Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Syreinducerad retinopatimodell för ischemiska näthinnesjukdomar hos gnagare

Published: September 16, 2020 doi: 10.3791/61482
Automatic Translation
1,2, 2, 2, 2, 1, 2, 1,3
1Faculty of Medicine and Health Technology, Tampere University & Tampere University Hospital, 2Experimentica Ltd, 3Eye Centre, Tampere University Hospital

Summary

Syreinducerad retinopati (OIR) kan användas för att modellera skandinaviska näthinnesjukdomar såsom retinopati av prematuritet och proliferativ diabetes retinopati och att fungera som en modell för proof-of-concept studier vid utvärdering av antiangiogenic läkemedel för neovaskulära sjukdomar. OIR inducerar robust och reproducerbar neovaskularisering i näthinnan som kan kvantifieras.

Abstract

En av de vanliga modellerna för skandinaviska retinopatier är den syreinducerade retinopatimodellen (OIR). Här beskriver vi detaljerade protokoll för OIR-modellens induktion och dess avläsningar hos både möss och råttor. Retinal neovascularization induceras i OIR genom att utsätta gnagare valpar antingen för hyperoxia (möss) eller alternerande nivåer av hyperoxia och hypoxi (råttor). De primära avläsningarna av dessa modeller är storleken på neovaskulära (NV) och avascular (AVA) områden i näthinnan. Denna prekliniska in vivo-modell kan användas för att utvärdera effekten av potentiella antiangiogena läkemedel eller för att ta itu med specifika geners roll i näthinnans angiogenes med hjälp av genetiskt manipulerade djur. Modellen har en viss stam- och leverantörsspecifik variation i OIR-induktionen som bör beaktas vid utformningen av experimenten.

Introduction

Tillförlitliga och reproducerbara experimentella modeller behövs för att studera patologin bakom angiogena ögonsjukdomar och för att utveckla nya terapier till dessa förödande sjukdomar. Patologisk angiogenes är kännetecknet för våt åldersrelaterad makuladegeneration (AMD) och för många skandinaviska näthinnesjukdomar bland dem retinopati av prematuritet (ROP), proliferativ diabetiker retinopati (PDR) och näthinnevenocklusion (RVO)1,2,3,4. Mänskliga och gnagare retinas följer ett liknande utvecklingsmönster, eftersom både mänskliga och gnagare näthinnan är bland de sista vävnaderna som är vascularized. Innan näthinnan vaskulaturen har utvecklats helt, får näthinnan sin näringstillförsel från hyaloid vaskulatur, som i sin tur går tillbaka när näthinnans vaskulatur börjar utvecklas1,2. Hos människa slutförs retinal vaskulär utveckling före födseln, medan tillväxten av retinal vaskulatur hos gnagare sker efter födseln. Eftersom retinal vaskulär utveckling sker postnatally hos gnagare, ger det ett idealiskt modellsystem för att studera angiogenesen2,3. Nyfödda gnagare har en avascular näthinnan som utvecklas gradvis tills fullständig vaskulär näthinnan utveckling uppnås i slutet av tredje postnatala vecka4. De växande blodkärlen hos neonatalmus är plast, och de genomgår regression under hyperoxiastimulans5.

ROP är den främsta orsaken till barndomsblindhet i västländer, eftersom det påverkar nästan 70% av de för tidigt födda med födelsevikt under 1 250 g6,7. ROP förekommer hos för tidigt födda spädbarn som föds innan näthinnekärlen slutför sin normala tillväxt. ROP fortskrider i två faser: i fas I, prematur födsel fördröjer retinal Vaskulär tillväxt där efter i fas II, oavslutad Vascularization av den utvecklande näthinnan orsakar hypoxi, vilket inducerar uttryck av angiogenic tillväxtfaktorer som stimulerar nya och onormala blodkärl tillväxt8. OIR-modellen har varit en allmänt använd modell för att studera patofysiologin hos ROP och andra skandinaviska retinopatier samt för att testa nya läkemedelskandidater2,3,9. Det anses allmänt vara en reproducerbar modell för att utföra proof-of-concept studier för potentiella antiangiogenic läkemedel för okulär samt icke-okulär sjukdomar. De två gnagarmodellerna, dvs. mus och råtta OIR skiljer sig åt i sin modell induktion och sjukdom fenotyp. Råttmodellen efterliknar ROP fenotyp mer exakt, men musmodellen ger en mer robust, snabb och reproducerbar modell för retinal neovascularization (NV). I musmodellen utvecklas NV till den centrala näthinnan. Denna patologiska avläsning är viktig i farmakologiska effektstudier för många skandinaviska retinopatier, såsom PDR, RV och exudativ AMD samt för icke-okulära, angiogena sjukdomar som cancer. Dessutom gör tillgången på genetiskt manipulerade (transgena och knockout) möss musens OIR-modell till ett mer populärt alternativ. Men varken mus eller råtta OIR modell skapar näthinnefibros, vilket är typiskt vid mänskliga sjukdomar.

Förståelsen att höga syrenivåer bidrar till utvecklingen av ROP på 1950-talet10,11 ledde till utvecklingen av djurmodeller. De första studierna om syrets effekt på retinalvaskulatur gjordes 195012,13,14 och fram till 1990-talet fanns det många förbättringar av OIR-modellen. Forskningen av Smith et al. 1994 satte en standard för den nuvarande mus OIR-modellen som skiljer hyaloidopati från retinopati15. En bred användning av metoden för att kvantifiera vaso-utplåning och patologisk NV av Connor et al. (2009) ökade ytterligare dess popularitet16. I denna modell placeras möss på 75% syre (O2) i 5 dagar vid P7, följt av 5 dagar i normoxiska förhållanden. Hyperoxia från P7 till P12 orsakar retinal vaskulatur att regress i centrala näthinnan. Vid återgång till normoxiska tillstånd blir avaskulär näthinna hypoxisk (figur 1A). På grund av de hypoxiska stimuli i den avaskulära centrala näthinnan spirar några av näthinnans blodkärl mot glaskroppen och bildar preretinal NV, kallad preretinal tufts2,3. Dessa tufts är omogna och hyperpermeable. Mängden NV-toppar vid P17, varefter den återinträdes. Näthinnan är helt revascularized och NV är helt regressed av P23 - P25 (Figur 2A)2,3.

Råtta OIR-modellen (med varierande nivåer av O2) beskrevs först på 1990-talet som visar att varierande O2-nivåer vid 80% och 40% orsakar mer uttalad NV än under 80% O2 konstant exponering17. Senare upptäcktes att den intermittenta hypoximodellen, där O2 cyklas från hyperoxi (50%) hypoxi (10-12 %), orsakar ännu mer NV än 80/40% O2 modell18. I 50/10% -modellen utsätts råttvalpar för 50% i 24 timmar, följt av 24 timmar i 10% O2. Dessa cykler fortsätter fram till P14, då råttvalparna återgår till normoxiska förhållanden (figur 1B). Liksom hos humana ROP- patienter utvecklas de avaskulära områdena i råttmodellen till näthinnans periferi på grund av omogna näthinnan Vaskulär plexus (figur 3).

I båda modellerna är de viktigaste parametrarna som vanligtvis kvantifieras storleken på AVA och NV. Dessa parametrar analyseras vanligtvis från näthinneplatta fästen där endotelcellerna ärmärkta 4,16. Tidigare utvärderades mängden preretinal NV från retinal tvärsnitt genom att räkna blodkärl eller vaskulär cellkärnor som sträcker sig till glaskropp ovanför det inre begränsande membranet. Den största begränsningen av detta tillvägagångssätt är att det inte är möjligt att kvantifiera avgränsarna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Det protokoll som beskrivs här har godkänts av Finlands nationella djuretiska kommitté (protokollnummer ESAVI/9520/2020 och ESAVI/6421/04.10.07/2017).

1. Experimentella djur och mus OIR modell induktion

OBS: Använd tidsparade djur, t.ex. vanliga C57BL/6J-möss, för att få valpar födda samma dag. Använd fosterdammar, t.ex. 129 stam (129S1/SvImJ eller 129S3/SvIM) lakterande dammar, för att amma valparna under och efter induktion av hyperoxi. Alternativt, se till att det finns extra lakterande dammar tillgängliga om amningsdammarna behöver bytas ut på grund av utmattning. Begränsa kullstorleken till 6-7 valpar för varje damm när du använder C57BL/6J möss/dammar (om kullarna är större än så tenderar valparna att ha begränsad viktökning)16.

  1. Registrera djurens vikt före och efter hyperoxiinduktion och vid tidpunkten för uppoffringen.
  2. Se till att det finns tillräckligt med mat på botten av buret, så att dammarna har enkel tillgång till mat.
  3. Tillsätt sodakalk med färgindikator till botten av kammaren för att absorbera överskott av CO2 när ett filtreringssystem inte används.
  4. Övervaka luftfuktigheten och temperaturen inuti kammaren och håll luftfuktigheten mellan 40 och 65%. Öka luftfuktigheten i kammaren, om det behövs, genom att placera rätter med vatten på botten av kammaren (t.ex. petriskålar).
  5. Kalibrera O2-sensorn med 100% O2 och normal rumsluft.
  6. Placera P7-mössen i en kammare och ställ in O2-nivån till 75%. Håll mössen i kammaren i 5 dagar, tills P12. Undvik att öppna kammaren under hyperoxiinduktionen. Kontrollera gastrycket på O2-cylindern och byt ut cylindern vid behov. Övervaka djuren under induktionen.
  7. Ta ut musburarna ur kammaren och väg alla valpar. Gruppera valparna baserat på vikten så att varje experimentell grupp har liknande viktfördelning hos valpar.

2. Försöksdjur och induktion av råtta OIR-modell (med halvstängt system)

OBS: Använd tidsparade djur för att få valparna födda samma dag. För råtta OIR, använd ökad kullstorlek, cirka 18 valpar/damm, för att få tillräcklig NV-induktion i råttmodellen. Poolvalpar från flera kullar för att få tillräckligt med valpar till varje kull.

  1. Registrera djurens vikt före och efter induktion och vid tidpunkten för uppoffringen.
  2. Se till att det finns tillräckligt med mat på botten av buret, så att dammarna har enkel tillgång till mat.
  3. Tillsätt sodakalk med färgindikator till botten av kammaren för att absorbera överskott av CO2 när filtreringssystemet inte används.
  4. Övervaka luftfuktigheten och temperaturen inne i kammaren. Absorbera extra fuktighet (genererad från flera antal råttor) genom att tillsätta kiselgel på botten av kammaren.
  5. Kalibrera O2-sensorn med 100% N2 och normal rumsluft.
  6. Placera råttorna i kammaren vid P0 (några timmar efter födseln). Ställ in O2-nivån på 50% och anslut O2-cylindern till kammaren i 24 timmar. Därefter, byt inställningarna till 10% O2 och anslut kvävecylindern (N2)till kammaren i 24 timmar. Fortsätt 24 h cykling mellan 50% och 10% O2 nivåer i 14 dagar.
  7. Övervaka gasförbrukningen och djurens välbefinnande under studien. Öppna kammaren under bytet mellan 50/10% O2 och tillsätt mer mat och vatten vid behov. Byt djurens burar för att rengöra dem under induktionen.
  8. Ta ut råttburarna ur kammaren och väg alla valpar. Gruppera valparna baserat på vikten så att varje experimentell grupp har liknande vägningsfördelning hos valparna.

3. Administrering av narkotika (frivillig uppgift)

OBS: Vanlig läkemedelsadministrationsväg i OIR är genom intravitreal behandling (ivt), vid P12-P14 för möss och vid P14 för råttor. Bestäm behandlingsdagen baserat på den experimentella installationen. När flera kullar av valpar används i experiment, dela upp behandlingsgrupperna för att få djur från alla kullar. Injicera helst läkemedlet till endast ett öga och håll det kontralaterala ögat som en kontroll.

  1. Väg djuren och gör identifieringsmärken på svansen och/eller örat.
  2. Bedöva djuret antingen med injicerbar anestesi (t.ex. blandning av ketamin och medetomidin, 30 mg/kg och 0,4 mg/kg för möss) eller med inandningsbedövning (isofluran vid 2-3,5% isofluran och 200-350 mL/min luftflöde). Kontrollera anestesins djup genom att nypa tårna. Håll djuret på en värmedyna under behandlingen.
  3. För lokalbedövning, applicera en droppe smärtstillande medel på ögonlocket. Öppna ögonlocket försiktigt med tång innan du utför droppet, när möss och råttor öppnar ögonen runt P14. Applicera en droppe smärtstillande medel (t.ex. oxybuprokainhydroklorid) på hornhinnan.
  4. Applicera en droppe jod innan droppinjektionen.
  5. För droppinjektionen använd en glasspruta med en 33-34 G nål fastsatt. Tryck ner ögonlocken och riv ögongloben med tång. Gör injektionen bakre till limbus, ungefär i 45° vinkelnål som pekar mot optisk nerv.
  6. Undvik att injicera mer än 1,0 μL i det intravitreala utrymmet. Håll nålen på plats i 30 s efter att läkemedlet injicerats för att undvika återflöde av den injicerade lösningen.
  7. Undersök ögat (t.ex. med ett oftalmoskop) för eventuella komplikationer, såsom blödningar eller näthinneskador, efter att ha tagit bort nålen. Applicera antibiotikasalva ovanpå hornhinnan efter injektionen.
    OBS: Ivt injektionsvolymen för möss ska vara 0,5 – 1,0 μL.
  8. Vänd anestesin (till exempel med en α2-antagonist för medetomidin (2,5 mg/kg) och sätt tillbaka valpen i buret. Hus skräpet normalt fram till slutet av studien.

4. In vivo-avbildning och elektroretinografi (valfritt)

  1. Om så önskas, utför in vivo-avbildning på levande djur under uppföljningsperioden för att registrera förändringar som utvecklas i näthinnan under de angiogena svaren. Utför till exempel fluoresceinangiografi (FA) eller skanna laserkonfokalmikroskopi 19 för att visualisera vaskulaturen (figur 4). Använd spectral domän optisk koherenstomografi (SD-OCT) för att visualisera näthinnelager in vivo (Figur 4).
  2. Om så önskas, undersök funktionella förändringar i olika retinalcellpopulationer efter OIR-induktion med hjälp av elektroretinografi (ERG) (figur 5).

5. Vävnadsinsamling och beredning av näthinneplatta fästen

OBS: Samla vävnaderna enligt önskad forskningshypotes. För möss, samla in proverna till exempel vid P12 (för att studera vaso-utplåning efter hyperoxisk fas) eller under den hypoxiska perioden (P13-P17). Samla in musens OIR-prover vid P17, som är den vanligaste tidpunkten för provtagning, för att upptäcka toppen i NV-mängd. Samla in proverna vid P18-P21 på råtta OIR för att observera den högsta mängden NV(figur 3).

  1. Väg djuren före provtagning.
  2. För att märka retinalvaskulaturen kan djupt sövda djur transcardially perfused med FITC-dextran. (Alternativt, färga näthinnans platta fästen med Isolectin senare).
  3. Offra djuren med antingen överdosering av anestesiläkemedel (t.ex. blandning av ketamin och medetomidin, 300 mg/kg och 4 mg/kg för möss) eller CO 2-inandning.
  4. Samla djurens ögon genom att ta tag bakom ögongloben med böjda tångar, skära vävnaden runt ögonen och lyfta ögat ut från omloppsbanan.
  5. Inkubera ögongloberna i nygjord, filtrerad 4% paraformaldehyd (i fosfatbuffrad saltlösning, PBS) i 1-4 h. Ta bort fixeringen och tvätta ögongloberna 3 x 10 min med PBS. Dissekera näthinnan omedelbart eller förvara dem i PBS vid +4 °C.
    VARNING: Paraformaldehyd är giftig vid inandning, hudkontakt och vid förtäring. Läs säkerhetsdatabladet innan du arbetar med det.
    OBS: Tryck inte på ögongloben under provtagningen eller någon fas av vävnadsbehandlingen för att undvika näthinneavlossning om tvärsnitt från hela ögonglober görs.
  6. Förbered retinalplatta fästen för att kvantifiera mängden NV och storleken på AVAs. Alternativt kan du bearbeta ögongloberna/näthinnan för histologi, eller RNA eller proteinanalys. Dissekera näthinnan under ett stereomikroskop med hjälp av en mikroskop och tång.
    1. Placera ögongloben i PBS för att hålla den fuktig och punktera ögongloben vid limbus med en nål (23G) och skär runt limbus med böjd mikrosax för att ta bort iris och hornhinnan.
    2. Placera försiktigt saxspetsen mellan sclera och näthinna och skär sclera mot synnerven. Gör samma sak med andra sidan ögongloben och skär/riv försiktigt sclera tills näthinnans kopp är exponerad. Dra ut objektivet ur näthinnekoppen och tillsätt PBS till koppen.
    3. Ta bort alla hyaloidkärl, glaskropp och skräp utan att skada näthinnan. Tvätta näthinnan genom att tillsätta PBS i näthinnans kopp. Utför fyra snitt (klockan 12, 3, 6 och 9) till näthinnan med rak mikrosax för att göra en blomliknande struktur. Alternativt, gör snitten med kirurgiskt blad innan du monterar proverna. Lyft näthinnan med en mjuk pensel till en brunnsplatta för färgning.
  7. Märk näthinnans vaskulatur med isolectin B4 som färgar ytan på endotelceller (om djuren inte var perfused med FITC-dextran). Inkubera näthinnan i blockeringsbufferten (10% NGS + 0,5% Triton i TBS) i 1 h och tvätta med 1% NGS + 0,1% Triton i TBS i 10 min. Inkubera näthinnan med fluorescerande färgämne konjugerat Isolectin B4 (5-10μg/ml) i 1% NGS + 0,1% Triton i TBS över natten vid +4 °C medan den är skyddad från ljuset.
    OBS: Om så önskas, märk andra celler som inflammatoriska celler och pericyter med specifika antikroppar.
  8. Tvätta näthinnan 3x i 10 min med 1% NGS + 0,1% Triton i TBS och lyft näthinnorna på en mikroskopisk rutschkana, inre näthinnan vänd uppåt. Sprid försiktigt ut näthinnan med mjuk pensel och ta bort eventuella kvarvarande hyaloidkärl eller skräp. Tillsätt monteringsmediet till en täcksping och placera det ovanpå näthinnan. Förvara näthinnorna vid +4 °C och skydda mot ljus.

6. Analys av de plana fästena

  1. Ta bilder av näthinnans platta fästen med hjälp av ett fluorescensmikroskop med 10x mål. Fokusera på den ytliga vaskulär plexus och till preretinal neovascularization. Gör en panelsökningsbild för att fånga hela näthinnan och slå samman panelskanningarna
  2. Kvantifiera bilderna genom att mäta AVAs, området NV och totalt näthinneområde med hjälp av ett bildbehandlingsprogram (se Materialförteckning ).
    1. Rita AVAs och den totala näthinneytan med hjälp av ett frihandsritverktyg och välj de neovaskulära områdena med hjälp av ett markeringsverktyg. Programvaran mäter de regioner som är av intresse för pixlar, och AVA- och NV-områdena (uttryckta i pixlar) kan användas för att beräkna deras procentandel i förhållande till den totala näthinneytan. Vissa programvaruverktyg är också tillgängliga för kvantifiering av NV.
      OBS: Nyligen har en öppen källkod, helautomatiska program för kvantifiering av nyckelvärden för OIR-bilder med hjälp av djupinlärning neurala nätverk introducerats och ger ett tillförlitligt verktyg för reproducerbar kvantifiering av retinal AVA och NV (t.ex. https://github.com/uw-biomedical-ml/oir/tree/bf75f9346064f1425b8b9408ab792b1531a86c64)20,21.
  3. Om man använder antikroppar för immunohistokemisk detektion av enskilda cellpopulationer, kvantifiera antalet färgade celler (t.ex. mikroglia, figur 2B)från näthinnans plana fästen för hand eller automatiserade bildanalyssystem om så önskas.

7. Statistik

  1. Analysera normalt distribuerade data efter studentens t-test eller enkelvägs-ANOVA följt av Dunnetts eller Tukeys test av flera jämförelser, efter behov. Använd icke-parametriska tester som Mann-Whitney U-test eller Kruskal Wallis-test för icke-normalt distribuerade data. Tänk på skillnader som är statistiskt signifikanta på P & 0,05-nivå.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Huvudresultatet av modellen är vaskulär fenotyp: storleken på AVAs och mängden NV. I musens OIR-modell sker vaso-utplåning i den centrala näthinnan (figur 2A), medan den i råttmodellen utvecklas i periferin,dvs. Detta beror på att den ytliga vaskulär plexusen redan har utvecklats när möss utsätts för hyperoxi, medan näthinnan i råttmodellen är avaskulär vid tidpunkten för OIR-induktion (P0). Preretinal neovaskularisering utvecklas nära de avaskulära områdena, dvs. central näthinnan i musen och periferin hos råttor (figur 2A och figur 3A).

Histologisk analys med hjälp av antingen tvärsnitt eller platta fästen kan göras för att utvärdera morfologiska förändringar i OIR-näthinnorna eller förekomsten av celltyper av intresse, till exempel inflammatoriska celler (Figur 2B). Förutom näthinna kan helöga eller glaskroppsprover samlas in för ytterligare gen- och proteinuttrycksanalyser i olika tidpunkter under OIR-modellen. Gen- eller proteinuttrycksnivåer kan analyseras med standardmetoder, till exempel RT-qPCR eller western blotting.

Alternativt kan icke-invasiv in vivo-avbildning utföras under OIR-uppföljningsperioden. Retinal och hyaloid vaskulatur kan visualiseras med FA (Figur 4A). SD-OCT kan användas för att utvärdera strukturella förändringar i näthinnan (figur 4B). Funktionella förändringar i näthinnan kan mätas med ERG (Figur 5).

Hämmare av vaskulär endotel tillväxtfaktor (VEGF) används ofta vid behandling av mänskliga angiogena ögonsjukdomar. Således används anti-VEGF ofta som referensförening i OIR. Aflibercept, som fungerar som en löslig VEGF-fälla, hämmar både NV och fysiologisk revaskularisering i OIR i både höga och låga doser (injiceras vid P14). OIR-ögon injicerade vid P14 med hög dos aflibercept hade ännu större näthinneavor än obehandlade ögon(figur 6). Detta tyder på att aflibercept blockerar också fysiologiska retinal revascularization drivs av hypoxi. Både mus- och råttmodeller kan användas för att utvärdera effekten av olika antiangiogena medel på näthinnan NV och fysiologisk revaskularisering av näthinnan (figur 3B och figur 6).

Figure 1
Figur 1: Grafisk översikt över en standard OIR-studiedesign för möss och råttor. (A) Mus OIR-modellen inducerades genom att exponera mössen för 75% O2 från P7 till P12 och återvände till normal rumsluft. Toppen av preretinal NV sågs på P17, som vanligtvis är provtagningspunkten för experimentet. B)Rat OIR-modellen inducerades genom att råttorna utsattes för alternerande O2-nivåer (50/10 % O2)från P0 till P14 och återgick till normoxiska förhållanden. Råttor offras vanligtvis på P20, när mängden NV toppade. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Vaskulär fenotyp i musens OIR-modell. Musens OIR-modell genererades enligt beskrivningen i figur 1. (A) Den ytliga vaskulär plexusen utvecklades hos normala möss medan OIR mössen utsattes för 75% O2 från P7 till P12. Under denna tid utvecklades vaskulär utplåning i den centrala näthinnan (markerad i blått vid P12 och P17 i de kvantifierade bilderna). Möss återvände till normal rumsluft, och den avaskulära näthinnan blev hypoxisk, vilket ledde till funktionell kärlåterväxt i näthinnan och patologiska NV (markerade i rött vid P17 i nedre panelen). Preretinal neovascular tufts utvecklats mellan vaskulär och avascular områden i centrala näthinnan. Mängden NV nådde sin topp vid P17 och återinträdde efteråt. Retina var helt revascularized och NV regressed runt P24-P25. B) Ett exempel på immunohistokemisk färgning av retinal platt fäste som visar retinal Iba-1 färgade mikroglia (grön) och GS-IB4 färgade blodkärl (röd) vid P12 och P17. C)Tvärsnitt av ett mus-OIR-öga vid P17, där preretinal tufts (pilar) spirade mot glaskroppen. Gallring av det inre kärnskiktet (INL) och yttre plexiformskikt (OPL) sågs också. Skalstängerna är 1 mm i A, 50 μm i B och 100 μm i C. ILM = inre begränsande membran, GCL = ganglioncellskikt, IPL = inre plexiformskikt, INL = inre kärnskikt, OPL = yttre plexiformskikt, ONL = yttre nukleärskikt, RPE = retinalpigmentepitetel. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Kärl fenotyp och dess utveckling i råtta OIR-modellen. A)Avaskulära områden (markerade i blått) och NV (markerade i rött) utvecklades i näthinnans periferi, liknande mänsklig ROP. B)AVA sågs i OIR-näthinnor, men inte i normoxiska kontroller. C)Kvantifieringen av NV-området visade en trend mot en topp i mängden nv vid P20, men skillnaden var inte statistiskt signifikant jämfört med P18 och P21 i OIR. (Studentens t-test, mellan tid matchade normoxiska och OIR-näthinnor, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001, båda ögonen på de djur som ritas i diagrammet). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: In vivo-avbildning med fluoresceinangiografi (FA) och spektraldomän optisk koherenstomografi (SD-OCT) i råtta OIR-modellen. (A) Vaskulär tortuositet (pilspetsar) sågs på bilderna tagna från den centrala näthinnan (översta raden) vid P18 och P20 hos OIR råttor jämfört med normoxiska P19 råttor. NV (pilar) och AVAs (asterisk) utvecklats till periferin av näthinnan (mellersta raden) sett i P18 och P20 OIR näthinnan. Regressing hyaloid fartyg (nedre raden) fångades av FA. (B) Blodkärl tillväxt mot glaskropp observerades som en förtjockning på nerv fiber lager (NFL) och ganglion cell lager (GCL) i OIR näthinnetecken (pil). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 5
Figur 5: Funktionaliteten hos näthinneneuroner kan mätas med hjälp av flashelektroretinografi (fERG). A)A-vågorna härleddes från näthinnekoner och stavfotoreceptorer och deras amplituder minskade avsevärt i råtta OIR-modellen. Effekten ökade med en högre ljusintensitet, vilket tyder på att defekterna påverkade konfotoreceptorfunktionerna främst. B)Amplituder med B-våg från OIR-djur minskade jämfört med normoxiska kontroller. B-vågor härleddes från ON-bipolära celler och Müller celler. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 6
Figur 6: Intravitreally injicerad PBS minskar NV och AVAs i musens OIR-modell. a)Representativa bilder av näthinneplatta fästen från obehandlade och afliberceptbehandlade (20 μg vid P14) och PBS injicerade OIR-ögon vid P17. Hög dos av aflibercept (20 μg) ökade storleken på AVAs med 47% (skisserat i vitt) och hämmade NV med 98% (pilar) jämfört med obehandlade kontroller. PBS injektion minskade AVAs med 31% och NV med 42% jämfört med obehandlade kontroller. Punktering av sclera som liknar ivt gav också liknande effekter som ivt injektion av PBS, men skillnaderna var inte statistiskt signifikanta. Pilspets pekar på hyaloida kärl som inte togs bort under dissekeringen. (Enkelvägs ANOVA, * p ≤ 0,05; ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001, **** p ≤ 0,0001). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Svårighetsgraden av sjukdomen fenotyp är beroende av både stammen och även leverantören i både mus och råtta OIR modeller23. Detta tyder på att det finns en bred genotypisk variabilitet i patologi utveckling. I allmänhet utvecklar pigmenterade gnagare allvarligare fenotyp än albino. Till exempel revascularizes retinal Vasculature av albino BALB/c revascularizes snabbt efter hyperoxia och utvecklar inte NV alls24. På samma sätt, hos råttor, visar pigmenterade Bruna Norge råttor allvarligare patologi än albino Sprague Dawley (SD) råttor25. SD råttor är vanliga stam, och leverantörsrelaterade skillnader i OIR fenotyp har rapporterats inom stammen. Till exempel producerar SD-råttor från Charles River betydligt mer NV än råttor från Harlan eller Zivic-Miller23. C3H/HeJ möss, i sin tur, som har en mutation i retinal degeneration 1 (Rd1) genen, har tunna näthinnorna och utvecklar inte NV26. På grund av dessa skäl och tillgången på transgena mösslinjer är den inavlade C57BL/6J den vanligaste musstammen för OIR-studier. Det finns dock en ganska hög dödlighet bland C57BL/ 6J-dammarna på grund av den hyperoxiska exponeringen, så mössens välbefinnande måste beaktas när man utformar studien och övervakas under experimenten. Dessutom ses ökad fotoreceptorskada hos C57BL/6 möss jämfört med BALB/c möss27.

För att säkerställa mössens välbefinnande och överlevnaden hos dammar och valpar bör kullstorleken hållas liten (6-7 valpar / damm). Detta är särskilt viktigt när du använder C57BL/ 6 möss, som är mer mottagliga för hyperoxisk stress27,28. Dessutom bör lättillgänglig stödmat (placerad på botten av buret) ges till mössen. Vissa forskare använder surrogatdammar för att ersätta dammarna i kammaren med friska efter syreinduktionen. Men de flesta forskare använder surrogater endast om dammen är uttömd22,29. Surrogatdammar rekommenderas att användas om större kullstorlekar används. Det har publicerats att 129S3/SvIM möss producerar mer NV än C57BL/6 och upprätthåller bättre de förändringar som orsakas av varierande syrenivåer28. Det bör noteras att de dammar som används i OIR är ofruktbara efter OIR-induktionen och inte bör användas för ytterligare avel22. Pups postnatala viktökning påverkar svårighetsgraden av OIR patologi. Ungar med dålig postnatal viktökning (<5 g vid P17) visar fördröjd uttryck av VEGF och därmed långvarig fas av retinopati jämfört med valpar med normal (5- 7,5 g vid P17) eller omfattande viktökning (>7,5 g vid P17)29. Dessutom visar mössvalpar som väger över 5 g vid P7 inte vaso-utplånade områden efter OIR-induktion30. Således är det viktigt att väga valparna under experimentet. Det kontralaterala obehandlade ögat kan användas som en intern kontroll för att säkerställa att mössens näringsstatus inte påverkar resultaten. Situationen är liknande hos råttor; ju mindre valparna är, desto allvarligare OIR fenotyp utvecklar de31. Således rekommenderas stor kullstorlek (ca 18 valpar) att användas för råtta OIR-modellen.

OIR-modellens induktion kan göras med antingen helt slutet system, där det finns en sluten krets med en pump som cirkulerar luften genom ett filtersystem (sodakalk och aktivt kol) tillbaka till kammaren. Ett annat alternativ är ett halvstängt system, där ventilation säkerställer att överskottet av metaboliter avlägsnas från kammaren. För att säkerställa att överskott av CO2 avlägsnas kan sodakalk (blandning av kalciumhydroxid med natriumhydroxid eller kaliumhydroxid) placeras på botten av kammaren. Avlägsnandet av CO2 är obligatoriskt eftersom de höga CO2-nivåerna förvärrar sjukdomen fenotyp hos råttor32. Man bör också komma ihåg att kalibrera om kammarens syresensor regelbundet eftersom de tenderar att driva över tiden och kan ge fel syrekoncentration från den avsedda.

Det har rapporterats att fordonsinsprutning (PBS) ensam eller till och med bara punktering till det intravitreala utrymmet har en effekt för revaskulariseringshastigheten och mängden NV (Figur 6)33,34,35,36. Det har spekulerats om effekten som ses med PBS/fordonsinsprutning kan bero på förändringar i intraokulärt tryck under injektionen, eller på grund av skador på okulär strukturer som ökar nivåerna av angiogena tillväxtfaktorer bland dem pigment epitel-härleddtillväxtfaktor 34,37. Dessutom har bara en pilot subretinal injektion ensam (punktering till det subretinala utrymmet) visat sig ha effekter på kärl- och funktionell fenotyp i OIR jämfört med de obehandladeråttorna 38. Dessa resultat belyser vikten av ordentliga negativa kontroller i OIR-studierna eller till och med systemisk administrering av testade föreningar, liksom tillräckligt stora n-nummer i varje studiegrupp. Det faktum att fordonsinsprutning verkligen förbättrar revascularization hastighet i näthinnan är en viktig begränsande faktor som revascularization hastighet och bildandet av patologiska preretinal tufts är inter-relaterade i OIR modellen: om revascularization hastighet accelereras, det leder till kompensatoriska downregulation av neovascular tufts och vice versa. Således påverkas båda primära utfallsmåtten av OIR-modellen av fordonsinsprutning.

VEGF-hämmare har revolutionerat behandlingen AMD och DR. OIR-modellen användes för att demonstrera deras effekt prekliniskt. När det gäller VEGF-hämmare i OIR visade en studie som jämförde olika anti-VEGFs och anti-PlGFs (placental tillväxtfaktor) (injicerad vid P12) att enbart anti-VEGF ledde till små avaskulära områden, medan anti-PIGF behandlade ögon hade större avaskulära områden33. Aflibercept hade de största AVAs jämfört med andra läkemedelsbehandlingar33. Aflibercept är känt för att binda både VEGF och PlGF39, det kan vara att hämma PlGF i OIR leder till blockering av fysiologisk angiogenes.

Noninvasive in vivo imaging ger ett verktyg för övervakning av retinal vaskulatur40 och retinal lager och struktur under uppföljningsperioden. Med FA kan parametrar som vaskulär densitet och arteriell tortuositet och venös utvidgning (kallad plussjukdom, figur 4A)mätas40,41. SD-OCT kan användas för att utvärdera strukturella förändringar och mäta näthinnetjocklek under OIR uppföljningsperiod42,43. ERG används för att mäta de funktionella förändringarna i näthinnan. Olika celltyper producerar elektriska potentialer efter ljusstimulans, och dessa signaler eller "vågor" kan mätas med ERG. Fotoreceptorer producerar den negativa a-vågen, och ON bipolära celler och Müller-celler är främst ansvariga för b-vågen44. Förlust av näthinnefunktion är typiskt hos OIR-möss ochråttor 45,46 (figur 5). Långvariga förändringar kvarstår i näthinnan och både funktionella förändringar och förändringar i proteinnivån har rapporterats i OIR retinas även efter revascularization och NV regression34,47.

För att visualisera retinalvaskulaturen kan de levande mössen antingen vara relevanta med FITC-märkt dextran eller näthinnans platta fästen kan färgas med fluorescerande färg märkt Isolectin B4. Man måste förstå skillnaden mellan fluorescerande färgämnen; Perfusionen med FITC-dextrans märker endast kärlens lumen, medan Isolectin B4 färgar ytan av endotelceller. Således kommer funktionella blodkärl med rätt lumen endast att visualiseras med FITC-dextran perfusion, medan den totala ytan av NV verkar större i Isolectin B4 färgade näthinner än i FITC-dextran perfused djur, eftersom Isolectin B4 i huvudsak plockar upp även endotelceller som inte har bildat funktionella lumen ännu48. Ett nyare alternativ för att visualisera hela näthinnan / ögonbollen i 3D-format är djup vävnadsavbildning med två-foton fluorescensmikroskopi(49).

Gnagarmodellen, liksom djurmodellerna i allmänhet, representerar bara delvis egenskaperna hos mänskliga sjukdomar. Den största skillnaden relaterad till OIR är att retinal neovascularization inte är associerad med fibros i gnagare OIR, medan retinal neovascularization leder ofta till fibrovaskulär spridning i mänskliga neovaskulära retinal sjukdomar. Dessutom kan de tillstånd som orsakar OIR vs. mänsklig sjukdom vara nästan motsatta. Prematur nyfödda med ROP kräver kompletterande syre med andningsstöd, upplever ofta intermittent hypoxemiska och hyperoxemiska episoder som orsakas av återkommande apné, men de utsätts inte för höga nivåer av syre. För att minimera de permanenta skadorna undviks höga fraktioner av inspirerad O2. I det avseendet liknar varken musmodellen med konstant exponering för 75% O2 i 5 dagar eller 50/10 råttmodellen patogenes vid mänsklig ROP. Dessutom finns det också skillnader mellan råttan och musens OIR-modeller. Neovascularizationen regresses i musen modellerar med re-establishment av det normala skyttlar vid P24, eftersom villkora blir värre i råtta OIR modellerar (liknande till människa ROP). Även om råtta OIR-modellen visar kliniskt relevanta egenskaper hos ROP såsom fördröjd retinal vaskulär utveckling och efterföljande patologiska neovascularization, dess användning begränsas av nästan fullständig avsaknad av transgena råtta stammar, högre underhållskostnader och mindre NV än i mus OIR modell.

Sammantaget, trots skillnaderna mellan mänskliga skandinaviska proliferativa retinopatier och gnagare OIR-modeller, gör den lätthet genom vilken NV kan induceras, i kombination med enkel visualisering och kvantifiering av näthinnan, OIR-modellerna populära för att studera molekylära mekanismer och potentiella terapier för skandinaviska proliferativa retinopatier. Intressant nog inducerar hyperoxiexponeringen i mus OIR-modellen också bronkopulmonell dysplasi, en annan sjukdom som orsakas av kompletterande syrebehandling hos mänskliga för tidigt födda spädbarn, vilket visar att OIR-modellen kan användas för att utforska nya mål för både ROP och bronchopulmonary dysplasisamtidigt 50.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna Maria Vähätupa, PhD, Niina Jääskeläinen, Marc Cerrada-Gimenez, PhD, och Rubina Thapa är anställda på Experimentica Ltd.

Författaren Giedrius Kalesnykas, phD, är anställd (VD och koncernchef) och aktieägare i Experimentica Ltd. som erbjuder kontraktsforskningstjänster som använder prekliniska OIR-modeller som används i denna artikel.

Tero Järvinen, M.D., PhD, och Hannele Uusitalo-Järvinen, M.D., PhD, har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Marianne Karlsberg, Anne Mari Haapaniemi, Päivi Partanen och Anne Kankkunen för utmärkt teknisk support. Detta arbete finansierades av Finlands Akademi, Päivikki och Sakari Sohlbergs stiftelse, Tammerfors tuberkulosstiftelse, Finlands medicinska stiftelse, Pirkanmaa sjukhusdistriktets forskningsstiftelse och Tammerfors universitetssjukhusforskningsfond.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
33 gauge, Small Hub RN Needle Hamilton Company 7803-05, 10mm, 25°, PS4 For intravitreal injection
Adobe Photoshop Adobe Inc. For image analysis
Air pump air100 Eheim GmbH & Co. KG. 143207 For inhalation anaesthesia
Anaesthesia unit 410 AP Univentor Ltd. 2360309 For inhalation anaesthesia
AnalaR NORMAPUR Soda lime VWR International Ltd 22666.362 For CO2 control during model induction
Attane Vet 1000 mg/g VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY vnr 17 05 79 For inhalation anaesthesia
Brush For preparation of flat mounts
Carbon dioxide gas For sacrifice
Celeris D430 ERG system Diagnosys LLC 121 For in vivo ERG
Cell culture dishes Greiner Bio-One International GmbH 664 160 For preparation of flat mounts
Cepetor Vet 1 mg/mL VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY vnr 08 78 96 For anaesthesia
Cover slips Thermo Fisher Scientific 15165452 For preparation of flat mounts
O2 Controlled InVivo Cabinet, Aninal Filtrarion System and Dehumidifier Coy Laboratory Products Closed system for disease model induction, optional for semi-closed system
E702 O2 sensor BioSphenix, Ltd. E207, 1801901 For oxygen level measurement
Envisu R2200 Spectral Domain Optical Coherence Tomograph (SD-OCT) Bioptigen, Inc. BPN000668 For in vivo imaging
Eye spears Beaver-Visitec International, Inc. 0008685 For intravitreal injection and in vivo imaging
Flexilux 600LL Cold light source Mikron 11140 For intravitreal injection or tissue collection
Fluorescein sodium salt Merck KGaA F6377-100G For in vivo imaging
Gas Exhaust unit (+Double 3-way valve, mouse and rat face masks, UNOsorb filter) UNO Roestvaststaal BV GEX 17015249 For inhalation anaesthesia
Glass syringe, Model 65 RN Hamilton Company 7633-01 For intravitreal injection
HRA2 Retina angiograph (FA) Heidelberg Engineering GmbH Spec-KT-05488 For in vivo imaging
Isolectin GS-IB4, Alexa Fluor 488 Conjugate Thermo Fisher Scientific I21411 For labeling retinal vasculature on flat mounts
Ketaminol Vet 50 mg/mL Intervet International B.V. vnr 51 14 85 For anaesthesia
Medicinal Oxygen gas For disease model induction
Mice C57BL/6JRj Janvier Labs Also other strains possible
Microscope slides Thermo Fisher Scientific J1800AMNZ For preparation of flat mounts
Minims Povidone Iodine 5% (unit) Bausch & Lomb U.K Limited vnr 24 11 304 For intravitreal injection
Nitrogen gas For disease model induction (rat)
Oftan Chlora 10 mg/g Santen Pharmaceutical Co., Ltd. vnr 55 01 11 For intravitreal injection
Oftan Metaoksedrin 100 mg/ml Santen Pharmaceutical Co., Ltd. vnr 55 03 43 For in vivo ERG
Oftan Obucain 4 mg/ml Santen Pharmaceutical Co., Ltd. vnr 55 03 50 For intravitreal injection
Oftan Tropicamid 5 mg/ml Santen Pharmaceutical Co., Ltd. vnr 04 12 36 For in vivo imaging
ProOx Model 110 O2 controller and animal chamber BioSphenix, Ltd. 803 For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system
ProOx Model P360 O2 controller and animal chamber BioSphenix, Ltd. 538 For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system
Rats CD(SD) Charles River Laboratories Also other strains possible
Revertor 5 mg/mL VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY vnr 13 04 97 For anaesthesia reversal
Silica gel For humidity control during model induction
Systane Ultra 10ml Alcon Tamro 2050250 For hydration of the eye
Systane Ultra unit 0.7ml Alcon Tamro 2064871 For hydration of the eye
Transfer pipette Thermo Fisher Scientific 1343-9108 For preparation of flat mounts
VENTI-Line VL 180 PRIME Drying oven VWR VL180S 170301 For drying silica gel
VisiScope SZT350 Stereomicroscope VWR 481067 For intravitreal injection or tissue collection

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chase, J. The evolution of retinal vascularization in mammals. A comparison of vascular and avascular retinae. Ophthalmology. 89 (12), 1518-1525 (1982).
  2. Sun, Y., Smith, L. E. H. Retinal vasculature in development and diseases. Annual Review of Vision Science. 4, 101-122 (2018).
  3. Vähätupa, M., Järvinen, T. A. H., Uusitalo-Järvinen, H. Exploration of oxygen-induced retinopathy model to discover new therapeutic drug targets in retinopathies. Frontiers in Pharmacology. 11, 873 (2020).
  4. Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (6), 2813-2826 (2010).
  5. Benjamin, L. E., Hemo, I., Keshet, E. A plasticity window for blood vessel remodelling is defined by pericyte coverage of the preformed endothelial network and is regulated by PDGF-B and VEGF. Development. 125 (9), 1591-1598 (1998).
  6. Bashinsky, A. L. Retinopathy of prematurity. North Carolina Medical Journal. 78 (2), 124-128 (2017).
  7. Ludwig, C. A., Chen, T. A., Hernandez-Boussard, T., Moshfeghi, A. A., Moshfeghi, D. M. The epidemiology of retinopathy of prematurity in the united states. Ophthalmic Surgery, Lasers and Imaging Retina. 48 (7), 553-562 (2017).
  8. Hartnett, M. E. Pathophysiology and mechanisms of severe retinopathy of prematurity. Ophthalmology. 122 (1), 200-210 (2015).
  9. Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: From development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
  10. Szewczyk, T. S. Retrolental fibroplasia; etiology and prophylaxis. American Journal of Ophthalmology. 35 (3), 301-311 (1952).
  11. Szewczyk, T. S. Retrolental fibroplasia and related ocular diseases; classification, etiology, and prophylaxis. American Journal of Ophthalmology. 36 (10), 1336-1361 (1953).
  12. Gerschman, R., Nadig, P. W., Snell, A. C. Jr, Nye, S. W. Effect of high oxygen concentrations on eyes of newborn mice. American Journal of Physiology. 179 (1), 115-118 (1954).
  13. Gyllnesten, L. J., Hellström, B. E. Experimental approach to the pathogenesis of retrolental fibroplasia. III. changes in the eye induced by exposure of newborn mice to general hypoxia. British Journal of Ophthalmology. 39 (7), 409-415 (1955).
  14. Curley, F. J., Habegger, H., Ingalls, T. H., Philbrook, F. R. Retinopathy of immaturity in the newborn mouse after exposure to oxygen imbalances. American Journal of Ophthalmology. 42 (3), 377-392 (1956).
  15. Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).
  16. Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: A model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).
  17. Penn, J. S., Tolman, B. L., Lowery, L. A. Variable oxygen exposure causes preretinal neovascularization in the newborn rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 34 (3), 576-585 (1993).
  18. Penn, J. S., Henry, M. M., Tolman, B. L. Exposure to alternating hypoxia and hyperoxia causes severe proliferative retinopathy in the newborn rat. Pediatric Research. 36 (6), 724-731 (1994).
  19. Ritter, M. R., et al. Three-dimensional in vivo imaging of the mouse intraocular vasculature during development and disease. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (9), 3021-3026 (2005).
  20. Xiao, S., et al. Fully automated, deep learning segmentation of oxygen-induced retinopathy images. Journal of Clinical Investigation Insight. 2 (24), 97585 (2017).
  21. Mazzaferri, J., Larrivee, B., Cakir, B., Sapieha, P., Costantino, S. A machine learning approach for automated assessment of retinal vasculature in the oxygen induced retinopathy model. Scientific Reports. 8 (1), 22251-22257 (2018).
  22. Kim, C. B., D'Amore, P. A., Connor, K. M. Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).
  23. Barnett, J. M., Yanni, S. E., Penn, J. S. The development of the rat model of retinopathy of prematurity. Documenta Ophthalmologica. 120 (1), 3-12 (2010).
  24. Ritter, M. R., et al. Myeloid progenitors differentiate into microglia and promote vascular repair in a model of ischemic retinopathy. Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3266-3276 (2006).
  25. Floyd, B. N., et al. Differences between rat strains in models of retinopathy of prematurity. Molecular Vision. 11, 524-530 (2005).
  26. Scott, A., Powner, M. B., Fruttiger, M. Quantification of vascular tortuosity as an early outcome measure in oxygen induced retinopathy (OIR). Experimental Eye Research. 120, 55-60 (2014).
  27. Walsh, N., Bravo-Nuevo, A., Geller, S., Stone, J. Resistance of photoreceptors in the C57BL/6-c2J, C57BL/6J, and BALB/cJ mouse strains to oxygen stress: Evidence of an oxygen phenotype. Current Eye Research. 29 (6), 441-447 (2004).
  28. Chan, C. K., et al. Differential expression of pro- and antiangiogenic factors in mouse strain-dependent hypoxia-induced retinal neovascularization. Laboratory Investigation. 85 (6), 721-733 (2005).
  29. Stahl, A., et al. Postnatal weight gain modifies severity and functional outcome of oxygen-induced proliferative retinopathy. American Journal of Pathology. 177 (6), 2715-2723 (2010).
  30. Liegl, R., Priglinger, C., Ohlmann, A. Induction and readout of oxygen-induced retinopathy. Methods in Molecular Biology. 1834, 179-191 (2019).
  31. Holmes, J. M., Duffner, L. A. The effect of postnatal growth retardation on abnormal neovascularization in the oxygen exposed neonatal rat. Current Eye Research. 15 (4), 403-409 (1996).
  32. Holmes, J. M., Zhang, S., Leske, D. A., Lanier, W. L. The effect of carbon dioxide on oxygen-induced retinopathy in the neonatal rat. Current Eye Research. 16 (7), 725-732 (1997).
  33. Heiduschka, P., Plagemann, T., Li, L., Alex, A. F., Eter, N. Different effects of various anti-angiogenic treatments in an experimental mouse model of retinopathy of prematurity. Journal of Clinical and Experimental Ophthalmology. 47 (1), 79-87 (2019).
  34. Tokunaga, C. C., et al. Effects of anti-VEGF treatment on the recovery of the developing retina following oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1884-1892 (2014).
  35. Tokunaga, C. C., Chen, Y. H., Dailey, W., Cheng, M., Drenser, K. A. Retinal vascular rescue of oxygen-induced retinopathy in mice by norrin. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (1), 222-229 (2013).
  36. Vähätupa, M., Uusitalo-Järvinen, H., Järvinen, T. A. H., Uusitalo, H., Kalesnykas, G. Intravitreal injection of PBS reduces retinal neovascularization in the mouse oxygen-induced retinopathy model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. Abstract Issue. 57 (12), 3649 (2016).
  37. Penn, J. S., et al. Angiostatic effect of penetrating ocular injury: Role of pigment epithelium-derived factor. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (1), 405-414 (2006).
  38. Becker, S., Wang, H., Stoddard, G. J., Hartnett, M. E. Effect of subretinal injection on retinal structure and function in a rat oxygen-induced retinopathy model. Molecular Vision. 23, 832-843 (2017).
  39. Sophie, R., et al. Aflibercept: A potent vascular endothelial growth factor antagonist for neovascular age-related macular degeneration and other retinal vascular diseases. Biological Therapy. 2, (2012).
  40. Mezu-Ndubuisi, O. J. In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery. Optometry and Vision Science. 93 (10), 1268-1279 (2016).
  41. Mezu-Ndubuisi, O. J., et al. In vivo retinal vascular oxygen tension imaging and fluorescein angiography in the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6968-6972 (2013).
  42. Dailey, W. A., et al. Ocular coherence tomography image data of the retinal laminar structure in a mouse model of oxygen-induced retinopathy. Data in Brief. 15, 491-495 (2017).
  43. Mezu-Ndubuisi, O. J., Taylor, L. K., Schoephoerster, J. A. Simultaneous fluorescein angiography and spectral domain optical coherence tomography correlate retinal thickness changes to vascular abnormalities in an in vivo mouse model of retinopathy of prematurity. Journal of Ophthalmology. 2017, 9620876 (2017).
  44. Pinto, L. H., Invergo, B., Shimomura, K., Takahashi, J. S., Troy, J. B. Interpretation of the mouse electroretinogram. Documenta Ophthalmologica. 115 (3), 127-136 (2007).
  45. Nakamura, S., et al. Morphological and functional changes in the retina after chronic oxygen-induced retinopathy. PLoS One. 7 (2), 32167 (2012).
  46. Dorfman, A. L., Polosa, A., Joly, S., Chemtob, S., Lachapelle, P. Functional and structural changes resulting from strain differences in the rat model of oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (5), 2436-2450 (2009).
  47. Vähätupa, M., et al. SWATH-MS proteomic analysis of oxygen-induced retinopathy reveals novel potential therapeutic targets. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (8), 3294-3306 (2018).
  48. Campos, M., Amaral, J., Becerra, S. P., Fariss, R. N. A novel imaging technique for experimental choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (12), 5163-5170 (2006).
  49. Yanez, C. O., et al. Deep Vascular Imaging in Wounds by Two-Photon Fluorescence Microscopy. PLos One. 8 (7), 67559 (2013).
  50. Wickramasinghe, L. C., et al. Lung and eye disease develop concurrently in supplemental oxygen-exposed neonatal mice. American Journal of Pathology. , 30287 (2020).

Tags

Medicin Utgåva 163 angiogenes neovaskularisering syreinducerad retinopati OIR hypoxi retinopati av prematuritet ROP diabetesretinopati intravitreal injektion bildanalys artificiell intelligens AI
Syreinducerad retinopatimodell för ischemiska näthinnesjukdomar hos gnagare
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vähätupa, M.,… More

Vähätupa, M., Jääskeläinen, N., Cerrada-Gimenez, M., Thapa, R., Järvinen, T., Kalesnykas, G., Uusitalo-Järvinen, H. Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents. J. Vis. Exp. (163), e61482, doi:10.3791/61482 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter