Summary
Il saggio ex vivo descritto in questo studio utilizzando estratti di omogenato intestinale e colorazione ad immunofluorescenza rappresenta un nuovo metodo per esaminare la morfogenesi iftale degli albicani Candida nel tratto GASTROINTESTINALe. Questo metodo può essere utilizzato per indagare i segnali ambientali che regolano la transizione morfogenetica nell'intestino.
Abstract
La morfogenesi ifobica candida albicans nel tratto gastrointestinale (IG) è strettamente controllata da vari segnali ambientali e svolge un ruolo importante nella diffusione e nella patogenesi di questo patogeno fungino opportunistico. Tuttavia, i metodi per visualizzare l'ife fungina nel tratto GASTROINTESTINAL in vivo sono impegnativi che limita la comprensione dei segnali ambientali nel controllo di questo processo di morfogenesi. Il protocollo qui descritto dimostra un nuovo metodo ex vivo per la visualizzazione della morfogenesi ifale negli estratti di omogenato intestinale. Utilizzando un saggio ex vivo, questo studio dimostra che il contenuto di cecal da topi trattati con antibiotici, ma non da topi di controllo non trattati, promuove la morfogenesi ifale C. albicans nel contenuto intestinale. Inoltre, l'aggiunta di gruppi specifici di metaboliti intestinali al contenuto di cecal da topi trattati con antibiotici regola in modo differenziato la morfogenesi ifogenesi ex vivo. Nel complesso, questo protocollo rappresenta un nuovo metodo per identificare e indagare i segnali ambientali che controllano la morfogenesi ifale di C. albicans nel tratto GASTROINTESTINALe.
Introduction
Candida albicans è un patogeno fungino opportunistico e polimorfico che normalmente è commensale, ma può subire un cambiamento morfologico in una forma virulento in grado di causare infezioni potenzialmente letali in individui immunocompromati1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. C. albicans è una delle principali cause di infezioni nosocomiali sistemiche, con un tasso di mortalità del 40\u201260% anche con trattamento antimicotico2,14,15. Sebbene C. albicans risieda in diverse nicchie ospiti tra cui il sistema riproduttivofemminile 16,17, la cavità orale di individuisani 18 e il tratto gastrointestinale (GI)19,20, la maggior parte delle infezioni sistemiche provengono dal tratto GASTROINTESTINALe e inoltre, la fonte dell'infezione sistemica è spesso confermata come il trattoGASTROINTESTINAL 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34. C. la patogenicità degli albicani nel tratto gastrointestinale è influenzata da un'ampia gamma di fattori; tuttavia, una delle principali caratteristiche necessarie per la virulenza è il passaggio da una morfologia cellulare di lievito a una morfologia virulento delle cellule ifali35,36,37,38,39,40,41,42,43,44. C. l'attaccamento e la diffusione degli albicani dal tratto gastrointestinale durante l'infezione è altamente associato alla sua capacità di passare da un lievito commensale in ife virulenti, consentendo ai funghi di causare malattie invasive44,45,46,47,48,49,50,51,52,53.
Una varietà di fattori nell'intestino, tra cui n-acetilglucosamina, regolano la formazione ifale di C. albicans. Pertanto, è fondamentale ridurre il divario di conoscenza per quanto riguarda la morfogenesi ifale di questo agente patogeno fungino nel trattoGASTROINTESTINAL 54,55,56. Recenti prove indicano che vari metaboliti intestinali controllano in modo differenziato la morfogenesi ifale di C. albicans in vitro57,58,59,60. Tuttavia, i vincoli tecnici presentano problemi quando si tenta di studiare la formazione di ife di C. albicans in campioni intestinali in vivo, in particolare la colorazione di lieviti e cellule ife e l'analisi quantitativa dello sviluppo ifale. Per comprendere la morfogenesi ifobia di C. albicans nel tratto GASTROINTESTINAL, è stato sviluppato un metodo ex vivo utilizzando estratti solubili di contenuto intestinale omogeneizzato dai topi per studiare l'effetto dei metaboliti sulla morfogenesi ifossica fungina. Utilizzando campioni intestinali di topi resistenti e suscettibili all'infezione da GI C. albicans, questo metodo aiuterà a identificare e studiare l'effetto di metaboliti, antibiotici e xenobiotici sulla morfogenesi ifossica fungina nel tratto GASTROINTESTINALe.
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Protocol
Tutti i protocolli sugli animali sono stati approvati dal Midwestern University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) come descritto primadel 57. Il Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Midwest University ha approvato questo studio nell'ambito del protocollo MWU IACUC #2894. Le politiche di assistenza agli animali del MWU seguono la politica del Servizio sanitario pubblico (PHS) sulla cura e l'uso umano degli animali da laboratorio e le politiche stabilite nella legge sul benessere degli animali (AWA).
1. I topi studiano il protocollo standard
- Utilizzare topi C57BL/6J maschi e femmine di almeno sei settimane. Completarli con acqua sterile con o senza cefoperazone (0,5 mg/mL).
- Co-house topi in gruppi di 5, con ogni gabbia contenente tutti i topi maschi o tutti femmine. Fornire ai topi il chow standard del mouse e l'acqua (tramite una bottiglia da 400 ml) in ogni momento.
- Controlla le gabbie ogni giorno per garantire che i livelli di cibo e acqua siano sufficienti e per esaminare i topi alla ricerca di segni di angoscia.
- Sostituire l'acqua con cefoperazone ogni 48 ore per assicurarsi che venga fornito antibiotico fresco indipendentemente dall'acqua rimanente nelle bottiglie di alimentazione della gabbia.
- Dopo 5\u20127 giorni di trattamento cefoperazone, eutanasiare i topi tramite asfissia di CO2 osservando il protocollo IACUC stabilito. Confermare la morte tramite lussazione cervicale.
- Sezionare i topi usando forbici affilate sterilizzate in autoclave e forcep sterilizzate in autoclave.
- Dopo l'eutanasia, fissare l'animale su una superficie di dissezione inchiodando tutti gli arti in modo che l'addome sia esposto.
- Spruzzare la regione addominale con il 70% di etanolo per evitare che la pelliccia si attacchi a forcep, forbici o sezioni intestinali durante la dissezione.
- Utilizzare le forcep per pizzicare e sollevare una sezione di pelle alla base dell'addome e creare una piccola incisione attraverso la pelle e la fascia sottostante usando le forbici. Fai molta attenzione quando fai questa incisione per evitare di forare il cieco o la parete intestinale.
- Estendere questo taglio alla gabbia toracica, esponendo parzialmente la cavità peritoneale. Effettuare un taglio a partire dal punto dell'incisione iniziale su entrambi i lati che si estende verso l'alto e lateralmente.
- Tirare questi lembi lateralmente e perno sulla superficie di sezionatura per esporre completamente la cavità peritoneale.
- Estrarre il tratto GI usando le forcep, mentre si usano le forbici per effettuare tagli superiori allo stomaco e nella regione distale dell'intestino crasso per garantire la raccolta della massima quantità di contenuto intestinale da ogni sezione.
- Quando si rimuove il tratto GI, fare attenzione a evitare di rupturing i singoli componenti. Separare lo stomaco, l'intestino tenue, il cieco e l'intestino crasso singolarmente usando le forbici alle estremità prossimali e distali.
- Per la raccolta di ogni contenuto intestinale da ogni sezione, effettuare una singola incisione all'estremità distale di ogni sezione utilizzando forbici, seguita dall'espulsione manuale del contenuto intestinale in un tubo di microcentrifugo da 1,5 ml utilizzando forcep.
- Conservare il contenuto intestinale a -80 °C per i saggi ex vivo.
2. Preparazione di piastre di agar di estratto di lievito-peptone-destrosio (YPD)
- Ad una bottiglia di vetro da 1 L aggiungere 25 g di estratto di lievito peptone-destrosio brodo in polvere, 10 g di agar e acqua ultrapura ad un volume finale di 500 mL.
- Autoclave a 121 °C per 30 minuti su un ciclo liquido per sterilizzare il supporto.
- Sotto una cappa di flusso laminare, versare circa 20 mL di mezzi di agar in una piastra di Petri sterile. 500 mL di supporti di agar devono produrre circa 25 piastre.
- Conservare le lastre a 4 °C fino a quando non sono pronte per l'uso.
3. Preparazione ex vivo per test di morfogenesi ifale
- Striare una nuova coltura di C. albicans SC5314 su una piastra di agar YPD e incubare durante la notte a 30 °C.
- Scegli da due a tre colonie individuali di medie dimensioni dalla coltura di C. albicans SC5314 coltivata durante la notte e riasspendi in 1 mL di salina tamponata di fosfato (PBS).
- Recuperare il contenuto intestinale congelato dal congelatore -80 °C e scongelare a 25 °C.
- Pesare circa 150 mg di contenuto intestinale in un nuovo tubo da 1,5 ml.
- Sospendere di nuovo il contenuto intestinale con 150 μL di PBS (contenuto intestinale e PBS con un rapporto peso/volume di 1:1).
- Vortice ad alta velocità per 30 s per omogeneizzare il contenuto intestinale e consentire di sedersi a temperatura ambiente per circa un minuto.
- Centrifugare gli omogeneati a 1000 x g per 3 min.
- Trasferire il supernatante su un nuovo tubo da 1,5 ml.
- Ripetere i passaggi 3.7 e 3.8 per rimuovere tutti i detriti nel supernatante.
- Aggiungere 10 μL dell'inoculo C. albicans SC5314 preparato sopra a questo supernatante
- Mescolare bene e incubare a 37 °C per 4-5 ore.
4. Aggiunta esogena di metaboliti agli estratti di omogenato intestinale per il saggio di morfogenesi ifogena
- Recuperare il contenuto intestinale congelato dal congelatore -80 °C e ri-sospeso in PBS con un rapporto 1:1 (peso: volume).
- Aggiungere la concentrazione desiderata di metaboliti intestinali al contenuto intestinale e alla miscela PBS.
- Vortice ad alta velocità per 30 s per omogeneizzare il contenuto intestinale contenente metaboliti e lasciare riposare a temperatura ambiente per circa 10 min.
- Centrifugare gli omogeneati a 1000 x g per 3 min.
- Trasferire il supernatante su un nuovo tubo da 1,5 ml. Ripetere i passaggi 4.4 e 4.5 per rimuovere tutti i detriti nel supernatante.
- Aggiungere 10 μL dell'inoculo C. albicans SC5314 preparato sopra a questo supernatante. Mescolare bene e incubare a 37 °C per 4-5 ore.
5. Test di morfogenesi C. albicans (immunostaining e imaging)
- Centrifugare i campioni a 1000 x g per 2 minuti e scartare il supernatante tramite pipettaggio.
- Fissare i campioni in 100 μL di paraformaldeide al 2% (PFA) per 15 min.
- Centrifugare a 1000 x g per 2 minuti e scartare il supernatante tramite pipettaggio.
- Lavare i campioni due volte con 1 mL di PBS. Per lavare i campioni, sospendere di nuovo il pellet in PBS tubazione delicatamente. Non vortice il campione in quanto ciò può danneggiare le strutture ifali. Dopo la riaspensione, centrifugare a 1000 x g per 2 minuti e scartare il supernatante tramite pipettaggio.
- Incubare i campioni a temperatura ambiente in 100 μL di PBS contenente anticorpo policlonale C. albicans (diluizione 1:100) per 30 min.
- Lavare i campioni tre volte con 1 mL di PBS.
NOTA: Quando si utilizza un anticorpo fluorescente, si consiglia di eseguire tutte le fasi di diluizione e lavaggio in condizioni di scarsa illuminazione per evitare lo sbiancamento fotografico e migliorare la longevità del campione. - Incubare i campioni a temperatura ambiente per 15 minuti in 100 μL di PBS contenente anticorpo anti-Coniglio IgG Alexafluor 488 a 1:500 diluizione. Eseguire l'incubazione in un cassetto o in una stanza buia per evitare lo sbiancamento delle foto.
- Lavare i campioni tre volte con 1 mL di PBS.
- Sospendere di nuovo i campioni in 100 μL di PBS e trasferirli su una piastra da 96 pomp po' per l'imaging.
NOTA: Quando non viene immaginato, si consiglia di avvolgere la piastra da 96 pozzi in un foglio di alluminio per evitare lo sbiancamento fotografico. - Immagini cellule fungine che utilizzano lenti obiettivo 20x e 40x utilizzando un microscopio per immagini a fluorescenza. Utilizzare un filtro proteico fluorescente verde (GFP) (lunghezza d'onda di eccitazione 470/40 e lunghezza d'onda di emissione 525/50) per rilevare la fluorescenza.
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Representative Results
Questi risultati, insieme ai precedenti risultati del laboratorio Thangamani60, indicano che quando C. albicans viene coltivato ex vivo in estratti di omogenato intestinale prelevati dallo stomaco, dall'intestino tenue e dall'intestino crasso di controllo non trattato e topi trattati con antibiotici, C. albicans si sviluppa generalmente con una morfologia del lievito(figura 1B). Tuttavia, se coltivato nell'estratto cecale di topi trattati con antibiotici, C. albicans subisce prontamente la morfogenesi, risultando in campioni contenenti lievito e forme di ife(figura 1B); questo non si verifica nei topi di controllo. Ciò supporta i risultati precedenti, che hanno mostrato un aumento significativo delle forme di ife in campioni coltivati in estratti cecali trattati con antibiotici, ma non in altri estratti intestinali trattati con antibiotici60. Questi risultati suggeriscono che il trattamento antibiotico causa cambiamenti nell'ambiente cecale, che inducono morfogenesi ifale di C. albicans. Inoltre, la localizzazione specifica di questo fenotipo notato solo nel cieco suggerisce anche che queste condizioni di promozione delle ife potrebbero non essere necessariamente presenti in tutto il tratto GASTROINTESTINAL, ma sono invece limitate a segmenti specifici del tratto GASTROINTESTINAL a seconda della disponibilità di nutrienti, metaboliti e altre molecole sconosciute.
Poiché l'estratto di topi trattati con antibiotici promuove la morfogenesi di C. albicans57,58,59,60, abbiamo esaminato se l'aggiunta esogena di un gruppo selezionato di metaboliti intestinali (identificati da precedenti studi in vitro) al contenuto cecale di topi trattati con cef influenzerà la morfogenesi di C. albicans ex vivo. Precedenti lavori eseguiti dal laboratorio Thangamani hanno caratterizzato il profilo metabolomico dell'omogeneato a contenuto cecale estratto da topi non trattati e trattati con antibiotici, rivelando cambiamenti significativi nell'abbondanza di vari metaboliti a seguito del trattamento antibiotico, in particolare la diminuzione dell'abbondanza di acidi biliari secondari e l'aumento dell'abbondanzadi carboidrati 60. Inoltre, questo studio ha identificato che gli acidi biliari secondari e gli acidi carbossilici inibiscono lo sviluppo delle ife, mentre i carboidrati, incluso il glucosio, promuovono la morfogenesi ifale di C. albicans in vitro60. I risultati indicano che l'aggiunta di un pool di metaboliti intestinali inibitori contenenti acido deossicolico (DCA, 0,5 mg/mL), acido litocolico (LCA, 0,1 mg/mL), acido palmitico (0,1 mg/mL), acido p-totilacetico (0,1 mg/mL), acido sebacico (0,5 mg/mL), L'acido 2-metilbutirrico (0,5 mg/mL) e l'acido lattico (5 mg/mL) all'omogeneato cecale dei topi trattati con cef hanno completamente inibito la morfogenesi ifale ex vivo. D'altra parte, l'aggiunta esogena di glucosio (1 mg/mL) all'omogeneato cecale dei topi trattati con cef ha mostrato un massiccio sviluppo iffiale ex vivo (Figura 2B). Collettivamente, questi risultati indicano che l'aggiunta di metaboliti intestinali all'omogeneato cecale dei topi trattati con cef regola in modo differenziato la morfogenesi di C. albicans, confermando così precedenti risultati in vitro. Questi risultati indicano che i metaboliti intestinali svolgono un ruolo critico nella morfogenesi ifobica dei C. albicans e comprendere gli obiettivi genetici e le vie di segnalazione modulate da questi metaboliti aiute aiviene lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici per prevenire e trattare le infezioni da C. albicans.
Figura 1: Saggio ex vivo per determinare l'effetto del trattamento con cefoperazone sulla morfogenesi ifale C. albicans nel contenuto intestinale. (A) Schema schematico del protocollo. (B) Il contenuto intestinale trattato con antibiotici (pannelli superiore) e non trattati (pannelli inferiori) è stato prelevato dallo stomaco, dall'intestino tenue, dal cieco e dall'intestino crasso dei topi C57BL/6J. Il contenuto intestinale inoculato con C. albicans SC5314 è stato incubato a 37 °C per 4\u20125 h e macchiato con anticorpo C. albicans. Le celle sono state immagini con ingrandimento 40x. Le immagini rappresentative sono mostrate qui. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Aggiunta esogena di metaboliti intestinali al contenuto di cef da topi trattati con cef sulla formazione di ife di C. albicans ex vivo. (A) Schema schematico del protocollo. (B) Pool di metaboliti intestinali inibitori contenenti DCA (0,5 mg/mL), LCA (0,1 mg/mL), acido palmitico (0,1 mg/mL), acido p-totilacetico (0,1 mg/mL), acido sebacico (0,5 mg/mL); L'acido 2-metilbutirrico (0,5 mg/mL) e l'acido lattico (5 mg/mL) o il glucosio (1 mg/mL) sono stati aggiunti al contenuto cecale di topi trattati con cef, miscelati accuratamente e incubati a 37 °C per 15 minuti per effettuare il saggio ex vivo hyphae. Il contenuto di Cecal inoculato con C. albicans SC5314 è stato incubato a 37 °C per 4\u20125 h e macchiato con anticorpo C. albicans. Le celle sono state immagini con ingrandimento 40x. Le immagini rappresentative sono mostrate qui. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il metodo qui descritto presenta un nuovo modo per indagare l'effetto degli impatti antibiotici, dietetici, xenobiotici e terapeutici sulla morfogenesi ifale di C. albicans nel tratto GASTROINTESTINALe. Poiché la maggior parte delle infezioni sistemiche proviene dal trattogastrointestinale 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34 e la formazione di ife è un fattore critico di virulenza che promuove la diffusione di C. gli albicani del tratto GASTROINTESTINAL, comprendendo i fattori che controllano questa morfogenesi nel tratto gastrointestinale amplieranno la conoscenza dei meccanismi di patogenesi e identificheranno nuove opzioni di trattamento.
Sebbene il metodo qui presentato sia relativamente semplice, alcuni passaggi discussi di seguito sono stati identificati come critici e importanti. ( i) L'inoculo iniziale di C. albicans dovrebbe essere ottimale per consentire sia la crescita che la morfogenesi ipale dei funghi. Con la limitata disponibilità di nutrienti negli estratti di omogeneato intestinale, un volume maggiore di inoculo può ridurre significativamente la crescita fungina e il processo di morfogenesi. Tuttavia, è probabile che la crescita di diversi isolati clinici e ceppi sia variabile, quindi è essenziale ottimizzare il tempo di inoculo e incubazione per specifici isolati di C. albicans. (ii) Sono risultati cruciali più passaggi di centrifugazione durante la preparazione dell'estratto di omogeneato intestinale per rimuovere il più possibile i detriti nel contenuto intestinale. iii) A causa della velocità relativamente bassa della centrifugazione (per evitare di danneggiare le strutture ifali), occorre fare attenzione ad evitare la perdita di cellule durante le fasi di immunosottenzione del presente protocollo.
In passato sono stati utilizzati metodi alternativi per visualizzare le ife fungine nel tratto GASTROINTESTINAL, con alcuni vantaggi e limitazioni associati a ciascun metodo. Un metodo relativamente notevole che utilizza l'ibridazione fluorescente in situ (FISH) per visualizzare le ife fungine nel tratto GASTROINTESTINAL è stato recentemente dimostrato da Witchley etal. Si tratta di un metodo in vivo promettente attualmente disponibile per rilevare le ife di C. albicans direttamente nel tratto GASTROINTESTINAL, tuttavia la complessità di questo protocollo rende difficile adattarlo a studi di screening iniziali rapidi e su larga scala. I metodi istopatologia tradizionali sono stati utilizzati anche in passato per vitalizzare il lievito di C. albicans e le forme di ife nel tratto GASTROINTESTINALe. Tuttavia, l'osservazione e l'imaging di cellule fungine con istopatologia di base, e macchie di ematossilina ed eosina (H / E) rimangono impegnative, poiché molti metodi di fissazione standard hanno il potenziale per interrompere lo strato mucoso dei campioni del tratto GASTROINTESTINALe, spesso danneggiando le strutture ifali nel processo e portando a rapporti contraddittori sull'abbondanza relativa della morfologia delle cellule ifali durantel'infezione 63,64,65,66. Questo metodo è stato sviluppato per evitare danni alle ife durante l'elaborazione per risolvere questo problema. Inoltre, le espianto tissutale sono state utilizzate come un modo per esaminare le condizioni biologiche ex vivo, tuttavia questi metodi sono generalmente focalizzati e utili per esaminare il potenziale di aderenza o invasione di C. albicans67, ma generalmente escludono anche la maggior parte dei componenti metabolomici e microbioma che contribuiscono alla patogenesi in vivo. Sebbene il protocollo ex vivo qui descritto non mimi completamente l'ambiente IG in vivo come descritto inprecedenza 61,62, fornisce le condizioni più vicine possibili che C. albicans incontra nell'ambiente intestinale rispetto ai metodi in vitro che utilizzano condizioni di crescita artificiali.
Questo protocollo può essere utilizzato per test di screening di base per identificare l'impatto dei segnali ambientali nel tratto GASTROINTESTINAL sulla morfogenesi ifale C. albicans. Questo metodo consente di vagliare rapidamente grandi gruppi di composti tra cui inibitori di piccole molecole, nuovi antimicotici e metaboliti per lo sviluppo ifale, e potrebbe essere utilizzato nello screening di trattamenti terapeutici o nell'identificazione di fattori di rischio per le malattie sistemiche. Poiché C. albicans colonizza in tutto il tratto gastrointestinale, questo protocollo aiviene ulteriormente nell'identificazione dei segnali ambientali presenti nei segmenti specifici del tratto gastrointestinale che controllano la morfogenesi iptica negli individui che assumono antibiotici, agenti chemioterapici e nei pazienti con disturbi metabolici tra cui diabete mellito. In definitiva, il metodo qui descritto consente una rapida caratterizzazione della morfogenesi ipale in C. albicans su una vasta gamma di fattori ambientali in un modo che è più biologicamente rilevante degli attuali metodi in vitro ed è sostanzialmente più veloce ed efficiente in termini di risorse rispetto agli attuali metodi in vivo.
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Disclosures
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti o altri conflitti di interesse.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono le risorse e il supporto della midwest University Cellular and Molecular Core Research facility.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 - 10 µL Pipet Tips | Fisher Scientific | 02-707-454 | Misc |
| 100 - 1000 µL Pipet Tips | Fisher Scientific | 02-707-400 | Misc |
| 20 - 200 µL Pipet Tips | Fisher Scientific | 02-707-451 | Misc |
| 2-methylbutyric acid | Sigma | 193070-25G | hyphal-inhibitory compound |
| 488 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen (Fisher) | A11008 | IF Staining secondary ab |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | YPD agar component |
| Automated Imaging Microscope | Keyence | BZX700 | |
| Candida Albicans Antibody | Invitrogen (Fisher) | PA1-27158 | IF Staining primary ab |
| cefoperazone | Cayman | 16113 | antibiotic |
| deoxycholic acid | Sigma | 30960 | hyphal-inhibitory compound |
| D-Glucose | Fisher | D16-500 | hyphal-promoting compound |
| forceps | Fisher | 08-885 | |
| lactic acid | Alfa Aesar | AAAL13242-06 | hyphal-inhibitory compound |
| lithocholic acid | Sigma | L6250-10G | hyphal-inhibitory compound |
| palmitic acid | Sigma | P5585-10G | hyphal-inhibitory compound |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | A11313 | IF Staining fixative |
| Phosphate-buffered saline (PBS), 10x | Alfa Aesar | J62692 | PBS component |
| p-tolylacetic acid | SCBT | sc-257959 | hyphal-inhibitory compound |
| sebacic acid | Sigma | 283258-250G | hyphal-inhibitory compound |
| sharp ended scissors | Fisher | 28301 | |
| sterile Milli-Q water | N/A | N/A | Misc |
| YPD Broth | BD Biosciences | 242810 | YPD agar component |
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