑制 NV 98% （箭头）。与未经治疗的对照相比，PBS 注射将 AVA 减少了 31%，NV 减少了 42%。此外，类似 ivt 的硬盘穿刺产生了与 PBS ivt 注射类似的效果，但差异在统计学上并不显著。箭头指向解剖过程中未拆卸的透明质容器。（单向 ANOVA， * p ≤ 0.05; ** p ≤ 0.01， *** p ≤ 0.001， ***p ≤ 0.0001）. 请点击这里查看此数字的较大版本。
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Discussion
疾病表型的严重程度取决于小鼠和大鼠OIR模型23中的菌株甚至供应商。这表明病理学发展存在广泛的基因变异性。一般来说，色素啮齿动物比白化病的啮齿动物发展更严重的表型。例如，白化病BALB/c的视网膜血管在多发性缺氧后迅速重新血管化，24日不会发展为NV。同样，在大鼠中，色素棕色挪威大鼠表现出比白化病更严重的病理学（SD）大鼠25。SD大鼠是常用的菌株，在菌株中报告了OIR表型与供应商相关的差异。例如，来自查尔斯河的SD大鼠比来自哈兰或齐维克-米勒23号的老鼠产生更多的NV。C3H/HeJ小鼠，反过来，有一个突变的视网膜退化1（Rd1）基因，有薄视网膜，并没有发展NV26。由于这些原因和转基因小鼠系的可用性，近亲繁殖的C57BL/6J是OIR研究中最常用的小鼠菌株。然而，由于高氧暴露，C57BL/6J水坝的死亡率相当高，因此在设计研究并在实验期间进行监测时需要考虑小鼠的福祉。此外，与 BALB/c 小鼠27相比，C57BL/6 小鼠的光受体损伤增加。
为了确保老鼠的福祉和水坝和幼崽的生存，垃圾大小应保持小（6-7只幼崽/水坝）。这是特别重要的，当使用C57BL/6小鼠，这是更容易受到高氧应激27，28。此外，应向小鼠提供容易获得的支持食品（放在笼子底部）。一些研究人员使用代孕水坝在氧气感应后用健康的大坝代替室内的水坝。然而，大多数研究人员使用代孕，只有当大坝用尽22，29。如果使用更大的垃圾大小，建议使用代理水坝。据公布，129S3/SvIM小鼠产生的NV比C57BL/6多，并能更好地维持不同氧气水平28造成的变化。应当指出，OIR中使用的水坝在OIR诱导后不育，不应用于进一步繁殖目的。幼崽产后体重增加影响OIR病理学的严重程度。产后体重增加不良的幼崽（P17）显示VEGF的延迟表达，因此与正常（P17时为5-7.5克）或体重增加（P17时为7.5克）的幼崽相比，视网膜病变的延迟期延长。此外，在P7上体重超过5克的小鼠幼崽在OIR诱导30后不会显示血管被抹杀的区域。因此，在实验中称量幼崽很重要。反向未经治疗的眼睛可以用作内部控制，以确保小鼠的营养状况不影响结果。老鼠的情况也差不多：幼崽越小，它们发展31的OIR表型越严重。因此，建议将大垃圾大小（约18只幼崽）用于大鼠OIR模型。
OIR 模型感应可以使用完全封闭的系统完成，该系统有一个闭环电路，泵通过过滤系统（苏打石灰和活性炭）将空气循环回腔室。另一种选择是半封闭系统，通风确保多余的代谢物从腔室中去除。为了确保去除过量的二 氧化碳，可以将苏打石灰（氢氧化钙与氢氧化钠或氢氧化钾混合）放在室底。去除二氧化碳 是强制性的，因为高二氧化碳 水平恶化了大鼠32的疾病表型。人们还应记住定期重新校准室内的氧气传感器，因为它们往往随时间漂移，并可能提供错误的氧气浓度从预期的。
据报，单单车辆注射（PBS），甚至只是穿刺到车内空间，对再血管化率及NV（图6）33、34、35、36的量有影响。据推测，PBS/车辆注射的效果是否可能是由于注射期间眼内压力的变化，还是由于眼结构损伤，增加了血管生长因子的水平，其中色素上皮衍生生长因子34，37。此外，与未经治疗的38只大鼠相比，单单进行先导亚视网膜注射（穿刺到次视网膜空间）就已证明对OIR的血管和功能表型有影响。这些结果突出了在OIR研究中适当的负控制，甚至对测试化合物进行系统管理的重要性，以及每个研究组中足够大的n-数字。事实上，车辆注射确实提高了视网膜的再血管化率是一个主要的限制因素，因为再血管化率和病理前腹腔的形成在OIR模型中是相互关联的：如果再血管化率加快，它会导致神经血管管的补偿性降低调节，反之亦然。因此，OIR 模型的两个主要结果测量都受到车辆喷射的影响。
VEGF抑制剂已经彻底改变了AMD的治疗，DR.OIR模型被用来在治疗前证明其疗效。关于OIR中的VEGF抑制剂，一项比较不同抗VEGF和抗PLGF（胎盘生长因子）（注射于P12）的研究表明，仅抗VEGF就导致血管区域小，而抗PIGF治疗的眼睛有较大的血管区域33。与其他药物治疗33相比， Aflibercept 拥有最大的 Avas 。众所周知，Aflibercept同时结合了VEGF和PlGF39，它可能是抑制OIR中的PlGF会导致生理血管生成的阻断。
体内成像非侵入性为后续期间监测视网膜血管40和视网膜层和结构提供了工具。使用FA，参数，如血管密度和动脉折磨和静脉增大（称为加病，图4A）可以测量40，41。SD-OCT可用于评估结构变化和测量视网膜厚度在OIR后续期42，43。ERG 用于测量网膜的功能变化。不同的细胞类型在光刺激后产生电位，这些信号或"波"可以用ERG测量。光受体正在产生负一波，而双极细胞和穆勒细胞是造成b波44的主要原因。视网膜功能丧失是典型的OIR小鼠和大鼠45，46（图5）。视网膜持续长期变化，即使在再血管化和NV回归34，47之后，OIR视网膜的功能变化和蛋白质水平的变化也报告。
为了可视化视网膜血管，活鼠可以注入FITC标记的德克斯特兰，或者视网膜扁平坐骑可以沾上荧光染料标签Isolectin B4。一个人需要了解荧光染料之间的区别：用FITC-dextrans的注水只标记血管的流明，而异黄素B4 会弄脏内皮细胞的表面。因此，功能血管与适当的流明将只可视化与FITC-dextran敷液，而NV的总面积似乎更大，在异素B4 染色视网膜比在FITC-dextran注入动物，因为异素B4 基本上拿起甚至内皮细胞尚未形成功能性流体48。最近一种以三维形式可视化整个视网膜/眼球的选择是通过双光子荧光显微镜（49）进行深层组织成像。
啮齿动物OIR模型，以及一般的动物模型，只部分代表了人类疾病的特点。与OIR相关的主要区别是视网膜神经化与啮齿动物OIR的纤维化无关，而视网膜神经血管化通常导致人类神经血管视网膜疾病的纤维血管增殖。此外，导致OIR与人类疾病的条件几乎相反。ROP的早产新生儿需要呼吸支持补充氧气，经常经历由复发性呼吸暂停引起的间歇性缺氧和高氧发作，但它们不会暴露在高浓度的氧气中。为了最大限度地减少永久性损坏，避免高分数的启发 O2。 在这方面，无论是连续5天接触75%O2 的小鼠模型，还是50/10大鼠模型，都不像人类ROP的发病机制。此外，大鼠和鼠 OIR 模型之间也存在差异。在小鼠模型中，神经血管化回归，由P24重新建立正常血管，而大鼠OIR模型（类似于人类ROP）的情况恶化。虽然，大鼠OIR模型显示了ROP的临床相关特征，如视网膜血管发育延迟和随后的病理神经化，但与小鼠OIR模型相比，其使用几乎完全没有转基因大鼠菌株，维护成本更高，NV更少。
综合起来，尽管人类缺血增殖视网膜病变和啮齿动物OIR模型之间存在差异，但NV诱导的易用性，加上视网膜的易于可视化和定量化，使得OIR模型成为研究缺血增殖视网膜病变的分子机制和潜在治疗方法的流行模型。有趣的是，小鼠OIR模型中的超氧暴露也诱发支气管炎发育不良，这是人类早产儿补充氧气疗法引起的另一种疾病，表明OIR模型可用于同时探索ROP和支气管炎发育不良的新目标。
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Disclosures
作者玛丽亚·维赫图帕博士、尼娜·约斯凯莱宁、马克·塞拉达-吉梅内斯博士和鲁比娜·塔帕是实验有限公司的员工。
作者Giedrius Kalesnykas博士是一名雇员（总裁兼首席执行官），也是实验有限公司的股东，该公司提供合同研究服务，使用本文中使用的学前OIR模型。
特罗·约尔维宁，医学博士，博士，汉内勒·乌西塔洛-约尔维宁，博士，没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢玛丽安·卡尔斯伯格、安妮·玛丽·哈帕涅米、佩维·帕塔宁和安妮·坎库宁提供出色的技术支持。这项工作由芬兰科学院、皮维基和萨卡里·索尔伯格基金会、坦佩雷结核病基金会、芬兰医学基金会、皮尔坎马医院地区研究基金会和坦佩雷大学医院研究基金资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 33 gauge, Small Hub RN Needle | Hamilton Company | 7803-05, 10mm, 25°, PS4 | For intravitreal injection |
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | For image analysis | |
| Air pump air100 | Eheim GmbH & Co. KG. | 143207 | For inhalation anaesthesia |
| Anaesthesia unit 410 AP | Univentor Ltd. | 2360309 | For inhalation anaesthesia |
| AnalaR NORMAPUR Soda lime | VWR International Ltd | 22666.362 | For CO2 control during model induction |
| Attane Vet 1000 mg/g | VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY | vnr 17 05 79 | For inhalation anaesthesia |
| Brush | For preparation of flat mounts | ||
| Carbon dioxide gas | For sacrifice | ||
| Celeris D430 ERG system | Diagnosys LLC | 121 | For in vivo ERG |
| Cell culture dishes | Greiner Bio-One International GmbH | 664 160 | For preparation of flat mounts |
| Cepetor Vet 1 mg/mL | VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY | vnr 08 78 96 | For anaesthesia |
| Cover slips | Thermo Fisher Scientific | 15165452 | For preparation of flat mounts |
| O2 Controlled InVivo Cabinet, Aninal Filtrarion System and Dehumidifier | Coy Laboratory Products | Closed system for disease model induction, optional for semi-closed system | |
| E702 O2 sensor | BioSphenix, Ltd. | E207, 1801901 | For oxygen level measurement |
| Envisu R2200 Spectral Domain Optical Coherence Tomograph (SD-OCT) | Bioptigen, Inc. | BPN000668 | For in vivo imaging |
| Eye spears | Beaver-Visitec International, Inc. | 0008685 | For intravitreal injection and in vivo imaging |
| Flexilux 600LL Cold light source | Mikron | 11140 | For intravitreal injection or tissue collection |
| Fluorescein sodium salt | Merck KGaA | F6377-100G | For in vivo imaging |
| Gas Exhaust unit (+Double 3-way valve, mouse and rat face masks, UNOsorb filter) | UNO Roestvaststaal BV | GEX 17015249 | For inhalation anaesthesia |
| Glass syringe, Model 65 RN | Hamilton Company | 7633-01 | For intravitreal injection |
| HRA2 Retina angiograph (FA) | Heidelberg Engineering GmbH | Spec-KT-05488 | For in vivo imaging |
| Isolectin GS-IB4, Alexa Fluor 488 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | I21411 | For labeling retinal vasculature on flat mounts |
| Ketaminol Vet 50 mg/mL | Intervet International B.V. | vnr 51 14 85 | For anaesthesia |
| Medicinal Oxygen gas | For disease model induction | ||
| Mice C57BL/6JRj | Janvier Labs | Also other strains possible | |
| Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | For preparation of flat mounts |
| Minims Povidone Iodine 5% (unit) | Bausch & Lomb U.K Limited | vnr 24 11 304 | For intravitreal injection |
| Nitrogen gas | For disease model induction (rat) | ||
| Oftan Chlora 10 mg/g | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 55 01 11 | For intravitreal injection |
| Oftan Metaoksedrin 100 mg/ml | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 55 03 43 | For in vivo ERG |
| Oftan Obucain 4 mg/ml | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 55 03 50 | For intravitreal injection |
| Oftan Tropicamid 5 mg/ml | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 04 12 36 | For in vivo imaging |
| ProOx Model 110 O2 controller and animal chamber | BioSphenix, Ltd. | 803 | For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system |
| ProOx Model P360 O2 controller and animal chamber | BioSphenix, Ltd. | 538 | For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system |
| Rats CD(SD) | Charles River Laboratories | Also other strains possible | |
| Revertor 5 mg/mL | VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY | vnr 13 04 97 | For anaesthesia reversal |
| Silica gel | For humidity control during model induction | ||
| Systane Ultra 10ml | Alcon | Tamro 2050250 | For hydration of the eye |
| Systane Ultra unit 0.7ml | Alcon | Tamro 2064871 | For hydration of the eye |
| Transfer pipette | Thermo Fisher Scientific | 1343-9108 | For preparation of flat mounts |
| VENTI-Line VL 180 PRIME Drying oven | VWR | VL180S 170301 | For drying silica gel |
| VisiScope SZT350 Stereomicroscope | VWR | 481067 | For intravitreal injection or tissue collection |
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