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Medicine

कृंतक में इस्कीमिक रेटिना रोगों के लिए ऑक्सीजन-प्रेरित रेटिनोपैथी मॉडल

Published: September 16, 2020 doi: 10.3791/61482

Summary

ऑक्सीजन-प्रेरित रेटिनोपैथी (ओआईआर) का उपयोग इस्कीमिक रेटिना रोगों जैसे प्रीमैच्योर और प्रोलिफेरेटिव डायबिटिक रेटिनोपैथी के रेटिनोपैथी को मॉडल करने और नियोवैस्कुलर रोगों के लिए एंटी एंजियोजेनिक दवाओं के मूल्यांकन में प्रूफ-ऑफ-कॉन्सेप्ट अध्ययन के लिए एक मॉडल के रूप में काम करने के लिए किया जा सकता है। ओआईआर रेटिना में मजबूत और प्रजनन योग्य नियोवैस्कुलराइजेशन को प्रेरित करता है जिसे मात्रा निर्धारित किया जा सकता है।

Abstract

इस्कीमिक रेटिनोपैथी के लिए आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले मॉडलों में से एक ऑक्सीजन-प्रेरित रेटिनोपैथी (ओआईआर) मॉडल है। यहां हम ओआईआर मॉडल इंडक्शन और चूहों और चूहों दोनों में इसके रीडआउट के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। रेटिनल नियोवैस्कुलराइजेशन को ओआईआर में कृंतक पिल्ले को उजागर करके प्रेरित किया जाता है या तो हाइपरऑक्सिया (चूहों) या हाइपरऑक्सिया और हाइपोक्सिया (चूहों) के बारी-बारी से स्तर। इन मॉडलों के प्राथमिक रीडआउट रेटिना में नेवस्कुलर (एनवी) और अवस्कुलर (एवीए) क्षेत्रों के आकार के हैं। वीवो मॉडल में इस प्रीक्लीनिकल का उपयोग संभावित एंटी-एंजियोजेनिक दवाओं की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने या आनुवंशिक रूप से हेरफेर किए गए जानवरों का उपयोग करके रेटिना एंजियोजेनेसिस में विशिष्ट जीन की भूमिका को संबोधित करने के लिए किया जा सकता है। मॉडल में ओआईआर प्रेरण में कुछ तनाव और विक्रेता विशिष्ट भिन्नता है जिसे प्रयोगों को डिजाइन करते समय ध्यान में रखा जाना चाहिए।

Introduction

एंजियोजेनिक नेत्र रोगों के पीछे की विकृति का अध्ययन करने और इन विनाशकारी बीमारियों के लिए उपन्यास चिकित्सा विज्ञान विकसित करने के लिए विश्वसनीय और प्रजनन योग्य प्रयोगात्मक मॉडल की आवश्यकता होती है। पैथोलॉजिकल एंजियोजेनेसिस गीले उम्र से संबंधित मैकुलर डिजनरेशन (एएमडी) के लिए पहचान है और उनमें से कई इस्कीमिक रेटिना रोगों के लिए प्रीमैच्योरिटी (आरओपी), प्रोलिफेरेटिव डायबिटिक रेटिनोपैथी (पीडीआर) और रेटिना नस ऑक्क्लुसेशन(आरवीओ)1,2,3,4के रेटिनोपैथी के लिए है। मानव और कृंतक रेटिना विकास के समान पैटर्न का पालन करते हैं, क्योंकि मानव और कृंतक रेटिना दोनों अंतिम ऊतकों में से हैं जो संवहनी हैं। रेटिना वैक्यूलेचर पूरी तरह से विकसित होने से पहले, रेटिना को हायलॉयड वैक्यूलेचर से पोषक तत्वों की आपूर्ति प्राप्त होती है, जो बदले में, जब रेटिना वैक्यूलेचर1, 2विकसित होने लगता हैतोपीछेहटताहै। मानव में, रेटिना संवहनी विकास जन्म से पहले पूरा हो जाता है, जबकि कृंतक में रेटिना वैक्यूलेचर का विकास जन्म के बाद होता है। चूंकि रेटिना संवहनी विकास कृंतक में पोस्टनेटली रूप से होता है, इसलिए यह एंजियोजेनेसिस2,3का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श मॉडल प्रणाली प्रदान करता है। नवजात कृंतकों में एक अवस्कुलर रेटिना होता है जो धीरे - धीरे तब तक विकसित होता है जब तक कि तीसरे प्रसवोत्तर सप्ताह के अंत तक पूर्ण संवहनी रेटिना विकास प्राप्त नहीं होजाता. नवजात माउस की बढ़ती रक्त वाहिकाएं प्लास्टिक हैं, और वे हाइपरऑक्सिया उत्तेजना 5 केदौरानप्रतिगमन से गुजरते हैं।

ROP पश्चिमी देशों में बचपन के अंधापन के लिए अग्रणी कारण है, क्योंकि यह 1,250 ग्राम6,7 के तहत जन्मजात के साथ समय से पहले शिशुओं के लगभग70%को प्रभावित करता है। आरओपी समय से पहले शिशुओं में होता है जो रेटिना जहाजों के सामान्य विकास को पूरा करने से पहले पैदा होते हैं। आरओपी दो चरणों में प्रगति करता है: चरण 1 में, अपरिपक्व जन्म रेटिना संवहनी विकास में देरी करता है जहां द्वितीय चरण के बाद, विकासशील रेटिना के अधूरे संवहनी हाइपोक्सिया का कारण बनता है, जो एंजियोजेनिक विकास कारकों की अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है जो नए और असामान्य रक्त वाहिका विकास को प्रोत्साहित करता है8। ओआईआर मॉडल आरओपी और अन्य इस्कीमिक रेटिनोपैथी के रोगविज्ञान का अध्ययन करने के साथ - साथ उपन्यास दवा उम्मीदवारों 2,3,9का परीक्षण करने के लिए एक व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला मॉडल रहा है। यह व्यापक रूप से नेत्र के साथ-साथ गैर-नेत्र रोगों के लिए संभावित एंटीएंजियोजेनिक दवाओं के लिए प्रूफ-ऑफ-कॉन्सेप्ट अध्ययन करने के लिए एक प्रजनन मॉडल के रूप में माना जाता है। दो कृंतक मॉडल यानी माउस और चूहा ओआईआर उनके मॉडल इंडक्शन और डिजीज फेनोटाइप में अलग-अलग हैं। चूहा मॉडल रोप फेनोटाइप को अधिक सटीकता से नकल करता है, लेकिन माउस मॉडल रेटिना नियोवैस्कुलराइजेशन (एनवी) के लिए अधिक मजबूत, तेज और प्रजनन योग्य मॉडल प्रदान करता है। माउस मॉडल में, एनवी केंद्रीय रेटिना के लिए विकसित होता है। यह रोग अध्ययन-आउट कई इस्कीमिक रेटिनोपैथी के लिए फार्माकोलॉजिक प्रभावकारिता अध्ययनों में महत्वपूर्ण है, जैसे पीडीआर, आरवी और एक्सयूडिएटिव एएमडी के साथ-साथ गैर-नेत्र, एंजियोजेनिक रोगों जैसे कैंसर के लिए। इसके अलावा, आनुवंशिक रूप से हेरफेर (ट्रांसजेनिक और नॉकआउट) चूहों की उपलब्धता माउस ओआईआर मॉडल को अधिक लोकप्रिय विकल्प बनाती है। हालांकि, न तो माउस और न ही चूहा ओआईआर मॉडल रेटिना फाइब्रोसिस बनाता है, जो मानव रोगों में विशिष्ट है।

समझ है कि उच्च ऑक्सीजन का स्तर 1950 के दशक में आरओपी के विकास में योगदान10,11 पशु मॉडल के विकास के लिए नेतृत्व किया । रेटिना वैक्यूलेचर पर ऑक्सीजन के प्रभाव के बारे में पहला अध्ययन 1 9 5012,13,14 में किया गया था और 1 99 0 के दशक तक ओआईआर मॉडल के लिए कई शोधन थे। स्मिथ एट अल द्वारा 1994 में किए गए शोध ने वर्तमान माउस ओआईआर मॉडल के लिए एक मानक निर्धारित किया जो हाइलोइडोपैथी को रेटिनोपैथी15से अलग करता है। धक्का देकर एट अल (2009) द्वारा वासो-विलोपन और पैथोलॉजिकल एनवी की मात्रा निर्धारित करने के लिए विधि को व्यापक रूप से अपनाने से इसकी लोकप्रियता16में और वृद्धि हुई। इस मॉडल में, चूहों को P7 पर 5 दिनों के लिए 75% ऑक्सीजन (O2)पर रखा जाता है, इसके बाद 5 दिनों तक नॉर्मॉक्सिक स्थिति में रखा जाता है। पी 7 से पी 12 तक हाइपरऑक्सिया केंद्रीय रेटिना में पीछे हटना करने के लिए रेटिना वेक्यूलेचर का कारण बनता है। नॉर्मॉक्सिक स्थितियों पर लौटने पर, अवस्कुलर रेटिना हाइपोक्सिक(चित्रा 1A) बन जाता है। अवस्कुलर केंद्रीय रेटिना की हाइपोक्सिक उत्तेजनाओं के कारण, रेटिना रक्त वाहिकाओं में से कुछ विट्रेस की ओर अंकुरित होते हैं, जो प्रीरेटिनल एनवी बनाते हैं, जिसे प्रीरेटिनल टफ्ट्स2, 3कहाजाताहै। ये टफ्ट्स अपरिपक्व हैं, और अतिप्रतिम हैं। P17 पर एनवी चोटियों की मात्रा, जिसके बाद यह पीछे हट जाती है। रेटिना पूरी तरह से पुनर्संवहन किया जाता है और एनवी पूरी तरह से P23 - P25(चित्रा 2A)2,3से पीछे हटजाताहै ।

चूहा ओआईआर मॉडल (ओ2के अलग - अलग स्तरों का उपयोग करके) को पहली बार 1990 के दशक में वर्णित किया गया था जिसमें यह दर्शाया गया था कि 80% और 40% पर अलग - अलग ओ2 के स्तर 80% से अधिक स्पष्ट एनवी का कारण बनते हैं17%O2 निरंतर एक्सपोजर 17 . बाद में यह पता चला कि आंतरायिक हाइपोक्सिया मॉडल, जहां ओ2 हाइपरऑक्सिया (50%) हाइपोक्सिया (10-12%), 80/40% O2 मॉडल18की तुलना में और भी अधिक एनवी का कारण बनता है । 50/10% मॉडल में, चूहे पिल्ले 24 घंटे के लिए 50% के संपर्क में हैं, इसके बाद 10% O 2 में24घंटे। इन चक्रों को P14 तक जारी रखा जाता है, जब चूहे के पिल्ले नॉर्मॉक्सिक स्थितियों(चित्रा 1B)में वापस आ जाते हैं। मानव आरओपी रोगियों के रूप में, चूहे के मॉडल में अवस्कुलर क्षेत्र अपरिपक्व रेटिना वैस्कुलर प्लेक्सस(चित्रा 3)के कारण रेटिना की परिधि में विकसित होते हैं।

दोनों मॉडलों में, मुख्य पैरामीटर जो आमतौर पर मात्रा निर्धारित किए जाते हैं, वे एवीए और एनवी के आकार के होते हैं। इन मापदंडों का विश्लेषण आमतौर पर रेटिना के सपाट माउंट से किया जाता है जहां एंडोथेलियल कोशिकाओं को 4,16लेबल कियाजाताहै । पहले प्रीरेटिनल एनवी की मात्रा का मूल्यांकन रेटिना क्रॉस सेक्शन से रक्त वाहिका या संवहनी कोशिका नाभिक की गिनती करके आंतरिक सीमन झिल्ली के ऊपर विट्रियस तक विस्तारित किया गया था। इस दृष्टिकोण की प्रमुख सीमा यह है कि एवीएएस की मात्रा बताना संभव नहीं है ।

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Protocol

यहां वर्णित प्रोटोकॉल को फिनलैंड की राष्ट्रीय पशु आचार समिति (प्रोटोकॉल संख्या ESAVI/9520/2020 और ESAVI/6421/04.10.07/2017) द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. प्रायोगिक जानवरों और माउस OIR मॉडल प्रेरण

नोट: एक ही दिन पैदा हुए पिल्ले पाने के लिए, आमतौर पर C57BL/6J चूहों का उपयोग करने के लिए समय-संभोग जानवरों का उपयोग करें। हाइपरऑक्सिया के शामिल होने के दौरान और बाद में पिल्ले को नर्स करने के लिए, बांधों को बढ़ावा देने का उपयोग करें, उदाहरण के लिए, 129S1/SvImJ या 129S3/SvIM) स्तनपान कराने वाले बांधों का उपयोग करें। वैकल्पिक रूप से, सुनिश्चित करें कि थकावट के कारण नर्सिंग बांधों को प्रतिस्थापित करने की आवश्यकता होने की स्थिति में अतिरिक्त स्तनपान बांध उपलब्ध हैं । C57BL/6J चूहों/बांधों का उपयोग करते समय प्रत्येक बांध के लिए कूड़े के आकार को 6-7 पिल्ले तक सीमित करें (यदि कूड़े से बड़े होते हैं कि पिल्ले सीमित वजन हासिल करते हैं)16

  1. हाइपरऑक्सिया प्रेरण से पहले और बाद में जानवरों के वजन को रिकॉर्ड करें, और बलिदान के समय।
  2. सुनिश्चित करें कि पिंजरे के तल पर पर्याप्त भोजन है, इसलिए बांधों में भोजन तक आसान पहुंच है।
  3. जब एक छानने का काम प्रणाली का उपयोग नहीं किया जाता है तो अतिरिक्त सीओ 2 को अवशोषित करने के लिए कक्ष केनीचे रंग संकेतक के साथ सोडा चूने जोड़ें।
  4. कक्ष के अंदर आर्द्रता और तापमान की निगरानी करें और आर्द्रता को 40 से 65% के बीच रखें। कक्ष के नीचे पानी के साथ व्यंजन रखकर (उदाहरण के लिए, पेट्री व्यंजन)।
  5. 100% O2 और सामान्य कमरे की हवा के साथ ओ2 सेंसर को कैलिब्रेट करें।
  6. P7 चूहों को एक कक्ष में रखें और ओ2 स्तर को 75% तक स्थापित करें। चूहों को 5 दिनों तक कक्ष में रखें, जब तक कि P12 न हो जाए। हाइपरऑक्सिया इंडक्शन के दौरान चैंबर खोलने से बचें। ओ 2 सिलेंडर के गैसप्रेशर की जांच करें और जरूरत पड़ने पर सिलेंडर को बदलें। इंडक्शन के दौरान जानवरों की निगरानी करें।
  7. माउस पिंजरों को कक्ष से बाहर ले जाएं और सभी पिल्ले का वजन करें। वजन के आधार पर पिल्ले समूह इतना है कि प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह पिल्ले में समान वजन वितरण किया है ।

2. प्रायोगिक जानवरों और चूहा OIR मॉडल प्रेरण (अर्द्ध बंद प्रणाली का उपयोग कर)

नोट: एक ही दिन में पैदा हुए पिल्ले को प्राप्त करने के लिए समय-संभोग जानवरों का उपयोग करें। चूहा ओआईआर के लिए, चूहे के मॉडल में पर्याप्त एनवी प्रेरण प्राप्त करने के लिए लगभग 18 पिल्ले/बांध, बढ़े हुए कूड़े के आकार का उपयोग करें । प्रत्येक कूड़े के लिए पर्याप्त पिल्ले प्राप्त करने के लिए कई कूड़े से पूल पिल्ले।

  1. शामिल होने से पहले और बाद में जानवरों के वजन को रिकॉर्ड करें, और बलिदान के समय।
  2. सुनिश्चित करें कि पिंजरे के तल पर पर्याप्त भोजन है, इसलिए बांधों में भोजन तक आसान पहुंच है।
  3. छानने का काम नहीं होने पर अतिरिक्त सीओ 2 को अवशोषित करने के लिए कक्ष केनीचे रंग संकेतक के साथ सोडा चूने जोड़ें।
  4. कक्ष के अंदर आर्द्रता और तापमान की निगरानी करें। कक्ष के तल पर सिलिका जेल जोड़कर अतिरिक्त आर्द्रता (चूहों की कई संख्या से उत्पन्न) को अवशोषित करें।
  5. 100% एन2 और सामान्य कमरे की हवा के साथ ओ2 सेंसर को कैलिब्रेट करें।
  6. चूहों को पी0 (जन्म के कुछ घंटे बाद) कक्ष में रखें। ओ2 लेवल को 50% तक सेट करें और24 घंटे के लिए ओ 2 सिलेंडर को चैंबर से कनेक्ट करें। इसके बाद सेटिंग्स को 10% O2 पर स्विच करें और 24 घंटे के लिए चैंबर में नाइट्रोजन (एन2)सिलेंडर कनेक्ट करें । 14 दिनों के लिए 50% और 10% O 2 के स्तर के बीच24 एच साइकिल चालन जारी रखें।
  7. अध्ययन के दौरान गैस की खपत और जानवरों की भलाई की निगरानी करें। 50/10% O 2 के बीच परिवर्तन के दौरान कक्षखोलें और जरूरत पड़ने पर अधिक भोजन और पानी जोड़ें। प्रेरण के दौरान जानवरों के पिंजरों को साफ करने के लिए बदलें।
  8. चूहे के पिंजरों को कक्ष से बाहर ले जाएं और सभी पिल्ले का वजन करें। वजन के आधार पर पिल्ले समूह इतना है कि प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह पिल्ले में समान वजन वितरण किया है ।

3. ड्रग एडमिनिस्ट्रेशन (वैकल्पिक)

नोट: ओआईआर में आमतौर पर उपयोग किया जाने वाला दवा प्रशासन मार्ग चूहों के लिए P12-P14 पर और चूहों के लिए P14 पर इंट्राविट्रियल उपचार (आईवीटी) द्वारा किया जाता है। प्रायोगिक सेटअप के आधार पर उपचार दिवस निर्धारित करें। जब पिल्ले के कई कूड़े प्रयोगों में उपयोग किए जाते हैं, तो उपचार समूहों को सभी कूड़े से जानवरों को विभाजित करें। अधिमानतः, दवा को केवल एक आंख में इंजेक्ट करें, और कॉन्ट्रालेट्रल आंख को नियंत्रण के रूप में रखें।

  1. जानवरों का वजन करें और पूंछ और/या कान के लिए पहचान के निशान बनाते हैं ।
  2. एनेस्थेटाइज जानवर या तो इंजेक्शन संज्ञाहरण के साथ (उदाहरण के लिए केटामाइन और मेडेटोमिडीन, 30 मिलीग्राम/किलो और चूहों के लिए ०.४ मिलीग्राम/किलो) या साँस लेना संज्ञाहरण (आइसोफ्लोरेन 2-3.5% आइसोफ्लारेन और 200-350 mL/min हवा प्रवाह) के साथ) । उंगलियों को पिंच करके संज्ञाहरण की गहराई की जांच करें। इलाज के दौरान जानवर को हीटिंग पैड पर रखें।
  3. स्थानीय संज्ञाहरण के लिए, पलक पर एनाल्जेसिक की एक बूंद लागू करें। आईवीटी प्रदर्शन करने से पहले पलक को सावधानी से संदंश के साथ खोलें, क्योंकि चूहे और चूहे P14 के आसपास अपनी आंखें खोलते हैं। कॉर्निया पर एनाल्जेसिक (जैसे, ऑक्सीबुप्रोकेन हाइड्रोक्लोराइड) की एक बूंद लागू करें।
  4. आईवीटी इंजेक्शन लगाने से पहले आयोडीन की एक बूंद लगाएं।
  5. आईवीटी इंजेक्शन के लिए एक 33-34 जी सुई संलग्न के साथ एक ग्लास सिरिंज का उपयोग करें। पलकों को नीचे दबाएं और आंखों की पुतली को संदंश से ग्रसन करें। इंजेक्शन को लिम्बस के पीछे करें, लगभग 45डिग्री कोण सुई में ऑप्टिक तंत्रिका की ओर इशारा करते हुए।
  6. इंट्राविट्रियल स्पेस में 1.0 माइक्रोन से अधिक इंजेक्शन लगाने से बचें। इंजेक्शन समाधान के भाटा से बचने के लिए दवा इंजेक्शन के बाद 30 एस के लिए जगह में सुई रखें।
  7. सुई को हटाने के बाद, रक्तस्राव या रेटिना क्षति जैसी किसी भी जटिलताओं के लिए आंख (उदाहरण के लिए, एक नेत्रदर्शी के साथ) की जांच करें। इंजेक्शन के बाद कॉर्निया के ऊपर एंटीबायोटिक मरहम लगाएं।
    नोट: चूहों के लिए आईवीटी इंजेक्शन की मात्रा 0.5 - 1.0 माइक्रोल होनी चाहिए।
  8. संज्ञाहरण रिवर्स (उदाहरण के लिए medetomidine (२.५ मिलीग्राम/kg) के लिए एक α2-विरोधी के साथ और पिंजरे में पिल्ला वापस । अध्ययन के अंत तक आम तौर पर कूड़े को घर करें।

4. वीवो इमेजिंग और इलेक्ट्रोरेटिनोग्राफी में (वैकल्पिक)

  1. यदि वांछित है, तो एंजियोजेनिक प्रतिक्रियाओं के दौरान रेटिना में विकसित होने वाले परिवर्तनों को रिकॉर्ड करने के लिए अनुवर्ती अवधि के दौरान जीवित जानवरों पर वीवो इमेजिंग में आचरण करें। उदाहरण के लिए, वेक्यूलेचर(चित्र 4)की कल्पना करने के लिए फ्लोरोसिन एंजियोग्राफी (एफए) या स्कैनिंग लेजर कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी19 करें। वीवो(चित्रा 4)में रेटिना परतों की कल्पना करने के लिए स्पेक्ट्रल डोमेन ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी (एसडी-OCT) का उपयोग करें।
  2. यदि वांछित है, तो इलेक्ट्रोरेटिनोग्राफी (ईआरजी)(चित्रा 5)का उपयोग करके ओआईआर प्रेरण के बाद विभिन्न रेटिना सेल आबादी में कार्यात्मक परिवर्तनों की जांच करें।

5. ऊतक संग्रह और रेटिना फ्लैट माउंट की तैयारी

नोट: वांछित अनुसंधान परिकल्पना के अनुसार ऊतकों को इकट्ठा करें। चूहों के लिए, पी 12 (हाइपरऑक्सिक चरण के बाद वासो-विलोपन का अध्ययन करने के लिए) या हाइपोक्सिक अवधि (P13-P17) में उदाहरण के लिए नमूने एकत्र करें। NV राशि में चोटी का पता लगाने के लिए, नमूने के लिए सबसे आम समय बिंदु है, जो P17 पर माउस OIR नमूने ले लीजिए। चूहा OIR में, NV(चित्रा 3)की उच्चतम राशि का पालन करने के लिए P18-P21 में नमूने एकत्र करें ।

  1. सैंपलिंग से पहले जानवरों का वजन करें।
  2. रेटिना वैक्यूलेचर को लेबल करने के लिए, गहराई से एनेस्थेटाइज्ड जानवरों को फिटसी-डेक्सट्रान के साथ ट्रांसकार्डिबद्ध किया जा सकता है। (वैकल्पिक रूप से, बाद में आइसोलेक्टिन के साथ रेटिना फ्लैट माउंट दाग)।
  3. संज्ञाहरण दवाओं के या तो अधिक मात्रा का उपयोग कर जानवरों का बलिदान (उदाहरण के लिए केटामाइन और मेडेटोमिडीन, ३०० मिलीग्राम/किलो और चूहों के लिए 4 मिलीग्राम/किलो) या सह2 साँस लेना ।
  4. घुमावदार संदंश के साथ आंखों की पुतली के पीछे हथियाने के द्वारा जानवरों की आंखों को ले लीजिए, आंखों के चारों ओर ऊतक काटें और आंखों को कक्षा से बाहर उठाएं।
  5. ताजा मेड में आंखों को इनक्यूबेट करें, 1-4 घंटे के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (फॉस्फेट-बफर नमकीन, पीबीएस में) फ़िल्टर किया। फिक्सेटिव निकालें और पीबीएस के साथ आंखों 3 x 10 मिनट धोएं। रेटिना को तुरंत विच्छेदन करें या उन्हें पीबीएस में +4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    सावधानी: पैराफॉर्मलडिहाइड त्वचा के संपर्क में और निगलने पर साँस लेने से विषाक्त है। इसके साथ काम करने से पहले सेफ्टी डाटा शीट पढ़ें।
    नोट: रेटिना टुकड़ी से बचने के लिए नमूना या ऊतक प्रसंस्करण के किसी भी चरण के दौरान आंखों की पुतली पर दबाव न लगाएं, यदि पूरी आंखों से क्रॉस-सेक्शन किए जाते हैं।
  6. एनवी की मात्रा और एवीए के आकार की मात्रा निर्धारित करने के लिए रेटिना फ्लैट माउंट तैयार करें। वैकल्पिक रूप से, हिस्टोलॉजी, या आरएनए या प्रोटीन विश्लेषण के लिए आंखों/रेटिना को संसाधित करें। माइक्रो कैंची और संदंश का उपयोग कर एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत रेटिना विच्छेदन।
    1. पीबीएस में आंखों की पुतली रखें इसे नम रखने के लिए और एक सुई (23G) के साथ लिम्बस पर आंखों की पुतली पंचर और आईरिस और कॉर्निया को हटाने के लिए घुमावदार माइक्रो कैंची के साथ लिम्बस के आसपास काटें ।
    2. सावधानी से स्क्लेरा और रेटिना के बीच कैंची की नोक रखें और ऑप्टिक तंत्रिका की ओर स्क्लेरा काट लें। आंखों की पुतली के दूसरी तरफ भी ऐसा ही करें, और रेटिना कप के उजागर होने तक स्क्लीरा को ध्यान से काट/फाड़ दें । रेटिना कप से लेंस बाहर खींचो और कप के लिए PBS जोड़ें ।
    3. रेटिना को नुकसान पहुंचाए बिना सभी हायलाइड जहाजों, विट्रेस और मलबे को हटा दें। रेटिना कप में पीबीएस डालकर रेटिना धो लें। फूल जैसी संरचना बनाने के लिए सीधे माइक्रो कैंची से रेटिना में चार चीरों (12, 3, 6 और 9 बजे) करें। वैकल्पिक रूप से, नमूनों को बढ़ते से पहले सर्जिकल ब्लेड के साथ कटौती करें। धुंधला करने के लिए एक अच्छी तरह से थाली के लिए एक नरम तूलिका का उपयोग कर रेटिना लिफ्ट ।
  7. आइसोलेक्टिन बी 4 का उपयोग करके रेटिना वैक्यूलेचर को लेबल करें जो एंडोथेलियल कोशिकाओं की सतह को दाग देता है(यदि जानवरों को फिटसी-डेक्सट्रान के साथ नहीं किया गया था)। 1 घंटे के लिए बफर (टीबीएस में 10% एनजी + 0.5% ट्राइटन) को अवरुद्ध करने में रेटिना को इनक्यूबेट करें और 10 मिनट के लिए टीबीएस में 1% एनजी + 0.1% ट्राइटन के साथ धोएं। प्रकाश से सुरक्षित रहते हुए रात भर टीबीएस में1% एनजीएस + 0.1% ट्राइटन में फ्लोरोसेंट डाई कंजूज्ड आइसोलेक्टिन बी (5-10μg/ml) के साथ रेटिना को इनक्यूबेट करें।
    नोट: यदि वांछित है, तो विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके भड़काऊ कोशिकाओं और पेरिसाइट्स जैसी अन्य कोशिकाओं को लेबल करें।
  8. टीबीएस में 1% एनजी + 0.1% ट्राइटन के साथ 10 मिनट के लिए रेटिना 3x धोएं और एक सूक्ष्म स्लाइड पर रेटिना उठाएं, आंतरिक रेटिना ऊपर की ओर सामना करना पड़ रहा है। नरम तूलिका का उपयोग करके रेटिना को सावधानीपूर्वक फैलाएं और किसी भी शेष हाइलाइड जहाजों या मलबे को हटा दें। एक कवर स्लिप में बढ़ते माध्यम जोड़ें और इसे रेटिना के शीर्ष पर रखें। रेटिना को +4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और प्रकाश से बचाएं।

6. फ्लैट माउंट का विश्लेषण

  1. 10x उद्देश्य के साथ फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके रेटिना फ्लैट माउंट की छवियां लें। सतही संवहनी प्लेक्सस और प्रीरेटिनल नियोवैस्कुलराइजेशन पर ध्यान केंद्रित करें। पूरे रेटिना पर कब्जा करने और टाइल स्कैन विलय करने के लिए एक टाइल स्कैन छवि बनाओ
  2. एक छवि प्रसंस्करण कार्यक्रम (सामग्रीकी तालिका देखें) का उपयोग करके एवीए, एनवी के क्षेत्र और कुल रेटिना क्षेत्र को मापकर छवियों की मात्रा निर्धारित करें।
    1. एक मुक्त हाथ ड्राइंग उपकरण का उपयोग करके एवीए और कुल रेटिना क्षेत्र ड्रा करें और चयन उपकरण का उपयोग करके नियोवैस्कुलर क्षेत्रों का चयन करें। सॉफ्टवेयर पिक्सल में रुचि के क्षेत्रों को मापता है, और AVA और NV क्षेत्रों (पिक्सल में व्यक्त) कुल रेटिना क्षेत्र के संबंध में उनके प्रतिशत की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, कुछ सॉफ्टवेयर उपकरण एनवी की मात्रा निर्धारित करने के लिए उपलब्ध हैं।
      नोट: हाल ही में, डीप लर्निंग न्यूरल नेटवर्क का उपयोग करके ओआईआर छवियों के प्रमुख मूल्यों के परिमाणीकरण के लिए एक खुला स्रोत, पूरी तरह से स्वचालित कार्यक्रम पेश किए गए हैं और रेटिना एवीए और एनवी (जैसे, https://github.com/uw-biomedical-ml/oir/tree/bf75f9346064f1425b8b9408ab792b1531a86c64)20, 21के प्रजनन योग्य मात्राकरण के लिए एक विश्वसनीय उपकरण प्रदान करते हैं।
  3. यदि व्यक्तिगत कोशिका आबादी के इम्यूनोहिस्टोकेमिकल डिटेक्शन के लिए एंटीबॉडी का उपयोग करते हैं, तो रेटिना फ्लैट माउंट से या वांछित होने पर स्वचालित छवि विश्लेषण प्रणालियों से दाग कोशिकाओं (जैसे माइक्रोग्लिया, चित्रा 2B)की संख्या निर्धारित करें।

7. सांख्यिकी

  1. छात्र के टी परीक्षण या एक तरह से ANOVA द्वारा सामान्य रूप से वितरित डेटा का विश्लेषण करें, जिसके बाद डननेट या तुकी के कई तुलना परीक्षण, उपयुक्त के रूप में। गैर-सामान्य रूप से वितरित डेटा के लिए मान-व्हिटनी यू टेस्ट या क्रुस्कल वालिस टेस्ट जैसे गैर-परमेट्रिक परीक्षणों का उपयोग करें। पी एंड एलटी; 0.05 स्तर पर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण मतभेदों पर विचार करें।

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Representative Results

मॉडल का मुख्य परिणाम संवहनी फेनोटाइप है: एवीए का आकार और एनवी की मात्रा। माउस ओआईआर मॉडल में, वासो-विलोपन केंद्रीय रेटिना(चित्रा 2 ए)में होता है, जबकि चूहे के मॉडल में यह परिधि में विकसित होता है, यानी, मानव ROP22 (चित्रा 3A) केसमान। इसका कारण यह है कि सतही संवहनी जाल पहले से ही विकसित हो चुका है जब चूहों को हाइपरऑक्सिया के संपर्क में लाया जाता है, जबकि चूहे मॉडल में रेटिना ओआईआर प्रेरण (पी0) के समय अवस्कुलर होता है। प्रीरेटिनल नियोवैस्कुलराइजेशन अवस्कुलर क्षेत्रों के पास विकसित होता है, यानी माउस में केंद्रीय रेटिना, और चूहों में परिधि(चित्रा 2 ए और चित्रा 3 ए)।

ओआईआर रेटिना में रूपात्मक परिवर्तनों या सेल प्रकार की रुचि की उपस्थिति का मूल्यांकन करने के लिए क्रॉस-सेक्शन या फ्लैट माउंट का उपयोग करके हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण किया जा सकता है, उदाहरण के लिए भड़काऊ कोशिकाएं(चित्रा 2 बी)। रेटिना के अलावा, ओआईआर मॉडल के दौरान विभिन्न समय बिंदुओं में आगे जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए पूरी आंख या विट्रियस नमूने एकत्र किए जा सकते हैं। जीन या प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर को मानक तरीकों के साथ विश्लेषण किया जा सकता है, जैसे आरटी-क्यूपीसीआर या पश्चिमी ब्लॉटिंग।

वैकल्पिक रूप से, वीवो इमेजिंग में गैर-आक्रामक ओआईआर अनुवर्ती अवधि के दौरान आयोजित किया जा सकता है। रेटिनल और हायलॉयड वेक्यूलेचर को एफए(चित्रा 4A)के साथ कल्पना की जा सकती है। एसडी-OCT का उपयोग रेटिना(चित्रा 4 बी)में संरचनात्मक परिवर्तनों का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है। रेटिना में कार्यात्मक परिवर्तन ईआरजी(चित्रा 5)द्वारा मापा जा सकता है ।

वैस्कुलर एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (VEGF) के अवरोधक आमतौर पर मानव एंजियोजेनिक नेत्र रोगों के उपचार में उपयोग किए जाते हैं। इस प्रकार, एंटी-वीजीएफ का उपयोग अक्सर ओआईआर में संदर्भ यौगिक के रूप में किया जाता है। Aflibercept, जो घुलनशील VEGF-जाल के रूप में काम करता है, उच्च और निम्न दोनों खुराक (P14 पर इंजेक्ट) में ओआईआर में एनवी और शारीरिक पुनर्संवहन दोनों को रोकता है। ओआईआर आंखें P14 पर एफलिबरसेप्ट की उच्च खुराक के साथ इंजेक्ट की गई थीं, जिसमें अनुपचारित आंखों(चित्र 6)की तुलना में भी बड़ा रेटिना एवीए था। इससे पता चलता है कि एफ्लिबरसेप्ट ब्लॉक भी हाइपोक्सिया द्वारा संचालित शारीरिक रेटिना पुनर्संवहन। माउस और चूहा मॉडल दोनों का उपयोग रेटिना एनवी और रेटिना के शारीरिक पुनर्संवहन(चित्रा 3 बी और चित्रा 6)पर विभिन्न एंटी-एंजियोजेनिक एजेंटों के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: चूहों और चूहों के लिए एक मानक OIR अध्ययन डिजाइन का चित्रमय अवलोकन। (A)माउस ओआईआर मॉडल को चूहों को पी 7 से पी12 तक 75% O2 में उजागर करके प्रेरित किया गया था और सामान्य कमरे की हवा में लौट आया था। प्रीरेटिनल एनवी की चोटी P17 में देखी गई थी, जो आमतौर पर प्रयोग के लिए नमूना बिंदु है। (ख)चूहा ओआईआर मॉडल को चूहों कोपी0 से पी 14 तक ओ 2 स्तरों (50/10% O2)को बारी-बारी से उजागर करके प्रेरित किया गया था और नॉर्मॉक्सिक परिस्थितियों में लौट आया था । चूहों आमतौर पर P20 में बलिदान कर रहे हैं, जब NV की राशि नुकीला । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: माउस ओआईआर मॉडल में वैस्कुलर फेनोटाइप। माउस ओआईआर मॉडल को चित्र 1 में वर्णित के रूप में उत्पन्न किया गया था। (क)सतही संवहनी जाल सामान्य चूहों में विकसित हुआ जबकि ओआईआर चूहों को पी 7 से पी 12 तक 75% O2 के संपर्क में किया गया। इस समय के दौरान, केंद्रीय रेटिना में संवहनी विलोपन विकसित हुआ (मात्रात्मक छवियों में P12 और P17 में नीले रंग में चिह्नित)। चूहों को सामान्य कमरे की हवा में वापस कर दिया गया, और अवस्कुलर रेटिना हाइपोक्सिक बन गया, जिससे रेटिना और पैथोलॉजिकल एनवी में कार्यात्मक पोत पुनर्विकास हो गया (निचले पैनल में P17 में लाल रंग में चिह्नित)। केंद्रीय रेटिना में संवहनी और अवस्कुलर क्षेत्रों के बीच प्रीरेटिनल नियोवैस्कुलर टफ्ट्स विकसित हुए। एनवी की राशि P17 पर नुकीला और बाद में पीछे हट गया । रेटिना पूरी तरह से पुनर्वहनी और NV P24-P25 के आसपास पीछे हट गया था । (ख)रेटिना फ्लैट माउंट के इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला का एक उदाहरण रेटिना आईबीए-1 सना हुआ माइक्रोग्लिया (हरा) और जीएस-आईबी4 दाग रक्त वाहिकाओं (लाल) P12 और P17 में दिखा । (ग)P17 में एक माउस OIR आंख के पार अनुभाग, जहां प्रीरेटिनल टफ्ट्स (तीर) vitreous की ओर अंकुरण कर रहे थे । इसके अलावा, आंतरिक परमाणु परत (आईएनएल) और बाहरी प्लेक्सिफॉर्म लेयर (ओपीएल) की पतली देखी गई। स्केल बार ए में 1 मिमी, बी में 50 माइक्रोन, और सी आईएलएम में 100 माइक्रोन = इनर सीमन झिल्ली, जीसीएल = गैंगलियन सेल लेयर, आईपीएल = इनर प्लेक्सिफॉर्म लेयर, आईएनएल = इनर न्यूक्लियर लेयर, ओपीएल = बाहरी प्लेक्सीफॉर्म लेयर, ओएनएल = बाहरी परमाणु परत, आरपीई = रेटिना पिगमेंट एपिथेलियम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: संवहनी फेनोटाइप और चूहा ओआईआर मॉडल में इसका विकास। (A)मानव आरओपी के समान रेटिना की परिधि में विकसित अवस्कुलर क्षेत्र (नीले रंग में चिह्नित) और एनवी (लाल रंग में चिह्नित) । (ख)ओआईआर रेटिना में एवीए देखा गया, लेकिन नॉर्मॉक्सिक नियंत्रणों में नहीं। (ग)एनवी के क्षेत्र का परिमाणीकरण ने पी-20 में एनवी की मात्रा में एक चोटी की ओर रुझान दिखाया, लेकिन ओआईआर में पी18 और पी21 की तुलना में अंतर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण नहीं था । (छात्र का टी-टेस्ट, समय मिलान नॉर्मॉक्सिक और ओआईआर रेटिना के बीच, ** पी ≤ 0.01, *** पी ≤ 0.001, जानवरों की दोनों आंखें ग्राफ में साजिश रची)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: वीवो इमेजिंग में चूहा ओआईआर मॉडल में फ्लोरोसेइन एंजियोग्राफी (एफए) और स्पेक्ट्रल डोमेन ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी (एसडी-OCT) का उपयोग करके। (A)नॉर्मॉक्सिक पी19 चूहों की तुलना में पी18 में केंद्रीय रेटिना (शीर्ष पंक्ति) और ओआईआर चूहों में पी20 से ली गई छवियों में संवहनी टॉर्टुओसिटी (एरोहेड) देखा गया था । NV (तीर) और एवीएएस (तारांकन) रेटिना (मध्य पंक्ति) की परिधि के लिए विकसित के रूप में P18 और P20 OIR रेटिना में देखा । पीछे बहिष्क जलयानों (नीचे पंक्ति) एफए द्वारा कब्जा कर लिया गया था ।(बी)विट्रियस की ओर रक्त वाहिका विकास ओआईआर रेटिना (तीर) में तंत्रिका फाइबर परत (एनएफएल) और गैंगलियन सेल लेयर (जीसीएल) पर एक मोटा के रूप में देखा गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: रेटिना न्यूरॉन्स की कार्यक्षमता फ्लैश इलेक्ट्रोरेटिनोग्राफी (FERG) का उपयोग करके मापा जा सकता है। (क)ए-वेव्स रेटिना शंकु और रॉड फोटोरिसेप्टर्स से प्राप्त किए गए थे और चूहे ओआईआर मॉडल में उनके आयामों में काफी कमी आई थी। प्रभाव एक उच्च प्रकाश तीव्रता के साथ वृद्धि हुई, सुझाव है कि दोष मुख्य रूप से शंकु फोटोरिसेप्टर कार्यों को प्रभावित कर रहे थे । (ख)ओआईआर जानवरों से बी-वेव आयाम नॉर्मॉक्सिक नियंत्रणों की तुलना में कम हो गए थे । बी-तरंगें ऑन-बाइपोलर कोशिकाओं और मुलर कोशिकाओं से ली गई थीं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: इंट्राविट्रेली इंजेक्ट किए गए पीबीएस माउस ओआईआर मॉडल में एनवी और एवीए को कम कर देता है। (A)रेटिना फ्लैट की प्रतिनिधि छवियां अनुपचारित से माउंट, और aflibercept-इलाज (P14 में 20 μg) और PBS P17 में OIR आंखें इंजेक्शन । एफ्लोबरसेप्ट (20 माइक्रोग्राम) की उच्च खुराक ने एवीए के आकार में 47% (सफेद में उल्लिखित) की वृद्धि की और अनुपचारित नियंत्रणों की तुलना में एनवी को 98% (तीर) से बाधित किया। पीबीएस इंजेक्शन अनुपचारित नियंत्रण की तुलना में 31% और एनवी द्वारा 42% की कमी आई। इसके अलावा, स्क्लेरा के पंचर जैसे आईवीटी ने पीबीएस के आईवीटी इंजेक्शन के समान प्रभाव पैदा किए, लेकिन मतभेद सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण नहीं थे। हाइलाइड जहाजों पर एरोहेड पॉइंट्स जिन्हें विच्छेदन के दौरान नहीं हटाया गया था। (वन-वे इनोवा, * पी ≤ ०.०५; ** पी ≤ ०.०१, *** पी ≤ ०.००१, **** पी ≤ ०.०००१) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

रोग फेनोटाइप की गंभीरता माउस और चूहा ओआईआर मॉडल दोनों में तनाव और यहां तक कि विक्रेता दोनों पर निर्भर है23. इससे पता चलता है कि पैथोलॉजी विकास में व्यापक जीनोटिपिक परिवर्तनशीलता है। सामान्य तौर पर, वर्णक कृंतक एल्बिनो लोगों की तुलना में अधिक गंभीर फेनोटाइप विकसित करते हैं। उदाहरण के लिए, एल्बिनो बाल्ब/सी का रेटिना वैक्यूलेचर हाइपरऑक्सिया के बाद तेजी से पुनः वर्गीकृत होता है और सभी24पर एनवी विकसित नहीं होता है । इसी तरह, चूहों में, पिगमेंटेड ब्राउन नॉर्वे चूहों एल्बिनो स्प्राग डाले (एसडी) चूहों की तुलना में अधिक गंभीर विकृति दिखाते हैं25। एसडी चूहों आमतौर पर तनाव का इस्तेमाल किया जाता है, और ओआईआर फेनोटाइप में विक्रेता से संबंधित मतभेदों को तनाव के भीतर सूचित किया गया है । उदाहरण के लिए, चार्ल्स नदी से एसडी चूहे हार्लन या जिविक-मिलर23से चूहों की तुलना में काफी अधिक एनवी का उत्पादन करते हैं । C3H/HeJ चूहों, बदले में, कि रेटिना अध: पतन 1(Rd1)जीन में एक उत्परिवर्तन है, पतली रेटिना है, और NV26विकसित नहीं है । इन कारणों और ट्रांसजेनिक चूहों लाइनों की उपलब्धता के कारण, inbred C57BL/6J OIR अध्ययन के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया माउस तनाव है । हालांकि, हाइपरऑक्सिक एक्सपोजर के कारण C57BL/6J बांधों के बीच काफी अधिक मृत्यु दर है, इसलिए चूहों की भलाई पर विचार करने की जरूरत है जब अध्ययन डिजाइन और प्रयोगों के दौरान निगरानी की । इसके अलावा, बाल्ब/सी चूहों27की तुलना में C57BL/6 चूहों में वृद्धि फोटोरिसेप्टर क्षति देखी जाती है ।

चूहों की भलाई और बांधों और पिल्ले के अस्तित्व को सुनिश्चित करने के लिए, कूड़े का आकार छोटा रखा जाना चाहिए (6-7 पिल्ले/बांध)। C57BL/6 चूहों का उपयोग करते समय यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, जो हाइपरऑक्सिक तनाव27,28के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं। इसके अलावा, चूहों को आसानी से सुलभ समर्थन भोजन (पिंजरे के नीचे रखा गया) प्रदान किया जाना चाहिए। कुछ शोधकर्ताओं ने ऑक्सीजन प्रेरण के बाद स्वस्थ लोगों के साथ चैंबर में बांधों की जगह सरोगेट बांधों का उपयोग करें । हालांकि, अधिकांश शोधकर्ता किराए का उपयोग तभी करते हैं जब बांध22,29समाप्त हो जाता है। यदि बड़े कूड़े के आकार का उपयोग किया जाता है तो सरोगेट बांधों का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। यह प्रकाशित किया गया है कि 129S3/SvIM चूहों C57BL/6 से अधिक NV का उत्पादन और बेहतर ऑक्सीजन के स्तर28बदलती की वजह से परिवर्तन को बनाए रखने । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि ओआईआर में उपयोग किए जाने वाले बांध ओआईआर के प्रेरण के बाद अनुपठ्ठन नहीं हैं और इनका उपयोग आगे प्रजननउद्देश्योंके लिए नहीं किया जाना चाहिए . पिल्ले का प्रसवोत्तर वजन ओआईआर विकृति की गंभीरता को प्रभावित करता है। खराब प्रसवोत्तर वजन के साथ पिल्ले (P17 में <5 ग्राम) VEGF की देरी से अभिव्यक्ति दिखाते हैं और इस प्रकार सामान्य (पी17 में 5 -7.5 ग्राम) या व्यापक वजन (P17 पर 7.5 ग्राम)29के साथ पिल्ले की तुलना में रेटिनोपैथी के लंबे चरण। इसके अलावा, पी 7 में 5 ग्राम से अधिक वजन वाले चूहों पिल्ले ओआईआर प्रेरण30के बाद वासो-काटना क्षेत्र नहीं दिखाते हैं। इस प्रकार, प्रयोग के दौरान पिल्ले का वजन करना महत्वपूर्ण है। कॉन्ट्रालेट्रल अनुपचारित आंख का उपयोग आंतरिक नियंत्रण के रूप में किया जा सकता है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि चूहों की पोषण स्थिति परिणामों को प्रभावित नहीं करती है। चूहों में स्थिति समान है; पिल्ले जितने छोटे होते हैं, उतने ही अधिक गंभीर ओइर फेनोटाइप वे31विकसित होते हैं । इस प्रकार, बड़े कूड़े के आकार (लगभग 18 पिल्ले) चूहा OIR मॉडल के लिए इस्तेमाल करने की सिफारिश की है।

ओआईआर मॉडल इंडक्शन पूरी तरह से बंद प्रणाली का उपयोग करके किया जा सकता है, जहां एक पंप के साथ एक बंद-लूप सर्किट होता है जो एक फिल्टर सिस्टम (सोडा चूने और सक्रिय कार्बन) के माध्यम से हवा को वापस कक्ष में प्रसारित करता है। एक अन्य विकल्प एक अर्ध-बंद प्रणाली है, जहां वेंटिलेशन यह सुनिश्चित करता है कि अतिरिक्त मेटाबोलाइट्स को कक्ष से हटा दिया जाता है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि अतिरिक्त सीओ2 को हटा दिया जाता है, सोडा चूना (सोडियम हाइड्रोक्साइड या पोटेशियम हाइड्रोक्साइड के साथ कैल्शियम हाइड्रोक्साइड का मिश्रण) कक्ष के नीचे रखा जा सकता है। सीओ2 को हटाना अनिवार्य है क्योंकि उच्च सीओ2 का स्तर चूहों में रोग फेनोटाइप को खराब कर देता है32. किसी को नियमित रूप से कक्ष के ऑक्सीजन सेंसर को पुनः प्राप्त करना याद रखना चाहिए क्योंकि वे समय के साथ बहाव करते हैं और एक इरादा से गलत ऑक्सीजन एकाग्रता प्रदान कर सकते हैं।

यह सूचित किया गया है कि वाहन इंजेक्शन (पीबीएस) अकेले या यहां तक कि इंट्रावाइड्रियल स्पेस में पंचर करने से पुनर्संवहन दर और एनवी की मात्रा(चित्र 6)33 , 34,35, 36,36पर प्रभाव पड़ता है । यह अनुमान लगाया गया है कि क्या पीबीएस/वाहन इंजेक्शन के साथ देखा गया प्रभाव इंजेक्शन के दौरान इंट्राओक्यूलर दबाव में परिवर्तन के कारण हो सकता है, या नेत्र संरचनाओं को चोट के कारण हो सकता है जो उन दोनों के बीच एंजियोजेनिक विकास कारकों के स्तर को बढ़ाता है वर्णक एपिथेलियम-व्युत्पन्न विकास कारक३४,३७। इसके अलावा, केवल एक पायलट सबरेटिनल इंजेक्शन (सबरेटिनल स्पेस को पंचर) को अनुपचारित चूहों38की तुलना में ओआईआर में संवहनी और कार्यात्मक फेनोटाइप पर प्रभाव पड़ता है। ये परिणाम OIR अध्ययन या यहां तक कि परीक्षण यौगिकों के प्रणालीगत प्रशासन में उचित नकारात्मक नियंत्रण के महत्व को उजागर करते हैं, साथ ही प्रत्येक अध्ययन समूह में पर्याप्त एन-नंबर भी बड़े होते हैं। तथ्य यह है कि वाहन इंजेक्शन वास्तव में रेटिना में पुनर्संवहन दर को बढ़ाता है पुनर्वैस्कुलराइजेशन दर और पैथोलॉजिकल प्रीरेटिनल टफ्ट्स का गठन ओआईआर मॉडल में अंतर-संबंधित है: यदि पुनर्वैस्कुलरीकरण दर में तेजी आती है, तो यह नेवस्कुलर टफ्ट्स और इसके विपरीत की प्रतिपूरक डाउनरेगुलेशन की ओर जाता है। इस प्रकार, ओआईआर मॉडल के दोनों प्राथमिक परिणाम उपाय वाहन इंजेक्शन से प्रभावित होते हैं।

VEGF अवरोधकों ने उपचार एएमडी में क्रांति ला दी है और डॉ ओआईआर मॉडल का उपयोग उनकी प्रभावकारिता को पूर्व-प्रभावकारिता प्रदर्शित करने के लिए किया गया था। OIR में VEGF अवरोधकों के विषय में, विभिन्न एंटी-VEGFs और एंटी-पीएलजीएफ (अपरा विकास कारक) (P12 में इंजेक्शन) की तुलना करने वाले एक अध्ययन से पता चला है कि अकेले एंटी-वीजीएफ ने छोटे अवस्कुलर क्षेत्रों का नेतृत्व किया, जबकि एंटी-पीडब्ल्यूएफ उपचारित आंखों में बड़ा अवस्कुलर क्षेत्र था३३। अन्य दवा उपचार33की तुलना में एफ्लिबेरसेप्ट में सबसे बड़ा एवीएएस था। Aflibercept दोनों VEGF और PlGF39बांध करने के लिए जाना जाता है, यह हो सकता है कि OIR में पीएलजीएफ बाधा शारीरिक एंजियोजेनेसिस के अवरुद्ध करने के लिए होता है।

वीवो इमेजिंग में नॉनइनवेसिव अनुवर्ती अवधि के दौरान रेटिना वैक्यूलेचर40 और रेटिना परतों और संरचना की निगरानी के लिए एक उपकरण प्रदान करता है। एफए का उपयोग करते हुए, संवहनी घनत्व और धमनी टॉर्टुओसिटी और शिरागत फैलाव (जिसे प्लस रोग, चित्रा 4 एकहा जाता है) जैसे मापदंडों को40,41मापा जा सकता है। एसडी-OCT का उपयोग संरचनात्मक परिवर्तनों के मूल्यांकन और ओआईआर अनुवर्ती अवधि42,43के दौरान रेटिना मोटाई को मापने के लिए किया जा सकता है। ईआरजी का उपयोग रेटिना में कार्यात्मक परिवर्तनों को मापने के लिए किया जाता है। विभिन्न सेल प्रकार प्रकाश उत्तेजना के बाद बिजली की क्षमता का उत्पादन करते हैं, और इन संकेतों या "तरंगों" को ईआरजी के साथ मापा जा सकता है। फोटोरिसेप्टर नकारात्मक ए-वेव का उत्पादन कर रहे हैं, और द्विध्रुवी कोशिकाओं और मुलर कोशिकाओं पर मुख्य रूप से बी-वेव44के लिए जिम्मेदार हैं। रेटिना समारोह का नुकसान ओआईआर चूहों और चूहों45, 46 (चित्रा 5)में विशिष्ट है। रेटिना में लंबे समय तक चलने वाले परिवर्तन और रीवैस्कुलराइजेशन और एनवी प्रतिगमन34,47के बाद भी ओआईआर रेटिना में प्रोटीन स्तर में कार्यात्मक परिवर्तन और परिवर्तन दोनों की सूचना मिली है ।

रेटिना वैक्यूलेचर की कल्पना करने के लिए, लाइव चूहों को या तो फिटसी-लेबल डेक्सट्रान के साथ किया जा सकता है या रेटिना फ्लैट माउंट को फ्लोरोसेंट डाई लेबल वाले आइसोलेक्टिन बी4से दाग दिया जा सकता है। किसी को फ्लोरोसेंट रंगों के बीच के अंतर को समझने की जरूरत है; फिटसी-डेक्सट्रांस के साथ परफ्यूजन केवल जहाजों के ल्यूमेन को लेबल करता है, जबकि आइसोलेक्टिन बी4 एंडोथेलियल कोशिकाओं की सतह को दाग देता है। इस प्रकार, उचित ल्यूमेन के साथ कार्यात्मक रक्त वाहिकाओं को केवल फिटसी-डेक्सट्रन परफ्यूजन के साथ कल्पना की जाएगी, जबकि एनवी का कुल क्षेत्र फिटसी-डेक्सट्रान परफ्यूसेस किए गए जानवरों की तुलना में आइसोलेक्टिन बी4 दाग रेटिना में बड़ा दिखाई देता है, क्योंकि आइसोलेक्टिन बी4 अनिवार्य रूप से एंडोथेलियल कोशिकाओं को भी उठाता है जिन्होंनेअभीतक कार्यात्मक ल्यूमेन नहीं बनाए हैं। 3-डी प्रारूप में पूरे रेटिना/आंख की गेंद की कल्पना करने के लिए एक और हाल ही में विकल्प दो फोटॉन फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी(४९)द्वारा गहरे ऊतक इमेजिंग है ।

कृंतक ओआईआर मॉडल, साथ ही सामान्य रूप से पशु मॉडल, केवल आंशिक रूप से मानव रोगों की विशेषताओं का प्रतिनिधित्व करते हैं। ओआईआर से संबंधित प्रमुख अंतर यह है कि रेटिना नियोवैस्कुलराइजेशन कृंतक ओआईआर में फाइब्रोसिस से जुड़ा नहीं है, जबकि रेटिना नियोवैस्कुलराइजेशन आमतौर पर मानव नियोवैस्कुलर रेटिना रोगों में फाइब्रोवैस्कुलर प्रसार की ओर जाता है। इसके अलावा, शर्तों है कि मानव रोग बनाम OIR कारण लगभग विपरीत हो सकता है । आरओपी के साथ अपरिपक्व नवजातों को श्वसन सहायता के साथ पूरक ऑक्सीजन की आवश्यकता होती है, आवर्ती एपनिया के कारण अक्सर आंतरायिक हाइपोक्सेमिक और हाइपरऑक्सेमिक एपिसोड का अनुभव होता है, लेकिन वे ऑक्सीजन के उच्च स्तर के संपर्क में नहीं होते हैं। स्थायी क्षति को कम करने के लिए, प्रेरित ओ 2 के उच्च अंशों से बचाजाता है। इस संबंध में, न तो 5 दिनों के लिए 75% O2 के लिए लगातार जोखिम के साथ माउस मॉडल और न ही 50/10 चूहा मॉडल मानव ROP के रोगजनकों के समान है। इसके अलावा, चूहे और माउस ओआईआर मॉडल के बीच भी अंतर हैं। पी 24 द्वारा सामान्य जहाजों की फिर से स्थापना के साथ माउस मॉडल में नियोवैस्कुलराइजेशन पीछे हटता है, जबकि चूहे ओआईआर मॉडल (मानव आरओपी के समान) में स्थिति बदतर हो जाती है। हालांकि, चूहा ओआईआर मॉडल आरओपी की चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक विशेषताओं को दिखाता है जैसे कि विलंबित रेटिना संवहनी विकास और बाद में रोग नियोवैस्कुलराइजेशन, इसका उपयोग ट्रांसजेनिक चूहे के उपभेदों, उच्च रखरखाव लागत और माउस ओआईआर मॉडल की तुलना में कम एनवी की लगभग पूरी अनुपस्थिति से सीमित है।

एक साथ लिया गया, मानव इस्कीमिक प्रोलिफेरेटिव रेटिनोपैथी और कृंतक ओआईआर मॉडल के बीच मतभेदों के बावजूद, जिस आसानी से एनवी को प्रेरित किया जा सकता है, रेटिना के आसान दृश्य और मात्राकरण के साथ मिलकर, ओआईआर मॉडल को इस्केमिक प्रोलाइफेरेटिव रेटिनोपैथी के लिए आणविक तंत्र और संभावित चिकित्सीय का अध्ययन करने के लिए लोकप्रिय बनाते हैं। दिलचस्प बात यह है कि माउस ओआईआर मॉडल में हाइपरऑक्सिया एक्सपोजर मानव समय से पहले शिशुओं में पूरक ऑक्सीजन चिकित्सा के कारण होने वाली एक और बीमारी ब्रोन्कोपल्मोनरी डिस्प्लेसिया को भी प्रेरित करता है, जिसमें यह दर्शाया गया है कि ओआईआर मॉडल का उपयोग एक साथ50में रोप और ब्रोंकोपुल्मोनरी डिस्प्लेसिया दोनों के लिए उपन्यास लक्ष्यों का पता लगाने के लिए किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखक मारिया Vähätupa, पीएचडी, नीना Jäskeläinen, मार्क Cerrada-Gimenez, पीएचडी, और रुबीना थापा प्रयोगिका लिमिटेड के कर्मचारी हैं ।

लेखक Giedrius Kalesnykas, पीएचडी, एक कर्मचारी (राष्ट्रपति और मुख्य कार्यकारी अधिकारी) और प्रयोगिका लिमिटेड के शेयरधारक है कि अनुबंध अनुसंधान इस लेख में इस्तेमाल किया preclinical OIR मॉडल को रोजगार सेवाओं प्रदान करता है ।

टेरो जेरविनेन, एमडी, पीएचडी, और हैनेल यूसिटालो-जेआरविनेन, एमडी, पीएचडी, खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए मैरिऐनी कार्ल्सबर्ग, ऐनी मारी हापानीमी, पेवी पार्टन और ऐनी कनककुनेन को धन्यवाद देते हैं। इस काम को फिनलैंड अकादमी, पेविककी और सकरी सोहलबर्ग फाउंडेशन, टैम्परे तपेदिक फाउंडेशन, फिनिश मेडिकल फाउंडेशन, पीरकानमां अस्पताल जिला अनुसंधान फाउंडेशन और टैम्परे यूनिवर्सिटी हॉस्पिटल रिसर्च फंड द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
33 gauge, Small Hub RN Needle Hamilton Company 7803-05, 10mm, 25°, PS4 For intravitreal injection
Adobe Photoshop Adobe Inc. For image analysis
Air pump air100 Eheim GmbH & Co. KG. 143207 For inhalation anaesthesia
Anaesthesia unit 410 AP Univentor Ltd. 2360309 For inhalation anaesthesia
AnalaR NORMAPUR Soda lime VWR International Ltd 22666.362 For CO2 control during model induction
Attane Vet 1000 mg/g VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY vnr 17 05 79 For inhalation anaesthesia
Brush For preparation of flat mounts
Carbon dioxide gas For sacrifice
Celeris D430 ERG system Diagnosys LLC 121 For in vivo ERG
Cell culture dishes Greiner Bio-One International GmbH 664 160 For preparation of flat mounts
Cepetor Vet 1 mg/mL VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY vnr 08 78 96 For anaesthesia
Cover slips Thermo Fisher Scientific 15165452 For preparation of flat mounts
O2 Controlled InVivo Cabinet, Aninal Filtrarion System and Dehumidifier Coy Laboratory Products Closed system for disease model induction, optional for semi-closed system
E702 O2 sensor BioSphenix, Ltd. E207, 1801901 For oxygen level measurement
Envisu R2200 Spectral Domain Optical Coherence Tomograph (SD-OCT) Bioptigen, Inc. BPN000668 For in vivo imaging
Eye spears Beaver-Visitec International, Inc. 0008685 For intravitreal injection and in vivo imaging
Flexilux 600LL Cold light source Mikron 11140 For intravitreal injection or tissue collection
Fluorescein sodium salt Merck KGaA F6377-100G For in vivo imaging
Gas Exhaust unit (+Double 3-way valve, mouse and rat face masks, UNOsorb filter) UNO Roestvaststaal BV GEX 17015249 For inhalation anaesthesia
Glass syringe, Model 65 RN Hamilton Company 7633-01 For intravitreal injection
HRA2 Retina angiograph (FA) Heidelberg Engineering GmbH Spec-KT-05488 For in vivo imaging
Isolectin GS-IB4, Alexa Fluor 488 Conjugate Thermo Fisher Scientific I21411 For labeling retinal vasculature on flat mounts
Ketaminol Vet 50 mg/mL Intervet International B.V. vnr 51 14 85 For anaesthesia
Medicinal Oxygen gas For disease model induction
Mice C57BL/6JRj Janvier Labs Also other strains possible
Microscope slides Thermo Fisher Scientific J1800AMNZ For preparation of flat mounts
Minims Povidone Iodine 5% (unit) Bausch & Lomb U.K Limited vnr 24 11 304 For intravitreal injection
Nitrogen gas For disease model induction (rat)
Oftan Chlora 10 mg/g Santen Pharmaceutical Co., Ltd. vnr 55 01 11 For intravitreal injection
Oftan Metaoksedrin 100 mg/ml Santen Pharmaceutical Co., Ltd. vnr 55 03 43 For in vivo ERG
Oftan Obucain 4 mg/ml Santen Pharmaceutical Co., Ltd. vnr 55 03 50 For intravitreal injection
Oftan Tropicamid 5 mg/ml Santen Pharmaceutical Co., Ltd. vnr 04 12 36 For in vivo imaging
ProOx Model 110 O2 controller and animal chamber BioSphenix, Ltd. 803 For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system
ProOx Model P360 O2 controller and animal chamber BioSphenix, Ltd. 538 For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system
Rats CD(SD) Charles River Laboratories Also other strains possible
Revertor 5 mg/mL VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY vnr 13 04 97 For anaesthesia reversal
Silica gel For humidity control during model induction
Systane Ultra 10ml Alcon Tamro 2050250 For hydration of the eye
Systane Ultra unit 0.7ml Alcon Tamro 2064871 For hydration of the eye
Transfer pipette Thermo Fisher Scientific 1343-9108 For preparation of flat mounts
VENTI-Line VL 180 PRIME Drying oven VWR VL180S 170301 For drying silica gel
VisiScope SZT350 Stereomicroscope VWR 481067 For intravitreal injection or tissue collection

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References

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Vähätupa, M., Jääskeläinen, N., Cerrada-Gimenez, M., Thapa, R., Järvinen, T., Kalesnykas, G., Uusitalo-Järvinen, H. Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents. J. Vis. Exp. (163), e61482, doi:10.3791/61482 (2020).

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