Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Oxygen-induceret retinopati Model for iskæmiske retinale sygdomme hos gnavere

Published: September 16, 2020 doi: 10.3791/61482
Automatic Translation
1,2, 2, 2, 2, 1, 2, 1,3
1Faculty of Medicine and Health Technology, Tampere University & Tampere University Hospital, 2Experimentica Ltd, 3Eye Centre, Tampere University Hospital

Summary

Oxygen-induceret retinopati (OIR) kan bruges til at modellere iskæmiske nethindesygdomme såsom retinopati af prematurity og proliferativ diabetisk retinopati og til at tjene som model for proof-of-concept undersøgelser i evalueringen af antiangiogene lægemidler til neovaskulære sygdomme. OIR fremkalder robust og reproducerbar neovascularisering i nethinden, der kan kvantificeres.

Abstract

En af de almindeligt anvendte modeller for iskæmiske retinopatier er den ilt-inducerede retinopati (OIR) model. Her beskriver vi detaljerede protokoller for OIR-modellens induktion og dens udlæsninger hos både mus og rotter. Retinal neovascularisering induceres i OIR ved at udsætte gnaverunger enten for hyperoxi (mus) eller vekslende niveauer af hyperoxi og hypoxi (rotter). De primære udlæsninger af disse modeller er størrelsen af neovaskulære (NV) og avascular (AVA) områder i nethinden. Denne prækliniske in vivo-model kan bruges til at evaluere effekten af potentielle antiangiogene lægemidler eller til at adressere specifikke geners rolle i nethindens angiogenese ved hjælp af genetisk manipulerede dyr. Modellen har en vis belastning og leverandørspecifik variation i OIR induktion, som bør tages i betragtning ved udformningen af eksperimenterne.

Introduction

Pålidelige og reproducerbare eksperimentelle modeller er nødvendige for at studere patologien bag angiogene øjensygdomme og for at udvikle nye terapeutiske til disse ødelæggende sygdomme. Patologisk angiogenese er kendetegnende for våd aldersrelateret makuladegeneration (AMD) og for mange iskæmiske nethindesygdomme blandt dem retinopati af prematurity (ROP), proliferativ diabetisk retinopati (PDR) og retinale vene okklusion (RVO)1,2,3,4. Humane og gnaver nethinder følge et lignende udviklingsmønster, som både menneskelige og gnaver nethinden er blandt de sidste væv, der er vaskulære. Før nethindens vaskulatur er helt udviklet, modtager nethinden sin næringsstofforsyning fra hyaloid vaskulatur, som igen regresserer, når nethindens vaskulatur begynder at udvikle1,2. Hos mennesker er nethindevakulær udvikling afsluttet før fødslen, mens væksten af nethindevakulature hos gnavere sker efter fødslen. Da nethinden vaskulær udvikling sker postnatally hos gnavere, giver det et ideelt modelsystem til at studere angiogenese2,3. De nyfødte gnavere har en avascular nethinde, der udvikler sig gradvist, indtil fuldstændig vaskulær nethinden udvikling er opnået ved udgangen af tredje postnatal uge4. De voksende blodkar af neonatal mus er plast, og de gennemgår regression under hyperoxia stimulus5.

ROP er den hyppigste årsag til barndommen blindhed i vestlige lande, da det påvirker næsten 70% af de for tidligt fødte spædbørn med fødselsvægt under 1.250 g6,7. ROP forekommer hos for tidligt fødte spædbørn, der er født før nethindefartøjer fuldføre deres normale vækst. ROP skrider frem i to faser: I fase I forsinker præmature fødsel nethindens vaskulære vækst, hvor den ufærdige vaskularisering af den udviklende nethinde efter fase II forårsager hypoxi, hvilket fremkalder udtryk for angiogene vækstfaktorer, der stimulerer ny og unormal vækst iblodkarrene 8. OIR-modellen har været en udbredt model til at studere patofysiologien af ROP og andre iskæmiske retinopatier samt til at teste nye lægemiddelkandidater2,3,9. Det betragtes bredt som en reproducerbar model til gennemførelse af proof-of-concept-undersøgelser for potentielle antiangiogene lægemidler til okulære såvel som ikke-okulære sygdomme. De to gnaver modeller, dvs mus og rotte OIR adskiller sig i deres model induktion og sygdom fænotype. Rottemodellen efterligner ROP-fænotype mere præcist, men musemodellen giver en mere robust, hurtig og reproducerbar model til nethindeneovascularisering (NV). I musemodellen udvikler NV sig til den centrale nethinde. Denne patologiske udlæsning er vigtig i farmakologiske effektundersøgelser for mange iskæmiske retinopatier, såsom PDR, RV og eksudativ AMD samt for ikke-okulære, angiogene sygdomme som kræft. Desuden gør tilgængeligheden af genetisk manipulerede (transgene og knockout) mus musen OIR-modellen til en mere populær mulighed. Men hverken mus eller rotte OIR model skaber nethindefibrose, som er typisk i sygdomme hos mennesker.

Forståelsen af, at høje iltniveauer bidrager til udviklingen af ROP i 1950'erne10,11 førte til udviklingen af dyremodeller. De første undersøgelser om virkningen af ilt på nethindevakulaturen blev udført i 195012,13,14 og indtil 1990'erne var der mange forbedringer af OIR-modellen. Forskningen af Smith et al. i 1994 satte en standard for den nuværende mus OIR model, der adskiller hyaloidopati fra retinopati15. En bred vedtagelse af metoden til at kvantificere vaso-udslettelse og patologisk NV af Connor et al. (2009) yderligere øget sin popularitet16. I denne model placeres mus ved 75% ilt (O2)i 5 dage ved P7, efterfulgt af 5 dage under normoxiske forhold. Hyperoxi fra P7 til P12 forårsager nethindevakulature at regressere i det centrale nethinden. Når man vender tilbage til normoxiske tilstande, bliver avascular nethinden hypoksisk (Figur 1A). På grund af de hypoksiske stimuli i den avaskulære centrale nethinde spirer nogle af nethindens blodkar mod det glasagtige og danner præretinal NV, kaldet præretinal tufts2,3. Disse tufts er umodne, og hyperpermeable. Mængden af NV topper ved P17, hvorefter den går tilbage. Nethinden er fuldt revascularized og NV er fuldt regresseret af P23 - P25 (Figur 2A)2,3.

OIR-modellen for rotter (ved hjælp af forskellige niveauer af O2) blev første gang beskrevet i 1990'erne og viste, at varierende O2-niveauer ved 80% og 40% forårsager mere udtalt NV end under 80% O2 konstant eksponering17. Senere blev det opdaget, at den intermitterende hypoxi model, hvor O2 er cyklet fra hyperoxi (50%) hypoxi (10-12 %), forårsager endnu mere NV end 80/40% O2 model18. I 50/10%-modellen udsættes rotteunger for 50% i 24 timer, efterfulgt af 24 timer i 10% O2. Disse cyklusser fortsættes indtil P14, hvor rotterungerne returneres til normoxiske tilstande (figur 1B). Som hos humane ROP-patienter udvikler avascularområderne i rottemodellen sig til nethindens periferi på grund af umodne nethindevakulære plexus (Figur 3).

I begge modeller er de vigtigste parametre, der normalt kvantificeres, størrelsen af AVA og NV. Disse parametre analyseres typisk fra nethindebeslag, hvor endotelcellerne er mærket4,16. Tidligere blev mængden af præretinal NV evalueret fra nethinde tværsnit ved at tælle blodkar eller vaskulære cellekerner, der strækker sig til glasagtige over den indre begrænsende membran. Den største begrænsning af denne fremgangsmåde er, at det ikke er muligt at kvantificere ava'erne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Den her beskrevne protokol er godkendt af Finlands nationale dyresundhedskomité (protokolnummer ESAVI/9520/2020 og ESAVI/6421/04.10.07/2017).

1. Forsøgsdyr og mus OIR model induktion

BEMÆRK: Brug tidsmåttede dyr, f.eks. almindeligt anvendte C57BL/6J-mus, til at få hvalpe født samme dag. Brug plejedæmninger, f.eks. 129 stamme (129S1/SvImJ eller 129S3/SvIM) ammende dæmninger, til at pleje hvalpene under og efter induktion af hyperoxi. Alternativt kan du sørge for, at der er ekstra ammende dæmninger til rådighed, hvis ammende dæmninger skal udskiftes på grund af udmattelse. Begræns kuldstørrelsen til 6-7 unger for hver dæmning, når du bruger C57BL/6J mus/dæmninger (hvis kuldene er større end, at hvalpene har en tendens til at have begrænset vægtforøgelse)16.

  1. Registrer vægten af dyrene før og efter hyperoxia induktion, og på tidspunktet for ofringen.
  2. Sørg for, at der er nok mad på bunden af buret, så dæmningerne har nem adgang til mad.
  3. Tilsæt sodavand med farveindikator til bunden af kammeret for at absorbere overskydende CO2, når der ikke anvendes et filtreringssystem.
  4. Overvåg fugtigheden og temperaturen inde i kammeret og hold fugtigheden mellem 40 og 65%. Forøg om nødvendigt kammerets fugtighed ved at placere retter med vand på bunden af kammeret (f.eks. petriskåle).
  5. Kalibrer O2-sensoren med 100% O2 og normal rumluft.
  6. Placer P7 mus i et kammer og oprette O2 niveau til 75%. Hold musene i kammeret i 5 dage, indtil P12. Undgå at åbne kammeret under hyperoxia induktion. Kontroller gastrykket på O 2-cylinderen, og udskift cylinderen, når det er nødvendigt. Overvåg dyrene under induktionen.
  7. Tag museburene ud af kammeret og vej alle hvalpene. Grupper hvalpene baseret på vægten, så hver eksperimentel gruppe har samme vægtfordeling hos hvalpe.

2. Forsøgsdyr og rotte OIR model induktion (ved hjælp af semi-lukket system)

BEMÆRK: Brug tidsnåttede dyr til at få hvalpene født samme dag. For rotte OIR skal der anvendes øget strøelsesstørrelse, ca. 18 unger/dæmning, for at opnå tilstrækkelig NV-induktion i rottemodellen. Pool hvalpe fra flere kuld for at opnå nok hvalpe til hvert kuld.

  1. Registrer vægten af dyrene før og efter induktion, og på tidspunktet for ofringen.
  2. Sørg for, at der er nok mad på bunden af buret, så dæmningerne har nem adgang til mad.
  3. Tilsæt sodavandskalk med farveindikator i bunden af kammeret for at absorbere overskydende CO2, når filtreringssystemet ikke anvendes.
  4. Overvåg fugtigheden og temperaturen inde i kammeret. Absorber ekstra luftfugtighed (genereret fra flere antal rotter) ved at tilsætte silicagel i bunden af kammeret.
  5. Kalibrer O2-sensoren med 100% N2 og normal rumluft.
  6. Placer rotterne i kammeret ved P0 (få timer efter fødslen). Sæt O2-niveauet til 50% og tilslut O2-cylinderen til kammeret i 24 timer. Derefter skal du skifte indstillingerne til 10% O2 og forbinde nitrogencylindret (N2)til kammeret i 24 timer. Fortsæt 24 timers cykling mellem 50% og 10% O2 niveauer i 14 dage.
  7. Overvåg gasforbruget og dyrenes velbefindende under undersøgelsen. Åbn kammeret under skiftet mellem 50/10% O2 og tilsæt mere mad og vand, hvis det er nødvendigt. Skift dyrenes bure for at rengøre dem under induktionen.
  8. Tag rotteburene ud af kammeret og vej alle hvalpene. Grupper hvalpene baseret på vægten, så hver eksperimentel gruppe har lignende vejefordeling i hvalpene.

3. Drug administration (valgfrit)

BEMÆRK: Almindeligt anvendt lægemiddeladministrationsvej i OIR er ved intravitreal behandling (ivt), ved P12-P14 for mus og ved P14 for rotter. Bestem behandlingsdagen baseret på den eksperimentelle opsætning. Når flere kuld hvalpe bruges til forsøg, skal du opdele behandlingsgrupperne for at få dyr fra alle kuld. Helst injicere stoffet til kun ét øje, og holde kontralaterale øje som en kontrol.

  1. Vej dyrene og lav identifikationsmærker til halen og/eller øret.
  2. Bedøve dyret enten med injicerbar anæstesi (f.eks. blanding af ketamin og medetomidin, 30 mg/kg og 0,4 mg/kg for mus) eller med indåndingsbedøvelse (isofluran ved 2-3,5% isofluran og 200-350 mL/min luftstrøm). Kontroller anæstesiens dybde ved at klemme tæerne. Hold dyret på en varmepude under behandlingen.
  3. For lokalbedøvelse, anvende en dråbe smertestillende på øjenlåget. Åbn øjenlåget forsigtigt med pincet, før du udfører ivt, som mus og rotter åbne deres øjne omkring P14. Påfør en dråbe smertestillende (f.eks. oxybuprocainhydrochlorid) på hornhinden.
  4. Påfør en dråbe jod, før du udfører ivt injektion.
  5. Til ivt injektion brug en glassprøjte med en 33-34 G nål fastgjort. Tryk øjenlågene ned og grap øjeæblet med pincet. Gør injektionen bagest til limbus, ca i 45° vinkel nål peger mod synsnerven.
  6. Undgå at injicere mere end 1,0 μL i det intravitreale rum. Hold nålen på plads i 30 s efter injektion af lægemidlet for at undgå tilbagesvaling af den injicerede opløsning.
  7. Undersøg øjet (f.eks. med et ophthaloskop) for eventuelle komplikationer, såsom blødninger eller nethindeskader, efter at nålen er fjernet. Påfør antibiotisk salve på toppen af hornhinden efter injektionen.
    BEMÆRK: Ivt-injektionsvolumenet for mus skal være 0,5 – 1,0 μL.
  8. Vend anæstesi (for eksempel med en α2-antagonist for medetomidin (2,5 mg/kg) og returnere hvalpen til buret. Hus kuldet normalt indtil slutningen af undersøgelsen.

4. In vivo billeddannelse og elektroretinografi (valgfrit)

  1. Hvis det ønskes, foretages in vivo-billeddannelse på levende dyr i opfølgningsperioden for at registrere ændringer, der udvikler sig i nethinden under de angiogene reaktioner. Udfør f.eks. fluoresceinangiografi (FA) eller scanning af laserkonfokal mikroskopi19 for at visualisere vaskulaturen (Figur 4). Brug spektraldomænet optisk sammenhængstomografi (SD-OCT) til at visualisere nethindelag in vivo (Figur 4).
  2. Hvis det ønskes, skal du undersøge funktionelle ændringer i forskellige nethindecellepopulationer efter OIR-induktion ved hjælp af elektroretinografi (ERG) (Figur 5).

5. Vævsindsamling og forberedelse af nethindebeslag

BEMÆRK: Saml vævene i henhold til den ønskede forskningshypotese. For mus indsamles prøverne for eksempel ved P12 (for at studere vaso-udslettelse efter den hyperoxiske fase) eller i den hypoksiske periode (P13-P17). Indsamle musen OIR prøver på P17, som er det mest almindelige tidspunkt for prøveudtagning, at opdage toppen i NV beløb. I rotte OIR indsamles prøverne ved P18-P21 for at observere den højeste mængde NV (figur 3).

  1. Afvej dyrene inden prøveudtagning.
  2. For at mærke nethindens vaskulatur kan dybt bedøvede dyr transcardialt perfunderes med FITC-dextran. (Alternativt, plette nethinde flade mounts med Isolectin senere).
  3. Ofre dyrene ved hjælp af enten overdosis af anæstesimedicin (f.eks. blanding af ketamin og medetomidin, 300 mg/kg og 4 mg/kg for mus) eller CO2-indånding.
  4. Saml dyrenes øjne ved at gribe bag øjeæblet med buede pincet, skær vævet rundt om øjnene og løft øjet ud fra kredsløbet.
  5. Inkuber øjeæblerne i frisklavet, filtreret 4% paraformaldehyd (i fosfat-buffered saltvand, PBS) i 1-4 timer. Fjern fikseringsmiddel og vask øjne 3 x 10 min med PBS. Disseker nethinden med det samme, eller opbevar dem i PBS ved +4 °C.
    ADVARSEL: Paraformaldehyd er giftigt ved indånding, i kontakt med huden og ved indtagelse. Læs sikkerhedsdatabladet, før du arbejder med det.
    BEMÆRK: Tryk ikke på øjeæblet under prøveudtagningen eller nogen fase af vævsbehandlingen for at undgå nethindeløsning, hvis der udføres tværsnit fra hele øjne.
  6. Forbered nethinde flade mounts at kvantificere mængden af NV og størrelsen af AVAs. Alternativt kan du behandle øjne / nethinder for histologi, eller RNA eller protein analyse. Disseker nethinden under et stereomikroskop ved hjælp af mikrosaks og pincet.
    1. Placer øjeæblet i PBS for at holde det fugtigt og punktere øjeæblet på limbus med en nål (23G) og skæres omkring limbus med buet mikro saks til at fjerne iris og hornhinden.
    2. Placer forsigtigt spidsen af saksen mellem sclera og nethinden og skær sclera mod synsnerven. Gør det samme til den anden side af øjeæblet, og forsigtigt skære / rive sclera indtil nethinden kop er udsat. Træk linsen ud af nethinden kop og tilføje PBS til koppen.
    3. Fjern alle hyaloide fartøjer, glasagtige og snavs uden at beskadige nethinden. Vask nethinden ved at tilføje PBS til nethinden kop. Udfør fire snit (kl. 12, 3, 6 og 9) til nethinden med lige mikrosaks for at lave en blomsterlignende struktur. Du kan også foretage snittene med kirurgisk klinge, inden prøverne monteres. Løft nethinden ved hjælp af en blød pensel til en brøndplade til farvning.
  7. Mærke nethindens vaskulatur ved hjælp af Isolectin B4, som pletter overfladen af endotelceller (hvis dyrene ikke var perfunderet med FITC-dextran). Inkuber nethinden i blokeringsbuffer (10% NGS + 0,5% Triton i TBS) i 1 time og vask med 1% NGS + 0,1% Triton i TBS i 10 min. Nethinden med fluorescerende farvestof konjugeret Isolectin B4 (5-10μg/ml) i 1% NGS + 0,1% Triton i TBS natten over ved +4 °C, mens beskyttet mod lyset.
    BEMÆRK: Hvis det ønskes, skal du mærke andre celler såsom inflammatoriske celler og pericytter ved hjælp af specifikke antistoffer.
  8. Vask nethinden 3x i 10 min med 1% NGS + 0,1% Triton i TBS og løft nethinder på en mikroskopisk rutsjebane, indre nethinden opad. Spred forsigtigt nethinden ud ved hjælp af blød pensel og fjern eventuelle resterende hyaloidbeholdere eller snavs. Tilføj monteringsmediet til et dæksedlen, og placer det oven på nethinden. Opbevar nethinden ved +4 °C og beskyt mod lys.

6. Analyse af de flade beslag

  1. Tag billeder af nethinden flade mounts ved hjælp af en fluorescens mikroskop med 10x mål. Fokuser på den overfladiske vaskulære plexus og på den præretinaale neovascularisering. Lav et feltscanningsbillede for at hente hele nethinden og flette feltscanningerne
  2. Kvantificer billederne ved at måle AVA'erne, NV-området og det samlede nethindeområde ved hjælp af et billedbehandlingsprogram (se Materialeoversigt).
    1. Tegn AVA'erne og det samlede nethindeområde ved hjælp af et frithåndstegningsværktøj, og vælg de neovaskulære områder ved hjælp af et markeringsværktøj. Softwaren måler de områder, der er af interesse for pixels, og AVA- og NV-områderne (udtrykt i pixel) kan bruges til at beregne deres procentdel i forhold til det samlede nethindeområde. Nogle softwareværktøjer er også tilgængelige til kvantificering af NV.
      BEMÆRK: For nylig, en open source, fuldautomatiske programmer til kvantificering af nøgleværdier af OIR billeder ved hjælp af deep learning neurale netværk er blevet indført og give et pålideligt værktøj til reproducerbar kvantificering af nethinde AVA og NV (f.eks https://github.com/uw-biomedical-ml/oir/tree/bf75f9346064f1425b8b9408ab792b1531a86c64)20,21.
  3. Hvis der bruges antistoffer til immunrotokemisk detektion af individuelle cellepopulationer, kvantificeres antallet af farvede celler (f.eks. mikroglia, figur 2B) fra nethindebelagte flade beslag i hånden eller ved hjælp af automatiserede billedanalysesystemer, hvis det ønskes.

7. Statistik

  1. Analyser normalt distribuerede data efter Student's t-test eller One-Way ANOVA efterfulgt af Dunnetts eller Tukeys multiple sammenligningstest, alt efter hvad der er relevant. Brug ikke-parametriske tests som Mann-Whitney U-test eller Kruskal Wallis-test til ikke-normalt distribuerede data. Overvej forskelle, der er statistisk signifikante på P < 0,05-niveau.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det vigtigste resultat af modellen er den vaskulære fænotype: størrelsen af AVAs og mængden af NV. I musemodellen OIR forekommer vaso-udslettelsen i den centrale nethinde (Figur 2A), mens den i rottemodellen udvikler sig i periferien,dvs. Dette skyldes, at den overfladiske vaskulære plexus allerede har udviklet sig, når mus udsættes for hyperoxi, mens nethinden i rottemodellen er avascular på tidspunktet for OIR induktion (P0). Præretinal neovascularisering udvikler sig i nærheden af avascular områder, dvs centrale nethinden i mus, og periferien hos rotter(Figur 2A og Figur 3A).

Histologiske analyser ved hjælp af enten tværsnit eller flade beslag kan gøres for at evaluere morfologiske ændringer i OIR nethinder eller tilstedeværelsen af celletyper af interesse, for eksempel inflammatoriske celler (Figur 2B). Ud over nethinden kan der indsamles hele øjenprøver eller glasagtige prøver til yderligere gen- og proteinudtryksanalyser på forskellige tidspunkter under OIR-modellen. Gen- eller proteinudtryksniveauer kan analyseres med standardmetoder, såsom RT-qPCR eller vestlig blotting.

Eventuelt kan der foretages ikke-invasiv in vivo-billeddannelse i OIR-opfølgningsperioden. Nethinde- og hyaloidvakulaturen kan visualiseres med FA (Figur 4A). SD-OCT kan bruges til at evaluere strukturelle ændringer i nethinden (Figur 4B). Funktionelle ændringer i nethinden kan måles ved ERG (Figur 5).

Hæmmere af vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) er almindeligt anvendt til behandling af humane angiogene øjensygdomme. Anti-VEGF bruges således ofte som referenceforbindelse i OIR. Aflibercept, der fungerer som en opløselig VEGF-fælde, hæmmer både NV og fysiologisk revascularisering i OIR i både høje og lave doser (injiceret ved P14). OIR øjne injiceres på P14 med høj dosis af aflibercept havde endnu større nethinde AVAs end ubehandlede øjne(Figur 6). Dette tyder på, at aflibercept blokke også fysiologiske nethinde revascularization drevet af hypoxi. Både muse- og rottemodeller kan bruges til at vurdere virkningen af forskellige antiangiogene midler på nethinde NV og fysiologisk revascularisering af nethinden (Figur 3B og Figur 6).

Figure 1
Figur 1: Grafisk oversigt over et standard OIR-undersøgelsesdesign til mus og rotter. (A) Mouse OIR-modellen blev induceret ved at udsætte musene for 75% O2 fra P7 til P12 og vendte tilbage til normal rumluft. Toppen af præretinal NV blev set på P17, som normalt er prøvetagningsstedet for eksperimentet. (B) Rotte OIR-modellen blev fremprovokeret ved at udsætte rotterne for vekslende O2-niveauer (50/10 % O2)fra P0 til P14 og returneret til normoxiske tilstande. Rotter ofres normalt ved P20, når mængden af NV toppede. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Vaskulær fænotype i musens OIR-model. Mouse OIR-modellen blev genereret som beskrevet i figur 1. (A) Den overfladiske vaskulære plexus udviklet i normale mus, mens OIR mus blev udsat for 75% O2 fra P7 til P12. I løbet af denne tid udviklede vaskulær udslettelse i den centrale nethinde (markeret med blåt ved P12 og P17 i de kvantificerede billeder). Mus blev returneret til normal rumluft, og den avaskulære nethinde blev hypoksisk, hvilket førte til funktionel kargenvækst i nethinden og patologisk NV (markeret med rødt ved P17 i underpanelet). Præretinal neovaskulære tufts udviklet mellem vaskulære og avascular områder i det centrale nethinden. Mængden af NV toppede ved P17 og regresserede bagefter. Nethinden var fuldt revascularized og NV regresseret omkring P24-P25. (B) Et eksempel på immunohistokemisk farvning af nethinde fladt beslag, der viser nethinde Iba-1 farvede mikroglia (grøn) og GS-IB4 farvede blodkar (rød) ved P12 og P17. (C) Tværsnit af en mus OIR øje på P17, hvor preretinal tufts (pile) spirede mod glasagtige. Også udtynding af det indre nukleare lag (INL) og ydre plexiform lag (OPL) blev set. Skalastænger er 1 mm i A, 50 μm i B og 100 μm i C. ILM = indre begrænsende membran, GCL = ganglioncellelag, IPL = indre plexiformlag, INL = indre nukleare lag, OPL = ydre plexiform lag, ONL = ydre atomlag, RPE = retinale pigment epitel. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Vaskulær fænotype og dens udvikling i rotte-OIR-modellen. (A) Avascular områder (markeret med blåt) og NV (markeret med rødt) udviklet i periferien af nethinden, svarende til menneskelige ROP. (B) AVAs blev set i OIR nethinder, men ikke i normoxiske kontroller. (C) Kvantificeringen af NV-området viste en tendens til et højdepunkt i NV's størrelse ved P20, men forskellen var ikke statistisk signifikant i forhold til P18 og P21 i OIR. (Student's t-test, mellem tid matchede normoxic og OIR nethinder, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001, begge øjne af dyrene plottet i grafen). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: In vivo-billeddannelse ved hjælp af fluoresceinangiografi (FA) og spektraldomænet optisk kohærografi (SD-OCT) i OIR-modellen. (A) Vaskulær tortuosity (pilespidser) blev set på billederne taget fra den centrale nethinden (øverste række) på P18 og P20 i OIR rotter i forhold til normoxic P19 rotter. NV (pile) og AVAs (stjerne) udviklet til periferien af nethinden (midterste række) som det ses i P18 og P20 OIR nethinder. Regresserende hyaloide kar (nederste række) blev fanget af FA. (B) Blodkar vækst mod glasagtige blev observeret som en fortykkelse på nervefiber lag (NFL) og ganglion cellelag (GCL) i OIR nethinder (pil). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Funktionaliteten af nethindeneuroner kan måles ved hjælp af flashelektroretinografi (fERG). (A) A-bølgerne stammede fra nethindekegler og stangfotoreceptorer, og deres amplituder blev væsentligt reduceret i OIR-modellen. Effekten steg med en højere lysintensitet, hvilket tyder på, at fejlene påvirkede kegle fotoreceptor funktioner primært. (B) B-bølge amplituder fra OIR-dyr blev reduceret sammenlignet med normoxisk kontrol. B-bølger stammer fra ON-bipolar celler og Müller celler. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Intravitreally injiceres PBS reducerer NV og AVAs i musen OIR model. (A) Repræsentative billeder af nethindebelagte flade beslag fra ubehandlede og afliberceptbehandlede (20 μg ved P14) og PBS injicerede OIR-øjne ved P17. Høj dosis af aflibercept (20 μg) øgede størrelsen af AVAs med 47% (skitseret i hvidt) og hæmmede NV med 98% (pile) sammenlignet med ubehandlede kontroller. PBS-injektionen faldt AVAs med 31% og NV med 42% sammenlignet med ubehandlede kontroller. Desuden gav punktering af sclera, der lignede ivt, lignende virkninger som ivt injektion af PBS, men forskellene var ikke statistisk signifikante. Pilespids peger på hyaloide fartøjer, der ikke blev fjernet under dissektionen. (One-Way ANOVA, * p ≤ 0,05; ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001, **** p ≤ 0,0001). Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sværhedsgraden af sygdom fænotype er afhængig af både stammen og endda sælger i både mus og rotte OIR modeller23. Dette tyder på, at der er en bred genotypisk variation i patologisk udvikling. Generelt udvikler pigmenterede gnavere mere alvorlig fænotype end albinoerne. F.eks. revasculariseres nethindevaculaturen af albino BALB/c hurtigt efter hyperoxi og udvikler slet ikke NV24. Tilsvarende viser pigmenterede Brune Norge rotter hos rotter mere alvorlig patologi end albino Sprague Dawley (SD) rotter25. SD rotter er almindeligt anvendte stamme, og sælger-relaterede forskelle i OIR fænotype er blevet rapporteret inden for stammen. For eksempel producerer SD-rotter fra Charles River betydeligt mere NV end rotter fra Harlan eller Zivic-Miller23. C3H/ HeJ mus, til gengæld, der har en mutation i nethinde degeneration 1 (Rd1) gen, har tynde nethinder, og ikke udvikler NV26. På grund af disse grunde og tilgængeligheden af transgene muselinjer er den indavlede C57BL/6J den mest anvendte musestamme til OIR-undersøgelser. Der er dog en ganske høj dødelighed blandt C57BL/6J-dæmningerne på grund af hyperoxisk eksponering, så musenes velbefindende skal overvejes, når de udformer undersøgelsen og overvåges under forsøgene. Desuden ses øget fotoreceptorskade hos C57BL/6 mus sammenlignet med BALB/c mus27.

For at sikre musenes trivsel og overlevelsen af dæmninger og hvalpe skal kuldstørrelsen holdes lille (6-7 hvalpe / dæmning). Dette er især vigtigt, når du bruger C57BL/6 mus, som er mere modtagelige for hyperoxisk stress27,28. Derudover skal der leveres lettilgængelig støtteføde (placeret på bunden af buret) til musene. Nogle forskere bruger surrogat dæmninger til at erstatte dæmninger i kammeret med raske dem efter ilt-induktion. Men de fleste forskere bruger surrogater kun, hvis dæmningen er opbrugt22,29. Surrogat dæmninger anbefales at blive brugt, hvis større kuld størrelser anvendes. Det er blevet offentliggjort, at 129S3/SvIM mus producerer mere NV end C57BL/6 og opretholder bedre ændringer forårsaget af varierende iltniveauer28. Det skal bemærkes, at de dæmninger, der anvendes i OIR, er ufrugtbare efter OIR-induktionen og ikke bør anvendes til yderligereavlsformål 22. Postnatal vægtøgning af hvalpene påvirker sværhedsgraden af OIR patologi. Unger med dårlig postnatal vægtforøgelse (<5 g ved P17) viser forsinket udtryk for VEGF og dermed langvarig fase af retinopati sammenlignet med unger med normal (5 - 7,5 g ved P17) eller omfattende vægtforøgelse (>7,5 g ved P17)29. Desuden viser mus, der vejer over 5 g ved P7, ikke vaso-udslettede områder efter OIR induktion30. Således er det vigtigt at veje hvalpene under eksperimentet. Det kontralaterale ubehandlede øje kan bruges som en intern kontrol for at sikre, at musenes ernæringsmæssige status ikke påvirker resultaterne. Situationen er den samme hos rotter; jo mindre hvalpene er, jo mere alvorlig OIR fænotype udvikler de31. Således anbefales stor kuldstørrelse (ca. 18 hvalpe) at blive brugt til rotte OIR-modellen.

OIR-modellens induktion kan gøres ved hjælp af enten fuldt lukket system, hvor der er et lukket kredsløb med en pumpe, der cirkulerer luften gennem et filtersystem (sodavandskalk og aktivt kul) tilbage til kammeret. En anden mulighed er et halvlukket system, hvor ventilation sikrer, at de overskydende metabolitter fjernes fra kammeret. For at sikre, at overskydende CO2 fjernes, kan sodavand (blanding af calciumhydroxid med natriumhydroxid eller kaliumhydroxid) placeres på bunden af kammeret. Fjernelse af CO2 er obligatorisk, da de høje CO2-niveauer forværrer sygdommens fænotype hos rotter32. Man skal også huske at kalibrere iltsensoren i kammeret regelmæssigt, da de har tendens til at drive over tid og kan give forkert iltkoncentration fra den tilsigtede.

Det forlyder , at køretøjsindsprøjtning (PBS) alene eller blot punktering til det intravitreale rum har en virkning for revasculariseringshastigheden og mængden af NV (figur 6)33,34,35,36. Det er blevet spekuleret på , om effekten set med PBS / køretøj injektion kan skyldes ændringer i intraokulært tryk under injektion, eller på grund af skade på okulære strukturer, der øger niveauet af angiogene vækstfaktorer blandt dem pigment epitel-afledt vækstfaktor34,37. Desuden har det vist sig, at blot en pilotunderretinal injektion (punktering i det subretinaale rum) har vist sig at have virkninger på den vaskulære og funktionelle fænotype i OIR sammenlignet med de ubehandlede rotter38. Disse resultater fremhæver vigtigheden af korrekt negativ kontrol i OIR-undersøgelserne eller endda systemisk administration af testede forbindelser samt store nok n-numre i hver studiegruppe. Den omstændighed, at køretøjet injektion faktisk øger revascularization sats i nethinden er en vigtig begrænsende faktor som revascularization sats og dannelsen af patologiske preretinal tufts er indbyrdes forbundne i OIR model: hvis revascularization sats er accelereret, det fører til kompenserende nedregulering af neovascular tufts og vice versa. Begge OIR-modellens primære resultatmål er således påvirket af køretøjets indsprøjtning.

VEGF-hæmmere har revolutioneret behandlingen AMD og DR. OIR model blev brugt til at demonstrere deres effektivitet præklinisk. Med hensyn til VEGF-hæmmere i OIR viste en undersøgelse, der sammenlignede forskellige anti-VEGF'er og anti-plGF'er (placental vækstfaktor) (injiceret ved P12), at anti-VEGF alene førte til små avascular områder, mens anti-PIGF behandlede øjne havde større avascular områder33. Aflibercept havde den største AVAs i forhold til andre medicinske behandlinger33. Aflibercept er kendt for at binde både VEGF og PlGF39, det kunne være, at hæmme PlGF i OIR fører til blokering af fysiologisk angiogenese.

Noninvasive in vivo imaging giver et værktøj til overvågning af nethindevakultur40 og nethindelag og struktur i opfølgningsperioden. Ved hjælp af FA kan parametre som vaskulær tæthed og arteriel tortuositet og venøs dilation (kaldet plus sygdom, figur 4A) måles40,41. SD-OCT kan anvendes til evaluering af strukturelle ændringer og måling af nethindetykkelse i OIR-opfølgningsperioden42,43. ERG bruges til at måle de funktionelle ændringer i nethinden. Forskellige celletyper producerer elektriske potentialer efter lysstimulans, og disse signaler eller "bølger" kan måles med ERG. Fotoreceptorer producerer den negative a-bølge, og ON bipolære celler og Müller celler er hovedansvarlige for b-bølge44. Tab af nethindefunktion er typisk hos OIR-mus og rotter45,46 ( Figur5). Langvarige ændringer fortsætter i nethinden , og både funktionelle ændringer og ændringer i proteinniveauet er blevet rapporteret i OIR nethinder, selv efter revascularization og NV regression34,47.

For at visualisere nethindens vaskulatur kan de levende mus enten perfunderes med FITC-mærket dextran, eller de retinale flade mounts kan farves med fluorescerende farvestof mærket Isolectin B4. Man er nødt til at forstå forskellen mellem de fluorescerende farvestoffer; perfusionen med FITC-dextrans-etiketter kun beholdernes lumen, mens Isolectin B4 pletter overfladen af endotelceller. Således vil funktionelle blodkar med ordentlig lumen kun blive visualiseret med FITC-dextran perfusion, mens det samlede areal af NV synes større i Isolectin B4 farvede nethinder end i FITC-dextran perfunderede dyr, fordi Isolectin B4 væsentlige opfanger selv endotelceller, som ikke har dannet funktionelle lumen endnu48. En nyere mulighed for at visualisere hele nethinden / øjet bolden i 3-D-format er dybt væv billeddannelse af to-foton fluorescens mikroskopi(49).

Gnaver OIR-modellen såvel som dyremodellerne generelt repræsenterer kun delvist egenskaberne ved menneskelige sygdomme. Den største forskel i forbindelse med OIR er, at nethinde neovascularization ikke er forbundet med fibrose hos gnaver OIR, mens nethinde neovascularization fører almindeligvis til fibrovaskulær spredning hos humane neovaskulære retinale sygdomme. Desuden kan de betingelser, der forårsager OIR vs menneskelig sygdom være næsten modsatte. De præmature nyfødte med ROP kræver supplerende ilt med respiratorisk støtte, oplever ofte intermitterende hypoxemic og hyperoxemic episoder forårsaget af tilbagevendende apnø, men de er ikke udsat for høje niveauer af ilt. For at minimere den permanente skade undgås høje fraktioner af inspireret O2. I denne henseende ligner hverken musemodellen med konstant eksponering for 75% O2 i 5 dage eller 50/10-rottemodellen patogenese hos human rop. Desuden er der også forskelle mellem rotte og mus OIR modeller. Den neovascularization regresserer i musen model med re-etablering af normale fartøjer ved P24, mens betingelsen bliver værre i rotte OIR model (svarende til menneskelige ROP). Selv om rotte OIR-modellen viser klinisk relevante træk ved rop, såsom den forsinkede nethinde vaskulære udvikling og efterfølgende patologisk neovascularisering, er dens anvendelse begrænset af næsten fuldstændig fravær af transgene rottestammer, højere vedligeholdelsesomkostninger og mindre NV end i musens OIR-model.

Samlet set, på trods af forskellene mellem human iskæmisk proliferative retinopatier og gnaver OIR modeller, den lethed, hvormed NV kan induceres, kombineret med nem visualisering og kvantificering af nethinden, gør OIR modeller populære til at studere de molekylære mekanismer og potentielle terapeutiske for iskæmisk proliferative retinopatier. Interessant nok fremkalder hyperoxiaeksponeringen hos mus OIR-modellen også bronchopulmonal dysplasi, en anden sygdom forårsaget af supplerende iltbehandling hos for tidligt fødte børn hos mennesker, hvilket viser, at OIR-modellen kan bruges til at udforske nye mål for både ROP og bronchopulmonal dysplasi samtidig50.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne Maria Vähätupa, ph.d., Niina Jääskeläinen, Marc Cerrada-Gimenez, ph.d., og Rubina Thapa er ansatte hos Experimentica Ltd.

Forfatteren Giedrius Kalesnykas, ph.d., er en medarbejder (President og Chief Executive Officer) og aktionær i Experimentica Ltd, der tilbyder kontrakt forskningstjenester beskæftiger prækliniske OIR modeller, der anvendes i denne artikel.

Tero Järvinen, M.D., ph.d., og Hannele Uusitalo-Järvinen, M.D., ph.d., har intet at oplyse.

Acknowledgments

Vi takker Marianne Karlsberg, Anne Mari Haapaniemi, Päivi Partanen og Anne Kankkunen for fremragende teknisk support. Dette arbejde blev finansieret af Finlands Akademi, Päivikki og Sakari Sohlberg Foundation, Tampere Tuberculosis Foundation, Finnish Medical Foundation, Pirkanmaa Hospital District Research Foundation og Tampere University Hospital Research Fund.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
33 gauge, Small Hub RN Needle Hamilton Company 7803-05, 10mm, 25°, PS4 For intravitreal injection
Adobe Photoshop Adobe Inc. For image analysis
Air pump air100 Eheim GmbH & Co. KG. 143207 For inhalation anaesthesia
Anaesthesia unit 410 AP Univentor Ltd. 2360309 For inhalation anaesthesia
AnalaR NORMAPUR Soda lime VWR International Ltd 22666.362 For CO2 control during model induction
Attane Vet 1000 mg/g VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY vnr 17 05 79 For inhalation anaesthesia
Brush For preparation of flat mounts
Carbon dioxide gas For sacrifice
Celeris D430 ERG system Diagnosys LLC 121 For in vivo ERG
Cell culture dishes Greiner Bio-One International GmbH 664 160 For preparation of flat mounts
Cepetor Vet 1 mg/mL VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY vnr 08 78 96 For anaesthesia
Cover slips Thermo Fisher Scientific 15165452 For preparation of flat mounts
O2 Controlled InVivo Cabinet, Aninal Filtrarion System and Dehumidifier Coy Laboratory Products Closed system for disease model induction, optional for semi-closed system
E702 O2 sensor BioSphenix, Ltd. E207, 1801901 For oxygen level measurement
Envisu R2200 Spectral Domain Optical Coherence Tomograph (SD-OCT) Bioptigen, Inc. BPN000668 For in vivo imaging
Eye spears Beaver-Visitec International, Inc. 0008685 For intravitreal injection and in vivo imaging
Flexilux 600LL Cold light source Mikron 11140 For intravitreal injection or tissue collection
Fluorescein sodium salt Merck KGaA F6377-100G For in vivo imaging
Gas Exhaust unit (+Double 3-way valve, mouse and rat face masks, UNOsorb filter) UNO Roestvaststaal BV GEX 17015249 For inhalation anaesthesia
Glass syringe, Model 65 RN Hamilton Company 7633-01 For intravitreal injection
HRA2 Retina angiograph (FA) Heidelberg Engineering GmbH Spec-KT-05488 For in vivo imaging
Isolectin GS-IB4, Alexa Fluor 488 Conjugate Thermo Fisher Scientific I21411 For labeling retinal vasculature on flat mounts
Ketaminol Vet 50 mg/mL Intervet International B.V. vnr 51 14 85 For anaesthesia
Medicinal Oxygen gas For disease model induction
Mice C57BL/6JRj Janvier Labs Also other strains possible
Microscope slides Thermo Fisher Scientific J1800AMNZ For preparation of flat mounts
Minims Povidone Iodine 5% (unit) Bausch & Lomb U.K Limited vnr 24 11 304 For intravitreal injection
Nitrogen gas For disease model induction (rat)
Oftan Chlora 10 mg/g Santen Pharmaceutical Co., Ltd. vnr 55 01 11 For intravitreal injection
Oftan Metaoksedrin 100 mg/ml Santen Pharmaceutical Co., Ltd. vnr 55 03 43 For in vivo ERG
Oftan Obucain 4 mg/ml Santen Pharmaceutical Co., Ltd. vnr 55 03 50 For intravitreal injection
Oftan Tropicamid 5 mg/ml Santen Pharmaceutical Co., Ltd. vnr 04 12 36 For in vivo imaging
ProOx Model 110 O2 controller and animal chamber BioSphenix, Ltd. 803 For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system
ProOx Model P360 O2 controller and animal chamber BioSphenix, Ltd. 538 For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system
Rats CD(SD) Charles River Laboratories Also other strains possible
Revertor 5 mg/mL VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY vnr 13 04 97 For anaesthesia reversal
Silica gel For humidity control during model induction
Systane Ultra 10ml Alcon Tamro 2050250 For hydration of the eye
Systane Ultra unit 0.7ml Alcon Tamro 2064871 For hydration of the eye
Transfer pipette Thermo Fisher Scientific 1343-9108 For preparation of flat mounts
VENTI-Line VL 180 PRIME Drying oven VWR VL180S 170301 For drying silica gel
VisiScope SZT350 Stereomicroscope VWR 481067 For intravitreal injection or tissue collection

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chase, J. The evolution of retinal vascularization in mammals. A comparison of vascular and avascular retinae. Ophthalmology. 89 (12), 1518-1525 (1982).
  2. Sun, Y., Smith, L. E. H. Retinal vasculature in development and diseases. Annual Review of Vision Science. 4, 101-122 (2018).
  3. Vähätupa, M., Järvinen, T. A. H., Uusitalo-Järvinen, H. Exploration of oxygen-induced retinopathy model to discover new therapeutic drug targets in retinopathies. Frontiers in Pharmacology. 11, 873 (2020).
  4. Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (6), 2813-2826 (2010).
  5. Benjamin, L. E., Hemo, I., Keshet, E. A plasticity window for blood vessel remodelling is defined by pericyte coverage of the preformed endothelial network and is regulated by PDGF-B and VEGF. Development. 125 (9), 1591-1598 (1998).
  6. Bashinsky, A. L. Retinopathy of prematurity. North Carolina Medical Journal. 78 (2), 124-128 (2017).
  7. Ludwig, C. A., Chen, T. A., Hernandez-Boussard, T., Moshfeghi, A. A., Moshfeghi, D. M. The epidemiology of retinopathy of prematurity in the united states. Ophthalmic Surgery, Lasers and Imaging Retina. 48 (7), 553-562 (2017).
  8. Hartnett, M. E. Pathophysiology and mechanisms of severe retinopathy of prematurity. Ophthalmology. 122 (1), 200-210 (2015).
  9. Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: From development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
  10. Szewczyk, T. S. Retrolental fibroplasia; etiology and prophylaxis. American Journal of Ophthalmology. 35 (3), 301-311 (1952).
  11. Szewczyk, T. S. Retrolental fibroplasia and related ocular diseases; classification, etiology, and prophylaxis. American Journal of Ophthalmology. 36 (10), 1336-1361 (1953).
  12. Gerschman, R., Nadig, P. W., Snell, A. C. Jr, Nye, S. W. Effect of high oxygen concentrations on eyes of newborn mice. American Journal of Physiology. 179 (1), 115-118 (1954).
  13. Gyllnesten, L. J., Hellström, B. E. Experimental approach to the pathogenesis of retrolental fibroplasia. III. changes in the eye induced by exposure of newborn mice to general hypoxia. British Journal of Ophthalmology. 39 (7), 409-415 (1955).
  14. Curley, F. J., Habegger, H., Ingalls, T. H., Philbrook, F. R. Retinopathy of immaturity in the newborn mouse after exposure to oxygen imbalances. American Journal of Ophthalmology. 42 (3), 377-392 (1956).
  15. Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).
  16. Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: A model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).
  17. Penn, J. S., Tolman, B. L., Lowery, L. A. Variable oxygen exposure causes preretinal neovascularization in the newborn rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 34 (3), 576-585 (1993).
  18. Penn, J. S., Henry, M. M., Tolman, B. L. Exposure to alternating hypoxia and hyperoxia causes severe proliferative retinopathy in the newborn rat. Pediatric Research. 36 (6), 724-731 (1994).
  19. Ritter, M. R., et al. Three-dimensional in vivo imaging of the mouse intraocular vasculature during development and disease. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (9), 3021-3026 (2005).
  20. Xiao, S., et al. Fully automated, deep learning segmentation of oxygen-induced retinopathy images. Journal of Clinical Investigation Insight. 2 (24), 97585 (2017).
  21. Mazzaferri, J., Larrivee, B., Cakir, B., Sapieha, P., Costantino, S. A machine learning approach for automated assessment of retinal vasculature in the oxygen induced retinopathy model. Scientific Reports. 8 (1), 22251-22257 (2018).
  22. Kim, C. B., D'Amore, P. A., Connor, K. M. Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).
  23. Barnett, J. M., Yanni, S. E., Penn, J. S. The development of the rat model of retinopathy of prematurity. Documenta Ophthalmologica. 120 (1), 3-12 (2010).
  24. Ritter, M. R., et al. Myeloid progenitors differentiate into microglia and promote vascular repair in a model of ischemic retinopathy. Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3266-3276 (2006).
  25. Floyd, B. N., et al. Differences between rat strains in models of retinopathy of prematurity. Molecular Vision. 11, 524-530 (2005).
  26. Scott, A., Powner, M. B., Fruttiger, M. Quantification of vascular tortuosity as an early outcome measure in oxygen induced retinopathy (OIR). Experimental Eye Research. 120, 55-60 (2014).
  27. Walsh, N., Bravo-Nuevo, A., Geller, S., Stone, J. Resistance of photoreceptors in the C57BL/6-c2J, C57BL/6J, and BALB/cJ mouse strains to oxygen stress: Evidence of an oxygen phenotype. Current Eye Research. 29 (6), 441-447 (2004).
  28. Chan, C. K., et al. Differential expression of pro- and antiangiogenic factors in mouse strain-dependent hypoxia-induced retinal neovascularization. Laboratory Investigation. 85 (6), 721-733 (2005).
  29. Stahl, A., et al. Postnatal weight gain modifies severity and functional outcome of oxygen-induced proliferative retinopathy. American Journal of Pathology. 177 (6), 2715-2723 (2010).
  30. Liegl, R., Priglinger, C., Ohlmann, A. Induction and readout of oxygen-induced retinopathy. Methods in Molecular Biology. 1834, 179-191 (2019).
  31. Holmes, J. M., Duffner, L. A. The effect of postnatal growth retardation on abnormal neovascularization in the oxygen exposed neonatal rat. Current Eye Research. 15 (4), 403-409 (1996).
  32. Holmes, J. M., Zhang, S., Leske, D. A., Lanier, W. L. The effect of carbon dioxide on oxygen-induced retinopathy in the neonatal rat. Current Eye Research. 16 (7), 725-732 (1997).
  33. Heiduschka, P., Plagemann, T., Li, L., Alex, A. F., Eter, N. Different effects of various anti-angiogenic treatments in an experimental mouse model of retinopathy of prematurity. Journal of Clinical and Experimental Ophthalmology. 47 (1), 79-87 (2019).
  34. Tokunaga, C. C., et al. Effects of anti-VEGF treatment on the recovery of the developing retina following oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1884-1892 (2014).
  35. Tokunaga, C. C., Chen, Y. H., Dailey, W., Cheng, M., Drenser, K. A. Retinal vascular rescue of oxygen-induced retinopathy in mice by norrin. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (1), 222-229 (2013).
  36. Vähätupa, M., Uusitalo-Järvinen, H., Järvinen, T. A. H., Uusitalo, H., Kalesnykas, G. Intravitreal injection of PBS reduces retinal neovascularization in the mouse oxygen-induced retinopathy model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. Abstract Issue. 57 (12), 3649 (2016).
  37. Penn, J. S., et al. Angiostatic effect of penetrating ocular injury: Role of pigment epithelium-derived factor. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (1), 405-414 (2006).
  38. Becker, S., Wang, H., Stoddard, G. J., Hartnett, M. E. Effect of subretinal injection on retinal structure and function in a rat oxygen-induced retinopathy model. Molecular Vision. 23, 832-843 (2017).
  39. Sophie, R., et al. Aflibercept: A potent vascular endothelial growth factor antagonist for neovascular age-related macular degeneration and other retinal vascular diseases. Biological Therapy. 2, (2012).
  40. Mezu-Ndubuisi, O. J. In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery. Optometry and Vision Science. 93 (10), 1268-1279 (2016).
  41. Mezu-Ndubuisi, O. J., et al. In vivo retinal vascular oxygen tension imaging and fluorescein angiography in the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6968-6972 (2013).
  42. Dailey, W. A., et al. Ocular coherence tomography image data of the retinal laminar structure in a mouse model of oxygen-induced retinopathy. Data in Brief. 15, 491-495 (2017).
  43. Mezu-Ndubuisi, O. J., Taylor, L. K., Schoephoerster, J. A. Simultaneous fluorescein angiography and spectral domain optical coherence tomography correlate retinal thickness changes to vascular abnormalities in an in vivo mouse model of retinopathy of prematurity. Journal of Ophthalmology. 2017, 9620876 (2017).
  44. Pinto, L. H., Invergo, B., Shimomura, K., Takahashi, J. S., Troy, J. B. Interpretation of the mouse electroretinogram. Documenta Ophthalmologica. 115 (3), 127-136 (2007).
  45. Nakamura, S., et al. Morphological and functional changes in the retina after chronic oxygen-induced retinopathy. PLoS One. 7 (2), 32167 (2012).
  46. Dorfman, A. L., Polosa, A., Joly, S., Chemtob, S., Lachapelle, P. Functional and structural changes resulting from strain differences in the rat model of oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (5), 2436-2450 (2009).
  47. Vähätupa, M., et al. SWATH-MS proteomic analysis of oxygen-induced retinopathy reveals novel potential therapeutic targets. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (8), 3294-3306 (2018).
  48. Campos, M., Amaral, J., Becerra, S. P., Fariss, R. N. A novel imaging technique for experimental choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (12), 5163-5170 (2006).
  49. Yanez, C. O., et al. Deep Vascular Imaging in Wounds by Two-Photon Fluorescence Microscopy. PLos One. 8 (7), 67559 (2013).
  50. Wickramasinghe, L. C., et al. Lung and eye disease develop concurrently in supplemental oxygen-exposed neonatal mice. American Journal of Pathology. , 30287 (2020).

Tags

Medicin angiogenese neovascularization ilt-induceret retinopati OIR hypoxi retinopati af prematurity ROP diabetisk retinopati intravitreal injektion billedanalyse kunstig intelligens AI
Oxygen-induceret retinopati Model for iskæmiske retinale sygdomme hos gnavere
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vähätupa, M.,… More

Vähätupa, M., Jääskeläinen, N., Cerrada-Gimenez, M., Thapa, R., Järvinen, T., Kalesnykas, G., Uusitalo-Järvinen, H. Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents. J. Vis. Exp. (163), e61482, doi:10.3791/61482 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter