Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Ex vivo Assay לחקר קנדידה אלביקנים מקף מורפוגנזה במערכת העיכול

Published: July 1, 2020 doi: 10.3791/61488
Automatic Translation
1, 2, 3
1College of Veterinary Medicine, Midwestern University, 2Masters in Biomedical Science Program, College of Graduate Studies, Midwestern University, 3Department of Pathology and Population Medicine, College of Veterinary Medicine, Midwestern University

Summary

ex vivo assay המתואר במחקר זה באמצעות תמציות הומוגנטיות במעיים וכתמי immunofluorescence מייצג שיטה חדשנית לבחון את המורפוגנזה המקף של קנדידה אלביקנים במערכת העיכול. שיטה זו יכולה להיות מנוצלת כדי לחקור את האותות הסביבתיים המסדירים מעבר מורפוגנטי במעיים.

Abstract

קנדידה אלביקנים מקף morphogenesis במערכת העיכול (GI) מערכת העיכול נשלטת היטב על ידי אותות סביבתיים שונים, וממלא תפקיד חשוב בהפצה ופתוגנזה של פתוגן פטרייתי אופורטוניסטי זה. עם זאת, שיטות לדמיין hyphae פטרייתי במערכת העיכול ב vivo הם מאתגרים אשר מגביל את ההבנה של אותות סביבתיים בשליטה על תהליך morphogenesis זה. הפרוטוקול המתואר כאן מדגים שיטת ex vivo חדשנית להדמיה של מורפוגנזה מקפית בתמציות הומוגניות במעיים. באמצעות מבחן אקס ויוו, מחקר זה מדגים כי תוכן cecal מעכברים מטופלים אנטיביוטיים, אבל לא מעכברי בקרה מטופלים, לקדם C. אלביקנים מקף morphogenesis בתכולת המעיים. כמו כן, הוספת קבוצות ספציפיות של מטבוליטים במעיים לתכולת cecal מעכברים שטופלו באנטיביוטיקה מווסתת באופן דיפרנציאלי את המקף morphogenesis ex vivo. יחד, פרוטוקול זה מייצג שיטה חדשנית לזהות ולחקור את האותות הסביבתיים השליטה C. אלביקנים מקף morphogenesis במערכת העיכול.

Introduction

קנדידה אלביקנים הוא פתוגן פטרייתי אופורטוניסטי, פולימורפי, כי הוא בדרך כלל בקנה אחד, אבל יכול לעבור שינוי מורפולוגי לתוך צורה ארסית המסוגלת לגרום לזיהומים מסכניחיים אצלאנשים immunocompromised 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. C. אלביקנים הוא הגורם המוביל של זיהומים nosocomial מערכתית, עם 40 \u201260% שיעור התמותה אפילו עם טיפול נגד פטריות2,14,15. למרות C. albicans שוכן בנישות מארח שונות כולל מערכתהרבייה הנשית 16,17, חלל הפה של אנשיםבריאים 18 ואת מערכת העיכול (GI) מערכת19,20, רוב זיהומים מערכתיים מקורם במערכת העיכול ועוד, מקור הזיהום המערכתי הוא אישר לעתים קרובות להיות GI בדרכי21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34. C. פתוגניות אלביקנים במערכת העיכול מושפעת ממגוון רחב של גורמים; עם זאת, מאפיין מרכזי הנחוץ לארסיות הוא המעבר ממורפולוגיה של תאי שמרים למורפולוגיה של תאי מקףארסיים 35,36,37,38,39,40,41,42,43,44. C. albicans התקשרות והפצה מ GI בדרכי במהלך זיהום קשורה מאוד עם היכולת שלה לעבור שמרים commensal לתוך hyphae ארסי, המאפשר פטריותלגרום למחלה פולשנית 44,45,46,47,48,49,50,51,52,53.

מגוון גורמים במעיים, כולל n-אצטילגלוקוסאמין, לווסת היווצרות מקף על ידי C. אלביקנים. לכן, חשוב לצמצם את הפער בידע לגבי מורפוגנזה המקף של פתוגן פטרייתי זה בדרכי GI54,55,56. עדויות אחרונים מצביעות על כך מטבוליטים שונים במעיים לשלוט באופן דיפרנציאלי מורפוגנזה המקף של C. אלביקנים במבחנה 57,58,59,60. עם זאת, אילוצים טכניים מציגים בעיות כאשר מנסים לחקור C. albicans היווצרות hyphae בדגימות המעיים in vivo, במיוחד הכתמת שמרים ותאי hyphae וניתוח כמותי של התפתחות המקף. כדי להבין C. אלביקנים מקף morphogenesis במערכת העיכול, שיטת vivo לשעבר פותחה באמצעות תמציות מסיסים של תוכן המעי הומוגני מעכברים כדי לחקור את ההשפעה של מטבוליטים על מורפוגן מקף פטרייתי. ניצול דגימות מעיים מעכברים עמידים רגישים לזיהום C. albicans GI, שיטה זו תסייע לזהות וללמוד את ההשפעה של מטבוליטים, אנטיביוטיקה ושנאת קסנוביוטיקה על מורפוגנזה מקף פטרייתי במערכת העיכול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הפרוטוקולים של בעלי חיים אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים מוסדיים של אוניברסיטת המערב התיכון (IACUC) כמתוארלפני 57. ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים מוסדיים באוניברסיטת המערב התיכון אישרה מחקר זה תחת פרוטוקול MWU IACUC #2894. מדיניות הטיפול בבעלי חיים של MWU פועלת בהתאם למדיניות שירות הבריאות הציבורי (PHS) בנוגע לטיפול בבני אדם ולשימוש בבעלי חיים במעבדה ולמדיניות שנקבעה לחוק לרווחת בעלי חיים (AWA).

1. עכברים לומדים פרוטוקול סטנדרטי

  1. השתמש בעכברים C57BL/6J זכר ונקבה לפחות שישה שבועות. משלימים אותם עם מים סטריליים עם או בלי cefoperazone (0.5 מ"ג / מ"ל).
    1. עכברי בית שותף בקבוצות של 5, כאשר כל כלוב מכיל את כל העכברים הזכריים או את כל העכברים הנשיים. לספק לעכברים אוכל עכבר רגיל ומים (באמצעות בקבוק 400 מ"ל) בכל עת.
    2. בדוק כלובים מדי יום כדי להבטיח שרמות המזון והמים מספיקות, ולבדוק עכברים לסימני מצוקה.
  2. החלף את המים עם cefoperazone כל 48 שעות כדי להבטיח אנטיביוטיקה טרי מסופק ללא קשר למים הנותרים בכלוב האכלה בקבוקים.
  3. לאחר 5\u20127 ימים של טיפול cefoperazone, המתת לחץ חוץ עכברים באמצעות CO2 חנק התבוננות פרוטוקול IACUC הוקמה. אשר מוות באמצעות נקע בצוואר הרחם.
  4. לנתח עכברים באמצעות מספריים חדים מעוקרים אוטומטית ומדפים מעוקרים אוטוקלאב.
    1. לאחר המתת חסד, לאבטח את החיה למשטח ניתוח על ידי הצמדת כל הגפיים כך הבטן נחשפת.
    2. לרסס את אזור הבטן עם 70% אתנול כדי למנוע פרווה להידבק מדפים, מספריים, או חלקי המעיים במהלך הניתוח.
    3. השתמש מדפים כדי לצבוט ולהרים קטע של העור בבסיס הבטן וליצור חתך קטן דרך העור ואת fascia הבסיסית באמצעות מספריים. יש לדאוג מאוד בעת ביצוע חתך זה, כדי למנוע ניקוב cecum או דופן המעי.
    4. מרחיבים את החתך הזה לכלוב הצלעות, וחושפים חלקית את חלל הצלף. בצע חתך החל בנקודה של החתך הראשוני משני הצדדים המשתרע כלפי מעלה וצד.
    5. משוך מדפים אלה באופן כללי ולהצמיד למשטח הניתוח כדי לחשוף באופן מלא את חלל צפירה.
  5. לחלץ את מערכת העיכול באמצעות מדפים, תוך שימוש במספריים כדי להפוך חתכים מעולה על הבטן ועל האזור הדיסטלי של המעי הגס כדי להבטיח איסוף של הכמות הגדולה ביותר של תוכן המעיים מכל סעיף.
  6. בעת הסרת מערכת העיכול, יש לדאוג להימנע מפגיעה ברכיבים הבודדים. להפריד את הקיבה, המעי הדק, cecum, ואת המעי הגס בנפרד באמצעות מספריים בקצוות הפרוקסימליים והדיסטליים שלהם.
  7. לאיסוף כל תוכן מעיים מכל מקטע, בצע חתך יחיד בקצה הדיסטלי של כל מקטע באמצעות מספריים, ואחריו לגרש באופן ידני את תוכן המעיים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל באמצעות מדפים.
  8. לאחסן את תכולת המעיים ב -80 °C (70 °F) עבור מראיות vivo לשעבר.

2. הכנת תמצית שמרים-פפטון-דקסטרוז (YPD) צלחות אגר

  1. לבקבוק זכוכית 1 L להוסיף 25 גרם של תמצית שמרים אבקת מרק peptone-dextrose, 10 גרם של אגר, ומים אולטרה לנפח הסופי של 500 מ"ל.
  2. אוטוקלאב ב 121 °C (60 °F) במשך 30 דקות על מחזור נוזלי כדי לעקר את התקשורת.
  3. מתחת למכסה המנוע לזרימה למינארית, יוצקים כ-20 מ"ל של אג מדיה לצלחת פטרי סטרילית. 500 מ"ל של אגאר מדיה צריך להניב כ 25 צלחות.
  4. לאחסן צלחות ב 4 °C (60 °F) עד מוכן לשימוש.

3. אקס ויוו הכנה למקף מורפוגנזה

  1. פס תרבות טרייה של C. albicans SC5314 על צלחת אגר YPD ודגירה לילה ב 30 °C (60 °F).
  2. בחר שתיים עד שלוש מושבות בודדות בגודל בינוני מתרבות C. albicans SC5314 הגדלות בן לילה והשהה מחדש ב- 1 מ"ל של תמיסת מלח במאגר פוספט (PBS).
  3. לאחזר תכולת מעיים קפואה מהמקפיא -80 מעלות צלזיוס ולהפשיר ב 25 °C (69 °F).
  4. לשקול כ 150 מ"ג של תוכן המעיים לתוך צינור חדש 1.5 מ"ל.
  5. השהה מחדש את תכולת המעיים עם 150 μL של PBS (תוכן המעיים ו- PBS ביחס משקל של 1:1 לנפח).
  6. מערבולת במהירות גבוהה עבור 30 s כדי homogenize את תכולת המעיים ולאפשר לשבת בטמפרטורת החדר במשך כדקה.
  7. צנטריפוגה הומוגניטים ב 1000 x גרם במשך 3 דקות.
  8. העבר את העל-טבעי לצינור חדש של 1.5 מ"ל.
  9. חזור על שלבים 3.7 ו- 3.8 כדי להסיר את כל הפסולת ב- supernatant.
  10. הוסף 10 μL של C. אלביקנים SC5314 אינוקולום מוכן לעיל זה על טבעי
  11. מערבבים היטב ו דגירה ב 37 °C (69 °F) במשך 4 עד 5 שעות.

4. תוספת אקסוגנית של מטבוליטים לתמציות הומוגנטיות במעיים עבור מקף מורפוגנזה assay

  1. אחזר תכולת מעיים קפואה מהמקפיא -80 °C (60 °F) והושעה מחדש ב- PBS ביחס של 1:1 (משקל: נפח).
  2. מוסיפים את הריכוז הרצוי של מטבוליטים במעיים לתכלית המעיים ולתערובת PBS.
  3. מערבולת במהירות גבוהה עבור 30 s כדי homogenize את תכולת המעיים המכיל מטבוליטים ולאפשר לשבת בטמפרטורת החדר במשך כ 10 דקות.
  4. צנטריפוגה הומוגניטים ב 1000 x גרם במשך 3 דקות.
  5. העבר את העל-טבעי לצינור חדש של 1.5 מ"ל. חזור על שלבים 4.4 ו- 4.5 כדי להסיר את כל הפסולת ב- supernatant.
  6. הוסף 10 μL של C. אלביקנים SC5314 אינוקולום מוכן לעיל זה על טבעי. מערבבים היטב ו דגירה ב 37 °C (69 °F) במשך 4 עד 5 שעות.

5. C. אלביקנים מורפוגנזה מראי (immunostaining והדמיה)

  1. צנטריפוגה הדגימות ב 1000 x g במשך 2 דקות להשליך את supernatant באמצעות צינורות.
  2. לתקן את הדגימות ב 100 μL של 2% paraformaldehyde (PFA) במשך 15 דקות.
  3. צנטריפוגה ב 1000 x גרם במשך 2 דקות ולהשליך על טבעי באמצעות צינורות.
  4. לשטוף את הדגימות פעמיים עם 1 מ"ל של PBS. כדי לשטוף דגימות, להשעות מחדש את גלולה PBS על ידי צינור בעדינות. אין למערבולת המדגם שכן הדבר עלול לגרום נזק למבני המקף. לאחר השעיה מחדש, צנטריפוגה ב 1000 x g במשך 2 דקות להשליך את supernatant באמצעות צינורות.
  5. הדגירה את הדגימות בטמפרטורת החדר ב 100 μL של PBS המכיל נוגדן פוליקלונל C. אלביקנים (1:100 דילול) במשך 30 דקות.
  6. לשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם 1 מ"ל של PBS.
    הערה: בעת שימוש בנוגדן פלואורסצנטי, מומלץ לבצע את כל שלבי הדילול והכביסה באור עמום כדי למנוע הלבנת תמונות ולשפר את תוחלת החיים לדוגמה.
  7. דגירה הדגימות בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות ב 100 μL של PBS המכיל נוגדן אנטי ארנב IgG Alexafluor 488 ב 1:500 דילול. בצע דגירה במגירה כהה או בחדר כדי למנוע הלבנת תמונות.
  8. לשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם 1 מ"ל של PBS.
  9. להשעות מחדש את הדגימות ב 100 μL של PBS ולהעביר צלחת 96 באר להדמיה.
    הערה: כאשר לא להיות בתמונה, מומלץ כי צלחת 96 גם להיות עטוף בנייר אלומיניום, כדי למנוע הלבנת תמונה.
  10. תאים פטרייתיים תמונה באמצעות 20x ו 40x עדשות אובייקטיביות באמצעות מיקרוסקופ הדמיה פלואורסצנטי. השתמש במסנן חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) (אורך גל 470/40 ואורך גל פליטה 525/50) כדי לזהות פלואורסצנטיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תוצאות אלה יחד עם ממצאים קודמים ממעבדת Thangamani60 מצביעים על כך שכאשר C. albicans גדל ex vivo בתמציות הומוגנטיות במעיים שנלקחו מהבטן, המעי הדק והמעי הגס של שליטה לא מטופלת ועכברים שטופלו באנטיביוטיקה, C. אלביקנים מתפתחים בדרך כלל עם מורפולוגיה שמרים (איור 1B). עם זאת, כאשר גדל בתמצית cecal מעכברים שטופלו באנטיביוטיקה, C. albicans בקלות עובר מורפוגנזה, וכתוצאה מכך דגימות המכילות שמרים וצורות hyphae (איור 1B); מצב זה אינו מתרחש בעכברי בקרה. זה תומך בתוצאות קודמות, אשר הראו עלייה משמעותית בצורות hyphae בדגימות גדל תמציות cecal שטופלו באנטיביוטיקה, אבל לא בכל תמציות מעיים אחרות שטופלובאנטיביוטיקה 60. תוצאות אלה מראות כי טיפול אנטיביוטי גורם לשינויים בסביבת cecal, אשר לגרום מורפוגנזה מקף של C. אלביקנים. בנוסף, לוקליזציה ספציפית של פנוטיפ זה הבחין רק cecum גם עולה כי אלה תנאים קידום hyphae לא בהכרח נוכח בכל מערכת העיכול, אבל במקום מוגבלים למקטעים ספציפיים של מערכת העיכול בהתאם לזמינות של חומרים מזינים, מטבוליטים ומולקולות לא ידועות אחרות.

מאז תמצית cecal של עכברים שטופלו באנטיביוטיקה מקדם את morphogenesis של C. אלביקנים57,58,59,60, בדקנו אם תוספת אקסוגנית של קבוצה נבחרת של מטבוליטים במעיים (מזוהה מחקרים במבחנה קודמים) לתוכן cecal של עכברים שטופלו cef ישפיע על המורפוגנזה של C. אלביקנים אקס ויו. עבודה קודמת שבוצעה על ידי מעבדת Thangamani אפיינה את הפרופיל המטבולומי של הומוגונט תוכן cecal המופק מעכברים לא מטופלים ואנטיביוטיקה מטופלים, חושף שינויים משמעותיים בשפע של מטבוליטים שונים כתוצאה של טיפול אנטיביוטי – במיוחד, ירידה בשפע של חומצות מרה משניות ושפע מוגבר של פחמימות60. יתר על כן, מחקר זה זיהה כי חומצות מרה משניות וחומצות קרבוקסיליות מעכבות התפתחות היפים, ואילו פחמימות כולל גלוקוז, מקדמות את המורפוגנזה המקף של C. albicans במבחנה 60. התוצאות מצביעות על כך שהוספת מאגר של מטבוליטים מעכבים במעיים המכילים חומצה דוקסיכולית (DCA, 0.5 מ"ג /מ"ל), חומצה ליטוכולית (LCA, 0.1 מ"ג/מ"ל), חומצה פלמיטית (0.1 מ"ג/מ"ל), חומצה פולילקטית (0.1 מ"ג/מ"ל), חומצה סבאצית (0.5 מ"ג/מ"ל), 2 חומצה מתיל-בוטירית (0.5 מ"ג/מ"ל), וחומצה לקטית (5 מ"ג/מ"ל) להומוגנטיות של עכברים שטופלו ב-cef מעכבים לחלוטין את מורפוגנזה מקף אקס ויו. מצד שני, תוספת אקסוגנית של גלוקוז (1 מ"ג / מ"ל) להומוגנטי cecal של עכברים שטופלו ב- cef הראתה התפתחות מקף מסיבית ex vivo (איור 2B). באופן קולקטיבי, ממצאים אלה מצביעים על כך שתוספת של מטבוליטים במעיים בחזרה להומוגנאט cecal של העכברים שטופלו ב- cef מסדירה באופן דיפרנציאלי את המורפוגנזה של C. albicans, ובכך מאשרת ממצאים ראשוניים קודמים. תוצאות אלה מצביעות על כך שמטבוליטים במעיים ממלאים תפקיד קריטי במורפוגנזה של C. albicans והבנת מטרות הגנים ומסלולי איתות המווסתים על ידי מטבוליטים אלה יסייעו בפיתוח גישות טיפוליות חדשות כדי למנוע ולטפל בזיהומים C. albicans.

Figure 1
איור 1: Ex vivo תוודא כדי לקבוע את ההשפעה של טיפול cefoperazone על C. אלביקנים מקף מורפוגנזה בתכולת המעיים. (א)חלוקה לרמות סכמטית של פרוטוקול. (B)טיפול אנטיביוטי (לוחות עליונים) ותכולת המעיים שאינם מטופלים (לוחות תחתונים) נלקחו מהבטן, המעי הדק, cecums, ומעיים גדולים של עכברים C57BL / 6J. תכולת המעיים שחוסנו עם C. אלביקנים SC5314 הודגרו ב 37 °C (69 °F) עבור 4\u20125 h ומוכתמים בנוגדן C. albicans. תאים דימוי בהגדלה 40x. תמונות מייצגות מוצגות כאן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: תוספת אקסוגנית של מטבוליטים במעיים לתכולת cecal מעכברים שטופלו ב- cef על היווצרות hyphae של C. אלביקנים אקס ויוו. (א)חלוקה לרמות סכמטית של פרוטוקול. (B)מאגר מטבוליטים מעכבים במעיים המכיל DCA (0.5 מ"ג /מ"ל), LCA (0.1 מ"ג / מ"ל), חומצה פלמיטית (0.1 מ"ג / מ"ל), חומצה פולילקטית (0.1 מ"ג / מ"ל), חומצה סבאצית (0.5 מ"ג / מ"ל); חומצה 2-מתיל-בוטירית (0.5 מ"ג/מ"ל), וחומצה לקטית (5 מ"ג/מ"ל) או גלוקוז (1 מ"ג/מ"ל) נוספו בחזרה לתוכן cecal של עכברים שטופלו ב- cef, מעורבבים ביסודיות ודגירה ב 37 °C (37 °C) במשך 15 דקות כדי לבצע את ההיפאי ex vivo hyphae. תכולת Cecal מחוסנת עם C. אלביקנים SC5314 הודגרו ב 37 °C (69 °F) עבור 4\u20125 h ומוכתמים בנוגדן C. albicans. תאים דימוי בהגדלה 40x. תמונות מייצגות מוצגות כאן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השיטה המתוארת כאן מציגה דרך חדשנית לחקור את ההשפעה של השפעות אנטיביוטיות, תזונתיות, קסנוביוטיות וטיפוליות על C. אלביקנים מקף מורפוגנזה במערכת העיכול. מאז רוב זיהומים מערכתיים מקורם GItract 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34 ו היווצרות hyphae הוא גורם ארסיות קריטי המקדם את הפצת C. אלביקנים מן GI בדרכי, הבנת הגורמים השולטים מורפוגנזה זו במערכת העיכול ירחיב את הידע על מנגנוני פתוגנזה ולזהות אפשרויות טיפול חדשניות.

בעוד השיטה המוצגת כאן היא פשוטה יחסית, צעדים מסוימים שנדונו להלן זוהו כבינויים וחשובים. (i) האינוקולום הראשוני של C. אלביקנים צריך להיות אופטימלי כדי לאפשר הן צמיחה מורפוגנזה מקף של פטריות. עם הזמינות המוגבלת של חומרים מזינים בתמציות הומוגנטיות במעיים, נפח גבוה יותר של אינוקולום עשוי להפחית באופן משמעותי את הצמיחה הפטרייתית ואת תהליך המורפוגנזה. עם זאת, הצמיחה של מבודדים קליניים שונים וזנים עשויים להיות משתנים, ובכך אופטימיזציה של זמן inoculum ודגירה עבור מסוים C. albicans מבודד הוא חיוני. (ii) צעדי צנטריפוגה מרובים בעת הכנת תמצית הומוגנית המעיים נמצאו חיוניים כדי להסיר את הפסולת בתכולת המעיים ככל האפשר. (iii) בשל המהירות הנמוכה יחסית של צנטריפוגה (כדי למנוע פגיעה במבני מקף), יש לנקוט בזהירות כדי למנוע אובדן תאים במהלך שלבי כשל חיסוני בפרוטוקול זה.

שיטות חלופיות כדי לדמיין hyphae פטרייתי במערכת העיכול שימשו בעבר, עם יתרונות ומגבלות מסוימים הקשורים לכל שיטה. שיטה אחת בולטת יחסית באמצעות פלואורסצנט בהכלאה situ (FISH) כדי לדמיין היפים פטרייתיים במערכת העיכול הוכח לאחרונה על ידי Witchley et al.61,62. זוהי שיטת in vivo מבטיחה הזמינה כיום לגילוי C. albicans hyphae ישירות במערכת העיכול, אולם המורכבות של פרוטוקול זה מקשה על התאמתו למחקרי סינון ראשוניים מהירים וגדולים. שיטות היסטופתולוגיה מסורתיות שימשו גם בעבר כדי חיוני C. albicans שמרים וצורות hyphae במערכת העיכול. עם זאת, תצפית והדמיה של תאים פטרייתיים עם היסטופתולוגיה בסיסית, וכתמי המטוקסילין ואאוסין (H/E) עדיין מאתגרים, אולם לשיטות קיבוע סטנדרטיות רבות יש פוטנציאל לשבש את שכבת הריר של דגימות מערכת העיכול, לעתים קרובות מזיקים למבניהמקף בתהליךומובילים לדיווחים סותרים על השפע היחסי של מורפולוגיה של תאי מקףבמהלך זיהום 63,64,65,66. שיטה זו פותחה כדי למנוע נזק hyphae במהלך העיבוד כדי לטפל בבעיה זו. בנוסף, explants רקמות שימשו כדרך לבחון את התנאים הביולוגיים ex vivo, אולם שיטות אלה הם בדרך כלל ממוקדים ושימושיים לבחינת פוטנציאל הדבקות או הפלישה של C. albicans67, אבל גם הם בדרך כלל להוציא את רוב מטבולומיים ורכיבי מיקרוביום התורמים in vivo פתוגנזה. למרות פרוטוקול ex vivo המתואר כאן אינו מחקה לחלוטין בסביבת VIVO GI כמתוארבעבר 61,62, הוא מספק את התנאים הקרובים ביותר האפשריים כי C. albicans נתקל בסביבת המעיים לעומת שיטות במבחנה באמצעות תנאי צמיחה מלאכותיים.

פרוטוקול זה יכול לשמש בדיקות סינון בסיסיות כדי לזהות את ההשפעה של אותות סביבתיים במערכת העיכול על C. אלביקנים מקף מורפוגנזה. שיטה זו מאפשרת קבוצות גדולות של תרכובות כולל מעכבי מולקולה קטנה, antimycotics הרומן, מטבוליטים להיות מוקרן במהירות להתפתחות מקף, והוא יכול לשמש סינון טיפולים טיפוליים או זיהוי גורמי סיכון למחלות מערכתיות. מאז C. albicans מתיישב בכל מערכת העיכול, פרוטוקול זה יסייע עוד יותר בזיהוי האותות הסביבתיים הקיימים בחלקים הספציפיים של מערכת העיכול כי לשלוט morphogenesis מקף אצל אנשים לוקחים אנטיביוטיקה, סוכנים כימותרפיים, ובחולים עם הפרעות מטבוליות כולל סוכרת. בסופו של דבר השיטה המתוארת כאן מאפשרת אפיון מהיר של מורפיום ב- C. albicans על פני מגוון רחב של גורמים סביבתיים באופן רלוונטי יותר מבחינה ביולוגית מאשר שיטות במבחנה הנוכחי והוא מהיר משמעותית ומשאב יעיל יותר מאשר שיטות vivo הנוכחי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין אינטרסים פיננסיים מתחרים או ניגודי אינטרסים אחרים.

Acknowledgments

המחברים מכירים במשאבים ותמיכה ממכון מחקר הליבה התאית והמולקולרית של אוניברסיטת המערב התיכון.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 - 10 µL Pipet Tips Fisher Scientific 02-707-454 Misc
100 - 1000 µL Pipet Tips Fisher Scientific 02-707-400 Misc
20 - 200 µL Pipet Tips Fisher Scientific 02-707-451 Misc
2-methylbutyric acid Sigma 193070-25G hyphal-inhibitory compound
488 goat anti-rabbit IgG Invitrogen (Fisher) A11008 IF Staining secondary ab
Agar Fisher BP1423-500 YPD agar component
Automated Imaging Microscope Keyence BZX700
Candida Albicans Antibody Invitrogen (Fisher) PA1-27158 IF Staining primary ab
cefoperazone Cayman 16113 antibiotic
deoxycholic acid Sigma 30960 hyphal-inhibitory compound
D-Glucose Fisher D16-500 hyphal-promoting compound
forceps Fisher 08-885
lactic acid Alfa Aesar AAAL13242-06 hyphal-inhibitory compound
lithocholic acid Sigma L6250-10G hyphal-inhibitory compound
palmitic acid Sigma P5585-10G hyphal-inhibitory compound
Paraformaldehyde Alfa Aesar A11313 IF Staining fixative
Phosphate-buffered saline (PBS), 10x Alfa Aesar J62692 PBS component
p-tolylacetic acid SCBT sc-257959 hyphal-inhibitory compound
sebacic acid Sigma 283258-250G hyphal-inhibitory compound
sharp ended scissors Fisher 28301
sterile Milli-Q water N/A N/A Misc
YPD Broth BD Biosciences 242810 YPD agar component

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huffnagle, G. B., Noverr, M. C. The emerging world of the fungal microbiome. Trends in Microbiology. 21 (7), 334-341 (2013).
  2. Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clinical Infectious Diseases. 39 (3), 309-317 (2004).
  3. Hajjeh, R. A., et al. Incidence of Bloodstream Infections Due to Candida Species and In Vitro Susceptibilities of Isolates Collected from 1998 to 2000 in a Population-based Active Surveillance Program. Journal of Clinical Microbiology. 42 (4), 1519-1527 (2004).
  4. Lockhart, S. R., et al. Species Identification and Antifungal Susceptibility Testing of Candida Bloodstream Isolates from Population-Based Surveillance Studies in Two U.S. Cities from 2008 to 2011. Journal of Clinical Microbiology. 50 (11), 3435-3442 (2012).
  5. Pfaller, M., et al. Epidemiology and outcomes of candidemia in 3648 patients: data from the Prospective Antifungal Therapy (PATH Alliance(R)) registry, 2004-2008. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 74 (4), 323-331 (2012).
  6. Angarone, M. Fungal infections in cancer patients. Cancer Treatment and Research. 161, 129-155 (2014).
  7. Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), 113 (2012).
  8. Calton, E. A., et al. Invasive bacterial and fungal infections in paediatric patients with cancer: incidence, risk factors, aetiology and outcomes in a UK regional cohort 2009-2011. Pediatric Blood & Cancer. 61 (7), 1239-1245 (2014).
  9. Carter, J. H., et al. Medical management of invasive fungal infections of the central nervous system in pediatric cancer patients. Pediatric Blood & Cancer. 62 (6), 1095-1098 (2015).
  10. Low, C. Y., Rotstein, C. Emerging fungal infections in immunocompromised patients. F1000 Medicine Reports. 3, 14 (2011).
  11. Mousset, S., et al. Treatment of invasive fungal infections in cancer patients-updated recommendations of the Infectious Diseases Working Party (AGIHO) of the German Society of Hematology and Oncology (DGHO). Annals of Hematology. 93 (1), 13-32 (2014).
  12. Perfect, J. R., Hachem, R., Wingard, J. R. Update on epidemiology of and preventive strategies for invasive fungal infections in cancer patients. Clinical Infectious Diseases. 59, Suppl 5 352-355 (2014).
  13. Sipsas, N. V., Kontoyiannis, D. P. Invasive fungal infections in patients with cancer in the Intensive Care Unit. International Journal of Antimicrobial Agents. 39 (6), 464-471 (2012).
  14. Falagas, M. E., Apostolou, K. E., Pappas, V. D. Attributable mortality of candidemia: a systematic review of matched cohort and case-control studies. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 25 (7), 419-425 (2006).
  15. Chi, H. W., et al. Candida albicans versus non-albicans bloodstream infections: the comparison of risk factors and outcome. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 44 (5), 369-375 (2011).
  16. Drell, T., et al. Characterization of the vaginal micro- and mycobiome in asymptomatic reproductive-age Estonian women. PLoS One. 8 (1), 54379 (2013).
  17. Merenstein, D., et al. Colonization by Candida species of the oral and vaginal mucosa in HIV-infected and noninfected women. AIDS Research and Human Retroviruses. 29 (1), 30-34 (2013).
  18. Ghannoum, M. A., et al. Characterization of the oral fungal microbiome (mycobiome) in healthy individuals. PLoS Pathogens. 6 (1), 1000713 (2010).
  19. Hoffmann, C., et al. Archaea and fungi of the human gut microbiome: correlations with diet and bacterial residents. PLoS One. 8 (6), 66019 (2013).
  20. Noble, S. M., Gianetti, B. A., Witchley, J. N. Candida albicans cell-type switching and functional plasticity in the mammalian host. Nature Reviews Microbiology. 15 (2), 96-108 (2017).
  21. Samonis, G., et al. Prospective evaluation of effects of broad-spectrum antibiotics on gastrointestinal yeast colonization of humans. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 37 (1), 51-53 (1993).
  22. Sahni, V., et al. Candidemia--an under-recognized nosocomial infection in Indian hospitals. The Journal of the Association of Physicians of India. 53, 607-611 (2005).
  23. Meijer-Severs, G. J., Joshi, J. H. The effect of new broad-spectrum antibiotics on faecal flora of cancer patients. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 24 (4), 605-613 (1989).
  24. Kennedy, M. J., Volz, P. A., Edwards, C. A., Yancey, R. J. Mechanisms of association of Candida albicans with intestinal mucosa. Journal of Medical Microbiology. 24 (4), 333-341 (1987).
  25. Miranda, L. N., et al. Candida colonisation as a source for candidaemia. Journal of Hospital Infections. 72 (1), 9-16 (2009).
  26. Nucci, M., Anaissie, E. Revisiting the source of candidemia: skin or gut. Clinical Infectious Diseases. 33 (12), 1959-1967 (2001).
  27. Raponi, G., Visconti, V., Brunetti, G., Ghezzi, M. C. Clostridium difficile infection and Candida colonization of the gut: is there a correlation. Clinical Infectious Diseases. 59 (11), 1648-1649 (2014).
  28. Guastalegname, M., Russo, A., Falcone, M., Giuliano, S., Venditti, M. Candidemia subsequent to severe infection due to Clostridium difficile: is there a link. Clinical Infectious Diseases. 57 (5), 772-774 (2013).
  29. Nerandzic, M. M., Mullane, K., Miller, M. A., Babakhani, F., Donskey, C. J. Reduced acquisition and overgrowth of vancomycin-resistant enterococci and Candida species in patients treated with fidaxomicin versus vancomycin for Clostridium difficile infection. Clinical Infectious Diseases. 55, Suppl 2 121-126 (2012).
  30. Krause, R., Krejs, G. J., Wenisch, C., Reisinger, E. C. Elevated fecal Candida counts in patients with antibiotic-associated diarrhea: role of soluble fecal substances. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 10 (1), 167-168 (2003).
  31. Krause, R., et al. Role of Candida in antibiotic-associated diarrhea. The Journal of Infectious Diseases. 184 (8), 1065-1069 (2001).
  32. Zuo, T., et al. Gut fungal dysbiosis correlates with reduced efficacy of fecal microbiota transplantation in Clostridium difficile infection. Nature Communications. 9 (1), 3663 (2018).
  33. Delaloye, J., Calandra, T. Invasive candidiasis as a cause of sepsis in the critically ill patient. Virulence. 5 (1), 161-169 (2014).
  34. Cole, G. T., Halawa, A. A., Anaissie, E. J. The role of the gastrointestinal tract in hematogenous candidiasis: from the laboratory to the bedside. Clinical Infectious Diseases. 22, Suppl 2 73-88 (1996).
  35. Lo, H. J., et al. Nonfilamentous C. albicans mutants are avirulent. Cell. 90 (5), 939-949 (1997).
  36. Gale, C. A., et al. Linkage of adhesion, filamentous growth, and virulence in Candida albicans to a single gene, INT1. Science. 279 (5355), 1355-1358 (1998).
  37. Bendel, C. M., et al. Systemic infection following intravenous inoculation of mice with Candida albicans int1 mutant strains. Molecular genetics and metabolism. 67 (4), 343-351 (1999).
  38. Toenjes, K. A., et al. Small-molecule inhibitors of the budded-to-hyphal-form transition in the pathogenic yeast Candida albicans. Antimicrobial agents and chemotherapy. 49 (3), 963-972 (2005).
  39. Carlisle, P. L., et al. Expression levels of a filament-specific transcriptional regulator are sufficient to determine Candida albicans morphology and virulence. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (2), 599-604 (2009).
  40. Fazly, A., et al. Chemical screening identifies filastatin, a small molecule inhibitor of Candida albicans adhesion, morphogenesis, and pathogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (33), 13594-13599 (2013).
  41. Pande, K., Chen, C., Noble, S. M. Passage through the mammalian gut triggers a phenotypic switch that promotes Candida albicans commensalism. Nature genetics. 45 (9), 1088 (2013).
  42. Bar-Yosef, H., Gonzalez, N. V., Ben-Aroya, S., Kron, S. J., Kornitzer, D. Chemical inhibitors of Candida albicans hyphal morphogenesis target endocytosis. Scientific reports. 7 (1), 5692 (2017).
  43. Mendelsohn, S., Pinsky, M., Weissman, Z., Kornitzer, D. Regulation of the Candida albicans hypha-inducing transcription factor Ume6 by the CDK1 cyclins Cln3 and Hgc1. mSphere. 2 (2), 00248 (2017).
  44. Vila, T., et al. Targeting Candida albicans filamentation for antifungal drug development. Virulence. 8 (2), 150-158 (2017).
  45. Pande, K., Chen, C., Noble, S. M. Passage through the mammalian gut triggers a phenotypic switch that promotes Candida albicans commensalism. Nature Genetics. 45 (9), 1088-1091 (2013).
  46. Lo, H. J., et al. Nonfilamentous C. albicans mutants are avirulent. Cell. 90 (5), 939-949 (1997).
  47. Bar-Yosef, H., Vivanco Gonzalez, N., Ben-Aroya, S., Kron, S. J., Kornitzer, D. Chemical inhibitors of Candida albicans hyphal morphogenesis target endocytosis. Scientific Reports. 7 (1), 5692 (2017).
  48. Carlisle, P. L., et al. Expression levels of a filament-specific transcriptional regulator are sufficient to determine Candida albicans morphology and virulence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (2), 599-604 (2009).
  49. Mendelsohn, S., Pinsky, M., Weissman, Z., Kornitzer, D. Regulation of the Candida albicans Hypha-Inducing Transcription Factor Ume6 by the CDK1 Cyclins Cln3 and Hgc1. mSphere. 2 (2), (2017).
  50. Bendel, C. M., et al. Effects of Alteration of the Candida albicans Gene INT1 on Cecal Colonization in Orally Innoculated Mice. Pediatric Research. 45, 156 (1999).
  51. Gale, C. A., et al. Linkage of adhesion, filamentous growth, and virulence in Candida albicans to a single gene, INT1. Science. 279 (5355), 1355-1358 (1998).
  52. Toenjes, K. A., et al. Small-molecule inhibitors of the budded-to-hyphal-form transition in the pathogenic yeast Candida albicans. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (3), 963-972 (2005).
  53. Fazly, A., et al. Chemical screening identifies filastatin, a small molecule inhibitor of Candida albicans adhesion, morphogenesis, and pathogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13594-13599 (2013).
  54. Naseem, S., Gunasekera, A., Araya, E., Konopka, J. B. N-acetylglucosamine (GlcNAc) induction of hyphal morphogenesis and transcriptional responses in Candida albicans are not dependent on its metabolism. Journal of Biological Chemistry. 286 (33), 28671-28680 (2011).
  55. Piispanen, A. E., Hogan, D. A. PEPped up: induction of Candida albicans virulence by bacterial cell wall fragments. Cell Host & Microbe. 4 (1), 1-2 (2008).
  56. Xu, X. L., et al. Bacterial peptidoglycan triggers Candida albicans hyphal growth by directly activating the adenylyl cyclase Cyr1p. Cell Host & Microbe. 4 (1), 28-39 (2008).
  57. Guinan, J., Thangamani, S. Antibiotic-induced alterations in taurocholic acid levels promote gastrointestinal colonization of Candida albicans. FEMS microbiology letters. 365 (18), (2018).
  58. Guinan, J., Villa, P., Thangamani, S. Secondary bile acids inhibit Candida albicans growth and morphogenesis. Pathogens and disease. 76 (3), (2018).
  59. Guinan, J., Wang, S., Hazbun, T. R., Yadav, H., Thangamani, S. Antibiotic-induced decreases in the levels of microbial-derived short-chain fatty acids correlate with increased gastrointestinal colonization of Candida albicans. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
  60. Gutierrez, D., et al. Antibiotic-induced gut metabolome and microbiome alterations increase the susceptibility to Candida albicans colonization in the gastrointestinal tract. FEMS microbiology ecology. 96 (1), 187 (2020).
  61. Witchley, J. N., et al. Candida albicans morphogenesis programs control the balance between gut commensalism and invasive infection. Cell Host & Microbe. 25 (3), 432-443 (2019).
  62. Witchley, J. N., Penumetcha, P. M., Noble, S. M. Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (153), e60283 (2019).
  63. Johansson, M. E., Hansson, G. C. Preservation of mucus in histological sections, immunostaining of mucins in fixed tissue, and localization of bacteria with FISH. Mucins. , Springer. 229-235 (2012).
  64. Lossinsky, A. S., et al. The histopathology of Candida albicans invasion in neonatal rat tissues and in the human blood-brain barrier in culture revealed by light, scanning, transmission and immunoelectron microscopy scanning. Histology and histopathology. , (2006).
  65. Rosenbach, A., Dignard, D., Pierce, J. V., Whiteway, M., Kumamoto, C. A. Adaptations of Candida albicans for growth in the mammalian intestinal tract. Eukaryotic Cell. 9, 1075-1086 (2010).
  66. Vautier, S., et al. C andida albicans colonization and dissemination from the murine gastrointestinal tract: the influence of morphology and T h17 immunity. Cellular Microbiology. 17, 445-450 (2015).
  67. Lyman, C., Navarro, E., Garrett, K., Roberts, D., Pizzo, P., Walsh, T. Adherence of Candida albicans to bladder mucosa: development and application of a tissue explant assay. Mycoses. 42, 255-259 (1999).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 161 קנדידה אלביקנים מורפוגנזה מקפית ex vivo assay גלוקוז חומצות מרה משניות ודרכי GI
Ex vivo Assay לחקר <em>קנדידה אלביקנים</em> מקף מורפוגנזה במערכת העיכול
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Monasky, R., Villa, S., Thangamani,… More

Monasky, R., Villa, S., Thangamani, S. An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract. J. Vis. Exp. (161), e61488, doi:10.3791/61488 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter