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Modèle de rétinopathie induite par l’oxygène pour les maladies rétiniennes ischémiques chez les rongeurs

Published: September 16, 2020 doi: 10.3791/61482
Automatic Translation
1,2, 2, 2, 2, 1, 2, 1,3
1Faculty of Medicine and Health Technology, Tampere University & Tampere University Hospital, 2Experimentica Ltd, 3Eye Centre, Tampere University Hospital

Summary

La rétinopathie induite par l’oxygène (OIR) peut être utilisée pour modéliser les maladies rétiniennes ischémiques telles que la rétinopathie de la prématurité et la rétinopathie diabétique proliférative et pour servir de modèle pour des études de preuve de concept dans l’évaluation des médicaments antiangiogéniques pour les maladies néovasculaires. OIR induit une néovascularisation robuste et reproductible dans la rétine qui peut être quantifiée.

Abstract

Un des modèles couramment utilisés pour les rétinopathies ischémiques est le modèle de rétinopathie induite par l’oxygène (OIR). Ici, nous décrivons des protocoles détaillés pour l’induction du modèle OIR et ses readouts chez les souris et les rats. La néovascularisation rétinienne est induite dans l’OIR en exposant les petits rongeurs soit à l’hyperoxie (souris) soit en alternant les niveaux d’hyperoxie et d’hypoxie (rats). Les principales lectures de ces modèles sont la taille des zones néovasculaires (NV) et avasculaires (AVA) dans la rétine. Ce modèle in vivo préclinique peut être utilisé pour évaluer l’efficacité des médicaments anti-angiogéniques potentiels ou pour aborder le rôle de gènes spécifiques dans l’angiogenèse rétinienne en utilisant des animaux génétiquement manipulés. Le modèle a une certaine tension et la variation spécifique du fournisseur dans l’induction OIR qui doit être pris en considération lors de la conception des expériences.

Introduction

Des modèles expérimentaux fiables et reproductibles sont nécessaires pour étudier la pathologie derrière les maladies oculaires angiogéniques et pour développer de nouvelles thérapeutiques à ces maladies dévastatrices. L’angiogenèse pathologique est la marque de fabrique de la dégénérescence maculaire liée à l’âge humide (DMLA) et de nombreuses maladies rétiniennes ischémiques dont la rétinopathie de la prématurité (ROP), la rétinopathie diabétique proliférante (DP) et l’occlusion rétinienne des veines (RVO)1,2,3,4. Les rétines humaines et rongeurs suivent un modèle de développement similaire, car la rétine humaine et la rétine des rongeurs sont parmi les derniers tissus vascularisés. Avant que la vascularisation rétinienne se soit complètement développée, la rétine reçoit son approvisionnement en éléments nutritifs de la vascularisation hyaloïde, qui, à son tour, régresse lorsque la vascularisation rétiniennecommence à se développer 1,2. Chez l’homme, le développement vasculaire rétinien est achevé avant la naissance, tandis que chez les rongeurs la croissance de la vascularisation rétinienne se produit après la naissance. Puisque le développement vasculaire rétinien se produit postnatally chez les rongeurs, il fournit un système modèle idéal pour étudier l’angiogenèse2,3. Les rongeurs nouveau-nés ont une rétine avasculaire qui se développe progressivement jusqu’à ce que le développement complet de la rétine vasculaire soit atteint à la fin de la troisième semainepostnatale 4. Les vaisseaux sanguins croissants de la souris néonatale sont en plastique, et ils subissent une régression pendant le stimulus hyperoxie5.

Rop est la principale cause de cécité infantile dans les pays occidentaux, car il affecte près de 70% des prématurés ayant un poids à la naissance de moins de 1250 g6,7. Le ROP survient chez les prématurés nés avant que les vaisseaux rétiniens ne terminent leur croissance normale. Rop progresse en deux phases: dans la phase I, la naissance prématurée retarde la croissance vasculaire rétinienne où, après la phase II, la vascularisation inachevée de la rétine en développement provoque l’hypoxie, ce qui induit l’expression de facteurs de croissance angiogéniques qui stimulent la croissance nouvelle et anormale des vaisseauxsanguins 8. Le modèle OIR a été un modèle largement utilisé pour étudier la pathophysiologie du ROP et d’autres rétinopathies ischémiques ainsi que pour tester de nouveaux candidatsmédicaments 2,3,9. Il est largement considéré comme un modèle reproductible pour la réalisation d’études de preuve de concept pour les médicaments antiangiogéniques potentiels pour les maladies oculaires ainsi que non oculaires. Les deux modèles de rongeurs, c’est-à-dire la souris et le rat OIR diffèrent dans leur modèle d’induction et de phénotype de la maladie. Le modèle de rat imite le phénotype ROP avec plus de précision, mais le modèle de souris fournit un modèle plus robuste, rapide et reproductible pour la néovascularisation rétinienne (NV). Dans le modèle de souris, NV se développe à la rétine centrale. Cette lecture pathologique est importante dans les études pharmacologiques d’efficacité pour de nombreuses rétinopathies ischémiques, telles que la RDP, le VR et la DMR exsudative, ainsi que pour les maladies angiogéniques non oculaires comme le cancer. En outre, la disponibilité de souris génétiquement manipulées (transgéniques et knockout) fait du modèle OIR souris une option plus populaire. Cependant, ni la souris ni le rat OIR modèle crée la fibrose rétinienne, qui est typique dans les maladies humaines.

La compréhension que des niveaux élevés d’oxygène contribuent au développement du ROP dans les années1950 10,11 a conduit au développement de modèles animaux. Les premières études sur l’effet de l’oxygène sur la vascularisation rétinienne ont été faites en 195012,13,14 et jusqu’aux années 1990, il y avait beaucoup de raffinements au modèle OIR. Les recherches menées par Smith et coll. en 1994 ont établi une norme pour le modèle actuel d’OIR de souris qui sépare l’hyaloidopathy de la rétinopathie15. Une large adoption de la méthode pour quantifier la vaso-oblitération et la NV pathologique par Connor et coll. (2009) a encore accru sa popularité16. Dans ce modèle, les souris sont placées à 75% d’oxygène (O2) pendant 5 jours à P7, suivies de 5 jours dans des conditions normoxiques. L’hyperoxie de P7 à P12 provoque une régression de la vascularisation rétinienne dans la rétine centrale. Au retour aux conditions normoxiques, la rétine avasculaire devient hypoxique (Figure 1A). En raison des stimulus hypoxiques de la rétine centrale avasculaire, certains des vaisseaux sanguins rétiniens poussent vers le vitré, formant le NV preretinal, appelé touffes préretinales2,3. Ces touffes sont immatures et hyperpermérables. La quantité de NV culmine à P17, après quoi elle régresse. La rétine est entièrement revascularisée et le NV est complètement régressé par P23 - P25 (Figure 2A)2,3.

Le modèle rat OIR (utilisant différents niveaux d’O2) a été décrit pour la première fois dans les années 1990 montrant que les différents niveauxd’O 2 à 80% et 40% causent un NV plus prononcé que moins de 80% O2 exposition constante17. Plus tard, il a été découvert que le modèle d’hypoxie intermittente, où O2 est pédalé à partir de l’hyperoxie (50%) l’hypoxie (10-12 %), provoque encore plus de NV que le modèle O 218à 80/40 %. Dans le modèle 50/10%, les chiots rat sont exposés à 50% pendant 24 heures, suivis de 24 heures dans 10% O2. Ces cycles se poursuivent jusqu’au P14, lorsque les chiots rat sont retournés à des conditions normoxiques (figure 1B). Comme chez les patients humains de ROP, dans le modèle de rat les secteurs avasculaires se développent à la périphérie de la rétine en raison du plexus vasculaire rétinien immature (figure 3).

Dans les deux modèles, les principaux paramètres qui sont habituellement quantifiés sont la taille d’AVA et de NV. Ces paramètres sont généralement analysés à partir de supports plats rétiniens où les cellules endothéliales sontétiquetées 4,16. Auparavant, la quantité de NV préretinal a été évaluée à partir de sections transversales rétiniennes en comptant les noyaux de vaisseaux sanguins ou de cellules vasculaires s’étendant à vitreux au-dessus de la membrane limitante interne. La principale limite de cette approche est qu’il n’est pas possible de quantifier les AGA.

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Protocol

Le protocole décrit ici a été approuvé par le Comité national d’éthique animale de Finlande (numéro de protocole ESAVI/9520/2020 et ESAVI/6421/04.10.07/2017).

1. Induction expérimentale de modèle d’OIR d’animaux et de souris

REMARQUE : Utilisez des animaux aciérés dans le temps, par exemple des souris C57BL/6J couramment utilisées, pour faire naître des petits le même jour. Utiliser des barrages d’accueil, p. ex., 129 souches (129S1/SvImJ ou 129S3/SvIM) pour allaiter les chiots pendant et après l’induction de l’hyperoxie. Sinon, assurez-vous qu’il y a des barrages de lactating supplémentaires disponibles au cas où les barrages de soins infirmiers doivent être remplacés en raison de l’épuisement. Limitez la taille de la portée à 6-7 petits pour chaque barrage lors de l’utilisation de souris/mères C57BL/6J (si les portées sont plus grandes que cela, les chiots ont tendance à avoir un gain de poids limité)16.

  1. Enregistrez le poids des animaux avant et après l’induction de l’hyperoxie, et au moment du sacrifice.
  2. Assurez-vous qu’il y a suffisamment de nourriture au fond de la cage, de sorte que les barrages ont un accès facile à la nourriture.
  3. Ajouter de la chaux gazeuse avec un indicateur de couleur au fond de la chambre pour absorber l’excès de CO2 lorsqu’un système de filtration n’est pas utilisé.
  4. Surveillez l’humidité et la température à l’intérieur de la chambre et maintenez l’humidité entre 40 et 65 %. Augmenter l’humidité de la chambre, si nécessaire, en plaçant des plats avec de l’eau au fond de la chambre (p. ex., boîtes de Pétri).
  5. Calibrer le capteur O2 avec 100% O2 et l’air normal de la pièce.
  6. Placez les souris P7 dans une chambre et installez le niveau O2 à 75%. Gardez les souris dans la chambre pendant 5 jours, jusqu’à P12. Évitez d’ouvrir la chambre pendant l’induction de l’hyperoxie. Vérifiez la pression de gaz du cylindre O2 et remplacez le cylindre en cas de besoin. Surveillez les animaux pendant l’induction.
  7. Sortez les cages de souris de la chambre et pesez tous les chiots. Regroupez les chiots en fonction du poids de sorte que chaque groupe expérimental ait une répartition du poids similaire chez les chiots.

2. Induction expérimentale de modèle d’animaux et de rat OIR (utilisant le système semi-fermé)

REMARQUE : Utilisez des animaux à osser dans le temps pour faire naître les petits le même jour. Pour rat OIR, utiliser une taille de litière accrue, environ 18 petits/barrage, pour obtenir une induction suffisante de NV dans le modèle de rat. Piscine chiots de plusieurs portées pour obtenir suffisamment de chiots à chaque portée.

  1. Enregistrez le poids des animaux avant et après l’induction, et au moment du sacrifice.
  2. Assurez-vous qu’il y a suffisamment de nourriture au fond de la cage, de sorte que les barrages ont un accès facile à la nourriture.
  3. Ajouter de la chaux gazeuse avec un indicateur de couleur au fond de la chambre pour absorber l’excès de CO2 lorsque le système de filtration n’est pas utilisé.
  4. Surveillez l’humidité et la température à l’intérieur de la chambre. Absorber l’humidité supplémentaire (générée par plusieurs nombres de rats) en ajoutant du gel de silice sur le fond de la chambre.
  5. Calibrer le capteur O2 avec 100% N2 et l’air normal de la pièce.
  6. Placez les rats dans la chambre à P0 (quelques heures après la naissance). Réglez le niveau O2 à 50% et connectez le cylindre O2 à la chambre pendant 24 h. Après cela, passer les paramètres à 10% O2 et connecter l’azote (N2) cylindre à la chambre pendant 24 h. Continuer le cycle de 24 h entre 50% et 10% O2 niveaux pendant 14 jours.
  7. Surveiller la consommation de gaz et le bien-être des animaux pendant l’étude. Ouvrez la chambre pendant le changement entre 50/10% O2 et ajoutez plus de nourriture et d’eau si nécessaire. Changer les cages des animaux pour les nettoyer pendant l’induction.
  8. Sortez les cages à rats de la chambre et pesez tous les chiots. Regroupez les chiots en fonction du poids de sorte que chaque groupe expérimental ait une distribution de peser similaire chez les chiots.

3. Administration de médicaments (facultatif)

REMARQUE : La voie couramment utilisée d’administration de drogue dans OIR est par traitement intravitreal (ivt), à P12-P14 pour des souris et à P14 pour des rats. Déterminez le jour du traitement en fonction de la configuration expérimentale. Lorsque plusieurs portées de petits sont utilisées dans des expériences, divisez les groupes de traitement pour avoir des animaux de toutes les portées. De préférence, injectez la drogue à un seul œil, et gardez l’œil contralatéral comme un contrôle.

  1. Pesez les animaux et faites des marques d’identification à la queue et/ou à l’oreille.
  2. Anesthésier l’animal soit par anesthésie injectable (par exemple mélange de kétamine et de médetomidine, 30 mg/kg et 0,4 mg/kg pour les souris) soit par anesthésie par inhalation (isoflurane à 2-3,5% isoflurane et 200-350 mL/min de débit d’air). Vérifiez la profondeur de l’anesthésie en pinçant les ateils. Gardez l’animal sur un coussin chauffant pendant le traitement.
  3. Pour l’anesthésie locale, appliquer une goutte d’analgésique sur la paupière. Ouvrez soigneusement la paupière avec des forceps avant d’effectuer l’ivt, comme les souris et les rats ouvrent les yeux autour de P14. Appliquer une goutte d’analgésique (p. ex., hydrochlorure d’oxybuprocaine) sur la cornée.
  4. Appliquer une goutte d’iode avant d’effectuer l’injection d’ivt.
  5. Pour l’injection ivt utiliser une seringue en verre avec une aiguille de 33-34 G attaché. Appuyez sur les paupières vers le bas et grap le globe oculaire avec des pinces. Faire l’injection postérieure aux limbes, environ dans l’aiguille d’angle de 45° pointant vers le nerf optique.
  6. Évitez d’injecter plus de 1,0 μL dans l’espace intravitreal. Gardez l’aiguille en place pendant 30 s après l’injection du médicament pour éviter le reflux de la solution injectée.
  7. Examiner l’œil (p. ex., à l’aide d’un ophtalmoscope) pour toute complication, comme des hémorragies ou des lésions rétiniennes, après avoir enlevé l’aiguille. Appliquer de l’onguent antibiotique sur la cornée après l’injection.
    REMARQUE : Le volume d’injection d’ivt pour les souris devrait être de 0,5 à 1,0 μL.
  8. Inverser l’anesthésie (par exemple avec un antagoniste α2 pour la médetomidine (2,5 mg/kg) et retourner le chiot dans la cage. Abritez la litière normalement jusqu’à la fin de l’étude.

4. Imagerie in vivo et électrorétographie (facultatif)

  1. Si désiré, effectuer une imagerie in vivo sur des animaux vivants pendant la période de suivi pour enregistrer les changements qui se développent dans la rétine pendant les réponses angiogéniques. Par exemple, effectuez une angiographie de fluorescéine (FA) ou une microscopie confoccale laserà balayage 19 pour visualiser la vascularisation (Figure 4). Utiliser la tomographie par cohérence optique du domaine spectral (SD-OCT) pour visualiser les couches rétiniennes in vivo (Figure 4).
  2. Si désiré, étudier les changements fonctionnels dans différentes populations de cellules rétiniennes après l’induction de l’OIR en utilisant l’électrorétinographie (ERG) (Figure 5).

5. Collecte de tissus et préparation de montures plates rétiniennes

REMARQUE : Recueillir les tissus selon l’hypothèse de recherche souhaitée. Pour les souris, recueillir les échantillons par exemple à P12 (pour étudier la vaso-oblitération après la phase hyperoxique) ou à la période hypoxique (P13-P17). Recueillir les échantillons de souris OIR à P17, qui est le point de temps le plus commun pour l’échantillonnage, pour détecter le pic en quantité de NV. Dans rat OIR, recueillir les échantillons à P18-P21 pour observer la plus grande quantité de NV (Figure 3).

  1. Pesez les animaux avant l’échantillonnage.
  2. Pour étiqueter la vascularisation rétinienne, les animaux profondément anesthésiés peuvent être transcardiés perfusés avec fitc-dextran. (Alternativement, tacher les montures plates rétiniennes avec isolectine plus tard).
  3. Sacrifier les animaux en utilisant soit une surdose de médicaments d’anesthésie (par exemple mélange de kétamine et de médetomidine, 300 mg/kg et 4 mg/kg pour les souris) ou l’inhalation de CO2.
  4. Recueillir les yeux des animaux en saisissant derrière le globe oculaire avec des forceps incurvés, couper le tissu autour des yeux et soulever l’œil hors de l’orbite.
  5. Incuber les globes oculaires dans du paraformaldéhyde fraîchement fait filtré et filtré (en solution saline tamponnée de phosphate, PBS) pendant 1-4 h. Retirer le fixatif et laver les globes oculaires 3 x 10 min avec PBS. Disséquer immédiatement les rétines ou les conserver en PBS à +4 °C.
    AVERTISSEMENT : Le paraformaldéhyde est toxique par inhalation, en contact avec la peau et s’il est avalé. Veuillez lire la fiche de données de sécurité avant de travailler avec elle.
    REMARQUE : N’appliquez pas de pression sur le globe oculaire pendant l’échantillonnage ou n’importe quelle phase du traitement des tissus afin d’éviter le décollement de la rétine, si des sections transversales de globes oculaires entiers sont effectuées.
  6. Préparez des supports plats rétiniens pour quantifier la quantité de NV et la taille des AVA. Alternativement, traiter les globes oculaires / rétines pour l’histologie, ou l’ARN ou l’analyse des protéines. Disséquer la rétine au microscope stéréo à l’aide de micro ciseaux et de forceps.
    1. Placez le globe oculaire dans PBS pour le garder humide et percer le globe oculaire à limbus avec une aiguille (23G) et couper autour des limbes avec des micro ciseaux incurvés pour enlever l’iris et la cornée.
    2. Placez soigneusement la pointe des ciseaux entre la sclère et la rétine et coupez la sclère vers le nerf optique. Faites de même de l’autre côté du globe oculaire, et coupez/déchirez soigneusement la sclère jusqu’à ce que la tasse rétinienne soit exposée. Retirez la lentille de la tasse rétinienne et ajoutez PBS à la tasse.
    3. Enlevez tous les vaisseaux hyaloïdes, vitreux et débris sans endommager la rétine. Lavez la rétine en ajoutant du PBS à la tasse rétinienne. Effectuer quatre incisions (à 12, 3, 6 et 9 heures) à la rétine avec des micro ciseaux droits pour faire une structure en forme de fleur. En option, faire les coupes avec la lame chirurgicale avant de monter les échantillons. Soulevez la rétine à l’aide d’un pinceau doux à une plaque de puits pour la coloration.
  7. Étiquetez la vascularisation rétinienne à l’aide de l’isolectine B4 qui tache la surface des cellules endothéliales (si les animaux n’ont pas été perfusés avec fitc-dextran). Incuber les rétines dans le tampon de blocage (10% NGS + 0,5% Triton dans tbs) pendant 1 h et laver avec 1% NGS + 0,1% Triton dans tbs pendant 10 min. Incuber les rétines avec colorant fluorescent conjugué Isolectine B4 (5-10μg/ml) en 1% NGS + 0,1% Triton dans tbs nuit à +4 °C tout en étant protégé de la lumière.
    REMARQUE : Si désiré, étiquetez d’autres cellules telles que les cellules inflammatoires et les péricytes à l’aide d’anticorps spécifiques.
  8. Laver les rétines 3x pendant 10 min avec 1% NGS + 0,1% Triton dans tbs et soulever les rétines sur une lame microscopique, la rétine interne orientée vers le haut. Étendre soigneusement la rétine à l’aide d’un pinceau souple et enlever les vaisseaux hyaloïdes restants ou les débris. Ajouter le milieu de montage à un glissement de couverture et le placer sur le dessus de la rétine. Conservez les rétines à +4 °C et protégez-les de la lumière.

6. Analyse des montures plates

  1. Prenez des images des montures plates rétiniennes à l’aide d’un microscope à fluorescence avec objectif 10x. Concentrez-vous sur le plexus vasculaire superficiel et sur la néovascularisation préréaculaire. Faites une image de balayage de tuile pour capturer la rétine entière et fusionner les balayages de tuile
  2. Quantifier les images en mesurant les AVA, la zone de NV et la zone rétinienne totale à l’aide d’un programme de traitement d’image (voir tableau des matériaux).
    1. Dessinez les AVA et la zone rétinienne totale à l’aide d’un outil de dessin à main libre et sélectionnez les zones néovasculaires à l’aide d’un outil de sélection. Le logiciel mesure les régions d’intérêt pour les pixels, et les zones AVA et NV (exprimées en pixels) peuvent être utilisées pour calculer leur pourcentage par rapport à la zone rétinienne totale. En outre, certains outils logiciels sont disponibles pour quantifier NV.
      REMARQUE : Récemment, un programme open-source entièrement automatisé pour la quantification des valeurs clés des images OIR à l’aide de réseaux neuronaux d’apprentissage profond a été introduit et fournit un outil fiable pour la quantification reproductible de l’AVA rétinienne et du NV (p. ex., https://github.com/uw-biomedical-ml/oir/tree/bf75f9346064f1425b8b9408ab792b1531a86c64)20,21.
  3. Si vous utilisez des anticorps pour la détection immunohistochimique des populations cellulaires individuelles, quantifier le nombre de cellules tachées (comme les microglies, figure 2B)à partir des supports plats rétiniens à la main ou par des systèmes automatisés d’analyse d’image si désiré.

7. Statistiques

  1. Analyser les données normalement distribuées par le test t de l’étudiant ou anova à sens unique suivi du test de comparaisons multiples de Dunnett ou Tukey, le cas échéant. Utilisez des tests non paramétriques comme le test Mann-Whitney U ou le test Kruskal Wallis pour les données non normalement distribuées. Tenir compte des différences statistiquement significatives au niveau P < 0,05.

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Representative Results

Le principal résultat du modèle est le phénotype vasculaire : la taille des AVA et la quantité de NV. Dans le modèle OIR de souris, la vaso-oblitération se produit dans la rétine centrale (Figure 2A), tandis que dans le modèle de rat, il se développe dans la périphérie, c’est-à-dire, semblable à l’homme ROP22 (Figure 3A). C’est parce que le plexus vasculaire superficiel s’est déjà développé lorsque les souris sont exposées à l’hyperoxie, alors que dans le modèle de rat la rétine est avasculaire au moment de l’induction OIR (P0). La néovascularisation prérétinienne se développe près des zones avasculaires, c’est-à-dire la rétine centrale chez la souris et la périphérie chez les rats (figure 2A et figure 3A).

L’analyse histologique à l’aide de sections transversales ou de supports plats peut être effectuée pour évaluer les changements morphologiques des rétines OIR ou la présence de types de cellules d’intérêt, par exemple les cellules inflammatoires (figure 2B). En plus de la rétine, des échantillons entiers d’œil ou de vitreux peuvent être prélevés pour d’autres analyses d’expression génétique et protéique à différents moments du modèle OIR. Les niveaux d’expression des gènes ou des protéines peuvent être analysés avec des méthodes standard, telles que rt-qPCR ou ballonnement occidental.

En option, l’imagerie in vivo non invasive peut être effectuée pendant la période de suivi de l’OIR. La vascularisation rétinienne et hyaloïde peut être visualisée avec fa (figure 4A). SD-OCT peut être utilisé pour évaluer les changements structurels de la rétine( Figure 4B). Les changements fonctionnels de la rétine peuvent être mesurés par ERG( Figure 5).

Les inhibiteurs du facteur vasculaire de croissance endothéliale (VEGF) sont couramment utilisés dans le traitement des maladies oculaires angiogéniques humaines. Ainsi, l’anti-VEGF est souvent utilisé comme composé de référence dans OIR. Aflibercept, qui agit comme un piège soluble vegf, inhibe à la fois le NV et la revascularisation physiologique dans OIR à fortes et faibles doses (injecté à P14). Les yeux OIR injectés à P14 avec une dose élevée d’aflibercept avaient des AVA rétiniens encore plus grands que les yeux non traités (figure 6). Ceci suggère que l’aflibercept bloque également la revascularisation rétinienne physiologique conduite par l’hypoxie. Les modèles de souris et de rats peuvent être utilisés pour évaluer l’effet de différents agents anti-angiogéniques sur le NV rétinien et la revascularisation physiologique de la rétine (figure 3B et figure 6).

Figure 1
Figure 1 : Vue d’ensemble graphique d’une conception standard d’étude d’OIR pour des souris et des rats. (A) Mouse OIR modèle a été induit en exposant les souris à 75% O2 de P7 à P12 et est retourné à l’air normal de la pièce. Le pic de NV préretinal a été vu à P17, qui est habituellement le point d’échantillonnage pour l’expérience. (B) Rat OIR modèle a été induit en exposant les rats à l’alternance o2 niveaux (50/10 % O2) de P0 à P14 et retourné à des conditions normoxiques. Les rats sont généralement sacrifiés au P20, lorsque la quantité de NV a atteint un sommet. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Phénotype vasculaire dans le modèle OIR de souris. Le modèle Mouse OIR a été généré tel que décrit dans la figure 1. (A) Le plexus vasculaire superficiel s’est développé chez les souris normales tandis que les souris d’OIR ont été exposées à 75% O2 de P7 à P12. Pendant ce temps, l’oblitération vasculaire s’est développée dans la rétine centrale (marquée en bleu à P12 et P17 dans les images quantifiées). Les souris ont été retournées à l’air normal de pièce, et la rétine avasculaire est devenue hypoxique, menant à la repousse fonctionnelle de vaisseau dans la rétine et le NV pathologique (marqué en rouge à P17 dans le panneau inférieur). Des touffes néovasculaires préretinales se sont développées entre les zones vasculaires et avasculaires de la rétine centrale. La quantité de NV a culminé à P17 et a régressé par la suite. La rétine a été entièrement revascularisée et le NV a régressé autour de P24-P25. (B) Un exemple de coloration immunohistochimique de la monture plate rétinienne montrant des microglies tachées rétiniennes Iba-1 (vert) et des vaisseauxsanguins tachés GS-IB 4 (rouge) à P12 et P17. (C) Coupe transversale d’un œil de souris OIR à P17, où des touffes préretinales (flèches) poussaient vers le vitré. En outre, l’amincissement de la couche nucléaire intérieure (INL) et de la couche plexiforme externe (OPL) a été vu. Les barres d’échelle sont de 1 mm en A, 50 μm en B et 100 μm en C. ILM = membrane limite interne, GCL = couche cellulaire ganglionnaire, IPL = couche plexiforme interne, INL = couche nucléaire interne, OPL = couche plexiforme externe, ONL = couche nucléaire externe, EPR = épithélium pigmentaire rétinien. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Phénotype vasculaire et son développement dans le modèle rat OIR. (A) Les zones avasculaires (marquées en bleu) et NV (marquées en rouge) se sont développées dans la périphérie de la rétine, semblables au ROP humain. (B) AVAs ont été vus dans les rétines OIR, mais pas dans les contrôles normoxiques. (C)La quantification de la superficie de NV a montré une tendance vers un pic de la quantité de NV à P20, mais la différence n’était pas statistiquement significative par rapport à P18 et P21 dans OIR. (T-test de l’élève, entre les rétines normoxiques et OIR appariées dans le temps, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001, les deux yeux des animaux tracés dans le graphique). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Imagerie in vivo utilisant l’angiographie de fluorescéine (FA) et la tomographie optique de cohérence de domaine spectral (SD-OCT) dans le modèle d’OIR de rat. ( A ) Tortuosité vasculaire (pointes de flèche)aété vu dans les images prises de la rétine centrale (rangée supérieure) à P18 et P20 chez les rats OIR par rapport aux rats normoxiques P19. NV (flèches) et AVAs (astérisque) se sont développés à la périphérie de la rétine (rangée moyenne) comme on le voit dans les rétines P18 et P20 OIR. Des vaisseaux hyaloïdes régressants (rangée inférieure) ont été capturés par FA. (B) La croissance de vaisseau sanguin vers le vitré a été observée comme épaississement sur la couche de fibre nerveuse (NFL) et la couche cellulaire de ganglion (GCL) dans les rétines d’OIR (flèche). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : La fonctionnalité des neurones rétiniens peut être mesurée à l’aide de l’électrorétinographie flash (fERG). (A) a-ondes ont été dérivés de cône rétinien et photorécepteurs de tige et leurs amplitudes ont été sensiblement diminuées dans le modèle de rat OIR. L’effet a augmenté avec une intensité lumineuse plus élevée, suggérant que les défauts affectaient les fonctions de photorécepteur de cône principalement. (B) Les amplitudes des ondes B des animaux oir ont été diminuées par rapport aux contrôles normoxiques. Les ondes B ont été dérivées des cellules on-bipolaires et des cellules Müller. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : PBS injecté intravitreally réduit NV et AVAs dans le modèle de souris OIR. (A) Images représentatives de montures plates rétiniennes provenant d’yeux OIR non traités et traités à l’aflibercept (20 μg au P14) et de PBS injectés aux yeux OIR au P17. Une dose élevée d’aflibercept (20 μg) a augmenté la taille des AVA de 47 % (décrite en blanc) et inhibé le NV de 98 % (flèches) par rapport aux témoins non traités. L’injection de PBS a diminué les AVA de 31 % et le NV de 42 % par rapport aux témoins non traités. En outre, la ponction de la sclera ressemblant à ivt a produit des effets semblables à l’injection d’ivt de PBS, mais les différences n’étaient pas statistiquement significatives. Pointes de pointe de flèche aux vaisseaux hyaloid qui n’ont pas été enlevés pendant la dissection. (One-Way ANOVA, * p ≤ 0,05; ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001, **** p ≤ 0,0001). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

La sévérité du phénotype de la maladie dépend à la fois de la souche et même du fournisseur dans les modèles OIR souris et rat23. Ceci suggère qu’il y ait une grande variabilité génotypique dans le développement pathologique. En général, les rongeurs pigmentés développent un phénotype plus grave que les rongeurs albinos. Par exemple, la vascularisation rétinienne de l’albinos BALB/c se revascularise rapidement après l’hyperoxie et ne développe pas de NVdu tout 24. De même, chez les rats, les rats de Norvège brune pigmentés montrent une pathologie plus sévère que les rats albinos Sprague Dawley (SD)25. Les rats SD sont des souches couramment utilisées, et des différences liées au fournisseur dans le phénotype OIR ont été signalées dans la souche. Par exemple, les rats SD de la rivière Charles produisent beaucoup plus de NV que les rats de Harlan ou Zivic-Miller23. Les souris C3H/HeJ, à leur tour, qui ont une mutation dans le gène de dégénérescence rétinienne 1 (Rd1), ont des rétines minces, et ne développent pas NV26. En raison de ces raisons et de la disponibilité des lignées de souris transgéniques, le C57BL/6J consanguin est la souche de souris la plus couramment utilisée pour les études OIR. Cependant, il y a une mortalité assez élevée parmi les barrages de C57BL/6J due à l’exposition hyperoxique, ainsi le bien-être des souris doit être considéré en concevant l’étude et surveillé pendant les expériences. En outre, des dommages accrus de photorécepteur sont vus dans les souris de C57BL/6 comparées aux souris de BALB/c27.

Afin d’assurer le bien-être des souris et la survie des mères et des petits, la taille de la litière doit être maintenue petite (6-7 petits/barrage). Ceci est particulièrement important lors de l’utilisation de souris C57BL/6, qui sont plus sensibles au stresshyperoxique 27,28. En outre, des aliments de soutien facilement accessibles (placés au fond de la cage) devraient être fournis aux souris. Certains chercheurs utilisent des mères porteuses pour remplacer les barrages de la chambre par des barrages sains après l’induction d’oxygène. Cependant, la plupart des chercheurs n’utilisent des substituts que si le barrageest épuisé 22,29. Les mères porteuses sont recommandées pour être utilisées si de plus grandes tailles de litière sont utilisées. Il a été publié que les souris 129S3/SvIM produisent plus de NV que C57BL/6 et soutiennent mieux les changements causés par différents niveauxd’oxygène 28. Il convient de noter que les barrages utilisés dans l’OIR ne sont pas stériles après l’induction de l’OIR et ne doivent pas être utilisés à d’autres fins dereproduction 22. Le gain de poids postnatal des chiots affecte la sévérité de la pathologie d’OIR. Les chiots avec le gain postnatal pauvre de poids (<5 g à P17) montrent l’expression retardée du VEGF et donc la phase prolongée de la rétinopathie par rapport aux chiots avec normal (5 - 7.5 g à P17) ou le gain de poids étendu (>7.5 g à P17)29. En outre, les chiots de souris pesant plus de 5 g à P7 ne montrent pas les secteurs vaso-oblitérés après induction d’OIR30. Ainsi, il est important de peser les chiots pendant l’expérience. L’œil non traité contralatéral peut être utilisé comme un contrôle interne pour s’assurer que l’état nutritionnel des souris n’affecte pas les résultats. La situation est similaire chez les rats; plus les chiots sont petits, plus le phénotype OIR grave qu’ils développent31. Ainsi, il est recommandé d’utiliser une grande taille de litière (environ 18 petits) pour le modèle rat OIR.

L’induction du modèle OIR peut se faire à l’aide de l’un ou l’autre système entièrement fermé, où il y a un circuit en boucle fermée avec une pompe qui fait circuler l’air à travers un système de filtre (chaux gazeuse et carbone activé) vers la chambre. Une autre option est un système semi-fermé, où la ventilation garantit que les métabolites excédentaires sont retirés de la chambre. Pour s’assurer que l’excès de CO2 est éliminé, de la chaux gazeuse (mélange d’hydroxyde de calcium avec hydroxyde de sodium ou hydroxyde de potassium) peut être placée au fond de la chambre. L’élimination du CO2 est obligatoire car les niveaux élevés de CO2 aggravent le phénotype de la maladie chez les rats32. Il faut également se rappeler de recalibrer le capteur d’oxygène de la chambre régulièrement car ils ont tendance à dériver au fil du temps et peut fournir une mauvaise concentration d’oxygène de celui prévu.

Il a été signalé que l’injection de véhicule (PBS) seul ou même juste la ponction à l’espace intravitreal a un effet pour le taux de revascularisation et la quantité de NV (Figure 6)33,34,35,36. Il a été spéculé si l’effet vu avec PBS/injection de véhicule pourrait être dû aux changements de pression intraoculaire pendant l’injection, ou dû à la blessure aux structures oculaires qui augmente des niveaux des facteurs angiogenic de croissance parmi eux le facteur de croissance épithélium-dérivé de pigment34,37. En outre, il a été démontré qu’une seule injection subrétitale pilote (ponction vers l’espace subréanel) a des effets sur le phénotype vasculaire et fonctionnel de l’OIR par rapport aux rats nontraités 38. Ces résultats soulignent l’importance de contrôles négatifs appropriés dans les études oir ou même l’administration systémique de composés testés, ainsi que des nombres n assez grands dans chaque groupe d’étude. Le fait que l’injection du véhicule améliore en effet le taux de revascularisation dans la rétine est un facteur limitant majeur car le taux de revascularisation et la formation de touffes prérétiniennes pathologiques sont interdélatables dans le modèle OIR : si le taux de revascularisation est accéléré, il conduit à la downregulation compensatoire des touffes néovasculaires et vice versa. Ainsi, les deux principales mesures des résultats du modèle OIR sont affectées par l’injection de véhicules.

Les inhibiteurs du VEGF ont révolutionné le traitement amd et dr. OIR modèle a été utilisé pour démontrer leur efficacité préclinique. En ce qui concerne les inhibiteurs du VEGF dans l’OIR, une étude comparant différents anti-VEGFs et anti-PLGFs (facteur de croissance placentaire) (injecté à P12) a montré que l’anti-VEGF seul a conduit à de petites zones avasculaires, tandis que les yeux traités anti-PIGF avaient de plus grandes zones avasculaires33. Aflibercept avait les plus grands AVAs par rapport à d’autres traitements médicamenteux33. Aflibercept est connu pour lier à la fois VEGF et PlGF39, il se pourrait que l’inhibition du PlGF dans OIR conduit au blocage de l’angiogenèse physiologique.

L’imagerie in vivo non invasive fournit un outil de surveillance de la vasculaturerétinienne 40 et des couches et de la structure rétiniennes pendant la période de suivi. À l’aide de la FA, des paramètres comme la densité vasculaire et la tortuosité artérielle et la dilatation veineuse (appelée maladie plus, figure 4A)peuvent êtremesurés 40,41. SD-OCT peut être employé pour évaluer des changements structurels et mesurer l’épaisseur rétinienne pendant la période de suivid’OIR 42,43. L’ERG est utilisé pour mesurer les changements fonctionnels de la rétine. Différents types de cellules produisent des potentiels électriques après stimulus léger, et ces signaux ou « ondes » peuvent être mesurés avec ERG. Les photorécepteurs produisent l’onde négative, et les cellules bipolaires on et les cellules Müller sont principalement responsables de la b-wave44. La perte de la fonction rétinienne est typique chez les souris OIR et les rats45,46 ( Figure 5). Des changements durables persistent dans la rétine et des changements fonctionnels et des changements dans le niveau de protéine ont été rapportés dans les rétines d’OIR même après revascularization et régression de NV34,47.

Pour visualiser la vascularisation rétinienne, les souris vivantes peuvent être soit perfusées avec du dextran étiqueté FITC, soit les supports plats rétiniens peuvent être tachés de colorant fluorescent étiqueté Isolectin B4. Il faut comprendre la différence entre les colorants fluorescents; la perfusion avec des étiquettes FITC-dextrans n’est que le lumen des vaisseaux, tandis que l’isolectine B4 tache la surface des cellules endothéliales. Ainsi, les vaisseaux sanguins fonctionnels avec lumen approprié ne seront visualisés avec la perfusion FITC-dextran, tandis que la zone totale de NV apparaît plus grande dans isolectine B4 rétines tachées que chez les animaux perfusés FITC-dextran, parce que l’isolectine B4 capte essentiellement même les cellules endothéliales qui n’ont pas formé lumens fonctionnelsencore 48. Une option plus récente pour visualiser la boule entière de rétine/oeil dans le format 3-D est l’imagerie profonde de tissu par microscopie de fluorescence de deux photons(49).

Le modèle OIR des rongeurs, ainsi que les modèles animaux en général, ne représentent que partiellement les caractéristiques des maladies humaines. La principale différence liée à l’OIR est que la néovascularisation rétinienne n’est pas associée à la fibrose chez les rongeurs OIR, tandis que la néovascularisation rétinienne conduit généralement à la prolifération fibrovasculaire dans les maladies rétiniennes néovasculaires humaines. En outre, les conditions qui causent l’OIR contre la maladie humaine peuvent être presque opposées. Les nouveau-nés prématurés avec ROP nécessitent de l’oxygène supplémentaire avec un soutien respiratoire, éprouvent fréquemment des épisodes hypoxémiques et hyperoxémiques intermittents causés par l’apnée récurrente, mais ils ne sont pas exposés à des niveaux élevés d’oxygène. Pour minimiser les dommages permanents, des fractions élevées d’O2 inspiré sont évitées. À cet égard, ni le modèle de souris avec une exposition constante à 75% O2 pendant 5 jours, ni le modèle de rat 50/10 ressemblent à la pathogénie du ROP humain. En outre, il existe également des différences entre le rat et les modèles OIR souris. La néovascularisation régresse dans le modèle de souris avec le rétablissement des vaisseaux normaux par P24, tandis que la condition s’aggrave dans le modèle rat OIR (similaire à ROP humain). Bien que, le modèle d’OIR de rat montre des dispositifs médicalement pertinents de ROP tels que le développement vasculaire rétinien retardé et la néovascularisation pathologique suivante, son utilisation est limitée par l’absence presque complète des souches transgéniques de rat, des coûts d’entretien plus élevés et moins de NV que dans le modèle d’OIR de souris.

Pris ensemble, en dépit des différences entre les rétinopathies prolifératives ischémiques humaines et les modèles d’OIR de rongeur, la facilité par laquelle le NV peut être induit, couplé avec la visualisation facile et la quantification de la rétine, rendent les modèles d’OIR populaires pour étudier les mécanismes moléculaires et les thérapeutiques potentielles pour les rétinopathies prolifératives ischémiques. Fait intéressant, l’exposition d’hyperoxie dans le modèle d’OIR de souris induit également la dysplasie bronchopulmonaire, une autre maladie provoquée par la thérapie supplémentaire d’oxygène dans les enfants prématurés humains, montrant que le modèle d’OIR pourrait être employé pour explorer de nouvelles cibles pour ROP et dysplasie bronchopulmonairesimultanément 50.

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Disclosures

Les auteurs Maria Vähätupa, PhD, Niina Jääskeläinen, Marc Cerrada-Gimenez, PhD, et Rubina Thapa sont des employés d’Experimentica Ltd.

L’auteur Giedrius Kalesnykas, Ph.D., est un employé (président et chef de la direction) et actionnaire d’Experimentica Ltd. qui offre des services de recherche contractuelle utilisant des modèles oir précliniques utilisés dans cet article.

Tero Järvinen, M.D., Ph.D., et Hannele Uusitalo-Järvinen, M.D., Ph.D., n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions Marianne Karlsberg, Anne Mari Haapaniemi, Päivi Partanen et Anne Kankkunen pour leur excellent soutien technique. Ces travaux ont été financés par l’Académie de Finlande, la Fondation Päivikki et Sakari Sohlberg, la Tampere Tuberculosis Foundation, la Fondation médicale finlandaise, la Pirkanmaa Hospital District Research Foundation et le Tampere University Hospital Research Fund.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
33 gauge, Small Hub RN Needle Hamilton Company 7803-05, 10mm, 25°, PS4 For intravitreal injection
Adobe Photoshop Adobe Inc. For image analysis
Air pump air100 Eheim GmbH & Co. KG. 143207 For inhalation anaesthesia
Anaesthesia unit 410 AP Univentor Ltd. 2360309 For inhalation anaesthesia
AnalaR NORMAPUR Soda lime VWR International Ltd 22666.362 For CO2 control during model induction
Attane Vet 1000 mg/g VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY vnr 17 05 79 For inhalation anaesthesia
Brush For preparation of flat mounts
Carbon dioxide gas For sacrifice
Celeris D430 ERG system Diagnosys LLC 121 For in vivo ERG
Cell culture dishes Greiner Bio-One International GmbH 664 160 For preparation of flat mounts
Cepetor Vet 1 mg/mL VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY vnr 08 78 96 For anaesthesia
Cover slips Thermo Fisher Scientific 15165452 For preparation of flat mounts
O2 Controlled InVivo Cabinet, Aninal Filtrarion System and Dehumidifier Coy Laboratory Products Closed system for disease model induction, optional for semi-closed system
E702 O2 sensor BioSphenix, Ltd. E207, 1801901 For oxygen level measurement
Envisu R2200 Spectral Domain Optical Coherence Tomograph (SD-OCT) Bioptigen, Inc. BPN000668 For in vivo imaging
Eye spears Beaver-Visitec International, Inc. 0008685 For intravitreal injection and in vivo imaging
Flexilux 600LL Cold light source Mikron 11140 For intravitreal injection or tissue collection
Fluorescein sodium salt Merck KGaA F6377-100G For in vivo imaging
Gas Exhaust unit (+Double 3-way valve, mouse and rat face masks, UNOsorb filter) UNO Roestvaststaal BV GEX 17015249 For inhalation anaesthesia
Glass syringe, Model 65 RN Hamilton Company 7633-01 For intravitreal injection
HRA2 Retina angiograph (FA) Heidelberg Engineering GmbH Spec-KT-05488 For in vivo imaging
Isolectin GS-IB4, Alexa Fluor 488 Conjugate Thermo Fisher Scientific I21411 For labeling retinal vasculature on flat mounts
Ketaminol Vet 50 mg/mL Intervet International B.V. vnr 51 14 85 For anaesthesia
Medicinal Oxygen gas For disease model induction
Mice C57BL/6JRj Janvier Labs Also other strains possible
Microscope slides Thermo Fisher Scientific J1800AMNZ For preparation of flat mounts
Minims Povidone Iodine 5% (unit) Bausch & Lomb U.K Limited vnr 24 11 304 For intravitreal injection
Nitrogen gas For disease model induction (rat)
Oftan Chlora 10 mg/g Santen Pharmaceutical Co., Ltd. vnr 55 01 11 For intravitreal injection
Oftan Metaoksedrin 100 mg/ml Santen Pharmaceutical Co., Ltd. vnr 55 03 43 For in vivo ERG
Oftan Obucain 4 mg/ml Santen Pharmaceutical Co., Ltd. vnr 55 03 50 For intravitreal injection
Oftan Tropicamid 5 mg/ml Santen Pharmaceutical Co., Ltd. vnr 04 12 36 For in vivo imaging
ProOx Model 110 O2 controller and animal chamber BioSphenix, Ltd. 803 For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system
ProOx Model P360 O2 controller and animal chamber BioSphenix, Ltd. 538 For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system
Rats CD(SD) Charles River Laboratories Also other strains possible
Revertor 5 mg/mL VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY vnr 13 04 97 For anaesthesia reversal
Silica gel For humidity control during model induction
Systane Ultra 10ml Alcon Tamro 2050250 For hydration of the eye
Systane Ultra unit 0.7ml Alcon Tamro 2064871 For hydration of the eye
Transfer pipette Thermo Fisher Scientific 1343-9108 For preparation of flat mounts
VENTI-Line VL 180 PRIME Drying oven VWR VL180S 170301 For drying silica gel
VisiScope SZT350 Stereomicroscope VWR 481067 For intravitreal injection or tissue collection

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Modèle de rétinopathie induite par l’oxygène pour les maladies rétiniennes ischémiques chez les rongeurs
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Vähätupa, M.,… More

Vähätupa, M., Jääskeläinen, N., Cerrada-Gimenez, M., Thapa, R., Järvinen, T., Kalesnykas, G., Uusitalo-Järvinen, H. Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents. J. Vis. Exp. (163), e61482, doi:10.3791/61482 (2020).

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