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Medicine

Modelo de retinopatía inducida por oxígeno para enfermedades retinianas isquémicas en roedores

Published: September 16, 2020 doi: 10.3791/61482
Automatic Translation
1,2, 2, 2, 2, 1, 2, 1,3
1Faculty of Medicine and Health Technology, Tampere University & Tampere University Hospital, 2Experimentica Ltd, 3Eye Centre, Tampere University Hospital

Summary

La retinopatía inducida por oxígeno (OIR) se puede utilizar para modelar enfermedades retinianas isquémicas como la retinopatía de la prematuridad y la retinopatía diabética proliferativa y para servir como modelo para estudios de prueba de concepto en la evaluación de fármacos antiangiogénicos para enfermedades neovasculares. OIR induce neovascularización robusta y reproducible en la retina que se puede cuantificar.

Abstract

Uno de los modelos comúnmente utilizados para las retinopatías isquémicas es el modelo de retinopatía inducida por oxígeno (OIR). Aquí describimos protocolos detallados para la inducción del modelo OIR y sus lecturas tanto en ratones como en ratas. La neovascularización retiniana se induce en OIR al exponer cachorros de roedores ya sea a hiperoxia (ratones) o niveles alternos de hiperoxia e hipoxia (ratas). Las lecturas primarias de estos modelos son el tamaño de las áreas neovasculares (NV) y avasculares (AVA) en la retina. Este modelo in vivo preclínico se puede utilizar para evaluar la eficacia de posibles fármacos anti-angiogénicos o para abordar el papel de genes específicos en la angiogénesis retiniana mediante el uso de animales genéticamente manipulados. El modelo tiene alguna variación específica de la tensión y del proveedor en la inducción OIR que debe tenerse en cuenta al diseñar los experimentos.

Introduction

Se necesitan modelos experimentales fiables y reproducibles para estudiar la patología detrás de las enfermedades oculares angiogénicas y para desarrollar nuevas terapias a estas devastadoras enfermedades. La angiogénesis patológica es el sello distintivo de la degeneración macular relacionada con la edad húmeda (DMAE) y para muchas enfermedades retinianas isquémicas entre ellas la retinopatía de la prematuridad (ROP), la retinopatía diabética proliferativa (PDR) y la oclusión venosa retiniana (RVO)1,2,3,4. Las retinas humanas y de roedores siguen un patrón de desarrollo similar, ya que tanto la retina humana como la de roedores se encuentran entre los últimos tejidos vascularizados. Antes de que la vasculatura retiniana se haya desarrollado por completo, la retina recibe su suministro de nutrientes a partir de vasculatura hialoide, que, a su vez, retrocede cuando la vasculatura retiniana comienza a desarrollarse1,2. En el ser humano, el desarrollo vascular de la retina se completa antes del nacimiento, mientras que en los roedores el crecimiento de la vasculatura retiniana ocurre después del nacimiento. Dado que el desarrollo vascular retiniano se produce postnatalmente en roedores, proporciona un sistema modelo ideal para estudiar la angiogénesis2,3. Los roedores recién nacidos tienen una retina avascular que se desarrolla gradualmente hasta que se logra un desarrollo completo de la retina vascular al final de la tercera semana postnatal4. Los vasos sanguíneos en crecimiento del ratón neonatal son plásticos, y se someten a regresión durante el estímulo de la hiperoxia5.

Rop es la principal causa de ceguera infantil en los países occidentales, ya que afecta a casi el 70% de los bebés prematuros con peso al nacer por debajo de 1.250 g6,7. El ROP ocurre en bebés prematuros que nacen antes de que los vasos de la retina completen su crecimiento normal. Rop progresa en dos fases: en la Fase I, el parto prematuro retrasa el crecimiento vascular retiniano donde después de la fase II, la vascularización inacabada de la retina en desarrollo causa hipoxia, lo que induce la expresión de factores de crecimiento angiogénicos que estimulan el crecimiento de vasos sanguíneos nuevos y anormales8. El modelo OIR ha sido un modelo ampliamente utilizado para estudiar la fisiopatología del ROP y otras retinopatías isquémicas, así como para probar nuevos candidatos a fármacos2,3,9. Es ampliamente considerado como un modelo reproducible para llevar a cabo estudios de prueba de concepto para posibles fármacos antiangiogénicos para enfermedades oculares y no oculares. Los dos modelos de roedores, es decir, el ratón y la rata OIR difieren en su inducción modelo y fenotipo de enfermedad. El modelo de rata imita el fenotipo ROP con mayor precisión, pero el modelo del ratón proporciona un modelo más robusto, rápido y reproducible para la neovascularización retiniana (NV). En el modelo del ratón, el NV se desarrolla en la retina central. Esta lectura patológica es importante en estudios farmacológicos de eficacia para muchas retinopatías isquémicas, como PDR, RV y AMD exudativa, así como para enfermedades angiogénicas no oculares como el cáncer. Además, la disponibilidad de ratones genéticamente manipulados (transgénicos y knockouts) hace que el modelo OIR del ratón sea una opción más popular. Sin embargo, ni el modelo OIR de ratón ni rata crea fibrosis retiniana, que es típica en las enfermedades humanas.

La comprensión de que los altos niveles de oxígeno contribuyen al desarrollo de ROP en 1950s10,11 condujo al desarrollo de modelos animales. Los primeros estudios sobre el efecto del oxígeno en la vasculatura retiniana se realizaron en 195012,13,14 y hasta la década de 1990 hubo muchos refinamientos al modelo OIR. La investigación de Smith et al. en 1994 estableció un estándar para el actual modelo OIR del ratón que separa la hialoidopatía de la retinopatía15. Una amplia adopción del método para cuantificar el vaso-obliteration y el NV patológico por Connor et al. (2009) aumentó aún más su popularidad16. En este modelo, los ratones se colocan al 75% de oxígeno (O2)durante 5 días en P7, seguidos de 5 días en condiciones normóxicas. La hiperoxia de P7 a P12 hace que la vasculatura retiniana retroceda en la retina central. Al volver a las condiciones normóxicas, la retina avascular se vuelve hipoxica(Figura 1A). Debido a los estímulos hipoxicos de la retina central avascular, algunos de los vasos sanguíneos de la retina brotan hacia lo vítreo, formando NV preretinal, llamados mechones preretinales2,3. Estos mechones son inmaduros e hiperpermeables. La cantidad de NV alcanza su punto máximo en P17, después de lo cual retrocede. La retina está completamente revascularizada y NV es completamente retrocedida por P23 - P25 (Figura 2A)2,3.

El modelo OIR de rata (utilizando diferentes niveles de O2)se describió por primera vez en la década de 1990 mostrando que los niveles variables de O2 al 80% y 40% causan NV más pronunciado que por debajo del 80% O2 exposición constante17. Más tarde se descubrió que el modelo de hipoxia intermitente, donde O2 es ciclo de hiperoxia (50%) a la hipoxia (10-12 %), causa aún más NV que el 80/40% O2 modelo18. En el modelo 50/10%, los cachorros de rata están expuestos al 50% durante 24 horas, seguidos de 24 horas en 10% O2. Estos ciclos se continúan hasta P14, cuando los cachorros de rata son devueltos a condiciones normóxicas (Figura 1B). Al igual que en los pacientes con ROP humano, en el modelo de rata las áreas avasculares se desarrollan a la periferia de la retina debido al plexo vascular retiniano inmaduro(Figura 3).

En ambos modelos, los principales parámetros que normalmente se cuantifican son el tamaño de AVA y NV. Estos parámetros se analizan normalmente desde soportes planos retinianos donde las células endoteliales están etiquetadas como4,16. Anteriormente, la cantidad de NV preretinal se evaluaba a partir de secciones transversales retinianas contando núcleos de vasos sanguíneos o células vasculares que se extendían a vítreos por encima de la membrana limitante interna. La principal limitación de este enfoque es que no es posible cuantificar los AAV.

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Protocol

El protocolo descrito aquí ha sido aprobado por el Comité Nacional de Ética Animal de Finlandia (número de protocolo ESAVI/9520/2020 y ESAVI/6421/04.10.07/2017).

1. Animales experimentales e inducción del modelo OIR del ratón

NOTA: Utilice animales apareados en el tiempo, por ejemplo, ratones C57BL/6J de uso común, para que los cachorros nazcan el mismo día. Utilice presas de crianza, por ejemplo, 129 cepas (129S1/SvImJ o 129S3/SvIM) presas lactantes, para cuidar a los cachorros durante y después de la inducción de hiperoxia. Alternativamente, asegúrese de que hay presas de lactancia adicionales disponibles en caso de que las presas de enfermería necesiten ser reemplazadas debido al agotamiento. Restrinja el tamaño de la camada a 6-7 cachorros por cada presa cuando utilice ratones/presas C57BL/6J (si las camadas son más grandes que las que los cachorros tienden a tener aumento de peso restringido)16.

  1. Registre el peso de los animales antes y después de la inducción por hiperoxia, y en el momento del sacrificio.
  2. Asegúrese de que haya suficiente comida en el fondo de la jaula, para que las presas tengan un fácil acceso a la comida.
  3. Agregue la lima de soda con el indicador de color a la parte inferior de la cámara para absorber el exceso de CO2 cuando no se utilice un sistema de filtración.
  4. Monitoree la humedad y la temperatura dentro de la cámara y mantenga la humedad entre el 40 y el 65%. Aumentar la humedad de la cámara, si es necesario, colocando platos con agua en la parte inferior de la cámara (por ejemplo, platos de Petri).
  5. Calibrar el sensor O2 con 100% O2 y aire ambiente normal.
  6. Coloque los ratones P7 en una cámara y establezca el nivel O2 al 75%. Mantenga a los ratones en la cámara durante 5 días, hasta P12. Evite abrir la cámara durante la inducción por hiperoxia. Compruebe la presión de gas del cilindro O2 y reemplace el cilindro cuando sea necesario. Monitoree a los animales durante la inducción.
  7. Saca las jaulas del ratón de la cámara y pesa todos los cachorros. Agrupa a los cachorros en función del peso para que cada grupo experimental tenga una distribución de peso similar en cachorros.

2. Inducción experimental del modelo OIR de animales y ratas (utilizando sistema semicerrado)

NOTA: Utilice animales apareados en el tiempo para que los cachorros nazcan el mismo día. Para la rata OIR, utilice el aumento del tamaño de la camada, aproximadamente 18 cachorros / presa, para obtener suficiente inducción nv en el modelo de rata. Cachorros de piscina de varias camadas para obtener suficientes cachorros para cada camada.

  1. Registre el peso de los animales antes y después de la inducción, y en el momento del sacrificio.
  2. Asegúrese de que haya suficiente comida en el fondo de la jaula, para que las presas tengan un fácil acceso a la comida.
  3. Agregue la lima de soda con el indicador de color a la parte inferior de la cámara para absorber el exceso de CO2 cuando no se utilice el sistema de filtración.
  4. Monitoree la humedad y la temperatura dentro de la cámara. Absorber la humedad adicional (generada a partir de múltiples números de ratas) mediante la adición de gel de sílice en la parte inferior de la cámara.
  5. Calibrar el sensor O2 con 100% N2 y aire normal de la habitación.
  6. Coloque las ratas en la cámara en P0 (pocas horas después del nacimiento). Ajuste el nivel O2 al 50% y conecte el cilindro O2 a la cámara durante 24 h. Después de eso, cambie los ajustes a 10% O2 y conecte el cilindro de nitrógeno (N2)a la cámara durante 24 h. Continúe el ciclo de 24 h entre el 50% y el 10% O2 niveles durante 14 días.
  7. Monitoree el consumo de gas y el bienestar de los animales durante el estudio. Abra la cámara durante el cambio entre 50/10% O2 y agregue más comida y agua si es necesario. Cambie las jaulas de los animales por otras limpias durante la inducción.
  8. Saca las jaulas de ratas de la cámara y pesa todos los cachorros. Agrupa a los cachorros en función del peso para que cada grupo experimental tenga una distribución de pesaje similar en los cachorros.

3. Administración de medicamentos (opcional)

NOTA: La ruta de administración de fármacos comúnmente utilizada en OIR es por tratamiento intravítreo (ivt), en P12-P14 para ratones y en P14 para ratas. Determine el día del tratamiento en función de la configuración experimental. Cuando se utilicen varias camadas de cachorros en experimentos, divida los grupos de tratamiento para tener animales de todas las camadas. Preferiblemente, inyectar la droga a un solo ojo, y mantener el ojo contralateral como un control.

  1. Pesar a los animales y hacer marcas de identificación en la cola y / o oído.
  2. Anestesiar al animal ya sea con anestesia inyectable (por ejemplo, mezcla de ketamina y medetomidina, 30 mg/kg y 0,4 mg/kg para ratones) o con anestesia por inhalación (isoflurano al 2-3,5% isoflurano y flujo de aire de 200-350 ml/min). Compruebe la profundidad de la anestesia pellizcando los dedos de los dedos de losdos. Mantenga al animal en una almohadilla de calefacción durante el tratamiento.
  3. Para la anestesia local, aplique una gota de analgésico en el párpado. Abra el párpado cuidadosamente con fórceps antes de realizar el ivt, mientras ratones y ratas abren los ojos alrededor de P14. Aplicar una gota de analgésico (por ejemplo, clorhidrato de oxibuprocaína) sobre la córnea.
  4. Aplique una gota de yodo antes de realizar la inyección de ivt.
  5. Para la inyección de ivt, utilice una jeringa de vidrio con una aguja de 33-34 G conectada. Presione los párpados hacia abajo y ralla el globo ocular con fórceps. Haga la inyección posterior al limbo, aproximadamente en 45° aguja angular apuntando hacia el nervio óptico.
  6. Evite inyectar más de 1,0 μL en el espacio intravítreo. Mantenga la aguja en su lugar durante 30 s después de inyectar el medicamento para evitar el reflujo de la solución inyectada.
  7. Examine el ojo (por ejemplo, con un oftalmoscopio) para cualquier complicación, como hemorragias o daño en la retina, después de extraer la aguja. Aplique ungüento antibiótico encima de la córnea después de la inyección.
    NOTA: El volumen de inyección de ivt para ratones debe ser de 0,5 – 1,0 μL.
  8. Revierta la anestesia (por ejemplo, con un antagonista de α2 para medetomidina (2,5 mg/kg) y devuelva al cachorro a la jaula. Casa la camada normalmente hasta el final del estudio.

4. Imágenes in vivo y electroretinografía (opcional)

  1. Si lo desea, realice imágenes in vivo en animales vivos durante el período de seguimiento para registrar los cambios que se desarrollan en la retina durante las respuestas angiogénicas. Por ejemplo, realizar angiografía de fluoresceína (FA) o microscopía confocal láser de barrido19 para visualizar la vasculatura (Figura 4). Utilice la tomografía de coherencia óptica de dominio espectral (SD-OCT) para visualizar capas retinianas in vivo (Figura 4).
  2. Si lo desea, investigue los cambios funcionales en diferentes poblaciones de células retinianas después de la inducción de OIR mediante electroretinografía (ERG) (Figura 5).

5. Recolección de tejidos y preparación de soportes planos retinianos

NOTA: Recoger los tejidos de acuerdo con la hipótesis de investigación deseada. Para ratones, recoja las muestras, por ejemplo, en P12 (para estudiar la eliminación de vasos después de la fase hiperxica) o en el período hipoxico (P13-P17). Recoja las muestras OIR del ratón en P17, que es el punto de tiempo más común para el muestreo, para detectar el pico en la cantidad de NV. En la rata OIR, recoger las muestras en P18-P21 para observar la mayor cantidad de NV (Figura 3).

  1. Pesar a los animales antes del muestreo.
  2. Para etiquetar la vasculatura retiniana, los animales profundamente anestesiados pueden ser perfundidos transcardialmente con FITC-dextran. (Alternativamente, tiñe los soportes planos de la retina con Isolectina más tarde).
  3. Sacrificar a los animales utilizando medicamentos para la anestesia (por ejemplo, mezcla de ketamina y medetomidina, 300 mg/kg y 4 mg/kg para ratones) o inhalación de CO2.
  4. Recoge los ojos de los animales agarrando detrás del globo ocular con fórceps curvos, corta el tejido alrededor de los ojos y levanta el ojo de la órbita.
  5. Incubar los globos oculares en paraformaldehído recién hecho y filtrado (en solución salina amortiguada por fosfato, PBS) durante 1-4 h. Retire el fijador y lave los globos oculares 3 x 10 min con PBS. Disecciona las retinas inmediatamente o guárdalas en PBS a +4 °C.
    PRECAUCIÓN: El paraformaldehído es tóxico por inhalación, en contacto con la piel y si se ingiere. Lea la hoja de datos de seguridad antes de trabajar con ella.
    NOTA: No aplique presión al globo ocular durante el muestreo o cualquier fase del procesamiento del tejido para evitar el desprendimiento de retina, si se realizan secciones transversales de globos oculares enteros.
  6. Prepare soportes planos retinianos para cuantificar la cantidad de NV y el tamaño de los AAV. Alternativamente, procesa los globos oculares/retinas para la histología, o el ARN o el análisis de proteínas. Disecciona la retina bajo un microscopio estéreo usando micro tijeras y fórceps.
    1. Coloque el globo ocular en PBS para mantenerlo húmedo y perforar el globo ocular en limbus con una aguja (23G) y cortar alrededor de limbus con micro tijeras curvas para eliminar el iris y la córnea.
    2. Coloque cuidadosamente la punta de las tijeras entre la esclerótica y la retina y corte la esclerótica hacia el nervio óptico. Haga lo mismo al otro lado del globo ocular y corte/rompa cuidadosamente la esclerótica hasta que la copa de la retina esté expuesta. Tire de la lente de la copa de la retina y agregue PBS a la taza.
    3. Retire todos los vasos hialoides, vítreos y escombros sin dañar la retina. Lave la retina añadiendo PBS a la copa de retina. Realiza cuatro incisiones (a las 12, 3, 6 y 9 en punto) a la retina con micro tijeras rectas para hacer una estructura similar a una flor. Opcionalmente, realice los cortes con cuchilla quirúrgica antes de montar las muestras. Levante la retina usando un pincel suave a un bien plato para la tinción.
  7. Etiquete la vasculatura retiniana usando Isolectina B4 que mancha la superficie de las células endoteliales (si los animales no fueron perfundidos con FITC-dextran). Incubar las retinas en amortiguador de bloqueo (10% NGS + 0,5% Tritón en TBS) durante 1 h y lavar con 1% NGS + 0,1% Tritón en TBS durante 10 minutos. Incubar las retinas con tinte fluorescente conjugado Isolectina B4 (5-10μg/ml) en 1% NGS + 0.1% Tritón en TBS durante la noche a +4 °C mientras está protegido de la luz.
    NOTA: Si lo desea, etiquete otras células como células inflamatorias y pericitos utilizando anticuerpos específicos.
  8. Lave las retinas 3x durante 10 min con 1% NGS + 0.1% Tritón en TBS y levante las retinas en un tobogán microscópico, retina interna hacia arriba. Extienda cuidadosamente la retina usando pincel suave y retire los vasos o desechos hialoides restantes. Agregue el medio de montaje a un resbalón de la cubierta y colóquelo en la parte superior de la retina. Almacene las retinas a +4 °C y protéjalos de la luz.

6. Análisis de los soportes planos

  1. Tome imágenes de los soportes planos de retina usando un microscopio de fluorescencia con objetivo de 10x. Concéntrese en el plexo vascular superficial y en la neovascularización preretinal. Haga una imagen de escaneo de azulejos para capturar toda la retina y fusionar los escaneos de azulejos
  2. Cuantifique las imágenes midiendo los AAV, el área de NV y el área total de la retina utilizando un programa de procesamiento de imágenes (consulte Tabla de materiales).
    1. Dibuje los AVAs y el área total de la retina utilizando una herramienta de dibujo a mano libre y seleccione las áreas neovasculares utilizando una herramienta de selección. El software mide las regiones de interés en píxeles, y las áreas AVA y NV (expresadas en píxeles) se pueden utilizar para calcular su porcentaje en relación con el área retiniana total. Además, algunas herramientas de software están disponibles para cuantificar NV.
      NOTA: Recientemente, se ha introducido un programa de código abierto y totalmente automatizado para la cuantificación de los valores clave de las imágenes OIR utilizando redes neuronales de aprendizaje profundo y proporcionar una herramienta confiable para la cuantificación reproducible de AVA y NV retinianas (por ejemplo, https://github.com/uw-biomedical-ml/oir/tree/bf75f9346064f1425b8b9408ab792b1531a86c64)20,21.
  3. Si utiliza anticuerpos para la detección inmunohistoquímica de poblaciones celulares individuales, cuantifique el número de células manchadas (como microglia, Figura 2B)de los soportes planos retinianos a mano o mediante sistemas automatizados de análisis de imágenes si lo desea.

7. Estadísticas

  1. Analice los datos distribuidos normalmente por la prueba t del estudiante o ANOVA unidireccional seguida de la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett o Tukey, según corresponda. Utilice pruebas no paramétricas como la prueba Mann-Whitney U o la prueba Kruskal Wallis para obtener datos no distribuidos normalmente. Considere las diferencias estadísticamente significativas en el nivel P < 0.05.

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Representative Results

El resultado principal del modelo es el fenotipo vascular: el tamaño de los AAV y la cantidad de NV. En el modelo OIR del ratón, el vaso-obliteration se produce en la retina central(Figura 2A),mientras que en el modelo de rata se desarrolla en la periferia, es decir, similar al ROP22 humano(Figura 3A). Esto se debe a que el plexo vascular superficial ya se ha desarrollado cuando los ratones están expuestos a la hiperoxia, mientras que en el modelo de rata la retina es avascular en el momento de la inducción OIR (P0). La neovascularización preretinal se desarrolla cerca de las áreas avasculares, es decir, la retina central en el ratón, y la periferia en ratas(Figura 2A y Figura 3A).

El análisis histológico utilizando secciones transversales o soportes planos se puede hacer para evaluar los cambios morfológicos en las retinas OIR o la presencia de tipos celulares de interés, por ejemplo, células inflamatorias(Figura 2B). Además de la retina, se pueden recolectar muestras enteras de ojos o vítreos para análisis adicionales de la expresión genética y proteica en diferentes puntos de tiempo durante el modelo OIR. Los niveles de expresión de genes o proteínas se pueden analizar con métodos estándar, como RT-qPCR o hinchazón occidental.

Opcionalmente, las imágenes in vivo no invasivas se pueden realizar durante el período de seguimiento de OIR. La vasculatura retiniana e hialoide se puede visualizar con FA(Figura 4A). SD-OCT se puede utilizar para evaluar los cambios estructurales en la retina (Figura 4B). Los cambios funcionales en la retina pueden medirse por ERG(Figura 5).

Inhibidores del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) se utilizan comúnmente en el tratamiento de enfermedades oculares angiogénicas humanas. Por lo tanto, anti-VEGF se utiliza a menudo como un compuesto de referencia en OIR. Aflibercept, que funciona como una trampa de VEGF soluble, inhibe la revascularización nv y fisiológica en OIR en dosis altas y bajas (inyectadas en P14). Los ojos OIR inyectados en P14 con una alta dosis de aflibercept tenían AVAs retinianas aún más grandes que los ojos no tratados (Figura 6). Esto sugiere que los bloques de aflibercept también revascularización fisiológica de la retina impulsados por la hipoxia. Tanto los modelos de ratón como de rata se pueden utilizar para evaluar el efecto de diferentes agentes anti-angiogénicos en la NV retiniana y la revascularización fisiológica de la retina(Figura 3B y Figura 6).

Figure 1
Figura 1: Visión general gráfica de un diseño de estudio OIR estándar para ratones y ratas. (A) El modelo OIR del ratón fue inducido por la exposición de los ratones al 75% O2 de P7 a P12 y regresó al aire normal de la habitación. El pico de NV preretinal se vio en P17, que suele ser el punto de muestreo para el experimento. (B) El modelo Rat OIR fue inducido por la exposición de las ratas a niveles alternas de O2 (50/10 % O2)de P0 a P14 y volvió a condiciones normóxicas. Las ratas generalmente se sacrifican en P20, cuando la cantidad de NV alcanzó su punto máximo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Fenotipo vascular en el modelo OIR del ratón. El modelo OIR del ratón se generó como se describe en la figura 1. (A) El plexo vascular superficial se desarrolló en ratones normales, mientras que los ratones OIR estuvieron expuestos al 75% O2 de P7 a P12. Durante este tiempo, la destrucción vascular se desarrolló en la retina central (marcada en azul en P12 y P17 en las imágenes cuantificadas). Los ratones fueron devueltos al aire normal de la habitación, y la retina avascular se volvió hipoxica, lo que llevó a la regeneración funcional de los vasos en la retina y el NV patológico (marcado en rojo en P17 en el panel inferior). Mechones neovasculares preretinales desarrollados entre las áreas vasculares y avasculares en la retina central. La cantidad de NV alcanzó su punto máximo en P17 y retrocedió después. Retina fue completamente revascularizada y el NV retrocedió alrededor de P24-P25. (B) Un ejemplo de tinción inmunohistoquímica del soporte plano retiniano que muestra microglia manchada de retina Iba-1 (verde) y vasos sanguíneos manchados GS-IB4 (rojo) en P12 y P17. (C) Sección transversal de un ojo OIR del ratón en P17, donde las mechones preretinales (flechas) brotaban hacia lo vítreo. Además, se observó el adelgazamiento de la capa nuclear interna (INL) y la capa plexiforme exterior (OPL). Las barras de escala son de 1 mm en A, 50 μm en B y 100 μm en C. ILM = membrana limitante interna, GCL = capa de células ganglios, IPL = capa plexiforme interna, INL = capa nuclear interna, OPL = capa plexiforme externa, ONL = capa nuclear externa, RPE = epitelio pigmentario retiniano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Fenotipo vascular y su desarrollo en el modelo OIR de rata. (A) Las áreas avasculares (marcadas en azul) y NV (marcadas en rojo) se desarrollaron en la periferia de la retina, similar a la ROP humana. (B) Las AAV se observaron en retinas OIR, pero no en controles normóxicos. (C) La cuantificación del área de NV mostró una tendencia hacia un pico en la cantidad del NV en P20, pero la diferencia no fue estadísticamente significativa en comparación con P18 y P21 en OIR. (La prueba t del estudiante, entre las retinas normoxic y OIR coincidentes con el tiempo, ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0.001, ambos ojos de los animales trazados en el gráfico). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Imágenes in vivo utilizando angiografía de fluoresceína (FA) y tomografía de coherencia óptica de dominio espectral (SD-OCT) en el modelo OIR de rata. (A) La tortuosidad vascular (puntas de flecha) se vio en las imágenes tomadas de la retina central (fila superior) en P18 y P20 en ratas OIR en comparación con las ratas P19 normoxic. NV (flechas) y AAV (asterisco) se desarrollaron en la periferia de la retina (fila media) como se ve en las retinas P18 y P20 OIR. Los vasos hialoides en retroceso (fila inferior) fueron capturados por fa. (B) El crecimiento de los vasos sanguíneos hacia el vítreo se observó como un engrosamiento en la capa de fibra nerviosa (NFL) y la capa de células gangliones (GCL) en las retinas OIR (flecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: La funcionalidad de las neuronas retinianas se puede medir mediante electroretinografía flash (fERG). (A) las ondas a se derivaron del cono retiniano y fotorreceptores de varilla y sus amplitudes se redujeron significativamente en el modelo OIR de rata. El efecto aumentó con una mayor intensidad de luz, lo que sugiere que los defectos estaban afectando las funciones del fotorreceptor del cono principalmente. (B) Las amplitudes de ondas B de los animales OIR se redujeron en comparación con los controles normóxicos. Las ondas B se derivaron de células ON-bipolares y células Müller. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: PBS inyectado intravítreamente reduce nv y AVAs en el modelo OIR del ratón. (A) Imágenes representativas de soportes planos retinianos de no tratadas y tratadas con aflibercept (20 μg a P14) y PBS inyectaron ojos OIR en P17. La alta dosis de aflibercept (20 μg) aumentó el tamaño de los AAV en un 47% (delineado en blanco) e inhibió el NV en un 98% (flechas) en comparación con los controles no tratados. La inyección de PBS disminuyó los AAV en un 31% y el NV en un 42% en comparación con los controles no tratados. Además, la punción de la esclerótica que se asemeja a ivt produjo efectos similares a la inyección de ivt de PBS, pero las diferencias no fueron estadísticamente significativas. Punta de flecha apunta a recipientes hialoides que no fueron retirados durante la disección. (Unidireccional ANOVA, * p ≤ 0.05; ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0.001, **** p ≤ 0.0001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La gravedad del fenotipo de la enfermedad depende tanto de la cepa como del proveedor en los modelos OIR de ratón y rata23. Esto sugiere que hay una amplia variabilidad genotípica en el desarrollo de la patología. En general, los roedores pigmentados desarrollan un fenotipo más grave que los albino. Por ejemplo, la vasculatura retiniana de albino BALB/c revasculariza rápidamente después de la hiperoxia y no desarrolla NV en absoluto24. Del mismo modo, en ratas, las ratas pigmentadas de Brown Norway muestran una patología más grave que las ratas albinas Sprague Dawley (SD)25. Las ratas SD se utilizan comúnmente cepa, y las diferencias relacionadas con el proveedor en el fenotipo OIR se han divulgado dentro de la cepa. Por ejemplo, las ratas SD del río Charles producen significativamente más NV que las ratas de Harlan o Zivic-Miller23. Los ratones C3H/HeJ, a su vez, que tienen una mutación en el gen degeneración retiniana 1(Rd1),tienen retinas delgadas y no desarrollan NV26. Debido a estas razones y la disponibilidad de líneas de ratones transgénicos, la endogámica C57BL/6J es la cepa de ratón más utilizada para estudios OIR. Sin embargo, hay una mortalidad bastante alta entre las presas C57BL/6J debido a la exposición hiperxica, por lo que el bienestar de los ratones debe considerarse al diseñar el estudio y monitorearse durante los experimentos. Además, se observa un aumento del daño del fotorreceptor en ratones C57BL/6 en comparación con ratones BALB/c27.

Con el fin de asegurar el bienestar de los ratones y la supervivencia de las presas y cachorros, el tamaño de la camada debe mantenerse pequeño (6-7 cachorros / presa). Esto es especialmente importante cuando se utilizan ratones C57BL/6, que son más susceptibles a la tensión hiperxica27,28. Además, se deben proporcionar alimentos de apoyo de fácil acceso (colocados en la parte inferior de la jaula) a los ratones. Algunos investigadores utilizan presas sustitutas para reemplazar las presas en la cámara por otras sanas después de la inducción de oxígeno. Sin embargo, la mayoría de los investigadores utilizan sustitutos sólo si la presa se agota22,29. Se recomienda utilizar presas sustitutas si se utilizan tamaños de basura más grandes. Se ha publicado que los ratones 129S3/SvIM producen más NV que C57BL/6 y sostienen mejor los cambios causados por los diferentes niveles de oxígeno28. Cabe señalar que las presas utilizadas en OIR no sonfértiles después de la inducción OIR y no deben utilizarse para fines de cría22. El aumento de peso posnatal de los cachorros afecta la gravedad de la patología OIR. Cachorros con bajo aumento de peso posnatal (<5 g en P17) muestran la expresión retardada de VEGF y por lo tanto fase prolongada de retinopatía en comparación con cachorros con normal (5 - 7.5 g en P17) o aumento de peso extenso (>7.5 g en P17)29. Además, los cachorros de ratones que pesan más de 5 g en P7 no muestran áreas de vaso-borrado después de la inducción de OIR30. Por lo tanto, es importante pesar a los cachorros durante el experimento. El ojo contralateral no tratado se puede utilizar como un control interno para asegurar que el estado nutricional de los ratones no afecte a los resultados. La situación es similar en ratas; cuanto más pequeños son los cachorros, más grave es el fenotipo OIR desarrollan31. Por lo tanto, se recomienda el tamaño de camada grande (aprox. 18 cachorros) para ser utilizado para el modelo OIR de rata.

La inducción del modelo OIR se puede hacer utilizando cualquier sistema completamente cerrado, donde hay un circuito de bucle cerrado con una bomba que circula el aire a través de un sistema de filtro (cal de soda y carbón activado) de vuelta a la cámara. Otra opción es un sistema semi-cerrado, donde la ventilación asegura que el exceso de metabolitos se eliminan de la cámara. Para garantizar que se elimine el exceso de CO2, se puede colocar cal de soda (mezcla de hidróxido de calcio con hidróxido sódico o hidróxido de potasio) en la parte inferior de la cámara. La extracción de CO2 es obligatoria ya que los altos niveles de CO2 empeoran el fenotipo de la enfermedad en ratas32. Uno también debe recordar recalibrar el sensor de oxígeno de la cámara regularmente, ya que tienden a la deriva con el tiempo y pueden proporcionar una concentración de oxígeno incorrecta de la prevista.

Se ha informado de que la inyección del vehículo (PBS) solo o incluso sólo la punción al espacio intravítreo tiene un efecto para la tasa de revascularización y la cantidad de NV (Figura 6)33,34,35,36. Se ha especulado si el efecto observado con la inyección de PBS/vehículo podría deberse a cambios en la presión intraocular durante la inyección, o debido a lesiones en las estructuras oculares que aumenta los niveles de factores de crecimiento angiogénicos entre ellos el factor de crecimiento derivado del epitelio pigmentario34,37. Además, sólo una inyección subretinal piloto solo (punción al espacio subretinal) se ha demostrado que tiene efectos sobre el fenotipo vascular y funcional en OIR en comparación con las ratas no tratadas38. Estos resultados ponen de relieve la importancia de los controles negativos adecuados en los estudios OIR o incluso la administración sistémica de compuestos probados, así como los números n lo suficientemente grandes en cada grupo de estudio. El hecho de que la inyección del vehículo realmente mejore la tasa de revascularización en la retina es un factor limitante importante, ya que la tasa de revascularización y la formación de mechones preretinales patológicos están interrelacionados en el modelo OIR: si se acelera la tasa de revascularización, conduce a la regulación compensatoria de los mechones neovasculares y viceversa. Por lo tanto, ambas medidas de resultados primarios del modelo OIR se ven afectadas por la inyección del vehículo.

Inhibidores de VEGF han revolucionado el tratamiento AMD y DR. OIR modelo se utilizó para demostrar su eficacia preclínicamente. En cuanto a los inhibidores del VEGF en OIR, un estudio que comparó diferentes anti-VEGFs y anti-PLGFs (factor de crecimiento placentaria) (inyectado en P12) mostró que el anti-VEGF solo conducía a pequeñas áreas avasculares, mientras que los ojos tratados anti-PIGF tenían áreas avasculares más grandes33. Aflibercept tenía los AVAs más grandes en comparación con otros tratamientos farmacológicos33. Aflibercept es conocido por unir VEGF y PlGF39,podría ser que la inhibición de PlGF en OIR conduce al bloqueo de la angiogénesis fisiológica.

Las imágenes in vivo no invasivas proporcionan una herramienta para monitorear la vasculatura retiniana40 y las capas y estructura de la retina durante el período de seguimiento. Usando FA, parámetros como densidad vascular y tortuosidad arterial y dilatación venosa (llamada más enfermedad, Figura 4A)se pueden medir40,41. SD-OCT se puede utilizar para evaluar los cambios estructurales y medir el grosor de la retina durante el período de seguimiento de OIR42,43. ERG se utiliza para medir los cambios funcionales en la retina. Diferentes tipos de células producen potenciales eléctricos después del estímulo de la luz, y estas señales u "ondas" se pueden medir con ERG. Los fotorreceptores están produciendo la onda negativa, y las células bipolares ON y las células Müller son principalmente responsables de la onda b44. La pérdida de la función retiniana es típica en ratones y ratas OIR45,46 (Figura 5). Los cambios duraderos persisten en la retina y tanto los cambios funcionales como los cambios en el nivel de proteínas se han notificado en retinas OIR incluso después de la revascularización y la regresión nv34,47.

Para visualizar la vasculatura retiniana, los ratones vivos pueden perfundirse con dextrano con etiqueta FITC o los soportes planos retinianos se pueden teñir con tinte fluorescente con la etiqueta Isolectina B4. Uno necesita entender la diferencia entre los tintes fluorescentes; la perfusión con FITC-dextrans etiqueta sólo el lúmenes de los vasos, mientras que isolectina B4 mancha la superficie de las células endoteliales. Así, los vasos sanguíneos funcionales con lumen adecuado sólo se visualizarán con perfusión fitc-dextrano, mientras que el área total de NV aparece más grande en las retinas manchadas isolectina B4 que en los animales perfundidos fitc-dextranos, porque isolectina B4 esencialmente recoge incluso células endoteliales que no han formado lúmenes funcionales todavía48. Una opción más reciente para visualizar toda la retina / bola del ojo en formato 3-D es imágenes de tejido profundo por microscopía de fluorescencia de dos fotones(49).

El modelo OIR de roedores, así como los modelos animales en general, sólo representan parcialmente las características de las enfermedades humanas. La principal diferencia relacionada con la OIR es que la neovascularización retiniana no está asociada con fibrosis en el roedor OIR, mientras que la neovascularización retiniana conduce comúnmente a la proliferación fibrovascular en enfermedades neovasculares de la retina humana. Además, las condiciones que causan la OIR frente a las enfermedades humanas pueden ser casi opuestas. Los neonatos prematuros con ROP requieren oxígeno suplementario con apoyo respiratorio, experimentan episodios hipobiómicos e hiperofímicos frecuentemente intermitentes causados por apnea recurrente, pero no están expuestos a altos niveles de oxígeno. Para minimizar el daño permanente, se evitan altas fracciones de O2 inspirados. En ese sentido, ni el modelo de ratón con exposición constante al 75% O2 durante 5 días ni el modelo de rata 50/10 se asemejan a la patogénesis del ROP humano. Además, también hay diferencias entre los modelos OIR de rata y ratón. La neovascularización retrocede en el modelo de ratón con el restablecimiento de los recipientes normales por P24, mientras que la condición empeora en el modelo OIR de rata (similar al ROP humano). Aunque, el modelo OIR de rata muestra características clínicamente relevantes de ROP como el retraso en el desarrollo vascular de la retina y la posterior neovascularización patológica, su uso está limitado por una ausencia casi completa de cepas de ratas transgénicas, mayores costos de mantenimiento y menos NV que en el modelo OIR del ratón.

En conjunto, a pesar de las diferencias entre las retinopatías proliferativas isquémicas humanas y los modelos OIR de roedores, la facilidad por la que se puede inducir el NV, junto con la fácil visualización y cuantificación de la retina, hacen que los modelos OIR sean populares para estudiar los mecanismos moleculares y las terapias potenciales para las retinopatías proliferativas isquémicas. Curiosamente, la exposición a la hiperoxia en el modelo OIR del ratón también induce displasia broncopulmonar, otra enfermedad causada por la oxigenoterapia suplementaria en bebés prematuros humanos, mostrando que el modelo OIR podría utilizarse para explorar objetivos novedosos tanto para rop como para displasia broncopulmonar simultáneamente50.

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Disclosures

Los autores Maria Vähätupa, PhD, Niina Jääskeläinen, Marc Cerrada-Gimenez, PhD y Rubina Thapa son empleados de Experimentica Ltd.

El autor Giedrius Kalesnykas, PhD, es un empleado (Presidente y Director Ejecutivo) y accionista de Experimentica Ltd. que ofrece servicios de investigación contractual que emplean modelos OIR preclínicos utilizados en este artículo.

Tero Järvinen, M.D., PhD, y Hannele Uusitalo-Järvinen, M.D., PhD, no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a Marianne Karlsberg, Anne Mari Haapaniemi, Päivi Partanen y Anne Kankkunen por su excelente apoyo técnico. Este trabajo fue financiado por la Academia de Finlandia, la Fundación Päivikki y Sakari Sohlberg, la Fundación Tampere Tuberculosis, la Fundación Médica Finlandesa, la Fundación de Investigación del Distrito Hospitalario pirkanmaa y el Fondo de Investigación hospitalaria de la Universidad de Tampere.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
33 gauge, Small Hub RN Needle Hamilton Company 7803-05, 10mm, 25°, PS4 For intravitreal injection
Adobe Photoshop Adobe Inc. For image analysis
Air pump air100 Eheim GmbH & Co. KG. 143207 For inhalation anaesthesia
Anaesthesia unit 410 AP Univentor Ltd. 2360309 For inhalation anaesthesia
AnalaR NORMAPUR Soda lime VWR International Ltd 22666.362 For CO2 control during model induction
Attane Vet 1000 mg/g VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY vnr 17 05 79 For inhalation anaesthesia
Brush For preparation of flat mounts
Carbon dioxide gas For sacrifice
Celeris D430 ERG system Diagnosys LLC 121 For in vivo ERG
Cell culture dishes Greiner Bio-One International GmbH 664 160 For preparation of flat mounts
Cepetor Vet 1 mg/mL VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY vnr 08 78 96 For anaesthesia
Cover slips Thermo Fisher Scientific 15165452 For preparation of flat mounts
O2 Controlled InVivo Cabinet, Aninal Filtrarion System and Dehumidifier Coy Laboratory Products Closed system for disease model induction, optional for semi-closed system
E702 O2 sensor BioSphenix, Ltd. E207, 1801901 For oxygen level measurement
Envisu R2200 Spectral Domain Optical Coherence Tomograph (SD-OCT) Bioptigen, Inc. BPN000668 For in vivo imaging
Eye spears Beaver-Visitec International, Inc. 0008685 For intravitreal injection and in vivo imaging
Flexilux 600LL Cold light source Mikron 11140 For intravitreal injection or tissue collection
Fluorescein sodium salt Merck KGaA F6377-100G For in vivo imaging
Gas Exhaust unit (+Double 3-way valve, mouse and rat face masks, UNOsorb filter) UNO Roestvaststaal BV GEX 17015249 For inhalation anaesthesia
Glass syringe, Model 65 RN Hamilton Company 7633-01 For intravitreal injection
HRA2 Retina angiograph (FA) Heidelberg Engineering GmbH Spec-KT-05488 For in vivo imaging
Isolectin GS-IB4, Alexa Fluor 488 Conjugate Thermo Fisher Scientific I21411 For labeling retinal vasculature on flat mounts
Ketaminol Vet 50 mg/mL Intervet International B.V. vnr 51 14 85 For anaesthesia
Medicinal Oxygen gas For disease model induction
Mice C57BL/6JRj Janvier Labs Also other strains possible
Microscope slides Thermo Fisher Scientific J1800AMNZ For preparation of flat mounts
Minims Povidone Iodine 5% (unit) Bausch & Lomb U.K Limited vnr 24 11 304 For intravitreal injection
Nitrogen gas For disease model induction (rat)
Oftan Chlora 10 mg/g Santen Pharmaceutical Co., Ltd. vnr 55 01 11 For intravitreal injection
Oftan Metaoksedrin 100 mg/ml Santen Pharmaceutical Co., Ltd. vnr 55 03 43 For in vivo ERG
Oftan Obucain 4 mg/ml Santen Pharmaceutical Co., Ltd. vnr 55 03 50 For intravitreal injection
Oftan Tropicamid 5 mg/ml Santen Pharmaceutical Co., Ltd. vnr 04 12 36 For in vivo imaging
ProOx Model 110 O2 controller and animal chamber BioSphenix, Ltd. 803 For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system
ProOx Model P360 O2 controller and animal chamber BioSphenix, Ltd. 538 For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system
Rats CD(SD) Charles River Laboratories Also other strains possible
Revertor 5 mg/mL VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY vnr 13 04 97 For anaesthesia reversal
Silica gel For humidity control during model induction
Systane Ultra 10ml Alcon Tamro 2050250 For hydration of the eye
Systane Ultra unit 0.7ml Alcon Tamro 2064871 For hydration of the eye
Transfer pipette Thermo Fisher Scientific 1343-9108 For preparation of flat mounts
VENTI-Line VL 180 PRIME Drying oven VWR VL180S 170301 For drying silica gel
VisiScope SZT350 Stereomicroscope VWR 481067 For intravitreal injection or tissue collection

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Medicina Número 163 angiogénesis neovascularización retinopatía inducida por oxígeno OIR hipoxia retinopatía de prematuridad ROP retinopatía diabética inyección intravítrea análisis de imágenes inteligencia artificial IA
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