Presentert her er en fosfoproteomisk tilnærming, nemlig stoppe og gå ekstraksjon tips basert fosfoproteomisk, som gir høy gjennomstrømning og dyp dekning av Arabidopsis fosfoproteom. Denne tilnærmingen avgrenser oversikten over osmotisk stresssignalering i Arabidopsis.
Proteinfosforylering er avgjørende for regulering av enzymaktivitet og genuttrykk under osmotisk tilstand. Massespektrometri (MS)-baserte fosfoproteomics har forvandlet måten å studere anlegget signal transduksjon. Imidlertid har kravet om mange startmaterialer og langvarig MS-måletid for å oppnå dybden av dekning vært den begrensende faktoren for den høye gjennomstrømningsstudien av globale fosfoproteomiske endringer i planter. For å forbedre følsomheten og gjennomstrømningen av plantefosfoproteomics, har vi utviklet en stopp og gå ekstraksjon (stadium) tipsbasert fosfoproteomics tilnærming kombinert med Tandem Mass Tag (TMT) merking for rask og omfattende analyse av plante fosforylering perturbasjon som svar på osmotisk stress. Ved hjelp av enkelheten og den høye gjennomstrømningen av trinnspissteknikk, tar hele prosedyren omtrent en time ved hjelp av to tips for å fullføre fosfoeptidberikelse, fraksjonering og prøverengjøringstrinn, noe som tyder på en brukervennlig og høy effektivitet av tilnærmingen. Denne tilnærmingen gir ikke bare en grundig plantefosfoproteomics analyse (> 11,000 fosfoeptid identifikasjon), men viser også overlegen separasjon effektivitet (< 5% overlapping) mellom tilstøtende fraksjoner. Videre er multipleksing oppnådd ved hjelp av TMT-merking for å kvantifisere fosfoproteomiske endringer av villtype og snrk2 decuple muterte planter. Denne tilnærmingen har med hell blitt brukt til å avsløre fosforyleringshendelsene til Raf-lignende kinaser som svar på osmotisk stress, som kaster lys over forståelsen av tidlig osmotisk signalering i landplanter.
Høy saltholdighet, lav temperatur og tørke forårsake osmotiske påkjenninger, noe som er en viktig miljøfaktor som påvirker planteproduktiviteten1,2. Proteinfosforylering er en av de viktigste post-translasjonelle modifikasjoner mediere signaloppfatning og transduksjon i planterespons på osmotisk stress3,4,5. SNF1-relatert protein kinase 2s (SnRK2s) er involvert i osmotisk stress signalering6. Ni av ti medlemmer av SnRK2-familien viser betydelig aktivering som svar på osmotisk stress7,8. Snrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10 decuple(snrk2-dec)mutert med mutasjoner i alle ti SnRK2 viste overfølsomhet overfor osmotisk stress. I snrk2-dec mutant er den osmotiske stressinduserte akkumuleringen av inositol 1,4,5-trisfosfat (IP3),abscisic acid (ABA) biosyntese og genuttrykk sterkt redusert, og fremhever den vitale rollen til SnRK2s i osmotiske stressresponser6. Det er imidlertid fortsatt uklart hvordan SnRK2s kinaser regulerer disse biologiske prosessene. Profilering av fosfoproteomiske endringer som svar på osmotisk stress er en effektiv måte å bygge bro over dette gapet og å avgrense de osmotiske stressutløste forsvarsmekanismene i planter.
Massespektrometri (MS) er en kraftig teknikk for kartlegging av plantefosfoproteom9. Karakterisering av plantefosfoproteomics er imidlertid fortsatt en utfordring på grunn av det dynamiske spekteret av planteproom og kompleksiteten av plantelysat4. For å overvinne disse utfordringene utviklet vi en universell plantefosfoproteomisk arbeidsflyt, som eliminerer uønskede forstyrrelser som fra fotosyntetiske pigmenter og sekundære metabolitter, og muliggjør dyp dekning av plantefosfoproteom10. Flere fosfoeptidberikelsesmetoder som immobilisert metallionaffinitetskromatografi (IMAC) og metalloksidkromatografi (MOC) er utviklet for berikende fosfoopeptider før MS-analyse11,12,13,14,15,16. Sure ikke-fosfoproeptider samtidig rensing med fosfokleptider er de viktigste forstyrrelsene for fosfoeptiddeteksjon. Tidligere standardiserte vi pH-verdien og organisk syrekonsentrasjon av IMAC-lastbuffer for å eliminere bindingen av ikke-fosfoopeptider, for å oppnå mer enn 90% berikelsespesifisitet som omgår pre-fraksjoneringstrinn11.
Prøvetap i flertrinnsprosessen av fosfoprotidberikelse og fraksjonering hindrer følsomheten til fosfoproeptididentifikasjon og dybden av fosfoproteomisk dekning. Stop-and-go-ekstraksjonsspisser (scenespisser) er pipettespisser som inneholder små disker for å dekke enden av spissen, som kan innlemmes med kromatografi for peptidfraksjon ogrengjøring 17. Prøvetap under trinnspissen kan minimeres ved å unngå prøveoverføring mellom rørene. Vi har implementert scenetips i Ga3 +-IMAC og Fe3 +-IMAC for å skille lav rikelig flere fosforylerte peptider fra enkeltfosforylerte peptider, noe som forbedret dybden av menneskelig fosfoproteom15. I tillegg har bruken av høy pH reversert fase (Hp-RP) stadium tips vist bredere dekning av menneskelig membran proteom sammenlignet med sterk kation utveksling (SCX) og sterk anion utveksling (SAX) kromatografi18. Derfor kan integrering av IMAC- og Hp-RP-trinns spissteknikker øke plantefosfoproteomdekningen med enkelhet, høy spesifisitet og høy gjennomstrømning. Vi har vist at denne strategien identifiserte mer enn 20.000 fosforyleringssteder fra Arabidopsis frøplanter, som representerer en forbedret dybde av plantefosfoproteom19.
Her rapporterer vi en stadium tipsbasert fosfoproteomisk protokoll for fosfoproteomisk profilering i Arabidopsis. Denne arbeidsflyten ble brukt til å studere fosfoproteomisk perturbasjon av villtype og snrk2-des muterte frøplanter som svar på osmotisk stress. Fosfoproteomisk analyse avslørte fosforyleringsstedene som er involvert i kinaseaktivering og tidlig osmotisk stresssignalering. Komparativ analyse av villtype og snrk2-des muterte fosfoproteomdata førte til oppdagelsen av en Raf-lignende kinase (RAF)-SnRK2 kinase kaskade som spiller en nøkkelrolle i osmore stress signalering i høye planter.
Det dynamiske området og kompleksiteten til planteproom og fosfoproteom er fortsatt en begrensende faktor for dybden av fosfoproteomics analyser. Til tross for muligheten for enkeltkjøring LC-MS / MS analyse for å identifisere 10.000 fosforyleringnettsteder 21,22,dekningen av hele anlegget fosfoproteom er fortsatt begrenset. Derfor er det nødvendig med en fosfoproteomisk arbeidsflyt som gir høy følsomhet og overlegen separasjonseffektivitet for å profilere…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Strategic Priority Research Program fra Det kinesiske vitenskapsakademiet, Grant XDB27040106.
1.5 mL tube | eppendorf | 22431081 | Protein LoBind, 1.5 mL, PCR clean, colorless, 100 tubes |
200 µL pipet tip | Gilson | F1739311 | |
2-chloroacetamide | Sigma-Aldrich | C0267 | |
acetic acid | Sigma-Aldrich | 5438080100 | |
acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | |
ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 | |
ammonium phosphate monbasic | Sigma-Aldrich | 216003 | |
BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
blunt-ended needle | Hamilton | 90516 | Kel-F hub (KF), point style 3, gauge 16 |
C18-AQ beads | Dr. Maisch | ReproSil-Pur-C18-AQ 5 µm | |
C8 Empore disk | 3 M | 2214 | 47 mm |
Centrifuge | eppendorf | 22620444 | |
chloroform | Sigma-Aldrich | CX1058 | |
data analysis software | Perseus 1.6.2.1 | https://maxquant.net/perseus/ | |
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ||
formic acid | Sigma-Aldrich | 5330020050 | |
Frits | Agilent | 12131024 | Frits for SPE Cartridges |
Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 50933 | |
H2O | Sigma-Aldrich | 1153334000 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Iron (III) chloride | Sigma-Aldrich | 157740 | |
LTQ-orbitrap | Thermo Fisher Scientific | Velos Pro | |
mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | LTQ-Orbitrap Velos Pro | |
methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
nano LC | Thermo Fisher Scientific | Easy-nLC 1000 | |
Ni-NTA spin column | Qiagen | 31014 | |
N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L9150 | |
plunger | Hamilton | 1122-01 | Plunger assembly N, RN, LT, LTN for model 1702 (25 μl) |
search engine software | MaxQuant 1.5.4.1 | https://www.maxquant.org | |
SEP-PAK Cartridge 50 mg | Waters | WAT054960 | |
sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
SpeedVac | Thermo Fisher Scientific | SPD121P | |
TMT 6-plex | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
Triethylammonium bicarbonate buffer | Sigma-Aldrich | T7408 | |
Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | |
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C4706 | |
Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 |