Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

En Ex vivo Assay at studere Candida albicans Hyphal Morphogenese i mave-tarmkanalen

Published: July 1, 2020 doi: 10.3791/61488
Automatic Translation
1, 2, 3
1College of Veterinary Medicine, Midwestern University, 2Masters in Biomedical Science Program, College of Graduate Studies, Midwestern University, 3Department of Pathology and Population Medicine, College of Veterinary Medicine, Midwestern University

Summary

Ex vivo-analysen, der er beskrevet i denne undersøgelse ved hjælp af guthomogenatekstrakter og immunofluorescensfarvning, repræsenterer en ny metode til at undersøge hyphal morfogensen af Candida albicans i mave-tarmkanalen. Denne metode kan anvendes til at undersøge de miljømæssige signaler, der regulerer morfogenetiske overgang i tarmen.

Abstract

Candida albicans hyphal morfogenese i mave (GI) tarmkanalen er stramt kontrolleret af forskellige miljømæssige signaler, og spiller en vigtig rolle i formidling og patogenese af denne opportunistiske svampepatogen. Men metoder til at visualisere svampehyfa i mave-tarmkanalen in vivo er udfordrende, hvilket begrænser forståelsen af miljøsignaler i at kontrollere denne morfogenese proces. Den protokol, der er beskrevet her, viser en ny ex vivo-metode til visualisering af hyphal morfosese i guthomogene ekstrakter. Ved hjælp af en ex vivo assay, denne undersøgelse viser, at cecal indhold fra antibiotika behandlede mus, men ikke fra ubehandlede kontrol mus, fremme C. albicans hyphal morfogens i tarmen indhold. Endvidere, tilføje tilbage specifikke grupper af tarm metabolitter til cecal indholdet fra antibiotika-behandlede mus differentieret regulerer hyphal morfogenese ex vivo. Samlet set repræsenterer denne protokol en ny metode til at identificere og undersøge de miljøsignaler, der styrer C. albicans hyphal morfogens i mave-tarmkanalen.

Introduction

Candida albicans er en opportunistisk, polymorfe svampepatogen, der normalt commensal, men kan gennemgå en morfologisk ændring i en virulent form i stand til at forårsage livstruende infektioner i immunkompromitterede personer1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. C. albicans er en førende årsag til systemiske nosokomielle infektioner, med en 40\u201260% dødelighed selv med svampedræbende behandling2,14,15. Selvom C. albicans bor i forskellige værtsnicher, herunder det kvindelige reproduktive system16,17, stammer mundhulen for raske personer18 og mave-tarmkanalen (GI)19,20, størstedelen af de systemiske infektioner stammer fra mave-tarmkanalen og desuden, kilden til systemisk infektion bekræftes ofte som mave-tarmkanalen21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34. C. albicanspatogenicitet i mave-tarmkanalen påvirkes af en lang række faktorer; en vigtig egenskab, der er nødvendig for virulens, er imidlertid overgangen fra en gærcellemorfologi til en virulent hyphalcellemorfologi35,36,37,38,39,40,41,42,43,44. C. albicans vedhæftet fil og formidling fra mave-tarmkanalen under infektion er stærkt forbundet med sin evne til at skifte fra en commensal gær til virulent hyphae, så svampene kan forårsage invasiv sygdom44,45,46,47,48,49,50,51,52,53.

En række faktorer i tarmen, herunder n-acetylglucosamin, regulere hyphal dannelse af C. albicans. Det er derfor afgørende at mindske kløften i viden om hyphal morfogens af dette svampepatogen imave-tarmkanalen 54,55,56. De seneste beviser tyderpå,at forskellige gutmetabolitter forskelligt kontrollerer hyphal morfogenese af C. albicans in vitro57,58,59,60. Men, tekniske begrænsninger præsentere spørgsmål, når de forsøger at studere C. albicans hyphae dannelse i in vivo tarm prøver, især farvning gær og hyphae celler og kvantitativ analyse af hyphal udvikling. For at forstå C. albicans hyphal morfogens i mave-tarmkanalen, en ex vivo metode blev udviklet ved hjælp af opløselige ekstrakter af homogeniseret tarmindhold fra mus til at undersøge effekten af metabolitter på svampehyphal morfosse. Udnytte tarmprøver fra mus, der er resistente og modtagelige for C. albicans GI-infektion, denne metode vil bidrage til at identificere og studere effekten af metabolitter, antibiotika og xenobiotika på svampehyphal morfogenese i mave-tarmkanalen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreprotokoller blev godkendt af Midwestern University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) som beskrevet før57. Den institutionelle Animal Care and Use Udvalget på Midwestern University godkendt denne undersøgelse under MWU IACUC protokol #2894. MWU dyrepleje politikker følger Public Health Service (PHS) Politik om human pleje og brug af laboratoriedyr og de politikker, der er fastsat i Animal Welfare Act (AWA).

1. Mus studerer standardprotokol

  1. Brug han- og hun-C57BL/6J-mus mindst seks uger gamle. Supplere dem med sterilt vand med eller uden cefoperazone (0,5 mg/ml).
    1. Co-house mus i grupper på 5, med hvert bur indeholder enten alle mandlige eller alle kvindelige mus. Giv musene standard mus chow og vand (via en 400 ml flaske) på alle tidspunkter.
    2. Kontroller bure dagligt for at sikre mad og vandstand er nok, og for at undersøge mus for tegn på nød.
  2. Udskift vandet med cefoperazone hver 48 timer for at sikre, at der leveres frisk antibiotika, uanset hvor der er vand i burets sutteflasker.
  3. Efter 5\u20127 dages cefoperazonebehandling aflives mus via CO2-kvælnings observation af etableret IACUC-protokol. Bekræft død via cervikal dislokation.
  4. Dissekere mus ved hjælp af autoklave-steriliserede skarpe endte saks og autoklave-steriliserede kraftvipper.
    1. Efter aktiv dødshjælp, sikre dyret til en dissektion overflade ved at fastgøre alle lemmer, således at maven er udsat.
    2. Spray maveregionen med 70% ethanol for at forhindre pels i at holde sig til spinces, saks, eller tarm sektioner under dissektion.
    3. Brug vices til at knibe og løfte en del af huden i bunden af maven og skabe et lille snit gennem huden og underliggende fascia ved hjælp af en saks. Vær meget forsigtig, når du foretager dette snit for at undgå at punktere cecum eller tarmvæggen.
    4. Udvid dette snit til brystkassen, delvis udsætter bughulen. Lav et snit, der starter ved det punkt, hvor det første snit strækker sig opad og side om side.
    5. Træk disse flapper side om side og pin til dissekering overfladen til fuldt ud at udsætte bughulen.
  5. Uddrag mave-tarmkanalen ved hjælp af sniver, mens du bruger en saks til at foretage nedskæringer overlegen i forhold til maven og i den distale region af tyktarmen for at sikre indsamling af den største mængde af tarmindholdet fra hver sektion.
  6. Når du fjerner mave-tarmkanalen, skal du passe på at undgå brud de enkelte komponenter. Adskære mave, tyndtarm, cecum, og tyktarmen individuelt ved hjælp af en saks på deres proksimale og distale ender.
  7. For indsamling af hvert tarmindhold fra hver sektion foretages et enkelt snit i den distale ende af hver sektion ved hjælp af en saks efterfulgt af manuelt at udvise tarmindholdet i et 1,5 ml mikrocentrifugerør ved hjælp af scener.
  8. Indholdet af tarmen ved -80 °C for ex vivo-analyser.

2. Fremstilling af gærekstrakt-peptone-dextrose (YPD) agar plader

  1. Til en 1 L glasflaske tilsættes 25 g gærekstrakt peptone-dextrose bouillon pulver, 10 g agar, og ultrapure vand til et endeligt volumen på 500 ml.
  2. Autoklave ved 121 °C i 30 minutter på en flydende cyklus for at sterilisere mediet.
  3. Under en laminar flow hætte, hæld ca 20 ml agar medier i en steril Petri plade. 500 ml agarmedier skal give ca. 25 plader.
  4. Pladerne opbevares ved 4 °C, indtil de er klar til brug.

3. Ex vivo prep til hyphal morfogenesis analyse

  1. Streak en frisk kultur af C. albicans SC5314 på en YPD agar plade og inkubere natten over ved 30 °C.
  2. Vælg to til tre mellemstore individuelle kolonier fra natten dyrket C. albicans SC5314 kultur og re-suspendere i 1 ml fosfat buffered saltvand (PBS).
  3. Det frosne tarmindhold hentes fra -80 °C-fryseren og tøs ved 25 °C.
  4. Ca. 150 mg tarmindhold vejes i et nyt 1,5 ml rør.
  5. Ophæng tarmindholdet igen med 150 μL PBS (tarmindhold og PBS med et forhold mellem 1:1 og volumen).
  6. Vortex ved høj hastighed i 30 s at homogenisere tarmen indhold og lad det sidde ved stuetemperatur i omkring et minut.
  7. Centrifuge homogenates ved 1000 x g i 3 min.
  8. Overfør supernatanten til et nyt 1,5 ml rør.
  9. Gentag trin 3.7 og 3.8 for at fjerne alt snavs i supernatanten.
  10. Der tilsættes 10 μL af C. albicans SC5314 inoculum, der er forberedt ovenfor, til denne supernatant
  11. Der blandes godt og inkuberes ved 37 °C i 4 til 5 timer.

4. Eksogen tilsætning af metabolitter til tarmhomogeneekstrakterne til hyphal morfoogenesisanalyse

  1. Der hentes frosset tarmindhold fra -80 °C-fryseren, og ophænges igen i PBS ved forholdet 1:1 (vægt: volumen).
  2. Tilsæt den ønskede koncentration af tarmmetabolitter til tarmindholdet og PBS-blandingen.
  3. Vortex ved høj hastighed i 30 s at homogenisere tarmindholdet, der indeholder metabolitter og lad det sidde ved stuetemperatur i ca 10 min.
  4. Centrifuge homogenates ved 1000 x g i 3 min.
  5. Overfør supernatanten til et nyt 1,5 ml rør. Gentag trin 4.4 og 4.5 for at fjerne alt snavs i supernatanten.
  6. Der tilsættes 10 μL af C. albicans SC5314 inoculum, der er forberedt ovenfor, til denne supernatant. Der blandes godt og inkuberes ved 37 °C i 4 til 5 timer.

5. C. albicans morfogeneseanalyse (immunstaining og billeddannelse)

  1. Centrifuge prøverne ved 1000 x g i 2 min og kassér supernatanten via pipettering.
  2. Prøverne fastgør prøverne i 100 μL 2% paraformaldehyd (PFA) i 15 min.
  3. Centrifuge ved 1000 x g i 2 min. og kassér supernatant via pipettering.
  4. Prøverne vaskes to gange med 1 ml PBS. For at vaske prøver, re-suspendere pellet i PBS ved pipettering forsigtigt. Må ikke vortex prøven, da dette kan beskadige hyphal strukturer. Efter re-suspension, centrifuge ved 1000 x g i 2 min og kassér supernatant via pipettering.
  5. Prøverne inkuberes ved stuetemperatur i 100 μL PBS indeholdende polyklonal C. albicansantistof (1:100 fortynding) i 30 min.
  6. Prøverne vaskes tre gange med 1 ml PBS.
    BEMÆRK: Når du bruger et fluorescerende antistof, anbefales det, at alle fortyndings- og vasketrin udføres i svagt lys for at undgå fotoblegning og forbedre prøvens levetid.
  7. Prøverne inkuberes ved stuetemperatur i 15 min i 100 μL PBS indeholdende anti-kanin IgG Alexafluor 488 antistof ved 1:500 fortynding. Udfør inkubation i en mørk skuffe eller rum for at undgå foto blegning.
  8. Prøverne vaskes tre gange med 1 ml PBS.
  9. Ophæng prøverne igen i 100 μL PBS, og overfør dem til en 96-brøndplade til billeddannelse.
    BEMÆRK: Når det ikke afbildes, anbefales det, at 96-brøndpladen pakkes ind i aluminiumsfolie for at undgå fotoblegning.
  10. Billede svampeceller ved hjælp af 20x og 40x objektive linser ved hjælp af en fluorescens imaging mikroskop. Brug et grønt fluorescerende proteinfilter (GFP) (excitation wavelength 470/40 og emission wavelength 525/50) til at detektere fluorescens.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Disse resultater sammen med tidligere resultater fra Thangamani laboratoriet60 viser, at når C. albicans dyrkes ex vivo i tarmhomogenatekstrakter taget fra maven, tyndtarmen og tyktarmen af ubehandlet kontrol og antibiotikabehandlede mus, udvikler C. albicans generelt med en gærmorfologi (Figur 1B). Når C. albicans dyrkes i cecalekstraktet af antibiotikabehandlede mus, gennemgår de dog let morfogenese, hvilket resulterer i prøver indeholdende gær- og hyfaformer (figur 1B) dette sker ikke i kontrolmus. Dette understøtter tidligere resultater, som viste en betydelig stigning i hyphae former i prøver dyrket i antibiotika-behandlede cecal ekstrakter, men ikke i andre antibiotika-behandledetarmekstrakter 60. Disse resultater tyder på, at antibiotisk behandling forårsager ændringer i cecal miljøet, som inducerer hyphal morfogens af C. albicans. Derudover, den specifikke lokalisering af denne fænotype bemærket kun i cecum tyder også på, at disse hyphae-fremme betingelser ikke nødvendigvis kan forekomme i hele mave-tarmkanalen, men i stedet er begrænset til specifikke segmenter af mave-tarmkanalen afhængigt af tilgængeligheden af næringsstoffer, metabolitter og andre ukendte molekyler.

Da cecal ekstrakt af antibiotika-behandlede mus fremmer morfogenese af C. albicans57,58,59,60, vi undersøgt, om eksogen tilsætning af en udvalgt gruppe af gut metabolitter (identificeret fra tidligere in vitro-undersøgelser) til cecal indholdet af cef-behandlede mus vil påvirke morfogenese af C. albicans ex vivo. Tidligere arbejde udført af Thangamani laboratoriet har karakteriseret metabolomics profil af cecal indhold homogenat udvundet af ubehandlede og antibiotika-behandlede mus, afslører betydelige ændringer i den overflod af forskellige metabolitter som følge af antibiotika-behandling-specifikt, nedsat overflod af sekundære galdesyrer og øget overflod af kulhydrater60. Endvidere, denne undersøgelse identificeret, at sekundære galdesyrer og carboxylsyre hæmmer hyphae udvikling, mens kulhydrater, herunder glukose, fremme hyphal morfogenese af C. albicans in vitro60. Resultaterne viser, at tilsætning af en pulje af hæmmende gutmetabolitter indeholdende deoxychylsyre (DCA, 0,5 mg/ml), lithocholicsyre (LCA, 0,1 mg/ml), palmiticsyre (0,1 mg/ml), p-tolylacetic syre (0,1 mg/ml), sebacicsyre (0,5 mg/ml) 2-methylbutsyre (0,5 mg/ml) og mælkesyre (5 mg/ml) til cecal homogenatet hos cef-behandlede mus, der er fuldstændig hæmmet hyphal morfogenese ex vivo. På den anden side viste eksogen tilsætning af glucose (1 mg/ml) til cecal homogenatet af cef-behandlede mus en massiv hyphal udvikling ex vivo (Figur 2B). Samlet set tyder disse resultater på, at tilsætning af tarmmetabolitter tilbage til cechomogenatet hos cefbehandlede mus differentieret regulerer morfogenese af C. albicans og dermed bekræfter tidligere in vitro-fund. Disse resultater viser, at gut metabolitter spiller en afgørende rolle i hyphal morfogens af C. albicans og forståelse af genmålene og signalering veje moduleret af disse metabolitter vil støtte i udviklingen af nye terapeutiske tilgange til at forebygge og behandle C. albicans infektioner.

Figure 1
Figur 1: Ex vivo-analyse for at bestemme effekten af cefoperazonebehandling på C. albicans hyphal morfogens i tarmindholdet. (A) Protokolskematisk skitse. (B)Antibiotikabehandlet (toppaneler) og ikke-behandlede (bundpaneler) tarmindhold blev taget fra maver, tyndtarme, cecums og tyktarmer af C57BL/6J mus. Tarmindholdet podet med C. albicans SC5314 blev inkuberet ved 37 °C i 4\u20125 h og farves med C. albicansantistof. Celler blev afbildet ved 40x forstørrelse. Repræsentative billeder vises her. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Eksogen tilsætning af tarmmetabolitter til cecalindholdet fra cef-behandlede mus ved hyfadannelse af C. albicans ex vivo. (A) Protokolskematisk skitse. B )Hæmmendegutmetabolitter pulje indeholdende DCA (0,5 mg/ ml), LCA (0,1 mg/ml), palmitinsyre (0,1 mg/ml), p-tolylacetic syre (0,1 mg/ml), sebacic syre (0,5 mg/ml) 2-methylbutsyre (0,5 mg/ml) og mælkesyre (5 mg/ml) eller glucose (1 mg/ml) blev tilsat cecalindholdet i cef-behandlede mus, blandet grundigt og inkuberet ved 37 °C i 15 minutter for at udføre ex vivo hyphae-analysen. Cecal indhold podet med C. albicans SC5314 blev inkuberet ved 37 °C for 4\u20125 h og farves med C. albicans antistof. Celler blev afbildet ved 40x forstørrelse. Repræsentative billeder vises her. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den metode, der er beskrevet her præsenterer en ny måde at undersøge effekten af antibiotika, kosten, xenobiotiske og terapeutiske virkninger på C. albicans hyphal morfogens i mave-tarmkanalen. Da størstedelen af systemiske infektioner stammer framave-tarmkanalen 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34 oghyphae dannelse er en kritisk virlensfaktor, der fremmer udbredelsen af C. albicans fra mave-tarmkanalen, forstå de faktorer, der styrer denne morfogenese i mave-tarmkanalen vil udvide viden om patogenese mekanismer og identificere nye behandlingsmuligheder.

Mens den metode, der præsenteres her, er forholdsvis ligetil, blev visse trin, der er beskrevet nedenfor, identificeret som kritiske og vigtige. i) Den første inoculum af C. albicans bør være optimal for at give mulighed for både vækst og hyphal morfogens af svampe. Med den begrænsede tilgængelighed af næringsstoffer i tarmen homogenate ekstrakter, højere volumen af inokulum kan reducere svampevækst og morfogenese proces. Væksten af forskellige kliniske isolater og stammer vil dog sandsynligvis være variabel, hvilket optimerer inokulum- og inkubationstiden for specifikke C. albicans isolater er afgørende. ii) Flere centrifugeringstrin ved klargøring af guthomogenatekstraktet viste sig at være afgørende for at fjerne snavset i tarmindholdet mest muligt. iii) På grund af centrifugeringshastigheden med relativt lav hastighed (for at undgå skadelige hyphalstrukturer) skal man være opmærksom på at undgå celletab under immunstainingtrin i denne protokol.

Alternative metoder til at visualisere svampe hyfa i mave-tarmkanalen er blevet brugt i fortiden, med visse fordele og begrænsninger forbundet med hver metode. En relativt bemærkelsesværdig metode ved hjælp af fluorescerende in situ hybridisering (FISH) til at visualisere svampe hyphae i mave-tarmkanalen er for nylig blevet påvist af Witchley et al.61,62. Dette er en lovende in vivo metode i øjeblikket til rådighed til at opdage C. albicans hyphae direkte i mave-tarmkanalen, men kompleksiteten af denne protokol gør det vanskeligt at tilpasse det til hurtige, store indledende screening undersøgelser. Traditionelle histopatologi metoder er også blevet brugt i fortiden til at vitalisere C. albicans gær og hyphae former i mave-tarmkanalen. Men, observation og billeddannelse af svampeceller med grundlæggende histopatologi, og Hematoxylin og Eosin (H / E) pletter er fortsat udfordrende, da mange standardfiksering metoder har potentiale til at forstyrre slimhindelaget af mave-tarmkanalen prøver, ofte skadelige hyphal strukturer i processen og fører til modstridende rapporter over den relative overflod af hyphal celle morfologi under infektion63,64,65,66. Denne metode blev udviklet for at undgå skader på hyphae under behandlingen for at løse dette problem. Desuden, væv explants er blevet brugt som en måde at undersøge biologiske betingelser ex vivo, men disse metoder er generelt fokuseret og nyttige til at undersøge overholdelse eller invasion potentiale af C. albicans67, men også de generelt udelukker de fleste af metabolomics og mikrobiom komponenter, der bidrager til in vivo patogenese. Selv om ex vivo protokol beskrevet her ikke helt efterligne in vivo GI miljø som beskrevet tidligere61,62, det giver de tættest mulige betingelser, C. albicans støder på i tarmen miljø i forhold til in vitro metoder ved hjælp af kunstige vækstbetingelser.

Denne protokol kan bruges til grundlæggende screening assays at identificere virkningen af miljøsignaler i mave-tarmkanalen på C. albicans hyphal morfogens. Denne metode giver mulighed for store grupper af forbindelser, herunder små molekylehæmmere, nye antimykotika, og metabolitter, der skal screenes hurtigt for hyphal udvikling, og kan anvendes i screening terapeutiske behandlinger eller identificere risikofaktorer for systemisk sygdom. Da C. albicans koloniserer i hele mave-tarmkanalen, vil denne protokol yderligere støtte til at identificere de miljømæssige signaler til stede i de specifikke segmenter af mave-tarmkanalen, der styrer hyphal morfogens hos personer, der tager antibiotika, kemoterapeutiske midler, og hos patienter med metaboliske lidelser, herunder diabetes mellitus. I sidste ende den metode, der er beskrevet her giver mulighed for hurtig karakterisering af hyphal morfogenese i C. albicans over en bred vifte af miljømæssige faktorer på en måde, der er mere biologisk relevant end de nuværende in vitro-metoder og er væsentligt hurtigere og mere ressourceeffektiv end de nuværende in vivo metoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende finansielle interesser eller andre interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfatterne anerkender ressourcer og støtte fra Midwestern University Cellular og Molecular Core Research facilitet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 - 10 µL Pipet Tips Fisher Scientific 02-707-454 Misc
100 - 1000 µL Pipet Tips Fisher Scientific 02-707-400 Misc
20 - 200 µL Pipet Tips Fisher Scientific 02-707-451 Misc
2-methylbutyric acid Sigma 193070-25G hyphal-inhibitory compound
488 goat anti-rabbit IgG Invitrogen (Fisher) A11008 IF Staining secondary ab
Agar Fisher BP1423-500 YPD agar component
Automated Imaging Microscope Keyence BZX700
Candida Albicans Antibody Invitrogen (Fisher) PA1-27158 IF Staining primary ab
cefoperazone Cayman 16113 antibiotic
deoxycholic acid Sigma 30960 hyphal-inhibitory compound
D-Glucose Fisher D16-500 hyphal-promoting compound
forceps Fisher 08-885
lactic acid Alfa Aesar AAAL13242-06 hyphal-inhibitory compound
lithocholic acid Sigma L6250-10G hyphal-inhibitory compound
palmitic acid Sigma P5585-10G hyphal-inhibitory compound
Paraformaldehyde Alfa Aesar A11313 IF Staining fixative
Phosphate-buffered saline (PBS), 10x Alfa Aesar J62692 PBS component
p-tolylacetic acid SCBT sc-257959 hyphal-inhibitory compound
sebacic acid Sigma 283258-250G hyphal-inhibitory compound
sharp ended scissors Fisher 28301
sterile Milli-Q water N/A N/A Misc
YPD Broth BD Biosciences 242810 YPD agar component

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huffnagle, G. B., Noverr, M. C. The emerging world of the fungal microbiome. Trends in Microbiology. 21 (7), 334-341 (2013).
  2. Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clinical Infectious Diseases. 39 (3), 309-317 (2004).
  3. Hajjeh, R. A., et al. Incidence of Bloodstream Infections Due to Candida Species and In Vitro Susceptibilities of Isolates Collected from 1998 to 2000 in a Population-based Active Surveillance Program. Journal of Clinical Microbiology. 42 (4), 1519-1527 (2004).
  4. Lockhart, S. R., et al. Species Identification and Antifungal Susceptibility Testing of Candida Bloodstream Isolates from Population-Based Surveillance Studies in Two U.S. Cities from 2008 to 2011. Journal of Clinical Microbiology. 50 (11), 3435-3442 (2012).
  5. Pfaller, M., et al. Epidemiology and outcomes of candidemia in 3648 patients: data from the Prospective Antifungal Therapy (PATH Alliance(R)) registry, 2004-2008. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 74 (4), 323-331 (2012).
  6. Angarone, M. Fungal infections in cancer patients. Cancer Treatment and Research. 161, 129-155 (2014).
  7. Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), 113 (2012).
  8. Calton, E. A., et al. Invasive bacterial and fungal infections in paediatric patients with cancer: incidence, risk factors, aetiology and outcomes in a UK regional cohort 2009-2011. Pediatric Blood & Cancer. 61 (7), 1239-1245 (2014).
  9. Carter, J. H., et al. Medical management of invasive fungal infections of the central nervous system in pediatric cancer patients. Pediatric Blood & Cancer. 62 (6), 1095-1098 (2015).
  10. Low, C. Y., Rotstein, C. Emerging fungal infections in immunocompromised patients. F1000 Medicine Reports. 3, 14 (2011).
  11. Mousset, S., et al. Treatment of invasive fungal infections in cancer patients-updated recommendations of the Infectious Diseases Working Party (AGIHO) of the German Society of Hematology and Oncology (DGHO). Annals of Hematology. 93 (1), 13-32 (2014).
  12. Perfect, J. R., Hachem, R., Wingard, J. R. Update on epidemiology of and preventive strategies for invasive fungal infections in cancer patients. Clinical Infectious Diseases. 59, Suppl 5 352-355 (2014).
  13. Sipsas, N. V., Kontoyiannis, D. P. Invasive fungal infections in patients with cancer in the Intensive Care Unit. International Journal of Antimicrobial Agents. 39 (6), 464-471 (2012).
  14. Falagas, M. E., Apostolou, K. E., Pappas, V. D. Attributable mortality of candidemia: a systematic review of matched cohort and case-control studies. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 25 (7), 419-425 (2006).
  15. Chi, H. W., et al. Candida albicans versus non-albicans bloodstream infections: the comparison of risk factors and outcome. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 44 (5), 369-375 (2011).
  16. Drell, T., et al. Characterization of the vaginal micro- and mycobiome in asymptomatic reproductive-age Estonian women. PLoS One. 8 (1), 54379 (2013).
  17. Merenstein, D., et al. Colonization by Candida species of the oral and vaginal mucosa in HIV-infected and noninfected women. AIDS Research and Human Retroviruses. 29 (1), 30-34 (2013).
  18. Ghannoum, M. A., et al. Characterization of the oral fungal microbiome (mycobiome) in healthy individuals. PLoS Pathogens. 6 (1), 1000713 (2010).
  19. Hoffmann, C., et al. Archaea and fungi of the human gut microbiome: correlations with diet and bacterial residents. PLoS One. 8 (6), 66019 (2013).
  20. Noble, S. M., Gianetti, B. A., Witchley, J. N. Candida albicans cell-type switching and functional plasticity in the mammalian host. Nature Reviews Microbiology. 15 (2), 96-108 (2017).
  21. Samonis, G., et al. Prospective evaluation of effects of broad-spectrum antibiotics on gastrointestinal yeast colonization of humans. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 37 (1), 51-53 (1993).
  22. Sahni, V., et al. Candidemia--an under-recognized nosocomial infection in Indian hospitals. The Journal of the Association of Physicians of India. 53, 607-611 (2005).
  23. Meijer-Severs, G. J., Joshi, J. H. The effect of new broad-spectrum antibiotics on faecal flora of cancer patients. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 24 (4), 605-613 (1989).
  24. Kennedy, M. J., Volz, P. A., Edwards, C. A., Yancey, R. J. Mechanisms of association of Candida albicans with intestinal mucosa. Journal of Medical Microbiology. 24 (4), 333-341 (1987).
  25. Miranda, L. N., et al. Candida colonisation as a source for candidaemia. Journal of Hospital Infections. 72 (1), 9-16 (2009).
  26. Nucci, M., Anaissie, E. Revisiting the source of candidemia: skin or gut. Clinical Infectious Diseases. 33 (12), 1959-1967 (2001).
  27. Raponi, G., Visconti, V., Brunetti, G., Ghezzi, M. C. Clostridium difficile infection and Candida colonization of the gut: is there a correlation. Clinical Infectious Diseases. 59 (11), 1648-1649 (2014).
  28. Guastalegname, M., Russo, A., Falcone, M., Giuliano, S., Venditti, M. Candidemia subsequent to severe infection due to Clostridium difficile: is there a link. Clinical Infectious Diseases. 57 (5), 772-774 (2013).
  29. Nerandzic, M. M., Mullane, K., Miller, M. A., Babakhani, F., Donskey, C. J. Reduced acquisition and overgrowth of vancomycin-resistant enterococci and Candida species in patients treated with fidaxomicin versus vancomycin for Clostridium difficile infection. Clinical Infectious Diseases. 55, Suppl 2 121-126 (2012).
  30. Krause, R., Krejs, G. J., Wenisch, C., Reisinger, E. C. Elevated fecal Candida counts in patients with antibiotic-associated diarrhea: role of soluble fecal substances. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 10 (1), 167-168 (2003).
  31. Krause, R., et al. Role of Candida in antibiotic-associated diarrhea. The Journal of Infectious Diseases. 184 (8), 1065-1069 (2001).
  32. Zuo, T., et al. Gut fungal dysbiosis correlates with reduced efficacy of fecal microbiota transplantation in Clostridium difficile infection. Nature Communications. 9 (1), 3663 (2018).
  33. Delaloye, J., Calandra, T. Invasive candidiasis as a cause of sepsis in the critically ill patient. Virulence. 5 (1), 161-169 (2014).
  34. Cole, G. T., Halawa, A. A., Anaissie, E. J. The role of the gastrointestinal tract in hematogenous candidiasis: from the laboratory to the bedside. Clinical Infectious Diseases. 22, Suppl 2 73-88 (1996).
  35. Lo, H. J., et al. Nonfilamentous C. albicans mutants are avirulent. Cell. 90 (5), 939-949 (1997).
  36. Gale, C. A., et al. Linkage of adhesion, filamentous growth, and virulence in Candida albicans to a single gene, INT1. Science. 279 (5355), 1355-1358 (1998).
  37. Bendel, C. M., et al. Systemic infection following intravenous inoculation of mice with Candida albicans int1 mutant strains. Molecular genetics and metabolism. 67 (4), 343-351 (1999).
  38. Toenjes, K. A., et al. Small-molecule inhibitors of the budded-to-hyphal-form transition in the pathogenic yeast Candida albicans. Antimicrobial agents and chemotherapy. 49 (3), 963-972 (2005).
  39. Carlisle, P. L., et al. Expression levels of a filament-specific transcriptional regulator are sufficient to determine Candida albicans morphology and virulence. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (2), 599-604 (2009).
  40. Fazly, A., et al. Chemical screening identifies filastatin, a small molecule inhibitor of Candida albicans adhesion, morphogenesis, and pathogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (33), 13594-13599 (2013).
  41. Pande, K., Chen, C., Noble, S. M. Passage through the mammalian gut triggers a phenotypic switch that promotes Candida albicans commensalism. Nature genetics. 45 (9), 1088 (2013).
  42. Bar-Yosef, H., Gonzalez, N. V., Ben-Aroya, S., Kron, S. J., Kornitzer, D. Chemical inhibitors of Candida albicans hyphal morphogenesis target endocytosis. Scientific reports. 7 (1), 5692 (2017).
  43. Mendelsohn, S., Pinsky, M., Weissman, Z., Kornitzer, D. Regulation of the Candida albicans hypha-inducing transcription factor Ume6 by the CDK1 cyclins Cln3 and Hgc1. mSphere. 2 (2), 00248 (2017).
  44. Vila, T., et al. Targeting Candida albicans filamentation for antifungal drug development. Virulence. 8 (2), 150-158 (2017).
  45. Pande, K., Chen, C., Noble, S. M. Passage through the mammalian gut triggers a phenotypic switch that promotes Candida albicans commensalism. Nature Genetics. 45 (9), 1088-1091 (2013).
  46. Lo, H. J., et al. Nonfilamentous C. albicans mutants are avirulent. Cell. 90 (5), 939-949 (1997).
  47. Bar-Yosef, H., Vivanco Gonzalez, N., Ben-Aroya, S., Kron, S. J., Kornitzer, D. Chemical inhibitors of Candida albicans hyphal morphogenesis target endocytosis. Scientific Reports. 7 (1), 5692 (2017).
  48. Carlisle, P. L., et al. Expression levels of a filament-specific transcriptional regulator are sufficient to determine Candida albicans morphology and virulence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (2), 599-604 (2009).
  49. Mendelsohn, S., Pinsky, M., Weissman, Z., Kornitzer, D. Regulation of the Candida albicans Hypha-Inducing Transcription Factor Ume6 by the CDK1 Cyclins Cln3 and Hgc1. mSphere. 2 (2), (2017).
  50. Bendel, C. M., et al. Effects of Alteration of the Candida albicans Gene INT1 on Cecal Colonization in Orally Innoculated Mice. Pediatric Research. 45, 156 (1999).
  51. Gale, C. A., et al. Linkage of adhesion, filamentous growth, and virulence in Candida albicans to a single gene, INT1. Science. 279 (5355), 1355-1358 (1998).
  52. Toenjes, K. A., et al. Small-molecule inhibitors of the budded-to-hyphal-form transition in the pathogenic yeast Candida albicans. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (3), 963-972 (2005).
  53. Fazly, A., et al. Chemical screening identifies filastatin, a small molecule inhibitor of Candida albicans adhesion, morphogenesis, and pathogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13594-13599 (2013).
  54. Naseem, S., Gunasekera, A., Araya, E., Konopka, J. B. N-acetylglucosamine (GlcNAc) induction of hyphal morphogenesis and transcriptional responses in Candida albicans are not dependent on its metabolism. Journal of Biological Chemistry. 286 (33), 28671-28680 (2011).
  55. Piispanen, A. E., Hogan, D. A. PEPped up: induction of Candida albicans virulence by bacterial cell wall fragments. Cell Host & Microbe. 4 (1), 1-2 (2008).
  56. Xu, X. L., et al. Bacterial peptidoglycan triggers Candida albicans hyphal growth by directly activating the adenylyl cyclase Cyr1p. Cell Host & Microbe. 4 (1), 28-39 (2008).
  57. Guinan, J., Thangamani, S. Antibiotic-induced alterations in taurocholic acid levels promote gastrointestinal colonization of Candida albicans. FEMS microbiology letters. 365 (18), (2018).
  58. Guinan, J., Villa, P., Thangamani, S. Secondary bile acids inhibit Candida albicans growth and morphogenesis. Pathogens and disease. 76 (3), (2018).
  59. Guinan, J., Wang, S., Hazbun, T. R., Yadav, H., Thangamani, S. Antibiotic-induced decreases in the levels of microbial-derived short-chain fatty acids correlate with increased gastrointestinal colonization of Candida albicans. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
  60. Gutierrez, D., et al. Antibiotic-induced gut metabolome and microbiome alterations increase the susceptibility to Candida albicans colonization in the gastrointestinal tract. FEMS microbiology ecology. 96 (1), 187 (2020).
  61. Witchley, J. N., et al. Candida albicans morphogenesis programs control the balance between gut commensalism and invasive infection. Cell Host & Microbe. 25 (3), 432-443 (2019).
  62. Witchley, J. N., Penumetcha, P. M., Noble, S. M. Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (153), e60283 (2019).
  63. Johansson, M. E., Hansson, G. C. Preservation of mucus in histological sections, immunostaining of mucins in fixed tissue, and localization of bacteria with FISH. Mucins. , Springer. 229-235 (2012).
  64. Lossinsky, A. S., et al. The histopathology of Candida albicans invasion in neonatal rat tissues and in the human blood-brain barrier in culture revealed by light, scanning, transmission and immunoelectron microscopy scanning. Histology and histopathology. , (2006).
  65. Rosenbach, A., Dignard, D., Pierce, J. V., Whiteway, M., Kumamoto, C. A. Adaptations of Candida albicans for growth in the mammalian intestinal tract. Eukaryotic Cell. 9, 1075-1086 (2010).
  66. Vautier, S., et al. C andida albicans colonization and dissemination from the murine gastrointestinal tract: the influence of morphology and T h17 immunity. Cellular Microbiology. 17, 445-450 (2015).
  67. Lyman, C., Navarro, E., Garrett, K., Roberts, D., Pizzo, P., Walsh, T. Adherence of Candida albicans to bladder mucosa: development and application of a tissue explant assay. Mycoses. 42, 255-259 (1999).

Tags

Immunologi og infektion Problem 161 Candida alobans hyphal morfosese ex vivo assay glukose sekundære galdesyrer og mave-tarmkanalen
En Ex vivo Assay at <em>studere Candida albicans</em> Hyphal Morphogenese i mave-tarmkanalen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Monasky, R., Villa, S., Thangamani,… More

Monasky, R., Villa, S., Thangamani, S. An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract. J. Vis. Exp. (161), e61488, doi:10.3791/61488 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter