Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

En Ex vivo analyse for å studere Candida albicans bindestrek morfogenese i mage-tarmkanalen

Published: July 1, 2020 doi: 10.3791/61488
Automatic Translation
1, 2, 3
1College of Veterinary Medicine, Midwestern University, 2Masters in Biomedical Science Program, College of Graduate Studies, Midwestern University, 3Department of Pathology and Population Medicine, College of Veterinary Medicine, Midwestern University

Summary

Ex vivo analysen beskrevet i denne studien ved hjelp av tarm homogenate ekstrakter og immunofluorescence farging representerer en ny metode for å undersøke bindestrekmorfogenese av Candida albicans i GI-kanalen. Denne metoden kan benyttes til å undersøke miljøsignalene som regulerer morfogenetisk overgang i tarmen.

Abstract

Candida albicans bindestrekmorfogenese i mage-tarmkanalen (GI) er tett kontrollert av ulike miljøsignaler, og spiller en viktig rolle i formidling og patogenese av dette opportunistiske sopppatogenet. Metoder for å visualisere sopphyphae i GI-kanalen in vivo er imidlertid utfordrende, noe som begrenser forståelsen av miljøsignaler for å kontrollere denne morfogeneseprosessen. Protokollen beskrevet her demonstrerer en ny ex vivo metode for visualisering av bindestrekmorfogenese i tarm homogenate ekstrakter. Ved hjelp av en ex vivo analyse viser denne studien at cecal innhold fra antibiotikabehandlede mus, men ikke fra ubehandlede kontrollmus, fremmer C. albicans bindestrekmorfogenese i tarminnholdet. Videre, legge tilbake bestemte grupper av tarm metabolitter til cecal innholdet fra antibiotika-behandlet mus differensialt regulerer bindestrek morfogenese ex vivo. Samlet representerer denne protokollen en ny metode for å identifisere og undersøke miljøsignalene som styrer C. albicans bindestrekmorfogenese i GI-kanalen.

Introduction

Candida albicans er en opportunistisk, polymorf sopppatogen som normalt er commensal, men kan gjennomgå en morfologisk endring i en virulent form som er i stand til å forårsake livstruende infeksjoner hos immunkompromitterte individer1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. C. albicans er en ledende årsak til systemiske nosocomial infeksjoner, med en 40 \\ u201260% dødelighet selv med antifungal behandling2,14,15. Selv om C. albicans bor i forskjellige vertsnisjemer, inkludert det kvinnelige reproduktivesystemet 16,17,munnhulen til friskeindivider 18 og mage-tarmkanalen (GI)19,20, stammer flertallet av de systemiske infeksjonene fra GI-kanalen og videre, kilden til systemisk infeksjon er ofte bekreftet å være GI tract21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34. C. albicans patogenitet i GI-kanalen påvirkes av et bredt spekter av faktorer; Men en viktig egenskap som er nødvendig for virulens er overgangen fra en gjær celle morfologi til en virulent bindestrekcelle morfologi35,36,37,38,39,40,41,42,43,44. C. albicans vedlegg og spredning fra GI-kanalen under infeksjon er svært forbundet med sin evne til å gå fra en commensal gjær til virulent hyphae, slik at soppene kan forårsake invasiv sykdom44,45,46,47,48,49,50,51,52,53.

En rekke faktorer i tarmen, inkludert n-acetylglucosamine, regulerer bindestrekdannelse av C. albicans. Derfor er det avgjørende å begrense kunnskapsgapet om bindestrekmorfogenesen til dette sopppatogenet iGI-kanalen 54,55,56. Nyere bevis indikerer at ulike tarmmetabolitter differensialt kontrollerer bindestrekmorfogenesen til C. albicans in vitro57,58,59,60. Tekniske begrensninger gir imidlertid problemer når man forsøker å studere C. albicans-hyfaedannelse i in vivo-tarmprøver, spesielt farging av gjær- og bindestrekceller og kvantitativ analyse av bindestrekutvikling. For å forstå C. albicans bindestrekmorfogenese i GI-kanalen, ble en ex vivo-metode utviklet ved hjelp av løselige ekstrakter av homogenisert tarminnhold fra mus for å studere effekten av metabolitter på soppgefokal morfogenese. Ved hjelp av tarmprøver fra mus som er resistente og utsatt for C. albicans GI-infeksjon, vil denne metoden bidra til å identifisere og studere effekten av metabolitter, antibiotika og xenobiotika på sopp bindestrekmorfogenese i GI-kanalen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreprotokoller ble godkjent av Midwestern University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) som beskrevet før57. Institutional Animal Care and Use Committee ved Midwestern University godkjente denne studien under MWU IACUC Protocol #2894. MWU-retningslinjene for dyrepleie følger Folkehelsetjenestens (PHS) retningslinjer for human omsorg og bruk av laboratoriedyr og retningslinjene i dyrevelferdsloven (AWA).

1. Mus studie standard protokoll

  1. Bruk hann- og hunnC57BL/6J-mus som er minst seks uker gamle. Supplere dem med sterilt vann med eller uten cefoperazon (0,5 mg/ml).
    1. Co-house mus i grupper på 5, med hvert bur som inneholder enten alle mannlige eller alle kvinnelige mus. Gi musene standard mus chow og vann (via en 400 ml flaske) til enhver tid.
    2. Sjekk bur daglig for å sikre at mat og vannstand er nok, og for å undersøke mus for tegn på nød.
  2. Skift ut vannet med cefoperazon hver 48.
  3. Etter 5\u20127 dager med cefoperazonbehandling, euthanize mus via CO2 kvelning observere etablert IACUC-protokollen. Bekreft død via cervical forvridning.
  4. Dissekere mus ved hjelp av autoklave-sterilisert skarp endte saks og autoklave-steriliserte tang.
    1. Etter eutanasi, sikre dyret til en disseksjonsoverflate ved å feste alle lemmer slik at magen blir utsatt.
    2. Spray bukregionen med 70% etanol for å hindre pels fra å holde seg til tang, saks eller tarmseksjoner under disseksjon.
    3. Bruk tang til å klemme og løfte en del av huden ved foten av magen og skape et lite snitt gjennom huden og underliggende fascia ved hjelp av saks. Vær stor forsiktighet når du gjør dette snittet for å unngå punktering av cecum eller tarmveggen.
    4. Utvid dette kuttet til brystkassen, delvis utsette bukhulen. Gjør et kutt som starter på punktet av det første snittet på hver side strekker seg oppover og lateralt.
    5. Trekk disse klaffene sidealt og pin til disseksjonsoverflaten for å fullstendig eksponere bukhulen.
  5. Trekk ut GI-kanalen ved hjelp av tang, mens du bruker saks for å gjøre kutt bedre enn magen og i den distale delen av tykktarmen for å sikre innsamling av størst mengde tarminnhold fra hver seksjon.
  6. Når du fjerner GI-kanalen, må du være forsiktig for å unngå rupturing av de enkelte komponentene. Skill mage, tynntarm, cecum og tykktarmen individuelt ved hjelp av saks på deres proksimale og distale ender.
  7. For innsamling av hvert tarminnhold fra hver seksjon, gjør et enkelt snitt på den distale enden av hver seksjon ved hjelp av saks, etterfulgt av manuelt å utvise tarminnholdet i et 1,5 ml mikrocentrifugerør ved hjelp av tang.
  8. Oppbevar tarminnholdet ved -80 °C for ex vivo-analyser.

2. Fremstilling av gjær ekstrakt-pepton-dekstrose (YPD) agar plater

  1. Til en 1 L glassflaske tilsett 25 g gjærekstrakt pepton-dekstrose buljongpulver, 10 g agar og ultrarent vann til et endelig volum på 500 ml.
  2. Autoklav ved 121 °C i 30 min på en væskesyklus for å sterilisere media.
  3. Under en laminær strømningshette helles ca. 20 ml agarmedier i en steril Petri-plate. 500 ml agarmedia skal gi ca. 25 plater.
  4. Oppbevar platene ved 4 °C til de er klare til bruk.

3. Ex vivo prep for bindestrek morfogen analyse

  1. Strek en frisk kultur av C. albicans SC5314 på en YPD agar plate og inkuber over natten ved 30 ° C.
  2. Velg to til tre mellomstore individuelle kolonier fra natten dyrket C. albicans SC5314 kultur og re-suspendere i 1 ml fosfat bufret saltvann (PBS).
  3. Hent frosset tarminnhold fra -80 °C fryseren og tin ved 25 °C.
  4. Vei ca. 150 mg tarminnhold i et nytt 1,5 ml rør.
  5. Suspender tarminnholdet på nytt med 150 μL PBS (tarminnhold og PBS med et vekt- og volumforhold på 1:1).
  6. Vortex i høy hastighet i 30 s for å homogenisere tarminnholdet og la det sitte ved romtemperatur i omtrent et minutt.
  7. Sentrifuge homogenatene ved 1000 x g i 3 min.
  8. Overfør det overnaturlige til et nytt 1,5 ml rør.
  9. Gjenta trinn 3.7 og 3.8 for å fjerne alt rusk i supernatanten.
  10. Tilsett 10 μL av C. albicans SC5314 inoculum utarbeidet ovenfor til denne supernatant
  11. Bland godt og inkuber ved 37 °C i 4 til 5 timer.

4. Eksogene tilsetning av metabolitter til tarmhomogeneekstrakter for bindestrekmorfogeneseanalysen

  1. Hent frossen tarminnhold fra -80 °C fryseren og re-suspendert i PBS ved 1:1-forhold (vekt: volum).
  2. Tilsett ønsket konsentrasjon av tarmmetabolitter til tarminnholdet og PBS-blandingen.
  3. Vortex ved høy hastighet i 30 s for å homogenisere tarminnholdet som inneholder metabolitter og la det sitte ved romtemperatur i ca 10 min.
  4. Sentrifuge homogenatene ved 1000 x g i 3 min.
  5. Overfør det overnaturlige til et nytt 1,5 ml rør. Gjenta trinn 4.4 og 4.5 for å fjerne alt rusk i supernatanten.
  6. Tilsett 10 μL av C. albicans SC5314 inoculum tilberedt ovenfor til denne supernatant. Bland godt og inkuber ved 37 °C i 4 til 5 timer.

5. C. albicans morfogenese analyse (immunstaining og avbildning)

  1. Sentrifuger prøvene ved 1000 x g i 2 min og kast supernatanten via pipettering.
  2. Fest prøvene i 100 μL på 2% paraformaldehyd (PFA) i 15 min.
  3. Sentrifuge ved 1000 x g i 2 min og kast supernatant via pipettering.
  4. Vask prøvene to ganger med 1 ml PBS. For å vaske prøver, re-suspendere pellet i PBS ved å pipettering forsiktig. Ikke virvle prøven, da dette kan skade bindestrekstrukturer. Etter re-suspensjon, sentrifuge på 1000 x g i 2 min og kast supernatant via pipettering.
  5. Inkuber prøvene ved romtemperatur i 100 μL PBS som inneholder polyklonalt C. albicans antistoff (1:100 fortynning) i 30 min.
  6. Vask prøvene tre ganger med 1 ml PBS.
    MERK: Ved bruk av et fluorescerende antistoff anbefales det at alle fortynnings- og vasketrinn utføres i svakt lys for å unngå bleking av bilder og forbedre prøvens levetid.
  7. Inkuber prøvene ved romtemperatur i 15 min i 100 μL PBS som inneholder antikanin IgG Alexafluor 488 antistoff ved 1:500 fortynning. Utfør inkubasjon i en mørk skuff eller rom for å unngå bleking av bilder.
  8. Vask prøvene tre ganger med 1 ml PBS.
  9. Suspender prøvene på nytt i 100 μL PBS og overfør til en 96-brønns plate for bildebehandling.
    MERK: Når den ikke blir avbildet, anbefales det at 96-brønnplaten pakkes inn i aluminiumsfolie for å unngå bleking av bilder.
  10. Bilde soppceller ved hjelp av 20x og 40x objektive linser ved hjelp av en fluorescens imaging mikroskop. Bruk et grønt fluorescerende proteinfilter (GFP) (eksitasjonsbølgelengde 470/40 og utslippsbølgelengde 525/50) til å oppdage fluorescens.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Disse resultatene sammen med tidligere funn fra Thangamani-laboratoriet60 indikerer at når C. albicans dyrkes ex vivo i tarmhomogenate ekstrakter tatt fra magen, tynntarmen og tykktarmen av ubehandlet kontroll og antibiotikabehandlede mus, utvikler C. albicans vanligvis med gjærmorfologi (figur 1B). Men når dyrket i cecal ekstrakt fra antibiotikabehandlede mus, C. albicans gjennomgår lett morfogenese, noe som resulterer i prøver som inneholder gjær og hyphae former (Figur 1B); dette forekommer ikke i kontrollmus. Dette støtter tidligere resultater, som viste en betydelig økning i hyphae former i prøver dyrket i antibiotika-behandlet cecal ekstrakter, men ikke i noen andre antibiotika-behandlet tarmekstrakter 60. Disse resultatene tyder på at antibiotikabehandling forårsaker endringer i cecal miljøet, som induserer bindestrekmorfogenese av C. albicans. I tillegg antyder den spesifikke lokaliseringen av denne fenotypen bare i cecum at disse hyphae-fremmende forholdene kanskje ikke nødvendigvis finnes i hele GI-kanalen, men i stedet er begrenset til bestemte segmenter av GI-kanalen, avhengig av tilgjengeligheten av næringsstoffer, metabolitter og andre ukjente molekyler.

Siden cecal ekstrakt av antibiotikabehandlede mus fremmer morfogenesen til C. albicans57,58,59,60,undersøkte vi om eksogen tilsetning av en valgt gruppe tarmmetabolitter (identifisert fra tidligere in vitro-studier) til cecal-innholdet av cef-behandlede mus vil påvirke morfogenesen til C. albicans ex vivo. Tidligere arbeid utført av Thangamani-laboratoriet har preget metabobomikkprofilen til cecal innhold homogenat ekstrahert fra ubehandlede og antibiotikabehandlede mus, avslører betydelige endringer i overflod av ulike metabolitter som følge av antibiotikabehandling-spesielt redusert overflod av sekundære gallesyrer og økt overflod avkarbohydrater 60. Videre identifiserte denne studien at sekundære gallesyrer og karboksylsyrer hemmer hyphaeutvikling, mens karbohydrater inkludert glukose, fremmer bindestrekmorfogenesen til C. albicans in vitro60. Resultatene indikerer at det å legge til en pool av hemmende tarmmetabolitter som inneholder deoksykolsyre (DCA, 0,5 mg/ml), lithocholic acid (LCA, 0,1 mg/ml), palmittsyre (0,1 mg/ml), p-tolylaketisk syre (0,1 mg/ml), sebacicsyre (0,5 mg/ml), 0,5 mg/ml), 2 2-metylbutyrsyre (0,5 mg/ml) og melkesyre (5 mg/ml) til cekal homogenat av cef-behandlede mus hemmet helt bindestrekmorfigenese ex vivo. På den annen side viste eksogene tilsetning av glukose (1 mg/ml) til cecal homogenat av cef-behandlede mus en massiv bindestrekutvikling ex vivo (figur 2B). Samlet indikerer disse funnene at tilsetning av tarmmetabolitter tilbake til cecal homogenatet av cef-behandlede mus differensial regulerer morfogenesen til C. albicans, og bekrefter dermed tidligere in vitro-funn. Disse resultatene indikerer at tarmmetabolitter spiller en kritisk rolle i bindestrekmorfogenese av C. albicans og forstå genmål og signalveier modulert av disse metabolittene vil hjelpe til med utviklingen av nye terapeutiske tilnærminger for å forebygge og behandle C. albicans infeksjoner.

Figure 1
Figur 1: Ex vivo analyse for å bestemme effekten av cefoperazon behandling på C. albicans bindestrek morfogenese i tarminnholdet. (A) Protokoll skjematisk disposisjon. (B)Antibiotikabehandlet (topppaneler) og ikke-behandlet (bunnpaneler) tarminnhold ble tatt fra mage, tynntarm, cecums og tykktarmen til C57BL/6J-mus. Tarminnholdet inokulert med C. albicans SC5314 ble inkubert ved 37 °C i 4\u20125 h og farget med C. albicans antistoff. Celler ble avbildet ved 40x forstørrelse. Representative bilder vises her. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Eksogene tilsetning av tarmmetabolitter til innholdet i cecal fra cef-behandlede mus på hyphaedannelse av C. albicans ex vivo. (A) Protokoll skjematisk disposisjon. (B) Hemmende tarmmetabolitter basseng som inneholder DCA (0,5 mg / ml), LCA (0,1 mg / ml), palmitisk syre (0,1 mg / ml), p-tolylaketisk syre (0,1 mg / ml), sebacic syre (0,5 mg / ml); 2-metylbutyrsyre (0,5 mg/ml) og melkesyre (5 mg/ml) eller glukose (1 mg/ml) ble tilsatt tilbake til cecalinnholdet av cef-behandlede mus, blandet grundig og inkubert ved 37 °C i 15 min for å utføre ex vivo hyphae analysen. Cecal-innholdet inokulert med C. albicans SC5314 ble inkubert ved 37 °C i 4\u20125 h og farget med C. albicans antistoff. Celler ble avbildet ved 40x forstørrelse. Representative bilder vises her. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoden som er beskrevet her presenterer en ny måte å undersøke effekten av antibiotika, kosttilskudd, xenobiotiske og terapeutiske virkninger på C. albicans bindestrekmorfogenese i GI-kanalen. Siden flertallet av systemiske infeksjoner stammer fra GI tract21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34 og hyphae formasjon er en kritisk virulensfaktor som fremmer spredning av C. albicans fra GI-kanalen, forstå faktorene som styrer denne morfogenesen i GI-kanalen vil utvide kunnskapen om patogenesemekanismer og identifisere nye behandlingsalternativer.

Selv om metoden som presenteres her er relativt grei, ble visse trinn omtalt nedenfor identifisert som kritisk og viktig. (i) Den første inoculum av C. albicans bør være optimal for å tillate både vekst og bindestrek morfogenese av sopp. Med begrenset tilgjengelighet av næringsstoffer i tarmen homogenate ekstrakter, høyere volum av inoculum kan redusere soppvekst og morfogene prosessen. Veksten av ulike kliniske isolater og stammer vil imidlertid trolig være variabel, og dermed optimalisere inokus og inkubasjonstid for spesifikke C. albicans isolater er avgjørende. (ii) Flere sentrifugeringstrinn ved utarbeidelse av tarmhomogeneekstraktet ble funnet å være avgjørende for å fjerne rusk i tarminnholdet så mye som mulig. (iii) På grunn av den relativt lave sentrifugeringshastigheten (for å unngå skadelige bindestrekstrukturer), må det tas hensyn til å unngå celletap under immunstainingstrinn i denne protokollen.

Alternative metoder for å visualisere sopphyphae i GI-kanalen har blitt brukt tidligere, med visse fordeler og begrensninger knyttet til hver metode. En relativt bemerkelsesverdig metode ved hjelp av fluorescerende in situ hybridisering (FISH) for å visualisere sopphyphae i GI-kanalen har nylig blitt demonstrert av Witchley et al.61,62. Dette er en lovende in vivo-metode som for tiden er tilgjengelig for å oppdage C. albicans hyphae direkte i GI-kanalen, men kompleksiteten i denne protokollen gjør det vanskelig å tilpasse den til raske, store innledende screeningstudier. Tradisjonelle histopatologi metoder har også blitt brukt i det siste for å vitalisere C. albicans gjær og hyphae former i GI-traktaten. Observasjon og avbildning av soppceller med grunnleggende histopatologi, og Hematoksylin og Eosin (H / E) flekker er fortsatt utfordrende, da mange standard fikseringsmetoder har potensial til å forstyrre slimhinnelaget av GI-kanalprøver, ofte skadelige bindestrekstrukturer i prosessen og fører til motstridende rapporter over den relative overfloden av bindestrekcellemorfologi underinfeksjon 63,64,65,66. Denne metoden ble utviklet for å unngå skade på hyphae under behandling for å løse dette problemet. I tillegg har vev explants blitt brukt som en måte å undersøke biologiske forhold ex vivo, men disse metodene er generelt fokusert og nyttig for å undersøke etterlevelse eller invasjon potensialet av C. albicans67, men også de generelt utelukke flertallet av metabolomics og mikrobiome komponenter som bidrar til in vivo patogenese. Selv om ex vivo protokollen beskrevet her ikke helt etterligne in vivo GI miljø som beskrevet tidligere61,62, det gir de nærmeste mulige forhold som C. albicans møter i tarmmiljøet sammenlignet med in vitro metoder ved hjelp av kunstige vekstforhold.

Denne protokollen kan brukes til grunnleggende screeninganalyser for å identifisere virkningen av miljøsignaler i GI-traktaten på C. albicans bindestrekmorfogenese. Denne metoden gjør det mulig for store grupper av forbindelser, inkludert små molekylhemmere, nye antimykotika og metabolitter som skal screenes raskt for bindestrekutvikling, og kan brukes til screening terapeutiske behandlinger eller identifisere risikofaktorer for systemisk sykdom. Siden C. albicans koloniserer i hele GI-kanalen, vil denne protokollen ytterligere hjelpe til med å identifisere miljøsignalene som finnes i de spesifikke segmentene av GI-kanalen som kontrollerer bindestrekmorfogenese hos personer som tar antibiotika, kjemoterapeutiske midler, og hos pasienter med metabolske forstyrrelser inkludert diabetes mellitus. Til syvende og sist gjør metoden som er beskrevet her, for rask karakterisering av bindestrekmorfogenese i C. albicans over et bredt spekter av miljøfaktorer på en måte som er mer biologisk relevant enn dagens in vitro-metoder og er vesentlig raskere og mer ressurseffektiv enn dagens in vivo-metoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfatterne anerkjenner ressurser og støtte fra Midwestern University Cellular and Molecular Core Research anlegget.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 - 10 µL Pipet Tips Fisher Scientific 02-707-454 Misc
100 - 1000 µL Pipet Tips Fisher Scientific 02-707-400 Misc
20 - 200 µL Pipet Tips Fisher Scientific 02-707-451 Misc
2-methylbutyric acid Sigma 193070-25G hyphal-inhibitory compound
488 goat anti-rabbit IgG Invitrogen (Fisher) A11008 IF Staining secondary ab
Agar Fisher BP1423-500 YPD agar component
Automated Imaging Microscope Keyence BZX700
Candida Albicans Antibody Invitrogen (Fisher) PA1-27158 IF Staining primary ab
cefoperazone Cayman 16113 antibiotic
deoxycholic acid Sigma 30960 hyphal-inhibitory compound
D-Glucose Fisher D16-500 hyphal-promoting compound
forceps Fisher 08-885
lactic acid Alfa Aesar AAAL13242-06 hyphal-inhibitory compound
lithocholic acid Sigma L6250-10G hyphal-inhibitory compound
palmitic acid Sigma P5585-10G hyphal-inhibitory compound
Paraformaldehyde Alfa Aesar A11313 IF Staining fixative
Phosphate-buffered saline (PBS), 10x Alfa Aesar J62692 PBS component
p-tolylacetic acid SCBT sc-257959 hyphal-inhibitory compound
sebacic acid Sigma 283258-250G hyphal-inhibitory compound
sharp ended scissors Fisher 28301
sterile Milli-Q water N/A N/A Misc
YPD Broth BD Biosciences 242810 YPD agar component

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huffnagle, G. B., Noverr, M. C. The emerging world of the fungal microbiome. Trends in Microbiology. 21 (7), 334-341 (2013).
  2. Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clinical Infectious Diseases. 39 (3), 309-317 (2004).
  3. Hajjeh, R. A., et al. Incidence of Bloodstream Infections Due to Candida Species and In Vitro Susceptibilities of Isolates Collected from 1998 to 2000 in a Population-based Active Surveillance Program. Journal of Clinical Microbiology. 42 (4), 1519-1527 (2004).
  4. Lockhart, S. R., et al. Species Identification and Antifungal Susceptibility Testing of Candida Bloodstream Isolates from Population-Based Surveillance Studies in Two U.S. Cities from 2008 to 2011. Journal of Clinical Microbiology. 50 (11), 3435-3442 (2012).
  5. Pfaller, M., et al. Epidemiology and outcomes of candidemia in 3648 patients: data from the Prospective Antifungal Therapy (PATH Alliance(R)) registry, 2004-2008. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 74 (4), 323-331 (2012).
  6. Angarone, M. Fungal infections in cancer patients. Cancer Treatment and Research. 161, 129-155 (2014).
  7. Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), 113 (2012).
  8. Calton, E. A., et al. Invasive bacterial and fungal infections in paediatric patients with cancer: incidence, risk factors, aetiology and outcomes in a UK regional cohort 2009-2011. Pediatric Blood & Cancer. 61 (7), 1239-1245 (2014).
  9. Carter, J. H., et al. Medical management of invasive fungal infections of the central nervous system in pediatric cancer patients. Pediatric Blood & Cancer. 62 (6), 1095-1098 (2015).
  10. Low, C. Y., Rotstein, C. Emerging fungal infections in immunocompromised patients. F1000 Medicine Reports. 3, 14 (2011).
  11. Mousset, S., et al. Treatment of invasive fungal infections in cancer patients-updated recommendations of the Infectious Diseases Working Party (AGIHO) of the German Society of Hematology and Oncology (DGHO). Annals of Hematology. 93 (1), 13-32 (2014).
  12. Perfect, J. R., Hachem, R., Wingard, J. R. Update on epidemiology of and preventive strategies for invasive fungal infections in cancer patients. Clinical Infectious Diseases. 59, Suppl 5 352-355 (2014).
  13. Sipsas, N. V., Kontoyiannis, D. P. Invasive fungal infections in patients with cancer in the Intensive Care Unit. International Journal of Antimicrobial Agents. 39 (6), 464-471 (2012).
  14. Falagas, M. E., Apostolou, K. E., Pappas, V. D. Attributable mortality of candidemia: a systematic review of matched cohort and case-control studies. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 25 (7), 419-425 (2006).
  15. Chi, H. W., et al. Candida albicans versus non-albicans bloodstream infections: the comparison of risk factors and outcome. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 44 (5), 369-375 (2011).
  16. Drell, T., et al. Characterization of the vaginal micro- and mycobiome in asymptomatic reproductive-age Estonian women. PLoS One. 8 (1), 54379 (2013).
  17. Merenstein, D., et al. Colonization by Candida species of the oral and vaginal mucosa in HIV-infected and noninfected women. AIDS Research and Human Retroviruses. 29 (1), 30-34 (2013).
  18. Ghannoum, M. A., et al. Characterization of the oral fungal microbiome (mycobiome) in healthy individuals. PLoS Pathogens. 6 (1), 1000713 (2010).
  19. Hoffmann, C., et al. Archaea and fungi of the human gut microbiome: correlations with diet and bacterial residents. PLoS One. 8 (6), 66019 (2013).
  20. Noble, S. M., Gianetti, B. A., Witchley, J. N. Candida albicans cell-type switching and functional plasticity in the mammalian host. Nature Reviews Microbiology. 15 (2), 96-108 (2017).
  21. Samonis, G., et al. Prospective evaluation of effects of broad-spectrum antibiotics on gastrointestinal yeast colonization of humans. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 37 (1), 51-53 (1993).
  22. Sahni, V., et al. Candidemia--an under-recognized nosocomial infection in Indian hospitals. The Journal of the Association of Physicians of India. 53, 607-611 (2005).
  23. Meijer-Severs, G. J., Joshi, J. H. The effect of new broad-spectrum antibiotics on faecal flora of cancer patients. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 24 (4), 605-613 (1989).
  24. Kennedy, M. J., Volz, P. A., Edwards, C. A., Yancey, R. J. Mechanisms of association of Candida albicans with intestinal mucosa. Journal of Medical Microbiology. 24 (4), 333-341 (1987).
  25. Miranda, L. N., et al. Candida colonisation as a source for candidaemia. Journal of Hospital Infections. 72 (1), 9-16 (2009).
  26. Nucci, M., Anaissie, E. Revisiting the source of candidemia: skin or gut. Clinical Infectious Diseases. 33 (12), 1959-1967 (2001).
  27. Raponi, G., Visconti, V., Brunetti, G., Ghezzi, M. C. Clostridium difficile infection and Candida colonization of the gut: is there a correlation. Clinical Infectious Diseases. 59 (11), 1648-1649 (2014).
  28. Guastalegname, M., Russo, A., Falcone, M., Giuliano, S., Venditti, M. Candidemia subsequent to severe infection due to Clostridium difficile: is there a link. Clinical Infectious Diseases. 57 (5), 772-774 (2013).
  29. Nerandzic, M. M., Mullane, K., Miller, M. A., Babakhani, F., Donskey, C. J. Reduced acquisition and overgrowth of vancomycin-resistant enterococci and Candida species in patients treated with fidaxomicin versus vancomycin for Clostridium difficile infection. Clinical Infectious Diseases. 55, Suppl 2 121-126 (2012).
  30. Krause, R., Krejs, G. J., Wenisch, C., Reisinger, E. C. Elevated fecal Candida counts in patients with antibiotic-associated diarrhea: role of soluble fecal substances. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 10 (1), 167-168 (2003).
  31. Krause, R., et al. Role of Candida in antibiotic-associated diarrhea. The Journal of Infectious Diseases. 184 (8), 1065-1069 (2001).
  32. Zuo, T., et al. Gut fungal dysbiosis correlates with reduced efficacy of fecal microbiota transplantation in Clostridium difficile infection. Nature Communications. 9 (1), 3663 (2018).
  33. Delaloye, J., Calandra, T. Invasive candidiasis as a cause of sepsis in the critically ill patient. Virulence. 5 (1), 161-169 (2014).
  34. Cole, G. T., Halawa, A. A., Anaissie, E. J. The role of the gastrointestinal tract in hematogenous candidiasis: from the laboratory to the bedside. Clinical Infectious Diseases. 22, Suppl 2 73-88 (1996).
  35. Lo, H. J., et al. Nonfilamentous C. albicans mutants are avirulent. Cell. 90 (5), 939-949 (1997).
  36. Gale, C. A., et al. Linkage of adhesion, filamentous growth, and virulence in Candida albicans to a single gene, INT1. Science. 279 (5355), 1355-1358 (1998).
  37. Bendel, C. M., et al. Systemic infection following intravenous inoculation of mice with Candida albicans int1 mutant strains. Molecular genetics and metabolism. 67 (4), 343-351 (1999).
  38. Toenjes, K. A., et al. Small-molecule inhibitors of the budded-to-hyphal-form transition in the pathogenic yeast Candida albicans. Antimicrobial agents and chemotherapy. 49 (3), 963-972 (2005).
  39. Carlisle, P. L., et al. Expression levels of a filament-specific transcriptional regulator are sufficient to determine Candida albicans morphology and virulence. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (2), 599-604 (2009).
  40. Fazly, A., et al. Chemical screening identifies filastatin, a small molecule inhibitor of Candida albicans adhesion, morphogenesis, and pathogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (33), 13594-13599 (2013).
  41. Pande, K., Chen, C., Noble, S. M. Passage through the mammalian gut triggers a phenotypic switch that promotes Candida albicans commensalism. Nature genetics. 45 (9), 1088 (2013).
  42. Bar-Yosef, H., Gonzalez, N. V., Ben-Aroya, S., Kron, S. J., Kornitzer, D. Chemical inhibitors of Candida albicans hyphal morphogenesis target endocytosis. Scientific reports. 7 (1), 5692 (2017).
  43. Mendelsohn, S., Pinsky, M., Weissman, Z., Kornitzer, D. Regulation of the Candida albicans hypha-inducing transcription factor Ume6 by the CDK1 cyclins Cln3 and Hgc1. mSphere. 2 (2), 00248 (2017).
  44. Vila, T., et al. Targeting Candida albicans filamentation for antifungal drug development. Virulence. 8 (2), 150-158 (2017).
  45. Pande, K., Chen, C., Noble, S. M. Passage through the mammalian gut triggers a phenotypic switch that promotes Candida albicans commensalism. Nature Genetics. 45 (9), 1088-1091 (2013).
  46. Lo, H. J., et al. Nonfilamentous C. albicans mutants are avirulent. Cell. 90 (5), 939-949 (1997).
  47. Bar-Yosef, H., Vivanco Gonzalez, N., Ben-Aroya, S., Kron, S. J., Kornitzer, D. Chemical inhibitors of Candida albicans hyphal morphogenesis target endocytosis. Scientific Reports. 7 (1), 5692 (2017).
  48. Carlisle, P. L., et al. Expression levels of a filament-specific transcriptional regulator are sufficient to determine Candida albicans morphology and virulence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (2), 599-604 (2009).
  49. Mendelsohn, S., Pinsky, M., Weissman, Z., Kornitzer, D. Regulation of the Candida albicans Hypha-Inducing Transcription Factor Ume6 by the CDK1 Cyclins Cln3 and Hgc1. mSphere. 2 (2), (2017).
  50. Bendel, C. M., et al. Effects of Alteration of the Candida albicans Gene INT1 on Cecal Colonization in Orally Innoculated Mice. Pediatric Research. 45, 156 (1999).
  51. Gale, C. A., et al. Linkage of adhesion, filamentous growth, and virulence in Candida albicans to a single gene, INT1. Science. 279 (5355), 1355-1358 (1998).
  52. Toenjes, K. A., et al. Small-molecule inhibitors of the budded-to-hyphal-form transition in the pathogenic yeast Candida albicans. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (3), 963-972 (2005).
  53. Fazly, A., et al. Chemical screening identifies filastatin, a small molecule inhibitor of Candida albicans adhesion, morphogenesis, and pathogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13594-13599 (2013).
  54. Naseem, S., Gunasekera, A., Araya, E., Konopka, J. B. N-acetylglucosamine (GlcNAc) induction of hyphal morphogenesis and transcriptional responses in Candida albicans are not dependent on its metabolism. Journal of Biological Chemistry. 286 (33), 28671-28680 (2011).
  55. Piispanen, A. E., Hogan, D. A. PEPped up: induction of Candida albicans virulence by bacterial cell wall fragments. Cell Host & Microbe. 4 (1), 1-2 (2008).
  56. Xu, X. L., et al. Bacterial peptidoglycan triggers Candida albicans hyphal growth by directly activating the adenylyl cyclase Cyr1p. Cell Host & Microbe. 4 (1), 28-39 (2008).
  57. Guinan, J., Thangamani, S. Antibiotic-induced alterations in taurocholic acid levels promote gastrointestinal colonization of Candida albicans. FEMS microbiology letters. 365 (18), (2018).
  58. Guinan, J., Villa, P., Thangamani, S. Secondary bile acids inhibit Candida albicans growth and morphogenesis. Pathogens and disease. 76 (3), (2018).
  59. Guinan, J., Wang, S., Hazbun, T. R., Yadav, H., Thangamani, S. Antibiotic-induced decreases in the levels of microbial-derived short-chain fatty acids correlate with increased gastrointestinal colonization of Candida albicans. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
  60. Gutierrez, D., et al. Antibiotic-induced gut metabolome and microbiome alterations increase the susceptibility to Candida albicans colonization in the gastrointestinal tract. FEMS microbiology ecology. 96 (1), 187 (2020).
  61. Witchley, J. N., et al. Candida albicans morphogenesis programs control the balance between gut commensalism and invasive infection. Cell Host & Microbe. 25 (3), 432-443 (2019).
  62. Witchley, J. N., Penumetcha, P. M., Noble, S. M. Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (153), e60283 (2019).
  63. Johansson, M. E., Hansson, G. C. Preservation of mucus in histological sections, immunostaining of mucins in fixed tissue, and localization of bacteria with FISH. Mucins. , Springer. 229-235 (2012).
  64. Lossinsky, A. S., et al. The histopathology of Candida albicans invasion in neonatal rat tissues and in the human blood-brain barrier in culture revealed by light, scanning, transmission and immunoelectron microscopy scanning. Histology and histopathology. , (2006).
  65. Rosenbach, A., Dignard, D., Pierce, J. V., Whiteway, M., Kumamoto, C. A. Adaptations of Candida albicans for growth in the mammalian intestinal tract. Eukaryotic Cell. 9, 1075-1086 (2010).
  66. Vautier, S., et al. C andida albicans colonization and dissemination from the murine gastrointestinal tract: the influence of morphology and T h17 immunity. Cellular Microbiology. 17, 445-450 (2015).
  67. Lyman, C., Navarro, E., Garrett, K., Roberts, D., Pizzo, P., Walsh, T. Adherence of Candida albicans to bladder mucosa: development and application of a tissue explant assay. Mycoses. 42, 255-259 (1999).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 161 Candida albicans bindestrekmorfogenese ex vivo analyse glukose sekundærgalle syrer og GI-kanaler
En Ex vivo analyse for å studere <em>Candida albicans</em> bindestrek morfogenese i mage-tarmkanalen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Monasky, R., Villa, S., Thangamani,… More

Monasky, R., Villa, S., Thangamani, S. An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract. J. Vis. Exp. (161), e61488, doi:10.3791/61488 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter