Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Oksygenindusert retinopati modell for iskemiske retinale sykdommer hos gnagere

Published: September 16, 2020 doi: 10.3791/61482
Automatic Translation
1,2, 2, 2, 2, 1, 2, 1,3
1Faculty of Medicine and Health Technology, Tampere University & Tampere University Hospital, 2Experimentica Ltd, 3Eye Centre, Tampere University Hospital

Summary

Oksygenindusert retinopati (OIR) kan brukes til å modellere iskemiske retinale sykdommer som retinopati av prematuritet og proliferativ diabetisk retinopati og å tjene som modell for konseptbevisstudier i evaluering av antiangiogene legemidler for neovaskulære sykdommer. OIR induserer robust og reproduserbar neovaskularisering i netthinnen som kan kvantifiseres.

Abstract

En av de mest brukte modellene for iskemiske retinopatier er den oksygeninduserte retinopati (OIR)-modellen. Her beskriver vi detaljerte protokoller for OIR-modellen induksjon og dets avlesninger hos både mus og rotter. Retinal neovaskularisering induseres i OIR ved å utsette gnagervalper enten for hyperoksi (mus) eller vekslende nivåer av hyperoksi og hypoksi (rotter). De primære avlesningene av disse modellene er størrelsen på neovaskulære (NV) og avascular (AVA) områder i netthinnen. Denne prekliniske in vivo-modellen kan brukes til å evaluere effekten av potensielle anti-angiogene legemidler eller for å ta opp rollen som spesifikke gener i retinal angiogenese ved hjelp av genetisk manipulerte dyr. Modellen har en viss belastning og leverandørspesifikk variasjon i OIR-induksjonen som bør tas i betraktning ved utdesign av eksperimentene.

Introduction

Pålitelige og reproduserbare eksperimentelle modeller er nødvendig for å studere patologien bak angiogene øyesykdommer og for å utvikle nye terapeutiske midler til disse ødeleggende sykdommene. Patologisk angiogenese er kjennetegnet for våt aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD) og for mange iskemiske retinale sykdommer blant dem retinopati av prematuritet (ROP), proliferativ diabetisk retinopati (PDR) og retinal vene okklusjon (RVO)1,2,3,4. Menneskelige og gnager retinas følger et lignende utviklingsmønster, da både menneskelig og gnager retina er blant de siste vevene som er vaskularisert. Før retinal vaskulaturen er fullstendig utviklet, mottar netthinnen sin næringstilførsel fra hyaloid vaskulatur, som igjen går tilbake når retinal vaskulatur begynner å utvikleseg 1,2. Hos mennesker er retinal vaskulær utvikling fullført før fødselen, mens hos gnagere oppstår veksten av retinal vaskulatur etter fødselen. Siden retinal vaskulær utvikling oppstår postnatalt hos gnagere, gir det et ideelt modellsystem for å studere angiogenese2,3. De nyfødte gnagere har en avascular retina som utvikler seg gradvis til fullstendig vaskulær retina utvikling oppnås ved slutten av tredje postnatal uke4. De voksende blodårene av neonatal mus er plast, og de gjennomgår regresjon under hyperoksistimulans5.

ROP er den ledende årsaken til barndommen blindhet i vestlige land, da det påvirker nesten 70% av de premature spedbarn med fødselsvekt under 1250 g6,7. ROP forekommer hos premature spedbarn som er født før retinal fartøy fullfører sin normale vekst. ROP utvikler seg i to faser: i fase I forsinker tidlig fødsel retinal vaskulær vekst der etter i fase II forårsaker den uferdige vaskulariseringen av den utviklende netthinnen hypoksi, noe som induserer uttrykket av angiogene vekstfaktorer som stimulerer ny og unormal blodkarvekst8. OIR-modellen har vært en mye brukt modell for å studere patofysiologien til ROP og andre iskemiske retinopatier, samt å teste nye narkotikakandidater2,3,9. Det er allment ansett som en reproduserbar modell for å utføre proof-of-concept studier for potensielle antiangiogene legemidler for okulære så vel som ikke-okulære sykdommer. De to gnagermodellene, det vil vil at mus og rotte OIR varierer i deres modellinduksjon og sykdomphenotype. Rottemodellen etterligner ROP fenotype mer nøyaktig, men musemodellen gir en mer robust, rask og reproduserbar modell for retinal neovaskularisering (NV). I musemodellen utvikler NV seg til den sentrale netthinnen. Denne patologiske lesing er viktig i farmakologiske effektstudier for mange iskemiske retinopatier, som PDR, RV og eksudativ AMD, samt for ikke-okulære, angiogene sykdommer som kreft. Videre gjør tilgjengeligheten av genetisk manipulerte (transgene og knockout) mus musen OIR-modellen til et mer populært alternativ. Imidlertid skaper verken mus eller rotte OIR-modell retinal fibrose, som er typisk for menneskelige sykdommer.

Forståelsen av at høye oksygennivåer bidrar til utviklingen av ROP i 195010,11 førte til utvikling av dyremodeller. De første studiene om effekten av oksygen på retinal vaskulatur ble gjort i 195012,13,14 og frem til 1990-tallet var det mange forbedringer til OIR-modellen. Forskningen av Smith et al. i 1994 satt en standard for den nåværende musen OIR modell som skiller hyaloidopati fra retinopati15. En bred innføring av metoden for å kvantifisere vaso-utslettelse og patologisk NV av Connor et al. (2009) ytterligere økt sin popularitet16. I denne modellen plasseres mus ved 75 % oksygen (O2) i 5 dager ved P7, etterfulgt av 5 dager under normoksiske forhold. Hyperoksi fra P7 til P12 forårsaker retinal vaskulatur til regress i sentral netthinnen. Ved retur til normoksiske forhold blir avascular retina hypoksisk (figur 1A). På grunn av hypoksiske stimuli av den avascular sentrale netthinnen, spirer noen av retinale blodkar mot glasslegemet, danner preretinal NV, kalt preretinal tufts2,3. Disse tuftene er umodne og hyperpermeable. Mengden NV topper på P17, hvor etter som den går tilbake. Netthinnen er helt revaskularisert og NV er fullstendig regressed av P23 - P25 (Figur 2A)2,3.

Rotteoir-modellen (ved bruk av varierende nivåer av O2) ble først beskrevet på 1990-tallet som viser at varierende O2-nivåer ved 80 % og 40 % forårsaker mer uttalt NV enn under 80 % O2 konstant eksponering17. Senere ble det oppdaget at den intermitterende hypoksimodellen, hvor O2 sykles fra hyperoksi (50 %) hypoksi (10-12 %), forårsaker enda mer NV enn 80/40% O2 modell18. I 50/10% modellen blir rottevalper utsatt for 50% i 24 timer, etterfulgt av 24 timer i 10% O2. Disse syklusene fortsetter til P14, når rottevalpene returneres til normoksiske tilstander (figur 1B). Som hos humane ROP-pasienter utvikler de avascular områdene i rottemodellen seg til periferien av netthinnen på grunn av umoden retinal vaskulær plexus (figur 3).

I begge modellene er de viktigste parametrene som vanligvis kvantifiseres, størrelsen på AVA og NV. Disse parametrene analyseres vanligvis fra retinal flate mounts hvor endotelcellene er merket4,16. Tidligere ble mengden preretinal NV evaluert fra retinale tverrsnitt ved å telle blodkar eller vaskulære cellekjerner som strekker seg til glasslegemer over den indre begrensende membranen. Den store begrensningen av denne tilnærmingen er at det ikke er mulig å kvantifisere AVAs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokollen som er beskrevet her er godkjent av Finlands nasjonale dyreetikkkomité (protokollnummer ESAVI/9520/2020 og ESAVI/6421/04.10.07/2017).

1. Eksperimentelle dyr og mus OIR modell induksjon

MERK: Bruk tidsmatte dyr, for eksempel vanlige C57BL/6J-mus, for å få unger født samme dag. Bruk fosterdammer, for eksempel 129 belastninger (129S1/SvImJ eller 129S3/SvIM) ammende dammer, for å pleie valpene under og etter induksjon av hyperoksi. Alternativt må du sørge for at det er ekstra ammende demninger tilgjengelig i tilfelle sykepleiedammen må skiftes ut på grunn av utmattelse. Begrens kullstørrelsen til 6-7 valper for hver demning når du bruker C57BL/6J-mus/dammer (hvis kullene er større enn at valpene har en tendens til å ha begrenset vektøkning)16.

  1. Registrer vekten av dyrene før og etter hyperoksi induksjon, og på offertid.
  2. Pass på at det er nok mat på bunnen av buret, slik at demningene har enkel tilgang til mat.
  3. Tilsett bruskalk med fargeindikator til bunnen av kammeret for å absorbere overflødig CO2 når et filtreringssystem ikke brukes.
  4. Overvåk fuktigheten og temperaturen inne i kammeret og hold fuktigheten mellom 40 og 65%. Øk fuktigheten i kammeret, om nødvendig, ved å plassere retter med vann på bunnen av kammeret (f.eks Petri retter).
  5. Kalibrer O2-sensoren med 100 % O2 og normal romluft.
  6. Plasser P7-musene i et kammer og sett opp O2-nivået til 75%. Hold musene i kammeret i 5 dager, til P12. Unngå å åpne kammeret under hyperoksiinduksjonen. Kontroller gasstrykket på O2-sylinderen og skift ut sylinderen ved behov. Overvåk dyrene under induksjonen.
  7. Ta museburene ut av kammeret og vei alle valpene. Grupper valpene basert på vekten slik at hver eksperimentell gruppe har lignende vektfordeling hos valper.

2. Eksperimentelle dyr og rotte OIR modell induksjon (ved hjelp av semi-lukket system)

MERK: Bruk tidsmatret dyr for å få valpene født på samme dag. For rotte OIR, bruk økt kullstørrelse, ca. 18 valper/demning, for å oppnå tilstrekkelig NV-induksjon i rottemodellen. Bassengvalper fra flere kull for å få nok valper til hvert kull.

  1. Registrer vekten av dyrene før og etter induksjon, og på offertid.
  2. Pass på at det er nok mat på bunnen av buret, slik at demningene har enkel tilgang til mat.
  3. Tilsett bruskalk med fargeindikator på bunnen av kammeret for å absorbere overflødig CO2 når filtreringssystemet ikke brukes.
  4. Overvåk fuktigheten og temperaturen inne i kammeret. Absorber ekstra fuktighet (generert fra flere antall rotter) ved å legge silikagel på bunnen av kammeret.
  5. Kalibrer O2-sensoren med 100 % N2 og normal romluft.
  6. Plasser rottene i kammeret ved P0 (noen timer etter fødselen). Sett O2-nivået til 50 % og koble O2-sylinderen til kammeret i 24 timer. Deretter bytter du innstillingene til 10 % O2 og kobler nitrogen (N2) sylinder til kammeret i 24 timer. Fortsett 24 h sykling mellom 50% og 10% O2 nivåer i 14 dager.
  7. Overvåk gassforbruket og dyrenes velvære under studien. Åpne kammeret under endringen mellom 50/10% O2 og tilsett mer mat og vann om nødvendig. Endre burene til dyrene for å rengjøre de under induksjonen.
  8. Ta rotteburene ut av kammeret og vei alle valpene. Grupper valpene basert på vekten slik at hver eksperimentell gruppe har lignende veiefordeling hos valpene.

3. Legemiddeladministrasjon (valgfritt)

MERK: Vanlig brukt legemiddeladministrasjonsrute i OIR er ved intravitreal behandling (ivt), ved P12-P14 for mus og ved P14 for rotter. Bestem behandlingsdagen basert på det eksperimentelle oppsettet. Når flere kull av valper brukes i eksperimenter, del behandlingsgruppene for å få dyr fra alle kullene. Fortrinnsvis injiserer du stoffet til bare ett øye, og hold det kontralaterale øyet som en kontroll.

  1. Vei dyrene og gjør identifikasjonsmerker til halen og/ eller øret.
  2. Bedøve dyret enten med injiserbar anestesi (for eksempel blanding av ketamin og medetomidin, 30 mg/kg og 0,4 mg/kg for mus) eller med innånding anestesi (isofluran ved 2-3,5 % isofluran og 200-350 ml/min luftstrøm). Kontroller dybden av anestesi ved å klemme tærne. Hold dyret på en varmepute under behandlingen.
  3. For lokalbedøvelse, bruk en dråpe smertestillende på øyelokket. Åpne øyelokket forsiktig med tang før du utfører ivt, som mus og rotter åpne øynene rundt P14. Påfør en dråpe smertestillende (f.eks. oksybuprokainhydroklorid) på hornhinnen.
  4. Påfør en dråpe jod før du utfører ivt injeksjon.
  5. For injeksjonen skal du bruke en glasssprøyte med en 33-34 G kanyle festet. Trykk øyelokkene ned og grap øyeeplet med tang. Gjør injeksjonen bakre til limbus, ca i 45° vinkel nål peker mot optisk nerve.
  6. Unngå å injisere mer enn 1,0 μL i det intravitreale rommet. Hold nålen på plass i 30 s etter injeksjon av stoffet for å unngå refluks av den injiserte oppløsningen.
  7. Undersøk øyet (f.eks. med et oftalmoskop) for komplikasjoner, som blødninger eller retinal skade, etter å ha fjernet nålen. Påfør antibiotika salve på toppen av hornhinnen etter injeksjonen.
    MERK: Injeksjonsvolumet for mus skal være 0,5 – 1,0 μL.
  8. Reverser anestesi (for eksempel med en α2-antagonist for medetomidin (2,5 mg/kg) og returner valpen til buret. Hus kullet normalt til slutten av studien.

4. In vivo avbildning og elektroretinografi (valgfritt)

  1. Hvis ønskelig, gjennomføre in vivo imaging på levende dyr i oppfølgingsperioden for å registrere endringer som utvikler seg i netthinnen under angiogene reaksjoner. Utfør for eksempel fluorescein angiografi (FA) eller skanning av laserkonferansemikroskopi19 for å visualisere vaskulaturen (figur 4). Bruk spektral domene optisk sammenhengtomografi (SD-OCT) til å visualisere retinale lag in vivo (figur 4).
  2. Hvis ønskelig, undersøke funksjonelle endringer i ulike retinal cellepopulasjoner etter OIR induksjon ved hjelp av elektroretinografi (ERG) (figur 5).

5. Vevssamling og fremstilling av retinale flate mounts

MERK: Samle vevet i henhold til ønsket forskningshypotese. For mus, samle prøvene for eksempel ved P12 (for å studere vaso-utslettelse etter hyperoksisk fase) eller i hypoksisk periode (P13-P17). Samle musen OIR prøver på P17, som er det vanligste tidspunktet for prøvetaking, for å oppdage toppen i NV-mengden. I rotte OIR samler du prøvene ved P18-P21 for å observere den høyeste mengden NV (figur 3).

  1. Vei dyrene før prøvetaking.
  2. For å merke netthinnens vaskulatur kan dypt bedøvede dyr transkarialt perfunderes med FITC-dextran. (Alternativt kan du beise retinal flate fester med Isolectin senere).
  3. Ofre dyrene ved hjelp av enten overdose av anestesi medisiner (for eksempel blanding av ketamin og medetomidin, 300 mg / kg og 4 mg / kg for mus) eller CO2 innånding.
  4. Samle øynene til dyrene ved å gripe bak øyebollet med buede tang, kutt vevet rundt øynene og løft øyet ut fra banen.
  5. Inkuber øyeeplene i nylaget, filtrert 4% paraformaldehyd (i fosfatbufret saltvann, PBS) i 1-4 timer. Fjern fikseringsmiddelet og vask øyeeplene 3 x 10 min med PBS. Disseker netthinnen umiddelbart eller oppbevar dem i PBS ved +4 °C.
    FORSIKTIG: Paraformaldehyd er giftig ved innånding, hudkontakt og svelging. Les sikkerhetsdatabladet før du arbeider med det.
    MERK: Ikke trykk på øyeeplet under prøvetakingen eller noen fase av vevsbehandlingen for å unngå netthinneavløsning, hvis tverrsnitt fra hele øyeepler er gjort.
  6. Forbered retinal flate mounts for å kvantifisere mengden AV og størrelsen på AVAs. Alternativt kan du behandle øyeeplene/netthinnen for histologi, eller RNA- eller proteinanalyse. Disseker netthinnen under et stereomikroskop ved hjelp av mikrosaks og tang.
    1. Plasser øyeeplet i PBS for å holde det fuktig og punkter øyeeplet på limbus med en nål (23G) og kutt rundt limbus med buet mikrosaks for å fjerne iris og hornhinnen.
    2. Plasser forsiktig saksspissen mellom sclera og netthinnen og kutt sclera mot synsnerven. Gjør det samme med den andre siden av øyebollet, og skjær forsiktig/riv scleraen til netthinnen er utsatt. Trekk linsen ut fra retinal koppen og legg PBS til koppen.
    3. Fjern alle hyaloidkar, glasslegemer og rusk uten å skade netthinnen. Vask netthinnen ved å legge PBS til retinal koppen. Utfør fire snitt (klokken 12, 3, 6 og 9) til netthinnen med rett mikrosaks for å lage en blomsterlignende struktur. Eventuelt gjør kuttene med kirurgisk blad før montering prøvene. Løft netthinnen med en myk pensel til en godt plate for farging.
  7. Merk netthinnens vaskulatur ved hjelp av Isolectin B4 som flekker overflaten av endotelceller (hvis dyrene ikke var perfundert med FITC-dextran). Inkuber netthinnen i blokkeringsbufferen (10 % NGS + 0,5 % triton i TBS) i 1 time og vask med 1 % NGS + 0,1 % Triton i TBS i 10 min. Inkuber netthinnen med fluorescerende fargestoff konjugert Isolectin B4 (5-10μg/ml) i 1% NGS + 0,1% Triton i TBS over natten ved +4 °C mens den er beskyttet mot lyset.
    MERK: Hvis ønskelig, merk andre celler som inflammatoriske celler og pericytter ved hjelp av spesifikke antistoffer.
  8. Vask netthinnen 3x i 10 min med 1% NGS + 0,1% Triton i TBS og løft netthinnen på en mikroskopisk lysbilde, indre netthinnen vendt oppover. Spre forsiktig ut netthinnen ved hjelp av myk pensel og fjern eventuelle gjenværende hyaloidkar eller rusk. Legg monteringsmedium til en dekselslipp og plasser den på toppen av netthinnen. Oppbevar netthinnen ved +4 °C og beskytt mot lys.

6. Analyse av de flate brakettene

  1. Ta bilder av retinal flat mounts ved hjelp av en fluorescens mikroskop med 10x mål. Fokuser på overfladisk vaskulær plexus og til preretinal neovaskularisering. Lag et bilde av flisskanningsbilde for å fange hele netthinnen og slå sammen flisskanningene
  2. Kvantifisere bildene ved å måle AVAs, området av NV og totalt retinal område ved hjelp av et bildebehandlingsprogram (se Materialse tabell).
    1. Tegn AVAs og totalt retinal område ved hjelp av en fri hånd tegneverktøy og velg neovaskulære områder ved hjelp av et utvalgsverktøy. Programvaren måler regionene av interesse for piksler, og AVA og NV-områdene (uttrykt i piksler) kan brukes til å beregne prosentandelen i forhold til det totale retinale området. Noen programvareverktøy er også tilgjengelige for å kvantifisere NV.
      MERK: Nylig har en åpen kildekode, helautomatiske programmer for kvantifisering av nøkkelverdier av OIR-bilder ved hjelp av dyp læring nevrale nettverk blitt introdusert og gir et pålitelig verktøy for reproduserbar kvantifisering av retinal AVA og NV (f.eks https://github.com/uw-biomedical-ml/oir/tree/bf75f9346064f1425b8b9408ab792b1531a86c64)20,21.
  3. Hvis du bruker antistoffer mot immunohistokjemisk påvisning av individuelle cellepopulasjoner, kvantifiserer du antall fargede celler (for eksempel microglia, figur 2B) fra retinal flate fester for hånd eller ved automatiserte bildeanalysesystemer hvis ønskelig.

7. Statistikk

  1. Analyser normalt distribuerte data etter Students t-test eller enveis ANOVA etterfulgt av Dunnetts eller Tukeys test for flere sammenligninger, etter behov. Bruk ikke-parametriske tester som Mann-Whitney U test eller Kruskal Wallis test for ikke-normalt distribuerte data. Vurder forskjeller statistisk signifikant på P < 0,05-nivå.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hovedresultatet av modellen er vaskulær fenotype: størrelsen på AVAs og mengden NV. I musen OIR-modellen forekommer vaso-utslettelse i den sentrale netthinnen (figur 2A), mens den i rottemodellen utvikler seg i periferien, det vil si lik menneskelig ROP22 (figur 3A). Dette skyldes at den overfladiske vaskulære plexus allerede har utviklet seg når mus blir utsatt for hyperoksi, mens netthinnen i rottemodellen er avascular på tidspunktet for OIR-induksjon (P0). Preretinal neovaskularisering utvikler seg nær de avascular områdene, det vil at sentral netthinnen i musen og periferi hos rotter (figur 2A og figur 3A).

Histologisk analyse ved hjelp av enten tverrsnitt eller flate mounts kan gjøres for å evaluere morfologiske endringer i OIR netthinnen eller tilstedeværelse av celletyper av interesse, for eksempel inflammatoriske celler (Figur 2B). I tillegg til netthinnen kan hele øyne eller glasslegemet prøver samles inn for ytterligere gen- og proteinuttrykksanalyser på forskjellige tidspunkter under OIR-modellen. Gen- eller proteinuttrykksnivåer kan analyseres med standardmetoder, for eksempel RT-qPCR eller vestlig blotting.

Eventuelt kan ikke-invasiv in vivo-bildebehandling utføres i oppfølgingsperioden for OIR. Retinal og hyaloid vaskulatur kan visualiseres med FA (figur 4A). SD-OCT kan brukes til å evaluere strukturelle endringer i netthinnen (figur 4B). Funksjonelle endringer i netthinnen kan måles ved ERG (figur 5).

Hemmere av vaskulær endotelvekstfaktor (VEGF) brukes ofte til behandling av humane angiogene øyesykdommer. Dermed, anti-VEGF brukes ofte som en referanse sammensatte i OIR. Aflibercept, som fungerer som en løselig VEGF-felle, hemmer både NV og fysiologisk revaskularisering i OIR i både høye og lave doser (injisert ved P14). OIR øyne injisert ved P14 med høy dose aflibercept hadde enda større retinal AVAs enn ubehandlede øyne (figur 6). Dette tyder på at aflibercept blokkerer også fysiologisk retinal revaskularisering drevet av hypoksi. Både mus- og rottemodeller kan brukes til å evaluere effekten av forskjellige antiangogene midler på retinal NV og fysiologisk revaskularisering av netthinnen (figur 3B og figur 6).

Figure 1
Figur 1: Grafisk oversikt over en standard OIR-studiedesign for mus og rotter. (A) Mouse OIR-modellen ble indusert ved å utsette musene til 75% O2 fra P7 til P12 og returnert til normal romluft. Toppen av preretinal NV ble sett på P17, som vanligvis er prøvetakingspunktet for eksperimentet. (B) Rat OIR-modellen ble indusert ved å utsette rotter for vekslende O2 nivåer (50/10 % O2) fra P0 til P14 og tilbake til normoxic forhold. Rotter ofres vanligvis ved P20, når mengden NV toppet seg. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Vaskulær fenotype i musen OIR modell. Mouse OIR-modellen ble generert som beskrevet i figur 1. (A)Den overfladiske vaskulære plexus utviklet seg hos normale mus mens OIR-musene ble utsatt for 75 % O2 fra P7 til P12. I løpet av denne tiden utviklet vaskulær utslettelse i den sentrale netthinnen (merket med blått på P12 og P17 i de kvantifiserte bildene). Mus ble returnert til normal romluft, og den avascular netthinnen ble hypoksisk, noe som førte til funksjonell kargjenvekst i netthinnen og patologisk NV (merket med rødt på P17 i det nedre panelet). Preretinal neovaskulære tufter utviklet mellom vaskulære og avascular områder i sentrale netthinnen. Mengden NV toppet seg på P17 og gikk tilbake etterpå. Retina ble fullstendig revaskularisert og NV gikk tilbake rundt P24-P25. (B)Et eksempel på immunohistokjemisk farging av retinal flat mount viser retinal Iba-1 farget microglia (grønn) og GS-IB4 farget blodkar (rød) på P12 og P17. (C) Tverrsnitt av en mus OIR øye på P17, hvor preretinal tufts (piler) spiret mot glasslegemet. Også tynning av det indre kjernefysiske laget (INL) og ytre plexiformlag (OPL) ble sett. Skalastenger er 1 mm i A, 50 μm i B og 100 μm i C. ILM = indre begrensende membran, GCL = ganglioncellelag, IPL = indre pleksiformlag, INL = indre kjernefysisk lag, OPL = ytre pleksiformlag, ONL = ytre kjernefysisk lag, RPE = retinal pigmentepitel. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Vaskulær fenotype og dens utvikling i rotteOIR-modellen. (A) Avascular områder (merket med blått) og NV (merket med rødt) utviklet i periferien av netthinnen, ligner på menneskelig ROP. (B) AVAs ble sett i OIR netthinnen, men ikke i normoxic kontroller. (C) Kvantifisering av området nv viste en trend mot en topp i mengden av NV ved P20, men forskjellen var ikke statistisk signifikant sammenlignet med P18 og P21 i OIR. (Studentens t-test, mellom tid matchet normoxic og OIR netthinnen, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001, begge øynene til dyrene plottet i grafen). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: In vivo-avbildning ved hjelp av fluorescein angiografi (FA) og spektraldomen optisk sammenhengtomografi (SD-OCT) i rotteOIR-modellen. (A) Vaskulær tortuosity (pilspisser) ble sett på bildene tatt fra den sentrale netthinnen (øverste rad) ved P18 og P20 i OIR rotter sammenlignet med normoxic P19 rotter. NV (piler) og AVAs (stjerne) utviklet seg til periferien av netthinnen (midterste rad) sett i P18 og P20 OIR netthinnen. Regresjonshyaloidkar (nederste rad) ble fanget opp av FA. (B) Blodkarvekst mot glasslegemet ble observert som en fortykning på nervefiberlaget (NFL) og ganglioncellelaget (GCL) i OIR retinas (pil). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Funksjonaliteten til retinale nevroner kan måles ved hjelp av blitselektroretinografi (fERG). (A) a-bølger ble avledet fra retinal kjegle og stang fotoreseptorer og deres amplituder ble betydelig redusert i rotte OIR modell. Effekten økte med høyere lysintensitet, noe som tyder på at feilene påvirket kjeglefotoreseptorfunksjoner primært. (B)B-bølge amplituder fra OIR dyr ble redusert sammenlignet med normoxic kontroller. B-bølger ble avledet fra ON-bipolare celler og Müller celler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Intravitrealt injisert PBS reduserer NV og AVAs i musen OIR modell. (A)Representative bilder av retinal flate fester fra ubehandlede, og aflibercept-behandlet (20 μg ved P14) og PBS injisert OIR øyne på P17. Høy dose aflibercept (20 μg) økte størrelsen på AVAer med 47 % (skissert i hvitt) og hemmet NV med 98 % (piler) sammenlignet med ubehandlede kontroller. PBS injeksjon redusert AVAs med 31% og NV med 42% sammenlignet med ubehandlede kontroller. Også punktering av sclera ligner ivt produsert lignende effekter som ivt injeksjon av PBS, men forskjellene var ikke statistisk signifikante. Pilspiss peker på hyaloidkar som ikke ble fjernet under disseksjonen. (Enveis ANOVA, * s ≤ 0,05; ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001, **** p ≤ 0,0001). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Alvorlighetsgraden av sykdom fenotype er avhengig av både belastningen og til og med leverandør i både mus og rotte OIR modeller23. Dette tyder på at det er en bred genotypisk variasjon i patologiutviklingen. Generelt utvikler pigmenterte gnagere mer alvorlig fenotype enn albinoene. For eksempel, retinal vaskulatur av albino BALB / c revaskulariserer raskt etter hyperoksi og utvikler ikke NV i det hele tatt24. På samme måte, hos rotter, viser pigmenterte Brown Norway rotter mer alvorlig patologi enn albino Sprague Dawley (SD) rotter25. SD-rotter brukes ofte, og leverandørrelaterte forskjeller i OIR fenotype er rapportert innenfor belastningen. For eksempel produserer SD-rotter fra Charles betydelig mer NV enn rotter fra Harlan eller Zivic-Miller23. C3H/HeJ-mus som igjen har en mutasjon i retinal degenerasjon 1 (Rd1) genet, har tynne netthinnen, og utvikler ikke NV26. På grunn av disse grunnene og tilgjengeligheten av transgene muslinjer, er den innavlede C57BL/6J den mest brukte musestammen for OIR-studier. Det er imidlertid ganske høy dødelighet blant C57BL/6J-demningene på grunn av den hyperoxiske eksponeringen, så musenes velvære må vurderes når de utformer studien og overvåkes under forsøkene. Videre er økt fotoreseptorskade sett hos C57BL/6-mus sammenlignet med BALB/c-mus27.

For å sikre musenes velvære og overlevelsen til demningene og valpene, bør kullstørrelsen holdes liten (6-7 valper / dam). Dette er spesielt viktig når du bruker C57BL/6 mus, som er mer utsatt for hyperoksisk stress27,28. I tillegg bør lett tilgjengelig støttemat (plassert på bunnen av buret) gis til musene. Noen forskere bruker surrogatdammer for å erstatte demningene i kammeret med sunne etter oksygeninduksjonen. Men de fleste forskere bruker surrogater bare hvis demningen er utmattet22,29. Surrogatdammer anbefales å brukes hvis større kullstørrelser brukes. Det har blitt publisert at 129S3/SvIM mus produserer mer NV enn C57BL/6 og opprettholde bedre endringer forårsaket av varierende oksygennivåer28. Det bør bemerkes at demningene som brukes i OIR er ufruktbare etter OIR induksjon og bør ikke brukes til videre avlsformål22. Postnatal vektøkning av valpene påvirker alvorlighetsgraden av OIR-patologi. Unger med dårlig postnatal vektøkning (<5 g ved P17) viser forsinket uttrykk for VEGF og dermed langvarig fase av retinopati sammenlignet med unger med normal (5 - 7,5 g ved P17) eller omfattende vektøkning (> 7,5 g ved P17)29. Videre viser musvalper som veier over 5 g ved P7 ikke vaso-utslettede områder etter OIR induksjon30. Dermed er det viktig å veie valpene under forsøket. Det kontralaterale ubehandlede øyet kan brukes som internkontroll for å sikre at musenes ernæringsmessige status ikke påvirker resultatene. Situasjonen er lik hos rotter; jo mindre valpene er, desto mer alvorlig OIR fenotype utvikler de31. Dermed anbefales det at store kullstørrelser (ca. 18 valper) brukes til rotteOIR-modellen.

OIR-modellen induksjon kan gjøres ved hjelp av enten fullt lukket system, hvor det er en lukket sløyfe krets med en pumpe som sirkulerer luften gjennom et filtersystem (brus kalk og aktivert karbon) tilbake til kammeret. Et annet alternativ er et semi-lukket system, hvor ventilasjon sikrer at overflødige metabolitter fjernes fra kammeret. For å sikre at overflødig CO2 fjernes, kan sodakalk (blanding av kalsiumhydroksid med natriumhydroksid eller kaliumhydroksid) plasseres på bunnen av kammeret. Fjerning av CO2 er obligatorisk da de høye CO2-nivåene forverrer sykdomsfenotypen hos rotter32. Man bør også huske å rekalibrere oksygensensoren i kammeret regelmessig som de har en tendens til å drive over tid og kan gi feil oksygenkonsentrasjon fra den som er ment.

Det har blitt rapportert at kjøretøy injeksjon (PBS) alene eller bare punktering til intravitreal plass har en effekt for revaskularisering rate og mengden av NV (Figur 6)33,34,35,36. Det har blitt spekulert om effekten sett med PBS / kjøretøy injeksjon kan skyldes endringer i intraokulært trykk under injeksjon, eller på grunn av skade på okulære strukturer som øker nivåene av angiogene vekstfaktorer blant dem pigment epitel-avledet vekstfaktor34,37. Videre har bare en pilot subretinal injeksjon alene (punktering til subretinal plass) vist seg å ha effekter på vaskulær og funksjonell fenotype i OIR sammenlignet med de ubehandlede rotter38. Disse resultatene understreker viktigheten av riktige negative kontroller i OIR-studiene eller til og med systemisk administrasjon av testede forbindelser, samt store nok n-tall i hver studiegruppe. Det faktum at kjøretøy injeksjon faktisk forbedrer revaskularisering rate i netthinnen er en viktig begrensende faktor som revaskularisering hastighet og dannelsen av patologiske preretinal tufts er inter-relatert i OIR-modellen: Hvis revaskulariseringsraten akselereres, det fører til kompenserende nedregulering av neovaskulære tufter og vice versa. Dermed påvirkes begge primære utfallsmålene for OIR-modellen av kjøretøyinjeksjon.

VEGF-hemmere har revolusjonert behandlingen AMD og DR. OIR modellen ble brukt til å demonstrere deres effekt preklinisk. Når det gjelder VEGF-hemmere i OIR, viste en studie som sammenlignet ulike anti-VEGFs og anti-PlGFs (placenta vekstfaktor) (injisert ved P12) at anti-VEGF alene førte til små avascular områder, mens anti-PIGF behandlet øyne hadde større avvaskulære områder33. Aflibercept hadde de største AVAene sammenlignet med andre legemiddelbehandlinger33. Aflibercept er kjent for å binde både VEGF og PlGF39, det kan være at hemmende PlGF i OIR fører til blokkering av fysiologisk angiogenese.

Ikke-invasiv in vivo-avbildning gir et verktøy for overvåking av retinal vaskulatur40 og retinale lag og struktur under oppfølgingsperioden. Ved hjelp av FA kan parametere som vaskulær tetthet og arteriell tortuositet og venøs utvidelse (kalt pluss sykdom, figur 4A) måles40,41. SD-OCT kan brukes til å evaluere strukturelle endringer og måle retinal tykkelse under OIR oppfølgingsperiode42,43. ERG brukes til å måle de funksjonelle endringene i netthinnen. Ulike celletyper produserer elektriske potensialer etter lysstimulans, og disse signalene eller "bølgene" kan måles med ERG. Fotoreseptorer produserer den negative a-bølgen, og ON bipolare celler og Müller-celler er hovedsakelig ansvarlige for b-bølgen44. Tap av retinal funksjon er typisk hos OIR-mus og rotter45,46 ( figur5). Langvarige endringer vedvarer i netthinnen, og både funksjonelle endringer og endringer i proteinnivå er rapportert i OIR netthinnen selv etter revaskularisering og NV regresjon34,47.

For å visualisere retinal vaskulatur, kan de levende musene enten perfunderes med FITC-merket dextran eller retinal flate mounts kan farges med fluorescerende fargestoff merket Isolectin B4. Man må forstå forskjellen mellom de fluorescerende fargestoffene; perfusjonen med FITC-dextrans etiketter bare lumen av fartøyene, mens Isolectin B4 flekker overflaten av endotelceller. Dermed vil funksjonelle blodkar med riktig lumen bare visualiseres med FITC-dextran perfusjon, mens det totale arealet av NV ser større ut i Isolectin B4 fargede netthinnen enn i FITC-dextran perfused dyr, fordi Isolectin B4 i hovedsak plukker opp selv endotelceller som ikke har dannet funksjonelle lumenennå 48. Et nyere alternativ for å visualisere hele retina / øye ball i 3D-format er dyp vev avbildning av to-foton fluorescens mikroskopi(49).

Gnageroir-modellen, samt dyremodellene generelt, representerer bare delvis egenskapene til menneskelige sykdommer. Den store forskjellen knyttet til OIR er at retinal neovaskularisering ikke er forbundet med fibrose hos gnageroir, mens retinal neovaskularisering fører ofte til fibrovaskulær spredning hos humane neovaskulære retinale sykdommer. Videre kan forholdene som forårsaker OIR vs. menneskelig sykdom være nesten motsatte. Preterm nyfødte med ROP krever ekstra oksygen med åndedrettsstøtte, erfaring ofte intermitterende hypoksemiske og hyperoksemiske episoder forårsaket av tilbakevendende apné, men de er ikke utsatt for høye nivåer av oksygen. For å minimere den permanente skaden unngås høye fraksjoner av inspirert O2. I så måte ligner verken musemodellen med konstant eksponering for 75% O2 i 5 dager eller 50/10 rottemodellen patogenese av menneskelig ROP. Videre er det også forskjeller mellom rotte og musen OIR modeller. Neovaskulariseringen går tilbake i musemodellen med reetablering av normale kar ved P24, mens tilstanden blir verre i rotteOIR-modellen (ligner på menneskelig ROP). Selv om rotteOIR-modellen viser klinisk relevante trekk ved ROP som forsinket retinal vaskulær utvikling og påfølgende patologisk neovaskularisering, er bruken begrenset av nesten fullstendig fravær av transgene rottestammer, høyere vedlikeholdskostnader og mindre NV enn i musoir-modellen.

Tatt sammen, til tross for forskjellene mellom humane iskemiske proliferative retinopatier og gnageroir-modeller, gjør den enkle som NV kan induseres, kombinert med enkel visualisering og kvantifisering av netthinnen, OIR-modellene populære for å studere molekylære mekanismer og potensielle terapeutiske midler for iskemisk proliferative retinopatier. Interessant, hyperoksi eksponering i mus OIR modellen induserer også bronkopulmonal dysplasi, en annen sykdom forårsaket av supplerende oksygenbehandling hos menneskelige premature spedbarn, viser at OIR modell kan brukes til å utforske nye mål for både ROP og bronkopulmonal dysplasi samtidig50.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne Maria Vähätupa, PhD, Niina Jääskeläinen, Marc Cerrada-Gimenez, PhD og Rubina Thapa er ansatte i Experimentica Ltd.

Forfatteren Giedrius Kalesnykas, PhD, er ansatt (president og administrerende direktør) og aksjonær i Experimentica Ltd. som tilbyr kontraktsforskningstjenester som bruker prekliniske OIR-modeller som brukes i denne artikkelen.

Tero Järvinen, M.D., PhD og Hannele Uusitalo-Järvinen, M.D., PhD, har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Marianne Karlsberg, Anne Mari Haapaniemi, Päivi Partanen og Anne Kankkunen for utmerket teknisk støtte. Dette arbeidet ble finansiert av Academy of Finland, Päivikki og Sakari Sohlberg Foundation, Tampere Tuberculosis Foundation, Finnish Medical Foundation, Pirkanmaa Hospital District Research Foundation og Tampere University Hospital Research Fund.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
33 gauge, Small Hub RN Needle Hamilton Company 7803-05, 10mm, 25°, PS4 For intravitreal injection
Adobe Photoshop Adobe Inc. For image analysis
Air pump air100 Eheim GmbH & Co. KG. 143207 For inhalation anaesthesia
Anaesthesia unit 410 AP Univentor Ltd. 2360309 For inhalation anaesthesia
AnalaR NORMAPUR Soda lime VWR International Ltd 22666.362 For CO2 control during model induction
Attane Vet 1000 mg/g VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY vnr 17 05 79 For inhalation anaesthesia
Brush For preparation of flat mounts
Carbon dioxide gas For sacrifice
Celeris D430 ERG system Diagnosys LLC 121 For in vivo ERG
Cell culture dishes Greiner Bio-One International GmbH 664 160 For preparation of flat mounts
Cepetor Vet 1 mg/mL VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY vnr 08 78 96 For anaesthesia
Cover slips Thermo Fisher Scientific 15165452 For preparation of flat mounts
O2 Controlled InVivo Cabinet, Aninal Filtrarion System and Dehumidifier Coy Laboratory Products Closed system for disease model induction, optional for semi-closed system
E702 O2 sensor BioSphenix, Ltd. E207, 1801901 For oxygen level measurement
Envisu R2200 Spectral Domain Optical Coherence Tomograph (SD-OCT) Bioptigen, Inc. BPN000668 For in vivo imaging
Eye spears Beaver-Visitec International, Inc. 0008685 For intravitreal injection and in vivo imaging
Flexilux 600LL Cold light source Mikron 11140 For intravitreal injection or tissue collection
Fluorescein sodium salt Merck KGaA F6377-100G For in vivo imaging
Gas Exhaust unit (+Double 3-way valve, mouse and rat face masks, UNOsorb filter) UNO Roestvaststaal BV GEX 17015249 For inhalation anaesthesia
Glass syringe, Model 65 RN Hamilton Company 7633-01 For intravitreal injection
HRA2 Retina angiograph (FA) Heidelberg Engineering GmbH Spec-KT-05488 For in vivo imaging
Isolectin GS-IB4, Alexa Fluor 488 Conjugate Thermo Fisher Scientific I21411 For labeling retinal vasculature on flat mounts
Ketaminol Vet 50 mg/mL Intervet International B.V. vnr 51 14 85 For anaesthesia
Medicinal Oxygen gas For disease model induction
Mice C57BL/6JRj Janvier Labs Also other strains possible
Microscope slides Thermo Fisher Scientific J1800AMNZ For preparation of flat mounts
Minims Povidone Iodine 5% (unit) Bausch & Lomb U.K Limited vnr 24 11 304 For intravitreal injection
Nitrogen gas For disease model induction (rat)
Oftan Chlora 10 mg/g Santen Pharmaceutical Co., Ltd. vnr 55 01 11 For intravitreal injection
Oftan Metaoksedrin 100 mg/ml Santen Pharmaceutical Co., Ltd. vnr 55 03 43 For in vivo ERG
Oftan Obucain 4 mg/ml Santen Pharmaceutical Co., Ltd. vnr 55 03 50 For intravitreal injection
Oftan Tropicamid 5 mg/ml Santen Pharmaceutical Co., Ltd. vnr 04 12 36 For in vivo imaging
ProOx Model 110 O2 controller and animal chamber BioSphenix, Ltd. 803 For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system
ProOx Model P360 O2 controller and animal chamber BioSphenix, Ltd. 538 For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system
Rats CD(SD) Charles River Laboratories Also other strains possible
Revertor 5 mg/mL VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY vnr 13 04 97 For anaesthesia reversal
Silica gel For humidity control during model induction
Systane Ultra 10ml Alcon Tamro 2050250 For hydration of the eye
Systane Ultra unit 0.7ml Alcon Tamro 2064871 For hydration of the eye
Transfer pipette Thermo Fisher Scientific 1343-9108 For preparation of flat mounts
VENTI-Line VL 180 PRIME Drying oven VWR VL180S 170301 For drying silica gel
VisiScope SZT350 Stereomicroscope VWR 481067 For intravitreal injection or tissue collection

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chase, J. The evolution of retinal vascularization in mammals. A comparison of vascular and avascular retinae. Ophthalmology. 89 (12), 1518-1525 (1982).
  2. Sun, Y., Smith, L. E. H. Retinal vasculature in development and diseases. Annual Review of Vision Science. 4, 101-122 (2018).
  3. Vähätupa, M., Järvinen, T. A. H., Uusitalo-Järvinen, H. Exploration of oxygen-induced retinopathy model to discover new therapeutic drug targets in retinopathies. Frontiers in Pharmacology. 11, 873 (2020).
  4. Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (6), 2813-2826 (2010).
  5. Benjamin, L. E., Hemo, I., Keshet, E. A plasticity window for blood vessel remodelling is defined by pericyte coverage of the preformed endothelial network and is regulated by PDGF-B and VEGF. Development. 125 (9), 1591-1598 (1998).
  6. Bashinsky, A. L. Retinopathy of prematurity. North Carolina Medical Journal. 78 (2), 124-128 (2017).
  7. Ludwig, C. A., Chen, T. A., Hernandez-Boussard, T., Moshfeghi, A. A., Moshfeghi, D. M. The epidemiology of retinopathy of prematurity in the united states. Ophthalmic Surgery, Lasers and Imaging Retina. 48 (7), 553-562 (2017).
  8. Hartnett, M. E. Pathophysiology and mechanisms of severe retinopathy of prematurity. Ophthalmology. 122 (1), 200-210 (2015).
  9. Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: From development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
  10. Szewczyk, T. S. Retrolental fibroplasia; etiology and prophylaxis. American Journal of Ophthalmology. 35 (3), 301-311 (1952).
  11. Szewczyk, T. S. Retrolental fibroplasia and related ocular diseases; classification, etiology, and prophylaxis. American Journal of Ophthalmology. 36 (10), 1336-1361 (1953).
  12. Gerschman, R., Nadig, P. W., Snell, A. C. Jr, Nye, S. W. Effect of high oxygen concentrations on eyes of newborn mice. American Journal of Physiology. 179 (1), 115-118 (1954).
  13. Gyllnesten, L. J., Hellström, B. E. Experimental approach to the pathogenesis of retrolental fibroplasia. III. changes in the eye induced by exposure of newborn mice to general hypoxia. British Journal of Ophthalmology. 39 (7), 409-415 (1955).
  14. Curley, F. J., Habegger, H., Ingalls, T. H., Philbrook, F. R. Retinopathy of immaturity in the newborn mouse after exposure to oxygen imbalances. American Journal of Ophthalmology. 42 (3), 377-392 (1956).
  15. Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).
  16. Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: A model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).
  17. Penn, J. S., Tolman, B. L., Lowery, L. A. Variable oxygen exposure causes preretinal neovascularization in the newborn rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 34 (3), 576-585 (1993).
  18. Penn, J. S., Henry, M. M., Tolman, B. L. Exposure to alternating hypoxia and hyperoxia causes severe proliferative retinopathy in the newborn rat. Pediatric Research. 36 (6), 724-731 (1994).
  19. Ritter, M. R., et al. Three-dimensional in vivo imaging of the mouse intraocular vasculature during development and disease. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (9), 3021-3026 (2005).
  20. Xiao, S., et al. Fully automated, deep learning segmentation of oxygen-induced retinopathy images. Journal of Clinical Investigation Insight. 2 (24), 97585 (2017).
  21. Mazzaferri, J., Larrivee, B., Cakir, B., Sapieha, P., Costantino, S. A machine learning approach for automated assessment of retinal vasculature in the oxygen induced retinopathy model. Scientific Reports. 8 (1), 22251-22257 (2018).
  22. Kim, C. B., D'Amore, P. A., Connor, K. M. Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).
  23. Barnett, J. M., Yanni, S. E., Penn, J. S. The development of the rat model of retinopathy of prematurity. Documenta Ophthalmologica. 120 (1), 3-12 (2010).
  24. Ritter, M. R., et al. Myeloid progenitors differentiate into microglia and promote vascular repair in a model of ischemic retinopathy. Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3266-3276 (2006).
  25. Floyd, B. N., et al. Differences between rat strains in models of retinopathy of prematurity. Molecular Vision. 11, 524-530 (2005).
  26. Scott, A., Powner, M. B., Fruttiger, M. Quantification of vascular tortuosity as an early outcome measure in oxygen induced retinopathy (OIR). Experimental Eye Research. 120, 55-60 (2014).
  27. Walsh, N., Bravo-Nuevo, A., Geller, S., Stone, J. Resistance of photoreceptors in the C57BL/6-c2J, C57BL/6J, and BALB/cJ mouse strains to oxygen stress: Evidence of an oxygen phenotype. Current Eye Research. 29 (6), 441-447 (2004).
  28. Chan, C. K., et al. Differential expression of pro- and antiangiogenic factors in mouse strain-dependent hypoxia-induced retinal neovascularization. Laboratory Investigation. 85 (6), 721-733 (2005).
  29. Stahl, A., et al. Postnatal weight gain modifies severity and functional outcome of oxygen-induced proliferative retinopathy. American Journal of Pathology. 177 (6), 2715-2723 (2010).
  30. Liegl, R., Priglinger, C., Ohlmann, A. Induction and readout of oxygen-induced retinopathy. Methods in Molecular Biology. 1834, 179-191 (2019).
  31. Holmes, J. M., Duffner, L. A. The effect of postnatal growth retardation on abnormal neovascularization in the oxygen exposed neonatal rat. Current Eye Research. 15 (4), 403-409 (1996).
  32. Holmes, J. M., Zhang, S., Leske, D. A., Lanier, W. L. The effect of carbon dioxide on oxygen-induced retinopathy in the neonatal rat. Current Eye Research. 16 (7), 725-732 (1997).
  33. Heiduschka, P., Plagemann, T., Li, L., Alex, A. F., Eter, N. Different effects of various anti-angiogenic treatments in an experimental mouse model of retinopathy of prematurity. Journal of Clinical and Experimental Ophthalmology. 47 (1), 79-87 (2019).
  34. Tokunaga, C. C., et al. Effects of anti-VEGF treatment on the recovery of the developing retina following oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1884-1892 (2014).
  35. Tokunaga, C. C., Chen, Y. H., Dailey, W., Cheng, M., Drenser, K. A. Retinal vascular rescue of oxygen-induced retinopathy in mice by norrin. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (1), 222-229 (2013).
  36. Vähätupa, M., Uusitalo-Järvinen, H., Järvinen, T. A. H., Uusitalo, H., Kalesnykas, G. Intravitreal injection of PBS reduces retinal neovascularization in the mouse oxygen-induced retinopathy model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. Abstract Issue. 57 (12), 3649 (2016).
  37. Penn, J. S., et al. Angiostatic effect of penetrating ocular injury: Role of pigment epithelium-derived factor. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (1), 405-414 (2006).
  38. Becker, S., Wang, H., Stoddard, G. J., Hartnett, M. E. Effect of subretinal injection on retinal structure and function in a rat oxygen-induced retinopathy model. Molecular Vision. 23, 832-843 (2017).
  39. Sophie, R., et al. Aflibercept: A potent vascular endothelial growth factor antagonist for neovascular age-related macular degeneration and other retinal vascular diseases. Biological Therapy. 2, (2012).
  40. Mezu-Ndubuisi, O. J. In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery. Optometry and Vision Science. 93 (10), 1268-1279 (2016).
  41. Mezu-Ndubuisi, O. J., et al. In vivo retinal vascular oxygen tension imaging and fluorescein angiography in the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6968-6972 (2013).
  42. Dailey, W. A., et al. Ocular coherence tomography image data of the retinal laminar structure in a mouse model of oxygen-induced retinopathy. Data in Brief. 15, 491-495 (2017).
  43. Mezu-Ndubuisi, O. J., Taylor, L. K., Schoephoerster, J. A. Simultaneous fluorescein angiography and spectral domain optical coherence tomography correlate retinal thickness changes to vascular abnormalities in an in vivo mouse model of retinopathy of prematurity. Journal of Ophthalmology. 2017, 9620876 (2017).
  44. Pinto, L. H., Invergo, B., Shimomura, K., Takahashi, J. S., Troy, J. B. Interpretation of the mouse electroretinogram. Documenta Ophthalmologica. 115 (3), 127-136 (2007).
  45. Nakamura, S., et al. Morphological and functional changes in the retina after chronic oxygen-induced retinopathy. PLoS One. 7 (2), 32167 (2012).
  46. Dorfman, A. L., Polosa, A., Joly, S., Chemtob, S., Lachapelle, P. Functional and structural changes resulting from strain differences in the rat model of oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (5), 2436-2450 (2009).
  47. Vähätupa, M., et al. SWATH-MS proteomic analysis of oxygen-induced retinopathy reveals novel potential therapeutic targets. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (8), 3294-3306 (2018).
  48. Campos, M., Amaral, J., Becerra, S. P., Fariss, R. N. A novel imaging technique for experimental choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (12), 5163-5170 (2006).
  49. Yanez, C. O., et al. Deep Vascular Imaging in Wounds by Two-Photon Fluorescence Microscopy. PLos One. 8 (7), 67559 (2013).
  50. Wickramasinghe, L. C., et al. Lung and eye disease develop concurrently in supplemental oxygen-exposed neonatal mice. American Journal of Pathology. , 30287 (2020).

Tags

Medisin utgave 163 angiogenese neovaskularisering oksygenindusert retinopati OIR hypoksi retinopati av prematuritet ROP diabetisk retinopati intravitreal injeksjon bildeanalyse kunstig intelligens AI
Oksygenindusert retinopati modell for iskemiske retinale sykdommer hos gnagere
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vähätupa, M.,… More

Vähätupa, M., Jääskeläinen, N., Cerrada-Gimenez, M., Thapa, R., Järvinen, T., Kalesnykas, G., Uusitalo-Järvinen, H. Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents. J. Vis. Exp. (163), e61482, doi:10.3791/61482 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter