Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Ex vivo Assay для изучения Candida Albicans Hyphal Morphogenesis в желудочно-кишечном тракте

Published: July 1, 2020 doi: 10.3791/61488
Automatic Translation
1, 2, 3
1College of Veterinary Medicine, Midwestern University, 2Masters in Biomedical Science Program, College of Graduate Studies, Midwestern University, 3Department of Pathology and Population Medicine, College of Veterinary Medicine, Midwestern University

Summary

Ex vivo анализ, описанный в этом исследовании с использованием экстрактов гомогената кишечника и иммунофторесценции окрашивания представляет собой новый метод для изучения гипхал морфогенез Candida albicans в желудочно-кишечном тракте. Этот метод может быть использован для исследования экологических сигналов, регулирующих морфогенетический переход в кишечнике.

Abstract

Candida albicans hyphal morphogenesis в желудочно-кишечном тракте (ГИ) жестко контролируется различными экологическими сигналами, и играет важную роль в распространении и патогенезе этого оппортунистического грибкового патогена. Тем не менее, методы визуализации грибковых гиф в желудочно-кишечном тракте in vivo являются сложными, что ограничивает понимание экологических сигналов в контроле этого процесса морфогенеза. Описанный здесь протокол демонстрирует новый метод ex vivo для визуализации гипхал-морфогенеза в экстрактах гомогената кишечника. Используя анализ ex vivo, это изучение демонстрирует что cecal содержание от антибиотика обработанных мышей, но не от untreated мышей управления, повысить C. albicans гипхальный морфогенез в содержании кишки. Кроме того, добавление назад конкретных групп метаболитов кишечника к содержимому cecal от антибиотико-обработанных мышей дифференциально регулирует гипхальный морфогенез ex vivo. Взятые вместе, этот протокол представляет собой новый метод для выявления и исследования экологических сигналов, которые контролируют C. Albicans гифаль морфогенез в желудочно-кишечном тракте.

Introduction

Candida albicans является оппортунистическим, полиморфным грибковым патогеном, который обычно commensal, но может пройти морфологические изменения в вирулентной форме, способной вызвать опасные для жизниинфекции у людей с ослабленным иммунитетом 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. C. albicans является ведущей причиной системных нозокомиальных инфекций, с 40-201260% смертности даже при противогрибковомлечении 2,14,15. Хотя C. albicans проживает в различных нишах хозяина включаяженскую репродуктивную систему 16,17, устную полостьздоровых индивидуалов 18 и желудочно-кишечный тракт (GI)тракта 19,20, большинство системных инфекций возникают от тракта GI и более того, Источником системной инфекции часто подтверждаетсяжелудочно-кишечный тракт 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34. C. микробиканы патогенности в желудочно-кишечном тракте зависит от широкого спектра факторов; Однако главной характеристикой, необходимой для вирулентности, является переход от морфологии дрожжевых клеток к вирулентной морфологиигипхал-клеток 35,36, 37,38, 39,40,41,42,43,44. C. Albicans крепления и распространения из желудочно-кишечного тракта во время инфекции тесно связано с его способностью к переходу от commensal дрожжей в вирулентной гифы, чтопозволяет грибам вызывать инвазивные заболевания 44,45,46,47,48,49,50,51,52,53.

Разнообразие факторов в кишечнике, в том числе n-acetylglucosamine, регулируют образование гифаля C. albicans. Поэтому крайне важно сократить пробел в знаниях относительно гипхал-морфогенеза этого грибкового патогена в желудочно-кишечномтракте 54,55,56. Последние данные свидетельствуют отом,что различные метаболиты кишечника дифференциально контролируют гипхалморфогенез C. Albicans in vitro57,58,59,60. Тем не менее, технические ограничения представляют проблемы при попытке изучения C. Albicans гифы формирования в образцах кишечника in vivo, особенно окрашивания дрожжей и клеток гифы и количественного анализа развития гипхала. Чтобы понять гипахал-морфогенез C. albicans в желудочно-кишечном тракте, был разработан метод ex vivo с использованием растворимых экстрактов гомогенизированного содержимого кишечника у мышей для изучения влияния метаболитов на грибковый гипхалморфез. Используя образцы кишечника у мышей, которые устойчивы и восприимчивы к инфекции C. Albicans GI, этот метод поможет определить и изучить влияние метаболитов, антибиотиков и ксенобиотиков на грибковый гипахал морфогенез в желудочно-кишечном тракте.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все протоколы животных были одобрены Midwestern University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), как описано до57. Институциональный комитет по уходу за животными и использованию в Среднем Западе университета одобрил это исследование в соответствии с протоколом MWU IACUC #2894. Политика MWU по уходу за животными следует политике Службы общественного здравоохранения (PHS) по гуманному уходу и использованию лабораторных животных и политике, изложенной в Законе о защите животных (AWA).

1. Мыши изучают стандартный протокол

  1. Используйте мышей мужского и женского пола C57BL/6J по крайней мере шесть недель. Дополните их стерильной водой с цефоперазоном или без него (0,5 мг/мл).
    1. Со-дом мышей в группах по 5, с каждой клетке, содержащей либо всех мужчин или всех самок мышей. Обеспечить мышей стандартной мыши чау и воды (через бутылку 400 мл) во все времена.
    2. Проверьте клетки ежедневно, чтобы обеспечить питание и уровень воды достаточно, и изучить мышей на наличие признаков бедствия.
  2. Замените воду цефоперазоном каждые 48 ч, чтобы гарантировать, что свежий антибиотик предоставляется независимо от оставшейся воды в бутылках для кормления в клетке.
  3. После 5-20127 дней лечения цефоперазоном, усыпляйте мышей с помощью CO2 удушья наблюдения установлен протокол IACUC. Подтвердите смерть через вывих шейки матки.
  4. Рассекают мышей с помощью автоклав-стерилизованных острых ножниц и автоклав-стерилизованных типсов.
    1. После эвтаназии, закрелите животное на поверхности вскрытия, прижав все конечности так, чтобы живот подвергался воздействию.
    2. Спрей брюшной области с 70% этанола, чтобы предотвратить меха от прилипания к тиски, ножницы, или кишечника разделов во время вскрытия.
    3. Используйте щипцы, чтобы ущипнуть и поднять часть кожи у основания живота и создать небольшой разрез через кожу и основные фасции с помощью ножниц. Позаботьтесь при принятии этого разреза, чтобы избежать прокола cecum или кишечной стенки.
    4. Расширьте этот разрез до грудной клетки, частично обнажая брюшную полость. Сделайте разрез, начиная с точки первоначального разреза с обеих сторон, простирающихся вверх и боково.
    5. Потяните эти закрылки боковой и контактный к поверхности вскрытия, чтобы полностью подвергать брюшной полости.
  5. Извлекайте желудочно-кишечный тракт с помощью типсов, используя ножницы, чтобы сделать порезы выше желудка и в дистальной области толстой кишки, чтобы обеспечить сбор наибольшего количества содержимого кишечника из каждого раздела.
  6. При удалении желудочно-кишечного тракта, позаботьтесь, чтобы избежать разрыва отдельных компонентов. Отделяйте желудок, тонкий кишечник, cecum, и толстой кишки индивидуально с помощью ножниц на проксимальных и дистальных концах.
  7. Для сбора каждого содержимого кишечника из каждого раздела, сделать один разрез на дистальной конце каждого раздела с помощью ножниц, а затем вручную изгонять содержимое кишечника в 1,5 мл микроцентрифуг трубки с помощью типсов.
  8. Храните содержимое кишечника при -80 градусов по Цельсию для анализа ex vivo.

2. Приготовление дрожжевой экстракт-пептон-декстроза (YPD) агар пластин

  1. К стеклянной бутылке объемом 1 л добавьте 25 г дрожжевого экстракта бульона пептон-декстроза, 10 г агара и ультрачистую воду до конечного объема 500 мл.
  2. Автоклав при 121 градусе по Цельсию в течение 30 минут на жидком цикле для стерилизации средств массовой информации.
  3. Под капотом ламинарного потока вылейте около 20 мл агар-медиа в стерильную пластину Петри. 500 мл агар-медиа должны дать около 25 пластин.
  4. Храните тарелки при 4 градусах Цельсия до готовности к использованию.

3. Ex vivo подготовка к анализу гипхал морфогенеза

  1. Streak свежей культуры C. albicans SC5314 на YPD агар пластины и инкубировать на ночь при 30 градусов по Цельсию.
  2. Выберите два-три средних отдельных колоний из ночных выращенных C. albicans SC5314 культуры и повторно приостановить в 1 мл фосфата буферного солевого раствора (PBS).
  3. Извлекит замороженное содержимое кишечника из морозильной камеры -80 градусов по Цельсию и оттаивать при 25 градусах Цельсия.
  4. Взвесить около 150 мг содержимого кишечника в новую трубку 1,5 мл.
  5. Повторно приостанавливать содержимое кишечника с 150 йЛ PBS (содержимое кишечника и PBS при соотношении веса 1:1 к объему).
  6. Vortex на высокой скорости в течение 30 с, чтобы гомогенизировать содержимое кишечника и позволяют сидеть при комнатной температуре около минуты.
  7. Центрифуга гомогенатов при 1000 х г в течение 3 мин.
  8. Перенесите супернатант на новую трубку 1,5 мл.
  9. Повторите шаги 3.7 и 3.8, чтобы удалить все обломки в супернатанте.
  10. Добавьте 10 МКЛ инокулума C. albicans SC5314, подготовленного выше, к этому супернатанту
  11. Хорошо перемешать и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 4 до 5 ч.

4. Экзогенное добавление метаболитов в экстракты гомогената кишечника для анализа гипхал-морфогенеза

  1. Извлеким замороженное содержимое кишечника из морозильной камеры -80 градусов по Цельсию и повторно приофлив в PBS при соотношении 1:1 (вес: объем).
  2. Добавьте желаемую концентрацию метаболитов кишечника к содержанию кишечника и смеси PBS.
  3. Вихрь на высокой скорости в течение 30 с, чтобы гомогенизировать содержимое кишечника, содержащего метаболиты и позволяют сидеть при комнатной температуре около 10 мин.
  4. Центрифуга гомогенатов при 1000 х г в течение 3 мин.
  5. Перенесите супернатант на новую трубку 1,5 мл. Повторите шаги 4.4 и 4.5, чтобы удалить все обломки в супернатанте.
  6. Добавьте к этому супернатанту 10 МКЛ Инокулума C. albicans SC5314, подготовленного выше. Хорошо перемешать и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 4 до 5 ч.

5. Анализ морфогенеза К. Альбикана (иммуностимулирование и визуализация)

  1. Центрифуга образцов на 1000 х г в течение 2 мин и отказаться от супернатанта через пипетки.
  2. Исправьте образцы в 100 МКЛ 2% параформальдегида (PFA) в течение 15 мин.
  3. Центрифуга на 1000 х г в течение 2 мин и отказаться от супернатанта через пипетки.
  4. Вымойте образцы дважды с 1 мл PBS. Чтобы вымыть образцы, повторно приостановить гранулы в PBS путем трубопроводов мягко. Не вихрь образца, как это может повредить гипхал структур. После повторной суспензии центрифуга при 1000 х г в течение 2 мин и отбросить супернатант через пипетку.
  5. Инкубировать образцы при комнатной температуре в 100 МКЛ PBS, содержащих поликлональные антитела C. albicans (1:100 разбавления) в течение 30 мин.
  6. Вымойте образцы три раза с 1 мл PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании флуоресцентных антител рекомендуется выполнять все шаги по разбавлению и мытью в тусклом свете, чтобы избежать отбеливания фотографий и улучшить долговечность образца.
  7. Инкубировать образцы при комнатной температуре в течение 15 мин в 100 МКЛ PBS, содержащих анти-Rabbit IgG Alexafluor 488 антител в 1:500 разбавления. Выполните инкубацию в темном ящике или комнате, чтобы избежать отбеливания фотографий.
  8. Вымойте образцы три раза с 1 мл PBS.
  9. Повторно приостанавливать образцы в 100 МКЛ PBS и передавать на 96-хорошо пластины для визуализации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Когда не изображены, рекомендуется, чтобы 96-хорошо пластины быть завернуты в алюминиевую фольгу, чтобы избежать фото отбеливания.
  10. Изображение грибковых клеток с использованием 20x и 40x объективных линз с помощью флуоресценции изображения микроскопа. Для обнаружения флуоресцентной лампы 470/40 и длины волны выбросов 525/50 используйте зеленый флуоресцентный белок (GFP) (возбуждение длиной волны 470/40).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Эти результаты наряду с предыдущими выводами из лаборатории Thangamani60 показывают, что, когда C. albicans выращивается ex vivo в кишечнике гомогенатных экстрактов, взятых из желудка, тонкого кишечника и толстой кишки необработанных контроля и антибиотиков обработанных мышей, C. Albicans обычно развивается с дрожжамиморфологии ( Рисунок 1B). Однако, когда выращивается в cecal экстракт из антибиотиков обработанных мышей, C. Albicans легко проходит морфогенез, в результате чего образцы, содержащие дрожжи и гифе формы(рисунок 1B); это не происходит в контрольных мышей. Это подтверждает предыдущие результаты, которые показали значительное увеличение форм гифы в образцах, выращенных в антибиотико-обработанных экстрактах cecal, но не в любых других обработанных антибиотикамиэкстрактах кишечника 60. Эти результаты показывают, что лечение антибиотиками вызывает изменения в cecal окружающей среды, которые вызывают гипхальный морфогенез C. albicans. Кроме того, специфическая локализация этого фенотипа, замеченная только в cecum, также предполагает, что эти гифа-продвигающие условия не обязательно присутствуют по всему желудочно-кишечному тракту, а вместо этого ограничиваются определенными сегментами желудочно-кишечного тракта в зависимости от наличия питательных веществ, метаболитов и других неизвестных молекул.

Так как цикальный экстракт обработанных антибиотиками мышей способствует морфогенезу C. albicans57,58,59,60, мы рассмотрели ли экзогенное добавление выбранной группы метаболитов кишечника (выявленные из предыдущих исследований in vitro) к содержимому cecal цеф-обработанных мышей повлияет на морфогенез C. albicans ex vivo. Предыдущая работа, выполненная лабораторией Thangamani, характеризовала метаболомический профиль гомогената cecal content, извлеченного из необработанных и обработанных антибиотиками мышей, выявляя значительные изменения в изобилии различных метаболитов в результате лечения антибиотиками, в частности, уменьшилось обилие вторичных желчных кислот и увеличилосьизобилие углеводов 60. Кроме того, это исследование показало, что вторичные желчные кислоты и карбоксилиновые кислоты подавляют развитие гифа, в то время как углеводы, включая глюкозу, способствуют гипальному морфогенезу C. albicans in vitro60. Результаты показывают, что добавление обратно пула ингибирующие метаболиты кишечника, содержащие дезоксихолевая кислота (DCA, 0,5 мг/мл), литохолевая кислота (LCA, 0,1 мг/мл), пальмитальная кислота (0,1 мг/мл), р-толякетическая кислота (0,1 мг/мл), себациальная кислота (0,5 мг/мл), 2-метилбутриевая кислота (0,5 мг/мл) и молочная кислота (5 мг/мл) к cecal гомогенату цеф-обработанных мышей полностью ингибируют гипальный морфогенез ex vivo. С другой стороны, экзогенное добавление глюкозы (1 мг/мл) к cecal гомогенату цеф-обработанных мышей показало массивное hyphal развитие ex vivo (Рисунок 2B). В совокупности, эти выводы показывают, что добавление метаболитов кишечника обратно в cecal гомогенат цеф-обработанных мышей дифференциально регулирует морфогенез C. albicans, тем самым подтверждая предыдущие выводы in vitro. Эти результаты показывают, что метаболиты кишечника играют решающую роль в гипхал-морфогенезе C. albicans и понимание целей генов и сигнальных путей, модулированных этими метаболитами, поможет в разработке новых терапевтических подходов к профилактике и лечению инфекций C. albicans.

Figure 1
Рисунок 1: Ex vivo анализ, чтобы определить влияние лечения цефоперазона на C. Albicans гипхал морфогенез в содержимом кишечника. (A)Схема протокола наброски. (B) Антибиотико-обработанные (верхние панели) и необработаемые (нижние панели) содержимое кишечника были взяты из желудка, тонкого кишечника, cecums, и толстой кишки C57BL/6J мышей. Содержимое кишки, привитое C. albicans SC5314, инкубировался при 37 градусов по Цельсию в течение 4-20125 ч и окрашивается антителами C. albicans. Клетки были изображены при увеличении в 40 раз. Репрезентативные изображения показаны здесь. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Экзогенное добавление метаболитов кишечника к содержимому cecal от цеф-обработанных мышей на формировании гифа C. albicans ex vivo. (A)Схема протокола наброски. (B) Ингибирующие метаболиты кишечника, содержащие DCA (0,5 мг/мл), LCA (0,1 мг/мл), пальмитовую кислоту (0,1 мг/мл), р-толилакетическую кислоту (0,1 мг/мл), себаковую кислоту (0,5 мг/мл); 2-метилбутриновой кислоты (0,5 мг/мл) и молочной кислоты (5 мг/мл) или глюкозы (1 мг/мл) были добавлены обратно в cecal содержание cef-обработанных мышей, смешанные тщательно и инкубируется при 37 градусов по Цельсию в течение 15 минут для выполнения ex vivo hyphae анализа. Содержимое cecal, привитое C. albicans SC5314, инкубировался при 37 градусах цельсия в течение 4-20125 ч и окрашивается антителами C. albicans. Клетки были изображены при увеличении в 40 раз. Репрезентативные изображения показаны здесь. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Метод, описанный здесь представляет собой новый способ исследовать влияние антибиотиков, диетических, ксенобиотических и терапевтических воздействий на C. Albicans hyphal морфогенез в желудочно-кишечном тракте. Поскольку большинство системных инфекций происходятиз желудочно-кишечного тракта 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34 и гифа формирования является критическим фактором вирулентности, что способствует распространению C. альбиканы из желудочно-кишечного тракта, понимая факторы, которые контролируют этот морфогенез в желудочно-кишечном тракте расширит знания о механизмах патогенеза и определить новые варианты лечения.

Хотя представленный здесь метод является относительно простым, некоторые шаги, о них говорилось ниже, были определены как критические и важные. i) первоначальный инокулЬ C. albicans должен быть оптимальным, чтобы обеспечить как рост, так и гипальный морфогенез грибов. При ограниченной доступности питательных веществ в экстрактах гомогената кишечника, более высокий объем инокулума может значительно уменьшить грибковый рост и процесс морфогенеза. Тем не менее, рост различных клинических изолятов и штаммов, вероятно, будет переменной, таким образом, оптимизация времени инокуляции и инкубации для конкретных изолятов C. albicans имеет важное значение. ii) при подготовке экстракта гомогената кишечника было установлено, что при подготовке экстракта гомогената имеет решающее значение для как можно большего удаления мусора в кишечнике. iii) в связи с относительно низкой скоростью центрифугации (чтобы избежать повреждения гипхалных структур) необходимо позаботиться о том, чтобы избежать потери клеток во время иммуностепенингных мер в этом протоколе.

Альтернативные методы визуализации грибковых гифа в желудочно-кишечном тракте были использованы в прошлом, с определенными преимуществами и ограничениями, связанными с каждым методом. Один относительно заметный метод использования флуоресцентных на месте гибридизации (FISH) для визуализации грибковых гиф в желудочно-кишечном тракте был недавно продемонстрирован Witchley et al.61,62. Это перспективный метод in vivo, доступный в настоящее время для обнаружения гифа C. albicans непосредственно в желудочно-кишечном тракте, однако сложность этого протокола затрудняет адаптацию его к быстрым, крупномасштабным первоначальным скрининг-исследованиям. Традиционные методы гистопатологии также были использованы в прошлом, чтобы оцифровать C. Albicans дрожжей и гифы формы в желудочно-кишечном тракте. Тем не менее, наблюдение и визуализация грибковых клеток с основной гистопатологии, и гематоксилин и эозин (H/E) пятна остается сложной задачей, так как многие стандартные методы фиксации имеют потенциал, чтобы нарушить слизистый слой образцов желудочно-кишечного тракта, часто повреждения гипальных структур в этом процессе и приводит к противоречивым сообщениям об относительном изобилии гипхальной морфологии клеток во времяинфекции 63 , 64,65 , 65. Этот метод был разработан, чтобы избежать повреждения гифы во время обработки для решения этой проблемы. Кроме того, ткани explants были использованы в качестве способа изучения биологических условий ex vivo, однако эти методы, как правило, сосредоточены и полезны для изучения присоединения или вторжения потенциал C. albicans67, но и они обычно исключают большинство метаболомики и микробиома компонентов, которые способствуют in vivo патогенеза. Хотя протокол ex vivo описанный здесь не вполне имитирует в окружающей среде GI vivo как описано ранее61,62, оно обеспечивает самые близкие возможные условия c. albicans встречает в окружающей среде кишки сравненной к методам in vitro используя искусственние условия роста.

Этот протокол может быть использован для основных анализов скрининга для выявления воздействия экологических сигналов в желудочно-кишечном тракте на гипхалморфез C. albicans. Этот метод позволяет быстро проверять большие группы соединений, включая ингибиторы малых молекул, новые антимикотики и метаболиты для развития гифаля, и может быть использован при скрининге терапевтического лечения или выявлении факторов риска системных заболеваний. Так как C. albicans колонизирует по всему желудочно-кишечному тракту, этот протокол будет дополнительно помогать в выявлении экологических сигналов, присутствующих в конкретных сегментах желудочно-кишечного тракта, которые контролируют гипхалморфез у лиц, принимающих антибиотики, химиотерапевтические агенты, и у пациентов с нарушениями обмена веществ, включая сахарный диабет. В конечном счете метод, описанный здесь, позволяет быстро охарактеризовать гипахал морфогенез в C. albicans по широкому кругу факторов окружающей среды таким образом, что является более биологически актуальным, чем нынешние методы in vitro и значительно быстрее и более ресурсоемким, чем нынешние методы in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют конкурирующих финансовых интересов или других конфликтов интересов.

Acknowledgments

Авторы признают ресурсы и поддержку со стороны Среднего Запада университета сотовых и молекулярных основных научно-исследовательских объектов.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 - 10 µL Pipet Tips Fisher Scientific 02-707-454 Misc
100 - 1000 µL Pipet Tips Fisher Scientific 02-707-400 Misc
20 - 200 µL Pipet Tips Fisher Scientific 02-707-451 Misc
2-methylbutyric acid Sigma 193070-25G hyphal-inhibitory compound
488 goat anti-rabbit IgG Invitrogen (Fisher) A11008 IF Staining secondary ab
Agar Fisher BP1423-500 YPD agar component
Automated Imaging Microscope Keyence BZX700
Candida Albicans Antibody Invitrogen (Fisher) PA1-27158 IF Staining primary ab
cefoperazone Cayman 16113 antibiotic
deoxycholic acid Sigma 30960 hyphal-inhibitory compound
D-Glucose Fisher D16-500 hyphal-promoting compound
forceps Fisher 08-885
lactic acid Alfa Aesar AAAL13242-06 hyphal-inhibitory compound
lithocholic acid Sigma L6250-10G hyphal-inhibitory compound
palmitic acid Sigma P5585-10G hyphal-inhibitory compound
Paraformaldehyde Alfa Aesar A11313 IF Staining fixative
Phosphate-buffered saline (PBS), 10x Alfa Aesar J62692 PBS component
p-tolylacetic acid SCBT sc-257959 hyphal-inhibitory compound
sebacic acid Sigma 283258-250G hyphal-inhibitory compound
sharp ended scissors Fisher 28301
sterile Milli-Q water N/A N/A Misc
YPD Broth BD Biosciences 242810 YPD agar component

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huffnagle, G. B., Noverr, M. C. The emerging world of the fungal microbiome. Trends in Microbiology. 21 (7), 334-341 (2013).
  2. Wisplinghoff, H., et al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clinical Infectious Diseases. 39 (3), 309-317 (2004).
  3. Hajjeh, R. A., et al. Incidence of Bloodstream Infections Due to Candida Species and In Vitro Susceptibilities of Isolates Collected from 1998 to 2000 in a Population-based Active Surveillance Program. Journal of Clinical Microbiology. 42 (4), 1519-1527 (2004).
  4. Lockhart, S. R., et al. Species Identification and Antifungal Susceptibility Testing of Candida Bloodstream Isolates from Population-Based Surveillance Studies in Two U.S. Cities from 2008 to 2011. Journal of Clinical Microbiology. 50 (11), 3435-3442 (2012).
  5. Pfaller, M., et al. Epidemiology and outcomes of candidemia in 3648 patients: data from the Prospective Antifungal Therapy (PATH Alliance(R)) registry, 2004-2008. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 74 (4), 323-331 (2012).
  6. Angarone, M. Fungal infections in cancer patients. Cancer Treatment and Research. 161, 129-155 (2014).
  7. Brown, G. D., et al. Hidden killers: human fungal infections. Science Translational Medicine. 4 (165), 113 (2012).
  8. Calton, E. A., et al. Invasive bacterial and fungal infections in paediatric patients with cancer: incidence, risk factors, aetiology and outcomes in a UK regional cohort 2009-2011. Pediatric Blood & Cancer. 61 (7), 1239-1245 (2014).
  9. Carter, J. H., et al. Medical management of invasive fungal infections of the central nervous system in pediatric cancer patients. Pediatric Blood & Cancer. 62 (6), 1095-1098 (2015).
  10. Low, C. Y., Rotstein, C. Emerging fungal infections in immunocompromised patients. F1000 Medicine Reports. 3, 14 (2011).
  11. Mousset, S., et al. Treatment of invasive fungal infections in cancer patients-updated recommendations of the Infectious Diseases Working Party (AGIHO) of the German Society of Hematology and Oncology (DGHO). Annals of Hematology. 93 (1), 13-32 (2014).
  12. Perfect, J. R., Hachem, R., Wingard, J. R. Update on epidemiology of and preventive strategies for invasive fungal infections in cancer patients. Clinical Infectious Diseases. 59, Suppl 5 352-355 (2014).
  13. Sipsas, N. V., Kontoyiannis, D. P. Invasive fungal infections in patients with cancer in the Intensive Care Unit. International Journal of Antimicrobial Agents. 39 (6), 464-471 (2012).
  14. Falagas, M. E., Apostolou, K. E., Pappas, V. D. Attributable mortality of candidemia: a systematic review of matched cohort and case-control studies. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 25 (7), 419-425 (2006).
  15. Chi, H. W., et al. Candida albicans versus non-albicans bloodstream infections: the comparison of risk factors and outcome. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 44 (5), 369-375 (2011).
  16. Drell, T., et al. Characterization of the vaginal micro- and mycobiome in asymptomatic reproductive-age Estonian women. PLoS One. 8 (1), 54379 (2013).
  17. Merenstein, D., et al. Colonization by Candida species of the oral and vaginal mucosa in HIV-infected and noninfected women. AIDS Research and Human Retroviruses. 29 (1), 30-34 (2013).
  18. Ghannoum, M. A., et al. Characterization of the oral fungal microbiome (mycobiome) in healthy individuals. PLoS Pathogens. 6 (1), 1000713 (2010).
  19. Hoffmann, C., et al. Archaea and fungi of the human gut microbiome: correlations with diet and bacterial residents. PLoS One. 8 (6), 66019 (2013).
  20. Noble, S. M., Gianetti, B. A., Witchley, J. N. Candida albicans cell-type switching and functional plasticity in the mammalian host. Nature Reviews Microbiology. 15 (2), 96-108 (2017).
  21. Samonis, G., et al. Prospective evaluation of effects of broad-spectrum antibiotics on gastrointestinal yeast colonization of humans. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 37 (1), 51-53 (1993).
  22. Sahni, V., et al. Candidemia--an under-recognized nosocomial infection in Indian hospitals. The Journal of the Association of Physicians of India. 53, 607-611 (2005).
  23. Meijer-Severs, G. J., Joshi, J. H. The effect of new broad-spectrum antibiotics on faecal flora of cancer patients. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 24 (4), 605-613 (1989).
  24. Kennedy, M. J., Volz, P. A., Edwards, C. A., Yancey, R. J. Mechanisms of association of Candida albicans with intestinal mucosa. Journal of Medical Microbiology. 24 (4), 333-341 (1987).
  25. Miranda, L. N., et al. Candida colonisation as a source for candidaemia. Journal of Hospital Infections. 72 (1), 9-16 (2009).
  26. Nucci, M., Anaissie, E. Revisiting the source of candidemia: skin or gut. Clinical Infectious Diseases. 33 (12), 1959-1967 (2001).
  27. Raponi, G., Visconti, V., Brunetti, G., Ghezzi, M. C. Clostridium difficile infection and Candida colonization of the gut: is there a correlation. Clinical Infectious Diseases. 59 (11), 1648-1649 (2014).
  28. Guastalegname, M., Russo, A., Falcone, M., Giuliano, S., Venditti, M. Candidemia subsequent to severe infection due to Clostridium difficile: is there a link. Clinical Infectious Diseases. 57 (5), 772-774 (2013).
  29. Nerandzic, M. M., Mullane, K., Miller, M. A., Babakhani, F., Donskey, C. J. Reduced acquisition and overgrowth of vancomycin-resistant enterococci and Candida species in patients treated with fidaxomicin versus vancomycin for Clostridium difficile infection. Clinical Infectious Diseases. 55, Suppl 2 121-126 (2012).
  30. Krause, R., Krejs, G. J., Wenisch, C., Reisinger, E. C. Elevated fecal Candida counts in patients with antibiotic-associated diarrhea: role of soluble fecal substances. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 10 (1), 167-168 (2003).
  31. Krause, R., et al. Role of Candida in antibiotic-associated diarrhea. The Journal of Infectious Diseases. 184 (8), 1065-1069 (2001).
  32. Zuo, T., et al. Gut fungal dysbiosis correlates with reduced efficacy of fecal microbiota transplantation in Clostridium difficile infection. Nature Communications. 9 (1), 3663 (2018).
  33. Delaloye, J., Calandra, T. Invasive candidiasis as a cause of sepsis in the critically ill patient. Virulence. 5 (1), 161-169 (2014).
  34. Cole, G. T., Halawa, A. A., Anaissie, E. J. The role of the gastrointestinal tract in hematogenous candidiasis: from the laboratory to the bedside. Clinical Infectious Diseases. 22, Suppl 2 73-88 (1996).
  35. Lo, H. J., et al. Nonfilamentous C. albicans mutants are avirulent. Cell. 90 (5), 939-949 (1997).
  36. Gale, C. A., et al. Linkage of adhesion, filamentous growth, and virulence in Candida albicans to a single gene, INT1. Science. 279 (5355), 1355-1358 (1998).
  37. Bendel, C. M., et al. Systemic infection following intravenous inoculation of mice with Candida albicans int1 mutant strains. Molecular genetics and metabolism. 67 (4), 343-351 (1999).
  38. Toenjes, K. A., et al. Small-molecule inhibitors of the budded-to-hyphal-form transition in the pathogenic yeast Candida albicans. Antimicrobial agents and chemotherapy. 49 (3), 963-972 (2005).
  39. Carlisle, P. L., et al. Expression levels of a filament-specific transcriptional regulator are sufficient to determine Candida albicans morphology and virulence. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (2), 599-604 (2009).
  40. Fazly, A., et al. Chemical screening identifies filastatin, a small molecule inhibitor of Candida albicans adhesion, morphogenesis, and pathogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (33), 13594-13599 (2013).
  41. Pande, K., Chen, C., Noble, S. M. Passage through the mammalian gut triggers a phenotypic switch that promotes Candida albicans commensalism. Nature genetics. 45 (9), 1088 (2013).
  42. Bar-Yosef, H., Gonzalez, N. V., Ben-Aroya, S., Kron, S. J., Kornitzer, D. Chemical inhibitors of Candida albicans hyphal morphogenesis target endocytosis. Scientific reports. 7 (1), 5692 (2017).
  43. Mendelsohn, S., Pinsky, M., Weissman, Z., Kornitzer, D. Regulation of the Candida albicans hypha-inducing transcription factor Ume6 by the CDK1 cyclins Cln3 and Hgc1. mSphere. 2 (2), 00248 (2017).
  44. Vila, T., et al. Targeting Candida albicans filamentation for antifungal drug development. Virulence. 8 (2), 150-158 (2017).
  45. Pande, K., Chen, C., Noble, S. M. Passage through the mammalian gut triggers a phenotypic switch that promotes Candida albicans commensalism. Nature Genetics. 45 (9), 1088-1091 (2013).
  46. Lo, H. J., et al. Nonfilamentous C. albicans mutants are avirulent. Cell. 90 (5), 939-949 (1997).
  47. Bar-Yosef, H., Vivanco Gonzalez, N., Ben-Aroya, S., Kron, S. J., Kornitzer, D. Chemical inhibitors of Candida albicans hyphal morphogenesis target endocytosis. Scientific Reports. 7 (1), 5692 (2017).
  48. Carlisle, P. L., et al. Expression levels of a filament-specific transcriptional regulator are sufficient to determine Candida albicans morphology and virulence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (2), 599-604 (2009).
  49. Mendelsohn, S., Pinsky, M., Weissman, Z., Kornitzer, D. Regulation of the Candida albicans Hypha-Inducing Transcription Factor Ume6 by the CDK1 Cyclins Cln3 and Hgc1. mSphere. 2 (2), (2017).
  50. Bendel, C. M., et al. Effects of Alteration of the Candida albicans Gene INT1 on Cecal Colonization in Orally Innoculated Mice. Pediatric Research. 45, 156 (1999).
  51. Gale, C. A., et al. Linkage of adhesion, filamentous growth, and virulence in Candida albicans to a single gene, INT1. Science. 279 (5355), 1355-1358 (1998).
  52. Toenjes, K. A., et al. Small-molecule inhibitors of the budded-to-hyphal-form transition in the pathogenic yeast Candida albicans. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (3), 963-972 (2005).
  53. Fazly, A., et al. Chemical screening identifies filastatin, a small molecule inhibitor of Candida albicans adhesion, morphogenesis, and pathogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13594-13599 (2013).
  54. Naseem, S., Gunasekera, A., Araya, E., Konopka, J. B. N-acetylglucosamine (GlcNAc) induction of hyphal morphogenesis and transcriptional responses in Candida albicans are not dependent on its metabolism. Journal of Biological Chemistry. 286 (33), 28671-28680 (2011).
  55. Piispanen, A. E., Hogan, D. A. PEPped up: induction of Candida albicans virulence by bacterial cell wall fragments. Cell Host & Microbe. 4 (1), 1-2 (2008).
  56. Xu, X. L., et al. Bacterial peptidoglycan triggers Candida albicans hyphal growth by directly activating the adenylyl cyclase Cyr1p. Cell Host & Microbe. 4 (1), 28-39 (2008).
  57. Guinan, J., Thangamani, S. Antibiotic-induced alterations in taurocholic acid levels promote gastrointestinal colonization of Candida albicans. FEMS microbiology letters. 365 (18), (2018).
  58. Guinan, J., Villa, P., Thangamani, S. Secondary bile acids inhibit Candida albicans growth and morphogenesis. Pathogens and disease. 76 (3), (2018).
  59. Guinan, J., Wang, S., Hazbun, T. R., Yadav, H., Thangamani, S. Antibiotic-induced decreases in the levels of microbial-derived short-chain fatty acids correlate with increased gastrointestinal colonization of Candida albicans. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
  60. Gutierrez, D., et al. Antibiotic-induced gut metabolome and microbiome alterations increase the susceptibility to Candida albicans colonization in the gastrointestinal tract. FEMS microbiology ecology. 96 (1), 187 (2020).
  61. Witchley, J. N., et al. Candida albicans morphogenesis programs control the balance between gut commensalism and invasive infection. Cell Host & Microbe. 25 (3), 432-443 (2019).
  62. Witchley, J. N., Penumetcha, P. M., Noble, S. M. Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (153), e60283 (2019).
  63. Johansson, M. E., Hansson, G. C. Preservation of mucus in histological sections, immunostaining of mucins in fixed tissue, and localization of bacteria with FISH. Mucins. , Springer. 229-235 (2012).
  64. Lossinsky, A. S., et al. The histopathology of Candida albicans invasion in neonatal rat tissues and in the human blood-brain barrier in culture revealed by light, scanning, transmission and immunoelectron microscopy scanning. Histology and histopathology. , (2006).
  65. Rosenbach, A., Dignard, D., Pierce, J. V., Whiteway, M., Kumamoto, C. A. Adaptations of Candida albicans for growth in the mammalian intestinal tract. Eukaryotic Cell. 9, 1075-1086 (2010).
  66. Vautier, S., et al. C andida albicans colonization and dissemination from the murine gastrointestinal tract: the influence of morphology and T h17 immunity. Cellular Microbiology. 17, 445-450 (2015).
  67. Lyman, C., Navarro, E., Garrett, K., Roberts, D., Pizzo, P., Walsh, T. Adherence of Candida albicans to bladder mucosa: development and application of a tissue explant assay. Mycoses. 42, 255-259 (1999).

Tags

Иммунология и инфекция выпуск 161 Candida albicans гипхал морфогенез ex vivo анализ глюкоза вторичные желчные кислоты и желудочно-кишечный тракт
Ex vivo Assay для изучения <em>Candida Albicans</em> Hyphal Morphogenesis в желудочно-кишечном тракте
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Monasky, R., Villa, S., Thangamani,… More

Monasky, R., Villa, S., Thangamani, S. An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract. J. Vis. Exp. (161), e61488, doi:10.3791/61488 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter