Præsenteret her er en fosforproteomic tilgang, nemlig stop og gå udvinding tip baseret fosforproteomic, som giver høj-gennemløb og dyb dækning af Arabidopsis fosforproteome. Denne tilgang afgrænser overblikket over osmotisk stresssignalering i Arabidopsis.
Proteinphosphorylering er afgørende for reguleringen af enzymaktivitet og genekspression under osmotisk tilstand. Massespektrometri (MS)-baserede fosforproteomics har ændret måden at studere plantesignaltransduktion på. Kravet om masser af råvarer og forlænget MS-målingstid for at opnå dækningsdybden har imidlertid været den begrænsende faktor for den høje gennemstrømningsundersøgelse af globale fosforprotemiske ændringer i planter. For at forbedre følsomheden og gennemstrømningen af plantephosphoproteomics har vi udviklet en stop and go-ekstraktion (fase) spidsbaseret fosforproteomics-tilgang kombineret med Tandem Mass Tag (TMT) mærkning til hurtig og omfattende analyse af plantephosphoryleringsengturbation som reaktion på osmotisk stress. Ved at udnytte enkelheden og den høje gennemløb af fasespidsteknikken tager hele proceduren cirka en time at bruge to spidser til at afslutte fosforberigelse, fraktionering og prøverensningstrin, hvilket tyder på en brugervenlig og høj effektivitet af tilgangen. Denne fremgangsmåde giver ikke kun en dybdegående plantephoosphoproteomics-analyse (> 11.000 fosforidentifikation), men viser også den overlegne adskillelseseffektivitet (< 5% overlapning) mellem tilstødende fraktioner. Desuden er multipleksering opnået ved hjælp af TMT-mærkning for at kvantificere fosforprotemiske ændringer af vilde og snrk2 decuple mutantplanter. Denne tilgang er med succes blevet brugt til at afsløre fosforyleringshændelserne i Raf-lignende kinases som reaktion på osmotisk stress, som kaster lys over forståelsen af tidlig osmotisk signalering i landplanter.
Høj saltholdighed, lav temperatur og tørke forårsager osmotiske belastninger, som er en vigtig miljøfaktor, der påvirker planteproduktivitet1,2. Proteinphosphorylering er en af de mest betydningsfulde ændringer efter oversættelsen , der formidler signalopfattelse og transduktion i anlæggets reaktion på osmotisk stress3,4,5. SNF1-relateret protein kinase 2s (SnRK2s) er involveret i den osmotiske stress signalering6. Ni af ti medlemmer af SnRK2 familien viser betydelig aktivering som reaktion på osmotisk stress7,8. Den snrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10 decuple (snrk2-dec) mutant har mutationer i alle ti SnRK2 vises overfølsomhed over for osmotisk stress. I snrk2-dec mutant, den osmotiske stress-induceret ophobning af inositol 1,4,5-trisphosphat (IP3), abscissyre (ABA) biosyntese, og genekspressioner er stærkt reduceret, fremhæver den afgørende rolle SnRK2s i osmotisk stressrespons6. Det er dog stadig uklart, hvordan SnRK2s kinases regulerer disse biologiske processer. Profilering af fosforprotemomic ændringer som reaktion på osmotisk stress er en effektiv måde at bygge bro over denne kløft og til at afgrænse osmotiske stress-udløste forsvarsmekanismer i planter.
Massespektrometri (MS) er en effektiv teknik til kortlægning af plantephoproteome9. Karakterisering af plantephosphoproteomics er imidlertid fortsat en udfordring på grund af det dynamiske udvalg af planteproteom og kompleksiteten af plante lysat4. For at overvinde disse udfordringer udviklede vi en universel plantephoproteomic arbejdsgang, som eliminerer uønskede interferenser som fra fotosyntetiske pigmenter og sekundære metabolitter og muliggør den dybe dækning af plantefosforproteome10. Der er udviklet flere fosforberigelsesmetoder såsom immobiliseret metalion-affinitetskromatografi (IMAC) og metaloxidkromatografi (MOC) til berigelse af fosforider forud for MS-analyse11,12,13,14,15,16. Sure ikke-phosphopeptider, der er medrensende med fosfortider, er de største interferenser for fosfordetektion. Tidligere har vi standardiseret pH-værdien og koncentrationen af organisk syre i IMAC-belastningsbuffer for at eliminere bindingen af ikke-phosphopeptider for at opnå mere end 90% berigelse specificitet uden om præfraktionstrin11.
Prøvetab i flertrinsprocessen for fosforberigelse og fraktionering hæmmer fosforidentifikationens følsomhed og dybden af fosforprotemisk dækning. Stop-and-go-ekstraktionsspidser (trinspidser) er pipettespidser, der indeholder små diske til at lægge låg på enden af spidsen, som kan indarbejdes med kromatografi til peptidfraktionering og rengøring17. Prøvetab under fasespidsproceduren kan minimeres ved at undgå prøveoverførsel mellem rørene. Vi har med succes implementeret fase tip i Ga3 +-IMAC og Fe3 +-IMAC at adskille lav rigelige flere fosforitilerede peptider fra enkeltvis phosphorylated peptider, som forbedrede dybden af menneskelige fosforeom15. Desuden har brugen af høj pH-bakfase (Hp-RP) trinspids vist den bredere dækning af humanmembran proteom sammenlignet med stærk kation udveksling (SCX) og stærk anion udveksling (SAX) kromatografi18. Derfor kan integration af IMAC- og Hp-RP-scenespidsteknikker øge plantens fosforproteome-dækning med enkelhed, høj specificitet og høj gennemløb. Vi har vist, at denne strategi identificerede mere end 20.000 fosforyleringssteder fra Arabidopsis-frøplanter, hvilket repræsenterer en forbedret dybde af plantephoproteome19.
Her rapporterer vi en fase tip-baseret fosforproteomic protokol for fosforproteomic profilering i Arabidopsis. Denne arbejdsgang blev anvendt til at studere fosforproteomic forstyrrelse af vilde-type og snrk2-dec mutant kimplanter som reaktion på osmotisk stress. Fosforproteomic analyse afslørede fosforylering steder impliceret i kinase aktivering og tidlig osmotisk stress signalering. Sammenlignende analyse af wild-type og snrk2-dec mutant phosphoproteome data førte opdagelsen af en Raf-lignende kinase (RAF)-SnRK2 kinase kaskade, som spiller en central rolle i osmore stress signalering i høje planter.
Det dynamiske område og kompleksiteten af planteproteom og fosforproteom er stadig en begrænsende faktor til dybden af fosforproteomics analyser. På trods af at LC-MS/MS-analysen med en enkelt kørsel er i stand til at identificere 10.000 fosforyleringssteder21,22, er dækningen af hele plantefosforproteomet stadig begrænset. Derfor kræves der en fosforæmisk arbejdsgang, der giver høj følsomhed og overlegen adskillelseseffektivitet, ved profilering af det…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af det strategiske prioriterede forskningsprogram for det kinesiske videnskabsakademi, Grant XDB27040106.
1.5 mL tube | eppendorf | 22431081 | Protein LoBind, 1.5 mL, PCR clean, colorless, 100 tubes |
200 µL pipet tip | Gilson | F1739311 | |
2-chloroacetamide | Sigma-Aldrich | C0267 | |
acetic acid | Sigma-Aldrich | 5438080100 | |
acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | |
ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 | |
ammonium phosphate monbasic | Sigma-Aldrich | 216003 | |
BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
blunt-ended needle | Hamilton | 90516 | Kel-F hub (KF), point style 3, gauge 16 |
C18-AQ beads | Dr. Maisch | ReproSil-Pur-C18-AQ 5 µm | |
C8 Empore disk | 3 M | 2214 | 47 mm |
Centrifuge | eppendorf | 22620444 | |
chloroform | Sigma-Aldrich | CX1058 | |
data analysis software | Perseus 1.6.2.1 | https://maxquant.net/perseus/ | |
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ||
formic acid | Sigma-Aldrich | 5330020050 | |
Frits | Agilent | 12131024 | Frits for SPE Cartridges |
Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 50933 | |
H2O | Sigma-Aldrich | 1153334000 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Iron (III) chloride | Sigma-Aldrich | 157740 | |
LTQ-orbitrap | Thermo Fisher Scientific | Velos Pro | |
mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | LTQ-Orbitrap Velos Pro | |
methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
nano LC | Thermo Fisher Scientific | Easy-nLC 1000 | |
Ni-NTA spin column | Qiagen | 31014 | |
N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L9150 | |
plunger | Hamilton | 1122-01 | Plunger assembly N, RN, LT, LTN for model 1702 (25 μl) |
search engine software | MaxQuant 1.5.4.1 | https://www.maxquant.org | |
SEP-PAK Cartridge 50 mg | Waters | WAT054960 | |
sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
SpeedVac | Thermo Fisher Scientific | SPD121P | |
TMT 6-plex | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
Triethylammonium bicarbonate buffer | Sigma-Aldrich | T7408 | |
Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | |
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C4706 | |
Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 |