Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Zuurstofgeïnduceerde retinopathiemodel voor ischemische netvliesziekten bij knaagdieren

Published: September 16, 2020 doi: 10.3791/61482
Automatic Translation
1,2, 2, 2, 2, 1, 2, 1,3
1Faculty of Medicine and Health Technology, Tampere University & Tampere University Hospital, 2Experimentica Ltd, 3Eye Centre, Tampere University Hospital

Summary

Zuurstofgeïnduceerde retinopathie (OIR) kan worden gebruikt om ischemische netvliesaandoeningen zoals retinopathie van prematuriteit en proliferatieve diabetische retinopathie te modelleren en om te dienen als model voor proof-of-concept studies bij het evalueren van antiangiogene geneesmiddelen voor neovasculaire ziekten. OIR induceert robuuste en reproduceerbare neovascularisatie in het netvlies die kan worden gekwantificeerd.

Abstract

Een van de meest gebruikte modellen voor ischemische retinopathieën is het zuurstofgeïnduceerde retinopathie (OIR) model. Hier beschrijven we gedetailleerde protocollen voor de OIR-modelinductie en de uitlezingen ervan bij zowel muizen als ratten. Retinale neovascularisatie wordt geïnduceerd in OIR door knaagdierjongen bloot te stellen aan hyperoxia (muizen) of afwisselende niveaus van hyperoxia en hypoxie (ratten). De primaire uitlezingen van deze modellen zijn de grootte van neovasculaire (NV) en avasculaire (AVA) gebieden in het netvlies. Dit preklinische in vivo model kan worden gebruikt om de werkzaamheid van potentiële anti-angiogene geneesmiddelen te evalueren of om de rol van specifieke genen in de retinale angiogenese aan te pakken met behulp van genetisch gemanipuleerde dieren. Het model heeft enige spannings- en leveranciersspecifieke variatie in de OIR-inductie waarmee rekening moet worden gehouden bij het ontwerpen van de experimenten.

Introduction

Betrouwbare en reproduceerbare experimentele modellen zijn nodig om de pathologie achter angiogene oogziekten te bestuderen en nieuwe therapieën voor deze verwoestende ziekten te ontwikkelen. Pathologische angiogenese is het kenmerk voor natte leeftijdsgebonden maculadegeneratie (AMD) en voor veel ischemische netvliesaandoeningen waaronder retinopathie van prematuriteit (ROP), proliferatieve diabetische retinopathie (PDR) en retinale ader occlusie (RVO)1,2,3,4. Menselijke en knaagdier retina's volgen een vergelijkbaar patroon van ontwikkeling, omdat zowel menselijk als knaagdier netvlies behoren tot de laatste weefsels die vasculair zijn. Voordat het netvlies vasculatuur zich volledig heeft ontwikkeld, ontvangt het netvlies zijn nutriëntentoevoer uit hyaloïde vasculatuur, dat op zijn beurt regresseert wanneer het netvlies vasculatuur begint te ontwikkelen1,2. Bij menselijke, retinale vasculaire ontwikkeling wordt voltooid vóór de geboorte, terwijl bij knaagdieren de groei van retinale vasculatuur optreedt na de geboorte. Aangezien de vasculaire ontwikkeling van het netvlies postnataal plaatsvindt bij knaagdieren, biedt het een ideaal modelsysteem om de angiogenese2,3 tebestuderen. De pasgeboren knaagdieren hebben een avasculaire retina die zich geleidelijk ontwikkelt totdat volledige vasculaire netvliesontwikkeling wordt bereikt tegen het einde van derde postnatale week4. De groeiende bloedvaten van neonatale muis zijn plastic en ondergaan regressie tijdens hyperoxia stimulus5.

ROP is de belangrijkste oorzaak voor kinderblindheid in westerse landen, omdat het bijna 70% van de premature zuigelingen met geboortegewicht onder 1.250 g6,7treft. ROP komt voor bij premature zuigelingen die worden geboren voordat netvliesvaten hun normale groei voltooien. ROP vordert in twee fasen: in fase I vertraagt vroeggeboorte de vasculaire groei van het netvlies, waarbij na fase II de onvoltooide vascularisatie van het zich ontwikkelende netvlies hypoxie veroorzaakt, wat de expressie van angiogene groeifactoren induceert die nieuwe en abnormale bloedvatgroei stimuleren8. Het OIR-model is een veelgebruikt model geweest om de pathofysiologie van ROP en andere ischemische retinopathieën te bestuderen en om nieuwe medicijnkandidaten te testen2,3,9. Het wordt algemeen beschouwd als een reproduceerbaar model voor het uitvoeren van proof-of-concept studies voor potentiële antiangiogene geneesmiddelen voor oog- en niet-oculaire ziekten. De twee knaagdiermodellen, d.w.z. muis en rat OIR verschillen in hun modelinductie en ziektefenotype. Het rattenmodel bootst het ROP-fenotype nauwkeuriger na, maar het muismodel biedt een robuuster, sneller en reproduceerbaarder model voor retinale neovascularisatie (NV). In het muismodel ontwikkelt NV zich tot het centrale netvlies. Deze pathologische uitlezing is belangrijk in farmacologische werkzaamheidsstudies voor veel ischemische retinopathieën, zoals PDR, RV en exsudatieve AMD, evenals voor niet-oculaire, angiogene ziekten zoals kanker. Bovendien maakt de beschikbaarheid van genetisch gemanipuleerde (transgene en knock-out) muizen het muis OIR-model een populairdere optie. Noch muis noch rat OIR model creëert echter retinale fibrose, wat typisch is bij menselijke ziekten.

Het inzicht dat hoge zuurstofniveaus bijdragen aan de ontwikkeling van ROP in de jaren 195010,11 leidde tot de ontwikkeling van diermodellen. De eerste studies over het effect van zuurstof op retinale vasculatuur werden gedaan in 195012,13,14 en tot de jaren 1990 waren er veel verfijningen aan het OIR-model. Het onderzoek van Smith et al. in 1994 zette een standaard voor het huidige muis OIR-model dat hyaloidopathie scheidt van retinopathie15. Een brede goedkeuring van de methode om vaso-vernietiging en pathologische NV door Connor et al. (2009) te kwantificeren verhoogde zijn populariteit verder16. In dit model worden muizen gedurende 5 dagen op 75% zuurstof (O2)geplaatst op P7, gevolgd door 5 dagen in normoxische omstandigheden. Hyperoxia van P7 tot P12 zorgt ervoor dat retinale vasculatuur teruggaat in het centrale netvlies. Bij terugkeer naar normoxische aandoeningen wordt het avasculaire netvlies hypoxisch (figuur 1A). Als gevolg van de hypoxische stimuli van het avasculaire centrale netvlies, ontspruiten sommige van de retinale bloedvaten naar het glasvocht en vormen preretinale NV, preretinale plukjes2,3genoemd . Deze plukjes zijn onvolwassen en hyperpermeabel. De hoeveelheid NV piekt op P17, waarna deze achteruitgaat. Het netvlies is volledig gerevasculariseerd en NV wordt volledig geregresseerd door P23 - P25 (figuur 2A)2,3.

Het rat OIR-model (met verschillende niveaus van O2) werd voor het eerst beschreven in de jaren 1990 waaruit bleek dat verschillende O2-niveaus bij 80% en 40% meer uitgesproken NV veroorzaken dan onder 80% O2 constante blootstelling17. Later werd ontdekt dat het intermitterende hypoxiemodel, waarbij O2 wordt gefietst uit hyperoxia (50%) hypoxie (10-12 %), veroorzaakt nog meer NV dan de 80/40% O2 model18. In het 50/10% model worden rattenjongen gedurende 24 uur blootgesteld aan 50%, gevolgd door 24 uur in 10% O2. Deze cycli worden voortgezet tot P14, wanneer de ratjongen worden teruggebracht naar normoxische omstandigheden (figuur 1B). Net als bij menselijke ROP-patiënten ontwikkelen zich in het rattenmodel de avasculaire gebieden tot aan de periferie van het netvlies als gevolg van onrijpe retinale vasculaire plexus (figuur 3).

In beide modellen zijn de belangrijkste parameters die meestal worden gekwantificeerd de grootte van AVA en NV. Deze parameters worden meestal geanalyseerd vanaf retinale platte mounts waarbij de endotheelcellen het label4,16 krijgen. Voorheen werd de hoeveelheid preretinale NV geëvalueerd aan de hand van retinale dwarsdoorsneden door het tellen van bloedvaten of vasculaire celkernen die zich uitstrekken tot glasvocht boven het binnenste beperkende membraan. De belangrijkste beperking van deze aanpak is dat het niet mogelijk is om de APA's te kwantificeren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Het hier beschreven protocol is goedgekeurd door de Nationale Ethische Commissie voor dieren van Finland (protocolnummer ESAVI/9520/2020 en ESAVI/6421/04.10.07/2017).

1. Proefdieren en muis OIR model inductie

OPMERKING: Gebruik tijdge gepaarde dieren, bijvoorbeeld veelgebruikte C57BL/6J muizen, om pups op dezelfde dag geboren te krijgen. Gebruik pleegdammen, bijvoorbeeld 129 stam (129S1/SvImJ of 129S3/SvIM) zogende moederdieren, om de pups te verzorgen tijdens en na de inductie van hyperoxia. U kunt er ook voor zorgen dat er extra zogende dammen beschikbaar zijn voor het geval de zogende dammen moeten worden vervangen vanwege uitputting. Beperk de nestgrootte tot 6-7 pups voor elke moeder bij gebruik van C57BL/6J muizen/dammen (als de nesten groter zijn dan dat de pups de neiging hebben om beperkte gewichtstoename te hebben)16.

  1. Noteer het gewicht van de dieren voor en na hyperoxia-inductie en op het moment van offeren.
  2. Zorg ervoor dat er voldoende voedsel op de bodem van de kooi ligt, zodat de dammen gemakkelijk toegang hebben tot voedsel.
  3. Voeg sodakalk met kleurindicator toe aan de onderkant van de kamer om overtollige CO2 op te nemen wanneer een filtratiesysteem niet wordt gebruikt.
  4. Controleer de luchtvochtigheid en temperatuur in de kamer en houd de luchtvochtigheid tussen de 40 en 65%. Verhoog indien nodig de luchtvochtigheid van de kamer door borden met water op de bodem van de kamer te plaatsen (bijv. Petri-gerechten).
  5. Kalibreer de O2 sensor met 100% O2 en normale kamerlucht.
  6. Plaats de P7 muizen in een kamer en zet het O2 niveau op 75%. Bewaar de muizen 5 dagen in de kamer, tot P12. Vermijd het openen van de kamer tijdens de hyperoxia inductie. Controleer de gasdruk van de O2 cilinder en vervang de cilinder indien nodig. Houd de dieren in de gaten tijdens de inductie.
  7. Haal de muizenkooien uit de kamer en weeg alle pups. Groepeer de pups op basis van het gewicht zodat elke experimentele groep een vergelijkbare gewichtsverdeling heeft bij pups.

2. Proefdieren en rat OIR model inductie (met behulp van semi-gesloten systeem)

OPMERKING: Gebruik tijdge gepaarde dieren om de pups op dezelfde dag geboren te krijgen. Gebruik voor rat OIR een grotere nestgrootte, ongeveer 18 pups/moeder, om voldoende NV inductie in het rattenmodel te verkrijgen. Zwembadjongen uit verschillende nesten om voldoende pups voor elk nest te krijgen.

  1. Noteer het gewicht van de dieren voor en na inductie en op het moment van offeren.
  2. Zorg ervoor dat er voldoende voedsel op de bodem van de kooi ligt, zodat de dammen gemakkelijk toegang hebben tot voedsel.
  3. Voeg sodakalk met kleurindicator toe aan de onderkant van de kamer om overtollige CO2 op te nemen wanneer het filtratiesysteem niet wordt gebruikt.
  4. Controleer de luchtvochtigheid en temperatuur in de kamer. Absorbeer extra vochtigheid (gegenereerd door meerdere ratten) door silicagel aan de onderkant van de kamer toe te voegen.
  5. Kalibreer de O2 sensor met 100% N2 en normale kamerlucht.
  6. Plaats de ratten in de kamer bij P0 (enkele uren na de geboorte). Stel het O2-niveau in op 50% en sluit de O2-cilinder 24 uur aan op de kamer. Schakel daarna de instellingen in op 10% O2 en sluit de stikstoffles (N2) gedurende 24 uur aan op de kamer. Ga 14 dagen door met fietsen tussen 50% en 10% O2.
  7. Monitor het gasverbruik en het welzijn van de dieren tijdens het onderzoek. Open de kamer tijdens de wissel tussen 50/10% O2 en voeg indien nodig meer voedsel en water toe. Verander de kooien van de dieren om de kooien tijdens de inductie schoon te maken.
  8. Haal de rattenkooien uit de kamer en weeg alle pups. Groepeer de pups op basis van het gewicht zodat elke experimentele groep een vergelijkbare gewichtsverdeling heeft in de pups.

3. Toediening van geneesmiddelen (optioneel)

OPMERKING: Veelgebruikte toedieningsroute van geneesmiddelen in OIR is via intravitreale behandeling (ivt), op P12-P14 voor muizen en op P14 voor ratten. Bepaal de behandeldag op basis van de experimentele opstelling. Wanneer meerdere nesten pups in experimenten worden gebruikt, verdeel dan de behandelingsgroepen om dieren van alle nesten te hebben. Injecteer het medicijn bij voorkeur in slechts één oog en houd het contralaterale oog als controle.

  1. Weeg de dieren af en maak identificatiemarkeringen op de staart en/of het oor.
  2. Verdoof het dier met injecteerbare anesthesie (bijvoorbeeld mengsel van ketamine en medetomidine, 30 mg/kg en 0,4 mg/kg voor muizen) of met inhalatie-anesthesie (isofluraan bij 2-3,5% isofluraan en 200-350 ml/min luchtstroom). Controleer de diepte van de anesthesie door in de tenen te knijpen. Houd het dier tijdens de behandeling op een verwarmingskussen.
  3. Breng voor lokale anesthesie een druppel pijnstiller aan op het ooglid. Open het ooglid voorzichtig met een tang voordat u het ivt uitvoert, terwijl muizen en ratten hun ogen openen rond P14. Breng een druppel pijnstillend (bijv. oxybuprocaïnehydrochloride) aan op het hoornvlies.
  4. Breng een druppel jodium aan voordat u de ivt-injectie uitvoert.
  5. Gebruik voor de ivt-injectie een glazen spuit waaraan een naald van 33-34 G is bevestigd. Druk de oogleden naar beneden en grijp de oogbol met een tang. Maak de injectie posterieure naar de limbus, ongeveer in 45° hoek naald wijzend naar oogzenuw.
  6. Vermijd het injecteren van meer dan 1,0 μL in de intravitreale ruimte. Houd de naald 30 s op zijn plaats na het injecteren van het medicijn om reflux van de geïnjecteerde oplossing te voorkomen.
  7. Onderzoek het oog (bijv. met een oogheelkunde) op eventuele complicaties, zoals bloedingen of netvliesbeschadiging, na het verwijderen van de naald. Breng na de injectie antibioticazalf aan op het hoornvlies.
    OPMERKING: Het ivt-injectievolume voor muizen moet 0,5 – 1,0 μL zijn.
  8. Draai de anesthesie om (bijvoorbeeld met een α2-antagonist voor medetomidine (2,5 mg/kg) en breng de pup terug naar de kooi. Huis het nest normaal tot het einde van het onderzoek.

4. In vivo beeldvorming en elektroretinografie (optioneel)

  1. Voer indien gewenst in vivo beeldvorming uit op levende dieren tijdens de follow-upperiode om veranderingen vast te leggen die zich in het netvlies ontwikkelen tijdens de angiogene reacties. Voer bijvoorbeeld fluoresceïne-angiografie (FA) uit of scan laserconfocale microscopie19 om de vasculatuur te visualiseren (figuur 4). Gebruik spectrale domein optische coherentietomografie (SD-OCT) om netvlieslagen in vivo te visualiseren (figuur 4).
  2. Onderzoek indien gewenst functionele veranderingen in verschillende netvliescelpopulaties na OIR-inductie met behulp van elektroretinografie (ERG) (figuur 5).

5. Weefselverzameling en voorbereiding van retinale vlakke mounts

OPMERKING: Verzamel de weefsels volgens de gewenste onderzoekshypothese. Verzamel voor muizen de monsters bijvoorbeeld bij P12 (om vaso-vernietiging na de hyperoxische fase te bestuderen) of tijdens de hypoxische periode (P13-P17). Verzamel de muis OIR-monsters op P17, het meest voorkomende tijdspunt voor bemonstering, om de piek in NV-hoeveelheid te detecteren. Verzamel bij rat OIR de monsters op P18-P21 om de hoogste hoeveelheid NV in acht te nemen (figuur 3).

  1. Weeg de dieren af voordat u bemonstert.
  2. Om de retinale vasculatuur te labelen, kunnen diep verdoofde dieren transcardieel worden doordrenkt met FITC-dextran. (Als alternatief, beits de retinale platte mounts met Isolectin later).
  3. Offer de dieren op met een overdosis anesthesiemedicijnen (bijvoorbeeld een mengsel van ketamine en medetomidine, 300 mg/kg en 4 mg/kg voor muizen) of CO 2-inademing.
  4. Verzamel de ogen van de dieren door met gebogen tang achter de oogbol te grijpen, het weefsel rond de ogen te snijden en het oog uit de baan te tillen.
  5. Incubeer de oogbollen in vers gemaakte, gefilterde 4% paraformaldehyde (in fosfaatgebufferde zoutoplossing, PBS) gedurende 1-4 uur. Verwijder het fixatief en was de oogbollen 3 x 10 min met PBS. Ontleed het netvlies onmiddellijk of bewaar ze in PBS bij +4 °C.
    LET OP: Paraformaldehyde is giftig bij inademing, in contact met de huid en bij inslikken. Lees het veiligheidsinformatieblad voordat u ermee werkt.
    OPMERKING: Oefen geen druk uit op de oogbol tijdens de bemonstering of een fase van de weefselverwerking om netvliesloslating te voorkomen, als doorsnedes van hele oogbollen worden gedaan.
  6. Bereid retinale vlakke mounts voor om de hoeveelheid NV en de grootte van ACA's te kwantificeren. U kunt ook de oogbollen/netvliezen verwerken voor histologie, of RNA- of eiwitanalyse. Ontleed het netvlies onder een stereomicroscoop met behulp van een microschaar en een tang.
    1. Plaats de oogbol in PBS om deze vochtig te houden en prik de oogbol bij limbus door met een naald (23G) en snijd rond limbus met een gebogen microschaar om iris en het hoornvlies te verwijderen.
    2. Plaats voorzichtig de punt van de schaar tussen sclera en netvlies en snijd sclera naar de oogzenuw. Doe hetzelfde aan de andere kant van de oogbol en snijd/scheur de sclera voorzichtig totdat de netvliesbeker wordt blootgesteld. Trek de lens uit de netvliesbeker en voeg PBS toe aan de beker.
    3. Verwijder alle hyaloïde vaten, glasvocht en vuil zonder het netvlies te beschadigen. Was het netvlies door PBS aan de retinale beker toe te voegen. Voer vier incisies uit (op 12, 3, 6 en 9 uur) op het netvlies met een rechte microschaar om een bloemachtige structuur te maken. Maak optioneel de sneden met chirurgisch mes voordat u de monsters monteert. Til het netvlies op met een zachte penseel op een putplaat voor vlekken.
  7. Label de retinale vasculatuur met Isolectine B4 die het oppervlak van endotheelcellen bevlekt (als de dieren niet doordrenkt waren met FITC-dextran). Incubeer het netvlies in blokkerende buffer (10% NGS + 0,5% Triton in TBS) gedurende 1 uur en was met 1% NGS + 0,1% Triton in TBS gedurende 10 minuten. Incubeer het netvlies met fluorescerende kleurstof geconjugeerd Isolectine B4 (5-10μg/ml) in 1% NGS + 0,1% Triton in TBS 's nachts bij +4 °C terwijl beschermd tegen het licht.
    OPMERKING: Label indien gewenst andere cellen zoals ontstekingscellen en pericyten met behulp van specifieke antilichamen.
  8. Was het netvlies 3x gedurende 10 minuten met 1% NGS + 0,1% Triton in TBS en til het netvlies op een microscopische dia, binnenste netvlies naar boven gericht. Spreid het netvlies voorzichtig uit met een zachte penseel en verwijder eventuele resterende hyaloïde vaten of vuil. Voeg het montagemedium toe aan een afdekslip en plaats het op het netvlies. Bewaar het netvlies bij +4 °C en bescherm tegen licht.

6. Analyse van de vlakke bevestigingen

  1. Maak foto's van de retinale platte mounts met behulp van een fluorescentiemicroscoop met 10x objectief. Focus op de oppervlakkige vasculaire plexus en op de preretinaale neovascularisatie. Maak een tegelscanafbeelding om het hele netvlies vast te leggen en de tegelscans samen te voegen
  2. Kwantificeer de beelden door de APA's, het gebied van NV en het totale netvliesgebied te meten met behulp van een beeldverwerkingsprogramma (zie Tabel met materialen).
    1. Teken de APA's en het totale netvliesgebied met behulp van een vrije hand tekengereedschap en selecteer de neovasculaire gebieden met behulp van een selectiegereedschap. De software meet de gebieden die van belang zijn voor pixels, en de AVA- en NV-gebieden (uitgedrukt in pixels) kunnen worden gebruikt om hun percentage te berekenen in verhouding tot het totale netvliesgebied. Ook zijn er enkele softwaretools beschikbaar voor het kwantificeren van NV.
      OPMERKING: Onlangs zijn een open-source, volledig geautomatiseerde programma's voor de kwantificering van kernwaarden van OIR-beelden met behulp van deep learning neurale netwerken geïntroduceerd en bieden een betrouwbaar hulpmiddel voor reproduceerbare kwantificering van retinale AVA en NV (bijv. https://github.com/uw-biomedical-ml/oir/tree/bf75f9346064f1425b8b9408ab792b1531a86c64)20,21.
  3. Als antilichamen worden gebruikt voor immunohistochemische detectie van individuele celpopulaties, kwantificeer dan het aantal bevlekte cellen (zoals microglia, figuur 2B)van de retinale platte mounts met de hand of door geautomatiseerde beeldanalysesystemen indien gewenst.

7. Statistieken

  1. Analyseer normaal gedistribueerde gegevens per Student's t-test of One-Way ANOVA, gevolgd door dunnett's of Tukey's multiple comparisons test, indien van toepassing. Gebruik niet-parametrische tests zoals Mann-Whitney U-test of Kruskal Wallis-test voor niet-normaal gedistribueerde gegevens. Beschouw verschillen statistisch significant op P < 0,05 niveau.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het belangrijkste resultaat van het model is het vasculaire fenotype: de grootte van ACA's en de hoeveelheid NV. In het muis OIR-model vindt de vaso-vernietiging plaats in het centrale netvlies (figuur 2A), terwijl het zich in het rattenmodel ontwikkelt in de periferie, d.w.z. vergelijkbaar met het menselijke ROP22 (figuur 3A). Dit komt omdat de oppervlakkige vasculaire plexus zich al heeft ontwikkeld wanneer muizen worden blootgesteld aan hyperoxia, terwijl in het rattenmodel het netvlies avasculaire is op het moment van OIR-inductie (P0). Preretinale neovascularisatie ontwikkelt zich in de buurt van de avasculaire gebieden, d.w.z. het centrale netvlies bij muizen en de periferie bij ratten (figuur 2A en figuur 3A).

Histologische analyse met behulp van dwarsdoorsneden of vlakke mounts kan worden uitgevoerd om morfologische veranderingen in OIR-netvlies of de aanwezigheid van celtypen van belang te evalueren, bijvoorbeeld ontstekingscellen (figuur 2B). Naast het netvlies kunnen hele oog- of glasvochtmonsters worden verzameld voor verdere gen- en eiwitexpressieanalyses op verschillende tijdstippen tijdens het OIR-model. Gen- of eiwitexpressieniveaus kunnen worden geanalyseerd met standaardmethoden, zoals RT-qPCR of western blotting.

Optioneel kan niet-invasieve in vivo beeldvorming worden uitgevoerd tijdens de OIR-follow-upperiode. Retinale en hyaloïde vasculatuur kunnen worden gevisualiseerd met FA (figuur 4A). SD-OCT kan worden gebruikt om structurele veranderingen in het netvlies te evalueren (figuur 4B). Functionele veranderingen in het netvlies kunnen worden gemeten met ERG (figuur 5).

Remmers van vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) worden vaak gebruikt bij de behandeling van menselijke angiogene oogziekten. Dus, anti-VEGF wordt vaak gebruikt als een referentieverbinding in OIR. Aflibercept, dat werkt als een oplosbare VEGF-val, remt zowel NV als fysiologische revascularisatie in OIR in zowel hoge als lage doses (geïnjecteerd bij P14). OIR-ogen geïnjecteerd op P14 met een hoge dosis aflibercept hadden nog grotere retinale APA's dan onbehandelde ogen (figuur 6). Dit suggereert dat aflibercept blokkeert ook fysiologische retinale revascularisatie aangedreven door hypoxie. Zowel muis- als rattenmodellen kunnen worden gebruikt om het effect van verschillende anti-angiogene middelen op retinale NV en fysiologische revascularisatie van het netvlies te evalueren (figuur 3B en figuur 6).

Figure 1
Figuur 1: Grafisch overzicht van een standaard OIR-studieontwerp voor muizen en ratten. (A) Muis OIR model werd geïnduceerd door de muizen bloot te stellen aan 75% O2 van P7 tot P12 en terug te keren naar de normale kamerlucht. De piek van preretinaal NV werd gezien op P17, wat meestal het bemonsteringspunt voor het experiment is. (B) Het rat OIR-model werd geïnduceerd door de ratten bloot te stellen aan afwisselend O2-niveaus (50/10 % O2) van P0 tot P14 en terug te keren naar normoxische omstandigheden. Ratten worden meestal geofferd op P20, toen de hoeveelheid NV piekte. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Vasculair fenotype in het muis OIR model. Muis OIR model is gegenereerd zoals beschreven in figuur 1. (A) De oppervlakkige vasculaire plexus ontwikkelde zich bij normale muizen, terwijl de OIR-muizen werden blootgesteld aan 75% O2 van P7 tot P12. Gedurende deze tijd ontwikkelde vasculaire vernietiging zich in het centrale netvlies (blauw gemarkeerd op P12 en P17 in de gekwantificeerde beelden). Muizen werden teruggebracht naar de normale kamerlucht en het avasculaire netvlies werd hypoxisch, wat leidde tot functionele hergroei van bloedvaten in het netvlies en pathologische NV (rood gemarkeerd op P17 in het onderste paneel). Preretinale neovasculaire plukjes ontwikkelden zich tussen de vasculaire en avasculaire gebieden in het centrale netvlies. Het aantal NV piekte op P17 en ging daarna achteruit. Retina werd volledig gerevasculariseerd en de NV regresseerde rond P24-P25. (B) Een voorbeeld van immunohistochemische kleuring van retinale vlakke mount met retinale Iba-1 bevlekte microglia (groen) en GS-IB4 bevlekte bloedvaten (rood) op P12 en P17. (C) Doorsnede van een muis OIR oog op P17, waar preretinale plukjes (pijlen) ontkiemen in de richting van het glasvocht. Ook werd het dunner worden van de binnenste kernlaag (INL) en de buitenste plexiforme laag (OPL) gezien. Schaalstaven zijn 1 mm in A, 50 μm in B en 100 μm in C. ILM = binnenste beperkende membraan, GCL = ganglioncellaag, IPL = binnenste plexiforme laag, INL = binnenste kernlaag, OPL = buitenste plexiforme laag, ONL = buitenste kernlaag, RPE = retinale pigmentepeeel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Vasculair fenotype en de ontwikkeling ervan in het rat OIR-model. (A) Avasculaire gebieden (gemarkeerd in blauw) en NV (gemarkeerd in rood) ontwikkelden zich in de periferie van het netvlies, vergelijkbaar met menselijke ROP. (B) APA's werden gezien in OIR retinas, maar niet in normoxische controles. (C) De kwantificering van het nv-gebied vertoonde een trend naar een piek in het bedrag van de NV op P20, maar het verschil was niet statistisch significant in vergelijking met P18 en P21 in OIR. (Student's t-test, tussen tijd afgestemd normoxic en OIR retinas, ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0.001, beide ogen van de dieren uitgezet in de grafiek). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: In vivo beeldvorming met fluoresceïne-angiografie (FA) en spectrale domein optische coherentietomografie (SD-OCT) in het rat OIR-model. (A) Vasculaire tortuositeit (pijlpunten) werd gezien op de beelden genomen vanaf het centrale netvlies (bovenste rij) bij P18 en P20 bij OIR-ratten in vergelijking met normoxische P19-ratten. NV (pijlen) en APA's (sterretje) ontwikkelden zich tot de periferie van het netvlies (middelste rij) zoals te zien in P18 en P20 OIR retinas. Regresserende hyaloïde vaten (onderste rij) werden gevangen door FA. (B) Bloedvatgroei naar het glasvocht werd waargenomen als een verdikking op de zenuwvezellaag (NFL) en ganglioncellaag (GCL) in het OIR-netvlies (pijl). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Functionaliteit van retinale neuronen kan worden gemeten met behulp van flash-elektroretinografie (fERG). (A) a-golven werden afgeleid van retinale kegel- en staaffotoreceptoren en hun amplitudes waren aanzienlijk verminderd in het rat OIR-model. Het effect nam toe met een hogere lichtintensiteit, wat suggereert dat de defecten voornamelijk de functies van kegelfotoreceptor beïnvloedden. (B) B-wave amplitudes van OIR-dieren werden verlaagd in vergelijking met normoxische controles. B-golven zijn afgeleid van ON-bipolaire cellen en Müller cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Intravitreaal geïnjecteerd PBS vermindert NV en APA's in het muis OIR model. (A) Representatieve beelden van retinale platte mounts van onbehandelde, en aflibercept-behandelde (20 μg bij P14) en PBS geïnjecteerd OIR ogen op P17. Hoge dosis aflibercept (20 μg) verhoogde de grootte van APA's met 47% (beschreven in wit) en remde NV met 98% (pijlen) in vergelijking met onbehandelde controles. PBS-injectie verlaagde APA's met 31% en NV met 42% in vergelijking met onbehandelde controles. Ook veroorzaakte punctie van de sclera die op ivt leek vergelijkbare effecten als ivt-injectie van PBS, maar de verschillen waren niet statistisch significant. Pijlpuntpunten op hyaloïde vaten die niet zijn verwijderd tijdens de dissectie. (Eenrichtings-ANOVA, * p ≤ 0,05; ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001, **** p ≤ 0,0001). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De ernst van het fenotype van de ziekte is afhankelijk van zowel de stam als zelfs de leverancier in zowel muis- als rat OIR-modellen23. Dit suggereert dat er een brede genotypische variabiliteit is in de pathologieontwikkeling. Over het algemeen ontwikkelen gepigmenteerde knaagdieren een ernstiger fenotype dan de albino knaagdieren. Bijvoorbeeld, de retinale vasculatuur van albino BALB/c revasculariseert snel na hyperoxia en ontwikkelt NV helemaal niet24. Evenzo vertonen gepigmenteerde Bruine Noorse ratten bij ratten met pigment een ernstigere pathologie dan albino Sprague Dawley (SD) ratten25. SD-ratten zijn veelgebruikte stammen en binnen de stam zijn leveranciersgerelateerde verschillen in OIR-fenotype gemeld. SD-ratten uit Charles River produceren bijvoorbeeld aanzienlijk meer NV dan ratten uit Harlan of Zivic-Miller23. C3H/HeJ muizen, op hun beurt, die een mutatie hebben in het retinale degeneratie 1 (Rd1) gen, dunne retina's hebben en nv26niet ontwikkelen . Vanwege deze redenen en de beschikbaarheid van transgene muizenlijnen is de inteelt C57BL/6J de meest gebruikte muizenstam voor OIR-studies. Er is echter een vrij hoge mortaliteit onder de C57BL/6J-dammen als gevolg van de hyperoxische blootstelling, dus het welzijn van de muizen moet worden overwogen bij het ontwerpen van de studie en worden gecontroleerd tijdens de experimenten. Bovendien wordt verhoogde fotoreceptorschade waargenomen bij C57BL/6 muizen in vergelijking met BALB/c muizen27.

Om het welzijn van de muizen en het voortbestaan van de moederdieren en pups te garanderen, moet de nestgrootte klein worden gehouden (6-7 pups/moeder). Dit is vooral belangrijk bij het gebruik van C57BL/6 muizen, die gevoeliger zijn voor hyperoxische stress27,28. Bovendien moet gemakkelijk toegankelijk ondersteunend voedsel (op de bodem van de kooi worden geplaatst) aan de muizen worden verstrekt. Sommige onderzoekers gebruiken surrogaatdammen om de dammen in de kamer te vervangen door gezonde dammen na de zuurstofinductie. De meeste onderzoekers gebruiken echter alleen surrogaten als de dam uitgeput is22,29. Draagmoeders worden aanbevolen om te worden gebruikt als grotere nestgroottes worden gebruikt. Er is gepubliceerd dat 129S3/SvIM muizen meer NV dan C57BL/6 produceren en de veranderingen veroorzaakt door verschillende zuurstofniveaus beter in stand houden28. Opgemerkt moet worden dat de in OIR gebruikte moederdieren na de OIR-inductie onvruchtbaar zijn en niet voor verdere fokdoeleinden mogen worden gebruikt22. Postnatale gewichtstoename van de pups beïnvloedt de ernst van OIR pathologie. Pups met een slechte postnatale gewichtstoename (<5 g bij P17) vertonen vertraagde expressie van VEGF en dus langdurige fase van retinopathie in vergelijking met pups met normale (5 - 7,5 g bij P17) of uitgebreide gewichtstoename (>7,5 g bij P17)29. Bovendien vertonen muizenjongen met een gewicht van meer dan 5 g op P7 geen vaso-vernietigde gebieden na OIR-inductie30. Het is dus belangrijk om de pups te wegen tijdens het experiment. Het gecontralaterale onbehandelde oog kan worden gebruikt als een interne controle om ervoor te zorgen dat de voedingstoestand van de muizen de resultaten niet beïnvloedt. De situatie is vergelijkbaar bij ratten; hoe kleiner de pups zijn, hoe ernstiger OIR fenotype ze ontwikkelen31. Daarom wordt een grote nestgrootte (ongeveer 18 pups) aanbevolen om te worden gebruikt voor het rat OIR-model.

De OIR-modelinductie kan worden gedaan met behulp van een volledig gesloten systeem, waarbij er een gesloten circuit is met een pomp die de lucht door een filtersysteem (sodakalk en actieve kool) terug naar de kamer circuleert. Een andere optie is een semi-gesloten systeem, waarbij ventilatie ervoor zorgt dat de overtollige metabolieten uit de kamer worden verwijderd. Om ervoor te zorgen dat overtollige CO2 wordt verwijderd, kan sodakalk (mengsel van calciumhydroxide met natriumhydroxide of kaliumhydroxide) op de bodem van de kamer worden geplaatst. Het verwijderen van CO2 is verplicht omdat de hoge CO2-niveaus het fenotype bij ratten verergeren32. Men moet ook onthouden om de zuurstofsensor van de kamer regelmatig opnieuw te kalibreren, omdat ze de neiging hebben om na verloop van tijd af te drijven en een verkeerde zuurstofconcentratie kunnen bieden dan de beoogde.

Er is gemeld dat voertuiginjectie (PBS) alleen of zelfs alleen de punctie in de intravitreale ruimte een effect heeft op de revascularisatiesnelheid en de hoeveelheid NV (figuur 6)33,34,35,36. Er is gespeculeerd of het effect van PBS/voertuiginjectie te wijten zou kunnen zijn aan veranderingen in de intraoculaire druk tijdens de injectie , of als gevolg van letsel aan oogstructuren die de niveaus van angiogene groeifactoren verhoogt, waaronder pigmentepeeel-afgeleide groeifactor34,37. Bovendien is aangetoond dat alleen een pilot subretinale injectie (punctie naar de subretinale ruimte) effecten heeft op het vasculaire en functionele fenotype in OIR in vergelijking met de onbehandelde ratten38. Deze resultaten benadrukken het belang van goede negatieve controles in de OIR-studies of zelfs systemische toediening van geteste verbindingen, evenals groot genoeg n-nummers in elke studiegroep. Het feit dat voertuiginjectie inderdaad de revascularisatiesnelheid in het netvlies verbetert, is een belangrijke beperkende factor, omdat de revascularisatiesnelheid en de vorming van pathologische preretinale plukjes onderling gerelateerd zijn in het OIR-model: als de revascularisatiesnelheid wordt versneld, leidt dit tot de compenserende downregulatie van neovasculaire plukjes en vice versa. Zo worden beide primaire uitkomstmaten van het OIR-model beïnvloed door voertuiginjectie.

VEGF-remmers hebben een revolutie teweeggebracht in de behandeling AMD en dr. OIR model werd gebruikt om hun werkzaamheid preklinisch aan te tonen. Met betrekking tot VEGF-remmers in OIR toonde een studie waarin verschillende anti-VEGFs en anti-PlGFs (placentagroeifactor) (geïnjecteerd op P12) werden vergeleken, aan dat anti-VEGF alleen leidde tot kleine avasculaire gebieden, terwijl met anti-PIGF behandelde ogen grotere avasculaire gebieden hadden33. Aflibercept had de grootste APA's in vergelijking met andere medicamenteuze behandelingen33. Aflibercept is bekend dat zowel VEGF als PlGF39binden, het kan zijn dat het remmen van PlGF in OIR leidt tot blokkering van fysiologische angiogenese.

Niet-invasieve in vivo beeldvorming biedt een hulpmiddel voor het monitoren van retinale vasculatuur40 en retinale lagen en structuur tijdens de follow-upperiode. Met behulp van FA kunnen parameters zoals vasculaire dichtheid en arteriële tortuositeit en veneuze dilatatie (plusziekte genoemd, figuur 4A)worden gemeten40,41. SD-OCT kan worden gebruikt voor het evalueren van structurele veranderingen en het meten van de netvliesdikte tijdens de follow-upperiodeOIR 42,43. ERG wordt gebruikt om de functionele veranderingen in het netvlies te meten. Verschillende celtypen produceren elektrische potentiaal na lichtprikkel, en deze signalen of "golven" kunnen worden gemeten met ERG. Fotoreceptoren produceren de negatieve a-golf, en ON bipolaire cellen en Müller cellen zijn voornamelijk verantwoordelijk voor de b-wave44. Verlies van netvliesfunctie is typisch bij OIR-muizen en ratten45,46 ( figuur5). Langdurige veranderingen blijven bestaan in het netvlies en zowel functionele veranderingen als veranderingen in het eiwitgehalte zijn gemeld in het OIR-netvlies, zelfs na revascularisatie en NV-regressie34,47.

Om de retinale vasculatuur te visualiseren, kunnen de levende muizen worden doordrenkt met FITC-gelabelde dextran of de retinale platte mounts kunnen worden gekleurd met fluorescerende kleurstof met het label Isolectine B4. Men moet het verschil tussen de fluorescerende kleurstoffen begrijpen; de perfusie met FITC-dextrans etiketteert alleen het lumen van de vaten, terwijl Isolectine B4 het oppervlak van endotheelcellen bevlekt. Functionele bloedvaten met de juiste lumen worden dus alleen gevisualiseerd met FITC-dextran perfusie, terwijl het totale oppervlak van NV groter lijkt in Isolectine B4 bevlekte netvliezen dan bij FITC-dextran doordrenkte dieren, omdat Isolectine B4 in wezen zelfs endotheelcellen oppikt die nog geen functionele lumen hebben gevormd48. Een recentere optie om hele retina/oogbal in 3D-formaat te visualiseren is deep tissue imaging door twee-foton fluorescentiemicroscopie(49).

Het knaagdier OIR-model, evenals de diermodellen in het algemeen, vertegenwoordigen slechts gedeeltelijk de kenmerken van menselijke ziekten. Het belangrijkste verschil met betrekking tot OIR is dat retinale neovascularisatie niet geassocieerd is met fibrose bij knaagdier OIR, terwijl retinale neovascularisatie vaak leidt tot fibrovasculaire proliferatie bij menselijke neovasculaire netvliesaandoeningen. Bovendien kunnen de aandoeningen die OIR versus menselijke ziekte veroorzaken bijna tegenovergesteld zijn. De te vroeg geboren pasgeborenen met ROP hebben aanvullende zuurstof met ademhalingsondersteuning nodig, ervaren vaak intermitterende hypoxemische en hyperoxemische episodes veroorzaakt door terugkerende apneu, maar ze worden niet blootgesteld aan hoge niveaus van zuurstof. Om de permanente schade te minimaliseren, worden hoge fracties van geïnspireerde O2 vermeden. In dat opzicht lijkt noch het muismodel met constante blootstelling aan 75% O2 gedurende 5 dagen, noch het 50/10 ratmodel op pathogenese van menselijke ROP. Verder zijn er ook verschillen tussen de rat en de muis OIR modellen. De neovascularisatie regresseert in het muismodel met het herstellen van normale vaten door P24, terwijl de toestand erger wordt in het rat OIR-model (vergelijkbaar met het menselijke ROP). Hoewel het rat OIR-model klinisch relevante kenmerken van ROP vertoont, zoals de vertraagde vasculaire ontwikkeling van het netvlies en de daaropvolgende pathologische neovascularisatie, wordt het gebruik ervan beperkt door bijna volledige afwezigheid van transgene rattenstammen, hogere onderhoudskosten en minder NV dan in het muis OIR-model.

Samen, ondanks de verschillen tussen menselijke ischemische proliferatieve retinopathieën en knaagdier OIR-modellen, maakt het gemak waarmee de NV kan worden geïnduceerd, in combinatie met eenvoudige visualisatie en kwantificering van het netvlies, de OIR-modellen populair om de moleculaire mechanismen en potentiële therapeutische middelen voor ischemische proliferatieve retinopathieën te bestuderen. Interessant is dat de blootstelling aan hyperoxia in muis OIR-model ook bronchopulmonale dysplasie induceert, een andere ziekte veroorzaakt door aanvullende zuurstoftherapie bij menselijke premature zuigelingen, waaruit blijkt dat het OIR-model kan worden gebruikt om nieuwe doelen voor zowel ROP als bronchopulmonale dysplasie tegelijkertijd te verkennen50.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs Maria Vähätupa, PhD, Niina Jääskeläinen, Marc Cerrada-Gimenez, PhD en Rubina Thapa zijn werknemers van Experimentica Ltd.

De auteur Giedrius Kalesnykas, PhD, is een werknemer (President en Chief Executive Officer) en aandeelhouder van Experimentica Ltd. die contractonderzoeksdiensten aanbiedt met behulp van preklinische OIR-modellen die in dit artikel worden gebruikt.

Tero Järvinen, M.D., PhD, en Hannele Uusitalo-Järvinen, M.D., PhD, hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Wij danken Marianne Karlsberg, Anne Mari Haapaniemi, Päivi Partanen en Anne Kankkunen voor de uitstekende technische ondersteuning. Dit werk werd gefinancierd door de Academy of Finland, Päivikki en Sakari Sohlberg Foundation, Tampere Tuberculosis Foundation, Finnish Medical Foundation, Pirkanmaa Hospital District Research Foundation en het Tampere University Hospital Research Fund.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
33 gauge, Small Hub RN Needle Hamilton Company 7803-05, 10mm, 25°, PS4 For intravitreal injection
Adobe Photoshop Adobe Inc. For image analysis
Air pump air100 Eheim GmbH & Co. KG. 143207 For inhalation anaesthesia
Anaesthesia unit 410 AP Univentor Ltd. 2360309 For inhalation anaesthesia
AnalaR NORMAPUR Soda lime VWR International Ltd 22666.362 For CO2 control during model induction
Attane Vet 1000 mg/g VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY vnr 17 05 79 For inhalation anaesthesia
Brush For preparation of flat mounts
Carbon dioxide gas For sacrifice
Celeris D430 ERG system Diagnosys LLC 121 For in vivo ERG
Cell culture dishes Greiner Bio-One International GmbH 664 160 For preparation of flat mounts
Cepetor Vet 1 mg/mL VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY vnr 08 78 96 For anaesthesia
Cover slips Thermo Fisher Scientific 15165452 For preparation of flat mounts
O2 Controlled InVivo Cabinet, Aninal Filtrarion System and Dehumidifier Coy Laboratory Products Closed system for disease model induction, optional for semi-closed system
E702 O2 sensor BioSphenix, Ltd. E207, 1801901 For oxygen level measurement
Envisu R2200 Spectral Domain Optical Coherence Tomograph (SD-OCT) Bioptigen, Inc. BPN000668 For in vivo imaging
Eye spears Beaver-Visitec International, Inc. 0008685 For intravitreal injection and in vivo imaging
Flexilux 600LL Cold light source Mikron 11140 For intravitreal injection or tissue collection
Fluorescein sodium salt Merck KGaA F6377-100G For in vivo imaging
Gas Exhaust unit (+Double 3-way valve, mouse and rat face masks, UNOsorb filter) UNO Roestvaststaal BV GEX 17015249 For inhalation anaesthesia
Glass syringe, Model 65 RN Hamilton Company 7633-01 For intravitreal injection
HRA2 Retina angiograph (FA) Heidelberg Engineering GmbH Spec-KT-05488 For in vivo imaging
Isolectin GS-IB4, Alexa Fluor 488 Conjugate Thermo Fisher Scientific I21411 For labeling retinal vasculature on flat mounts
Ketaminol Vet 50 mg/mL Intervet International B.V. vnr 51 14 85 For anaesthesia
Medicinal Oxygen gas For disease model induction
Mice C57BL/6JRj Janvier Labs Also other strains possible
Microscope slides Thermo Fisher Scientific J1800AMNZ For preparation of flat mounts
Minims Povidone Iodine 5% (unit) Bausch & Lomb U.K Limited vnr 24 11 304 For intravitreal injection
Nitrogen gas For disease model induction (rat)
Oftan Chlora 10 mg/g Santen Pharmaceutical Co., Ltd. vnr 55 01 11 For intravitreal injection
Oftan Metaoksedrin 100 mg/ml Santen Pharmaceutical Co., Ltd. vnr 55 03 43 For in vivo ERG
Oftan Obucain 4 mg/ml Santen Pharmaceutical Co., Ltd. vnr 55 03 50 For intravitreal injection
Oftan Tropicamid 5 mg/ml Santen Pharmaceutical Co., Ltd. vnr 04 12 36 For in vivo imaging
ProOx Model 110 O2 controller and animal chamber BioSphenix, Ltd. 803 For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system
ProOx Model P360 O2 controller and animal chamber BioSphenix, Ltd. 538 For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system
Rats CD(SD) Charles River Laboratories Also other strains possible
Revertor 5 mg/mL VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY vnr 13 04 97 For anaesthesia reversal
Silica gel For humidity control during model induction
Systane Ultra 10ml Alcon Tamro 2050250 For hydration of the eye
Systane Ultra unit 0.7ml Alcon Tamro 2064871 For hydration of the eye
Transfer pipette Thermo Fisher Scientific 1343-9108 For preparation of flat mounts
VENTI-Line VL 180 PRIME Drying oven VWR VL180S 170301 For drying silica gel
VisiScope SZT350 Stereomicroscope VWR 481067 For intravitreal injection or tissue collection

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chase, J. The evolution of retinal vascularization in mammals. A comparison of vascular and avascular retinae. Ophthalmology. 89 (12), 1518-1525 (1982).
  2. Sun, Y., Smith, L. E. H. Retinal vasculature in development and diseases. Annual Review of Vision Science. 4, 101-122 (2018).
  3. Vähätupa, M., Järvinen, T. A. H., Uusitalo-Järvinen, H. Exploration of oxygen-induced retinopathy model to discover new therapeutic drug targets in retinopathies. Frontiers in Pharmacology. 11, 873 (2020).
  4. Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (6), 2813-2826 (2010).
  5. Benjamin, L. E., Hemo, I., Keshet, E. A plasticity window for blood vessel remodelling is defined by pericyte coverage of the preformed endothelial network and is regulated by PDGF-B and VEGF. Development. 125 (9), 1591-1598 (1998).
  6. Bashinsky, A. L. Retinopathy of prematurity. North Carolina Medical Journal. 78 (2), 124-128 (2017).
  7. Ludwig, C. A., Chen, T. A., Hernandez-Boussard, T., Moshfeghi, A. A., Moshfeghi, D. M. The epidemiology of retinopathy of prematurity in the united states. Ophthalmic Surgery, Lasers and Imaging Retina. 48 (7), 553-562 (2017).
  8. Hartnett, M. E. Pathophysiology and mechanisms of severe retinopathy of prematurity. Ophthalmology. 122 (1), 200-210 (2015).
  9. Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: From development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
  10. Szewczyk, T. S. Retrolental fibroplasia; etiology and prophylaxis. American Journal of Ophthalmology. 35 (3), 301-311 (1952).
  11. Szewczyk, T. S. Retrolental fibroplasia and related ocular diseases; classification, etiology, and prophylaxis. American Journal of Ophthalmology. 36 (10), 1336-1361 (1953).
  12. Gerschman, R., Nadig, P. W., Snell, A. C. Jr, Nye, S. W. Effect of high oxygen concentrations on eyes of newborn mice. American Journal of Physiology. 179 (1), 115-118 (1954).
  13. Gyllnesten, L. J., Hellström, B. E. Experimental approach to the pathogenesis of retrolental fibroplasia. III. changes in the eye induced by exposure of newborn mice to general hypoxia. British Journal of Ophthalmology. 39 (7), 409-415 (1955).
  14. Curley, F. J., Habegger, H., Ingalls, T. H., Philbrook, F. R. Retinopathy of immaturity in the newborn mouse after exposure to oxygen imbalances. American Journal of Ophthalmology. 42 (3), 377-392 (1956).
  15. Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).
  16. Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: A model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).
  17. Penn, J. S., Tolman, B. L., Lowery, L. A. Variable oxygen exposure causes preretinal neovascularization in the newborn rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 34 (3), 576-585 (1993).
  18. Penn, J. S., Henry, M. M., Tolman, B. L. Exposure to alternating hypoxia and hyperoxia causes severe proliferative retinopathy in the newborn rat. Pediatric Research. 36 (6), 724-731 (1994).
  19. Ritter, M. R., et al. Three-dimensional in vivo imaging of the mouse intraocular vasculature during development and disease. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (9), 3021-3026 (2005).
  20. Xiao, S., et al. Fully automated, deep learning segmentation of oxygen-induced retinopathy images. Journal of Clinical Investigation Insight. 2 (24), 97585 (2017).
  21. Mazzaferri, J., Larrivee, B., Cakir, B., Sapieha, P., Costantino, S. A machine learning approach for automated assessment of retinal vasculature in the oxygen induced retinopathy model. Scientific Reports. 8 (1), 22251-22257 (2018).
  22. Kim, C. B., D'Amore, P. A., Connor, K. M. Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).
  23. Barnett, J. M., Yanni, S. E., Penn, J. S. The development of the rat model of retinopathy of prematurity. Documenta Ophthalmologica. 120 (1), 3-12 (2010).
  24. Ritter, M. R., et al. Myeloid progenitors differentiate into microglia and promote vascular repair in a model of ischemic retinopathy. Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3266-3276 (2006).
  25. Floyd, B. N., et al. Differences between rat strains in models of retinopathy of prematurity. Molecular Vision. 11, 524-530 (2005).
  26. Scott, A., Powner, M. B., Fruttiger, M. Quantification of vascular tortuosity as an early outcome measure in oxygen induced retinopathy (OIR). Experimental Eye Research. 120, 55-60 (2014).
  27. Walsh, N., Bravo-Nuevo, A., Geller, S., Stone, J. Resistance of photoreceptors in the C57BL/6-c2J, C57BL/6J, and BALB/cJ mouse strains to oxygen stress: Evidence of an oxygen phenotype. Current Eye Research. 29 (6), 441-447 (2004).
  28. Chan, C. K., et al. Differential expression of pro- and antiangiogenic factors in mouse strain-dependent hypoxia-induced retinal neovascularization. Laboratory Investigation. 85 (6), 721-733 (2005).
  29. Stahl, A., et al. Postnatal weight gain modifies severity and functional outcome of oxygen-induced proliferative retinopathy. American Journal of Pathology. 177 (6), 2715-2723 (2010).
  30. Liegl, R., Priglinger, C., Ohlmann, A. Induction and readout of oxygen-induced retinopathy. Methods in Molecular Biology. 1834, 179-191 (2019).
  31. Holmes, J. M., Duffner, L. A. The effect of postnatal growth retardation on abnormal neovascularization in the oxygen exposed neonatal rat. Current Eye Research. 15 (4), 403-409 (1996).
  32. Holmes, J. M., Zhang, S., Leske, D. A., Lanier, W. L. The effect of carbon dioxide on oxygen-induced retinopathy in the neonatal rat. Current Eye Research. 16 (7), 725-732 (1997).
  33. Heiduschka, P., Plagemann, T., Li, L., Alex, A. F., Eter, N. Different effects of various anti-angiogenic treatments in an experimental mouse model of retinopathy of prematurity. Journal of Clinical and Experimental Ophthalmology. 47 (1), 79-87 (2019).
  34. Tokunaga, C. C., et al. Effects of anti-VEGF treatment on the recovery of the developing retina following oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1884-1892 (2014).
  35. Tokunaga, C. C., Chen, Y. H., Dailey, W., Cheng, M., Drenser, K. A. Retinal vascular rescue of oxygen-induced retinopathy in mice by norrin. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (1), 222-229 (2013).
  36. Vähätupa, M., Uusitalo-Järvinen, H., Järvinen, T. A. H., Uusitalo, H., Kalesnykas, G. Intravitreal injection of PBS reduces retinal neovascularization in the mouse oxygen-induced retinopathy model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. Abstract Issue. 57 (12), 3649 (2016).
  37. Penn, J. S., et al. Angiostatic effect of penetrating ocular injury: Role of pigment epithelium-derived factor. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (1), 405-414 (2006).
  38. Becker, S., Wang, H., Stoddard, G. J., Hartnett, M. E. Effect of subretinal injection on retinal structure and function in a rat oxygen-induced retinopathy model. Molecular Vision. 23, 832-843 (2017).
  39. Sophie, R., et al. Aflibercept: A potent vascular endothelial growth factor antagonist for neovascular age-related macular degeneration and other retinal vascular diseases. Biological Therapy. 2, (2012).
  40. Mezu-Ndubuisi, O. J. In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery. Optometry and Vision Science. 93 (10), 1268-1279 (2016).
  41. Mezu-Ndubuisi, O. J., et al. In vivo retinal vascular oxygen tension imaging and fluorescein angiography in the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6968-6972 (2013).
  42. Dailey, W. A., et al. Ocular coherence tomography image data of the retinal laminar structure in a mouse model of oxygen-induced retinopathy. Data in Brief. 15, 491-495 (2017).
  43. Mezu-Ndubuisi, O. J., Taylor, L. K., Schoephoerster, J. A. Simultaneous fluorescein angiography and spectral domain optical coherence tomography correlate retinal thickness changes to vascular abnormalities in an in vivo mouse model of retinopathy of prematurity. Journal of Ophthalmology. 2017, 9620876 (2017).
  44. Pinto, L. H., Invergo, B., Shimomura, K., Takahashi, J. S., Troy, J. B. Interpretation of the mouse electroretinogram. Documenta Ophthalmologica. 115 (3), 127-136 (2007).
  45. Nakamura, S., et al. Morphological and functional changes in the retina after chronic oxygen-induced retinopathy. PLoS One. 7 (2), 32167 (2012).
  46. Dorfman, A. L., Polosa, A., Joly, S., Chemtob, S., Lachapelle, P. Functional and structural changes resulting from strain differences in the rat model of oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (5), 2436-2450 (2009).
  47. Vähätupa, M., et al. SWATH-MS proteomic analysis of oxygen-induced retinopathy reveals novel potential therapeutic targets. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (8), 3294-3306 (2018).
  48. Campos, M., Amaral, J., Becerra, S. P., Fariss, R. N. A novel imaging technique for experimental choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (12), 5163-5170 (2006).
  49. Yanez, C. O., et al. Deep Vascular Imaging in Wounds by Two-Photon Fluorescence Microscopy. PLos One. 8 (7), 67559 (2013).
  50. Wickramasinghe, L. C., et al. Lung and eye disease develop concurrently in supplemental oxygen-exposed neonatal mice. American Journal of Pathology. , 30287 (2020).

Tags

Geneeskunde angiogenese neovascularisatie zuurstofgeïnduceerde retinopathie OIR hypoxie retinopathie van prematuriteit ROP diabetische retinopathie intravitreale injectie beeldanalyse kunstmatige intelligentie AI
Zuurstofgeïnduceerde retinopathiemodel voor ischemische netvliesziekten bij knaagdieren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vähätupa, M.,… More

Vähätupa, M., Jääskeläinen, N., Cerrada-Gimenez, M., Thapa, R., Järvinen, T., Kalesnykas, G., Uusitalo-Järvinen, H. Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents. J. Vis. Exp. (163), e61482, doi:10.3791/61482 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter