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Chemistry

माउस रेटिना पिगमेंट एपिथेलियम की लाइट-पैदा हुई विद्युत प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड करने के लिए डायरेक्ट-युग्मित इलेक्ट्रोरेटिनोग्राम (डीसी-ईआरजी)

doi: 10.3791/61491 Published: July 14, 2020
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम चूहों में रेटिना वर्णक एपिथेलियम (आरपीई) की प्रकाश-पैदा विद्युत प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं, जिसे पहले 2000 के दशक में मारमोरस्टीन, पीची और सहयोगियों द्वारा वर्णित डीसी-ईआरजी के रूप में जाना जाता है।

Abstract

रेटिना पिगमेंट एपिथेलियम (आरपीई) रेटिना और कोरियोकैपिलरिस के बीच रणनीतिक रूप से स्थित कोशिकाओं का एक विशेष मोनोलेयर है जो फोटोरिसेप्टर्स के समग्र स्वास्थ्य और संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखता है। आरपीई ध्रुवीकृत है, एपिक और बेसली स्थित रिसेप्टर्स या चैनलों का प्रदर्शन करता है, और पानी, आयनों, मेटाबोलाइट्स के वेक्टरल परिवहन करता है, और कई साइटोकिन्स का स्राव करता है।

आरपीई फ़ंक्शन के वीवो नॉनइनवेसिव मापों में प्रत्यक्ष-युग्मित ईआरजी (डीसी-ईआरजी) का उपयोग करके बनाया जा सकता है। डीसी-ईआरजी के पीछे की कार्यप्रणाली को मारमोरस्टीन, पीची और सहयोगियों द्वारा कस्टम-निर्मित उत्तेजना रिकॉर्डिंग प्रणाली का उपयोग करके बीड़ा उठाया गया था और बाद में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रणाली का उपयोग करके प्रदर्शन किया गया था। डीसी-ईआरजी तकनीक हैंक के बफर्ड सॉल्ट सॉल्यूशन (एचबीबीएस) से भरी कांच की केशिकाओं का उपयोग करती है ताकि फोटोरिसेप्टर गतिविधि के कारण सबरेटिनल अंतरिक्ष में प्रकाश-पैदा एकाग्रता परिवर्तन से प्राप्त आरपीई की धीमी विद्युत प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए किया जा सके। लंबे समय तक प्रकाश उत्तेजना और डीसी-ईआरजी रिकॉर्डिंग की लंबाई इसे बहाव और शोर के लिए असुरक्षित बनाती है जिसके परिणामस्वरूप उपयोग योग्य रिकॉर्डिंग की कम उपज होती है। यहां, हम रिकॉर्डिंग की स्थिरता में सुधार के लिए एक तेज, विश्वसनीय विधि प्रस्तुत करते हैं, जबकि वैक्यूम दबाव का उपयोग करके शोर को कम करने/बुलबुले को खत्म करने के लिए है कि HBSS और इलेक्ट्रोड धारक के outgassing से परिणाम । इसके अतिरिक्त, बिजली लाइन कलाकृतियों एक वोल्टेज नियामक/बिजली कंडीशनर का उपयोग कर तनु हैं । हम एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ईआरजी प्रणाली के लिए आवश्यक प्रकाश उत्तेजना प्रोटोकॉल के साथ-साथ डीसी-ईआरजी घटकों के विश्लेषण के लिए स्क्रिप्ट शामिल हैं: सी-वेव, तेज दोलन, प्रकाश शिखर, और प्रतिक्रिया से। रिकॉर्डिंग की बेहतर आसानी और तेजी से विश्लेषण कार्यप्रवाह के कारण, यह सरलीकृत प्रोटोकॉल आरपीई समारोह, रोग प्रगति और औषधीय हस्तक्षेप के आकलन में उम्र से संबंधित परिवर्तनों को मापने में विशेष रूप से उपयोगी है।

Introduction

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रेटिना पिगमेंट एपिथेलियम (आरपीई) विशेष कोशिकाओं का एक मोनोलेयर है जो आंखों के पीछे के खंड को लाइन करता है और रेटिना होमोस्टेसिस1को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण कार्य करता है। आरपीई एक प्रक्रिया में अपने फोटॉन कैप्चरिंग दृश्य वर्णक को पुनर्जीवित करके फोटोरिसेप्टर्स का समर्थन करता है, जिसे दृश्य चक्र 2 कहाजाताहै, शेड आउटर सेगमेंट टिप्स3के दैनिक फैगोसाइटोसिस में भाग लेकर, और फोटोरिसेप्टर्स और कोरियोकैपिलरिस4,5के बीच पोषक तत्वों और मेटाबोलिक उत्पादों के परिवहन में। आरपीई फ़ंक्शन में असामान्यताएं कई मानव रेटिना रोगों को रेखांकित करती हैं, जैसे कि उम्र से संबंधित मैकुलर डिजनरेशन6,लेबर की जन्मजात अमौरोसिस7,8 और बेस्ट विटेलीफॉर्म मैक्युलर डिस्ट्रॉफी9। चूंकि दाता नेत्र ऊतकों को अक्सर केवल अनुसंधान उद्देश्यों के लिए प्राप्त करना मुश्किल होता है, आनुवंशिक संशोधनों वाले पशु मॉडल रेटिना रोगों के विकास का अध्ययन करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका प्रदान कर सकते हैं10,11। इसके अतिरिक्त, CRISPR cas9 प्रौद्योगिकी का उद्भव और अनुप्रयोग अब पूर्व जीन लक्ष्यीकरण प्रौद्योगिकियों की सीमाओं को पार करते हुए एक सरल, एक कदम की प्रक्रिया में जीनोमिक परिचय (नॉक-इन) या विलोपन (नॉक-आउट) की अनुमति देता है12। नए माउस मॉडल13 की उपलब्धता में तेजी को आरपीई फ़ंक्शन का मूल्यांकन करने के लिए एक अधिक कुशल रिकॉर्डिंग प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है।

आरपीई की हल्की-पैदा हुई विद्युत प्रतिक्रियाओं का मापन प्रत्यक्ष-युग्मित इलेक्ट्रोरेटिनोग्राम (डीसी-ईआरजी) तकनीक का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। जब पारंपरिक ईआरजी रिकॉर्डिंग के संयोजन में उपयोग किया जाता है जो फोटोरिसेप्टर (ए-वेव) और बाइपोलर (बी-वेव) सेल प्रतिक्रियाओं को मापते हैं14,डीसी-ईआरजी यह परिभाषित कर सकते हैं कि रेटिना अध: पतन15, 16,17के साथ आरपीई की प्रतिक्रिया गुण कैसे बदलते हैं या क्या आरपीई की शिथिलता फोटोरिसेप्टर हानि से पहले होती है। यह प्रोटोकॉल मार्मोरस्टीन, पीची और सहयोगियों के काम से अनुकूलित एक विधि का वर्णन करता है जिन्होंने पहले डीसी-ईआरजी तकनीक16, 18,19,20 विकसित की और प्रजनन क्षमता और उपयोग में आसानी में सुधार किया।

डीसी-ईआरजी रिकॉर्डिंग लंबे अधिग्रहण समय (9 मिनट) के कारण प्रदर्शन करना मुश्किल है जिसके दौरान शोर की कोई रुकावट या परिचय डेटा की व्याख्या को जटिल बना सकता है। इस नई विधि का लाभ यह है कि बेसलाइन समय की एक छोटी राशि के भीतर स्थिर स्थिति तक पहुंचने की संभावना है कि जानवर संज्ञाहरण से समय से पहले जागजाएगा और केशिका इलेक्ट्रोड में बुलबुला गठन के लिए कम प्रवण है ।

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Protocol

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यह प्रोटोकॉल राष्ट्रीय नेत्र संस्थान की पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित पशु अध्ययन प्रोटोकॉल में उल्लिखित पशु देखभाल दिशानिर्देशों का पालन करता है ।

1. डीसी-ईआरजी के लिए प्रकाश उत्तेजना प्रोटोकॉल आयात करना

नोट: ईआरजी सिस्टम सॉफ्टवेयर(सामग्रीकी तालिका) में डीसी-ईआरजी के लिए प्रकाश उत्तेजना प्रोटोकॉल आयात करने के लिए नीचे दिए गए निर्देशों का पालन करें। प्रोटोकॉल में 0.5 मिनट पूर्व-उत्तेजना अंतराल होता है, जिसके बाद 7 मिनट के लिए प्रकाश (10 सीडी/एम2)का एक कदम होता है, और 1.5 मिनट के बाद उत्तेजना अंतराल के साथ समाप्त होता है। 10 सीडी/एम 2 (1 लॉग10 सीडी/एम2) की हल्की तीव्रता का चयन किया गया था क्योंकि यह डब्ल्यूटी चूहों18,21में डीसी-ईआरजी के सभी घटकों के लिए लगभग आधा अधिकतम प्रतिक्रिया देता है । सी-वेव और तेज दोलन विशेष रुचि के हैं क्योंकि इन विद्युत प्रतिक्रियाओं की उत्पत्ति अच्छी तरह से विशेषता है और विट्रो आरपीई मॉडल (जैसे, आईपीएससी-आरपीई) में अलग-थलग और अध्ययन किया जा सकता है। अन्य प्रकाश तीव्रता के आवेदन अतिरिक्त जानकारी निकाल सकते हैं, उदाहरण के लिए, बंद प्रतिक्रिया उज्जवल प्रकाश उत्तेजनाओं पर ध्रुवता के उलट से गुजरता है और तीव्रता जिस पर इस उलट जगह लेता है पर मतभेद दिखा सकते हैं । उपयोगकर्ता अपने विवेक से प्रकाश तीव्रता सेटिंग्स को बदलने के लिए स्वतंत्र है।

  1. ईआरजी सिस्टम सॉफ्टवेयर खोलें।
  2. डाटाबेस सेंटरपर क्लिक करें ।
  3. नई पर क्लिक करें (एक नया डेटाबेस फ़ाइल नाम प्रदान करते हैं) । सेवपर क्लिक करें । पॉपअप बॉक्स प्रदर्शित करेगा: "डेटाबेस बनाया गया है, क्या आप नए डेटाबेस फ़ाइल से कनेक्ट करना चाहते हैं। हांपर क्लिक करें । वर्तमान डेटाबेस नाम अब नई फ़ाइल नाम को प्रतिबिंबित करना चाहिए।
  4. डाटाबेस कंट्रोल सेंटर विंडो में ट्रांसफर इन पर क्लिक करें।
  5. पूरक फ़ाइल 1 का चयन करें: लाइटप्रोटोल - स्थानांतरण। EXP. ओपनपर क्लिक करें ।
  6. प्रगति बार के पूरा होने पर क्लोज (डाटाबेस कंट्रोल सेंटर) पर क्लिक करें।
  7. ग्रीन स्टार्ट बटन पर क्लिक करें।
  8. चुनें रोगी विंडोपर नई पर क्लिक करें । माउस मॉडल का वर्णन करते हुए एक नया रोगी परिवार का नाम बनाएं, जन्म तिथि (डीओबी, एमएम/डीडी/y) दर्ज करें, उचित विवरण के लिए लिंग (एम/एफ) बटन को टॉगल करें। प्रायोगिक विवरण को सहेजने के लिए करीब पर क्लिक करें।
  9. प्रोटोकॉलपर क्लिक करें । डार्क अडॉप्टेड ईआरजी और डीसी-ईआरजी प्रोटोकॉल अब दिखाई देने चाहिए ।
  10. अंत में, लॉन्ग फ्लैश.कर्नल फ़ाइल को निम्नलिखित फ़ोल्डर सी में रखें: \ ईआरजी उपयोगकर्ता फ़ाइलें \ लांग फ्लैश.कर्नल।

2. केशिका इलेक्ट्रोड तैयारी

  1. कांच को स्कोर करने और भौतिक काउंटरफोर्स प्रदान करने और ग्लास को स्थिर करने के लिए टेबल का उपयोग करके सिरेमिक टाइल(सामग्री की तालिका)का उपयोग करके आधे में 1.5 मिमी ग्लास केशिकाओं को काटें।
    नोट: कुंद कटौती के रूप में आवश्यक समाप्त होता है ।
  2. एक बुनसेन बर्नर(सामग्री की मेज) काउपयोग करके गर्मी को केशिका में एक छोटा सा मोड़ बनाने की अनुमति दें, जबकि इसे संदंश के साथ लौ पर पकड़ लें।

3. केशिका इलेक्ट्रोड भरना

  1. इन-लाइन फिल्टर(सामग्रीकी तालिका) के माध्यम से वैक्यूम डेसिकेटर को प्रयोगशाला की वैक्यूम लाइन से जोड़ें।
  2. एक खुले 50 एमएल शंकु नली में हैंक्स के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) (सामग्री की तालिका) के 30 एमएल डालें और इसे वैक्यूम कक्ष में (टोपी के साथ) रखें।
  3. वैक्यूम चालू करें और कंप्यूटर और रिकॉर्डिंग उपकरण को चालू करते हुए एचबीएसएस को डिगैस करें।
  4. 5 \u201210 मिनट के बाद वैक्यूम बंद कर दें और एक संलग्न 25 जी सुई के माध्यम से 12 एमएल सिरिंज भरने के लिए डिगैस्ड एचबीएसएस का उपयोग करें। इसका उपयोग इलेक्ट्रोड धारकों के ठिकानों को भरने के लिए अतिरिक्त सावधानी बरतने के लिए बुलबुले पेश नहीं करते हैं।
    1. ऐसा करने के लिए, पिरोया स्क्रू कैप को हटा दें और धारक की पीछे की दीवार (चांदी/चांदी क्लोराइड गोली) तक पहुंचने के लिए सिलिकॉन रबर गैसकेट के माध्यम से सिरिंज सुई को ध्यान से स्लाइड करें।
      नोट: चांदी/चांदी क्लोराइड छर्रों धारकों पर लाभप्रद है कि चांदी के तार का उपयोग के रूप में वे और अधिक सतह क्षेत्र प्रदान एक स्थिर कम शोर आधार रेखा में जिसके परिणामस्वरूप । हालांकि, चांदी/चांदी क्लोराइड छर्रों एक अच्छा कनेक्शन प्राप्त करने के लिए हवा बुलबुले से मुक्त एक तरल इंटरफेस की आवश्यकता है । इसलिए, इस प्रक्रिया के दौरान हवा के बुलबुले पेश न करने का बहुत ध्यान रखें।
    2. धीरे-धीरे सिरिंज सुई से मुकर जाते हुए पूरे माइक्रोइलेक्ट्रोड को भरने के लिए एचबीबीएस इंजेक्ट करें। पिरोए गए कैप को फिर से संलग्न करें लेकिन कसें नहीं। एचबीएसएस के साथ टोपी के भीतर खाली जगह को भरने के लिए सिरिंज सुई को फिर से लागू करें। फिर दूसरे छोर से बचने से समाधान को रोकने के लिए क्षैतिज पकड़ते समय ग्लास केशिका भरें।
    3. मुड़े हुए अंत से ग्लास केशिका पकड़ो और धीरे-धीरे ढीला टोपी के माध्यम से विपरीत अंत डालें और फिर स्क्रू कैप को जगह में कस लें।
      नोट: एचबीएसएस से भरे ग्लास इलेक्ट्रोड माउस की आंख के स्नेहन को बनाए रखते हैं और कॉर्नियल निर्जलीकरण को रोकते हैं जो मानक सोने के लूप इलेक्ट्रोड के उपयोग के साथ होता है।
  5. बुलबुले को बाहर बहने की अनुमति देने के लिए केशिका इलेक्ट्रोड के साथ इलेक्ट्रोड धारकों को ऊपर की ओर झुका हुआ स्थिति। 5\u201210 मिनट के लिए वैक्यूम को डेगास तक चलाएं। कांच और प्लास्टिक की सतहों से बचने वाली गैस एचबीबीएस को इलेक्ट्रोड धारकों से बाहर धकेल देगी ।
  6. बंद करो और फिर धीरे-धीरे वैक्यूम जारी करें। इलेक्ट्रोड धारकों और कांच केशिकाओं को पहले वर्णित के रूप में फिर से भरना।
    नोट: बुलबुले पर या सिलिकॉन रबर गैसकेट के पास इकट्ठा करने के लिए करते है और यह भी पिरोया टोपी के खांचे में छिपा सकते हैं, इसलिए विशेष ध्यान इन क्षेत्रों बुलबुला मुक्त रखने के लिए भुगतान किया जाना चाहिए ।
  7. माइक्रोइलेक्ट्रोड होल्डर को कस्टम-मेड टी-क्लिप/मैग्नेटिक बॉल ज्वाइंट स्टैंड(चित्रा 1A,इनसेट) में इंस्टॉल और सिक्योर करें । माइक्रोइलेक्ट्रोड धारक के लिए कस्टम स्टैंड बनाने के लिए, एक तरफ काले पॉलीएस्टल क्लिप को हटाकर एक टी-क्लिप (5/16"-11/32" ओडी ट्यूबिंग) #8(सामग्री की तालिका)को संशोधित करें । ऊंचाई(सामग्रीकी तालिका) को समायोजित करने के लिए आधे में चुंबकीय गेंद जोड़ों के सिलेंडर आधार है। M3 आकार के नट के साथ चुंबकीय गेंद बढ़ते शिकंजा के लिए संशोधित टी क्लिप सुरक्षित।
  8. माइक्रोइलेक्ट्रोड धारक को संशोधित टी-क्लिप में रखें और एक कोण पर एक कपास इत्तला दी सफाई छड़ी(सामग्री की मेज)को तोड़ने से बने लगभग 1 इंच पतला लकड़ी के हैंडल में फिसलने से इसे कसकर पकड़ें। 180 डिग्री धुरी पर 360 डिग्री रोटेशन को सक्षम करने के लिए अनुकूलित इलेक्ट्रोड धारक को सुरक्षित रूप से स्थान देने के लिए दुर्लभ पृथ्वी चुंबक सिलेंडर आधार का उपयोग करें।

4. टेस्ट इलेक्ट्रोड

  1. एक छोटे कंटेनर में एचबीएस डालो (उदाहरण के लिए, 50 एमएल शंकु नली की टोपी)।
  2. धीरे से पूरी तरह से इकट्ठे कम, HBSS से भरा केशिका माइक्रोइलेक्ट्रोड को इलेक्ट्रोड को पूर्व-समतुल्य करने के लिए एचबीबीएस युक्त टोपी में और सर्किट(चित्रा 1A)को पूरा करने के लिए एक ही एचबीबीएस में सुई ग्राउंड इलेक्ट्रोड (पूंछ/रियर लेग) और एजी/एजीसीएल सिंटर पेलेट रेफरेंस इलेक्ट्रोड (मुंह) रखें ।
    नोट: मंद लाल बत्ती के तहत बाद के सभी चरणों का प्रदर्शन करें। माउस और केशिका इलेक्ट्रोड को स्थिति में रखने के लिए लाल बत्ती वाली टॉर्च का उपयोग करें। रिकॉर्डिंग शुरू करने से पहले सभी प्रकाश स्रोतों को पूरी तरह से बंद करना याद रखें।
  3. माउस का परीक्षण करने और निम्नलिखित आदेश के अनुसार पंजीकरण पूरा करके किए जाने वाले डीसी-ईआरजी प्रोटोकॉल का चयन करने के लिए एक उपयुक्त पहचानकर्ता (परिवार का नाम) चुनें या बनाएं।
    1. प्रोटोकॉलपर क्लिक करें । डीसी-ईआरजीका चयन करें । रनपर क्लिक करें । एक संवाद बॉक्स पॉप अप होगा: "वर्तमान रोगी XXX है [DOB: XX/XX/XX) परीक्षण के लिए यह सही है किया जा रहा है?" हांपर क्लिक करें । फिर "चरण 1/6" के लिए आगे बढ़ें ।
  4. फैराडे पिंजरे के दरवाजे बंद कर दें।
  5. बाधा पर क्लिक करके बाधा मोड प्रदर्शित करें और सत्यापित करें कि मुंह के संदर्भ, पूंछ जमीन और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के लिए मान स्वीकार्य हैं (चित्रा 1Bदेखें)।
  6. स्टेप 4/6 "लॉन्ग फ्लैश नो लाइट" का चयन करने के लिए स्टेप (फॉरवर्ड एरो) पर क्लिक करके बेसलाइन स्थिरता (शोर और बहाव) का परीक्षण करें।
    नोट: बहाव की मात्रा देखी गई जब इलेक्ट्रोड को एचबीबीएस स्नान में रखा जाता है, आम तौर पर स्थिर होने के बाद प्रति 80 एस 500 माइक्रोन से कम होता है और जब इलेक्ट्रोड माउस से जुड़े होते हैं तो देखा जाने वाला बहाव के बराबर होता है। इस प्रकार, एचबीबीएस बाथ में इलेक्ट्रोड का विद्युत रीडआउट इलेक्ट्रोड की स्थिति का एक महत्वपूर्ण संकेतक है। शोर, पीक-टू-पीक के रूप में मापा जाता है, आम तौर पर एचबीबीएस स्नान की तुलना में माउस में ~ 10 \u201215% अधिक होता है। यह शायद सांस लेने से गति कलाकृतियों के अलावा के कारण है।
  7. पूर्वावलोकनपर क्लिक करके निशान देखना शुरू करें । निशान एक चोटी से पीक आयाम और लेफ्टिनेंट 200 μV के साथ कम शोर होना चाहिए। एक मामूली बहाव (<500 μV/80 s) जो धीरे-धीरे बेसलाइन पर फीका पड़ जाता है, स्वीकार्य है(चित्रा 1C)।

5. माउस और इलेक्ट्रोड पोजिशनिंग

  1. चूहों को अंधेरे अनुकूलन के लिए एक अच्छी तरह से हवादार प्रकाश-तंग बॉक्स में रात भर रखें।
  2. केटामाइन (80 मिलीग्राम/किलो) और जाइलाज़ीन (8 मिलीग्राम/किलो) के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा जानवरों को एनेस्थेटाइज करें।
  3. कॉर्निया को एनेस्थेटाइज करने के साथ-साथ विद्यार्थियों को फैलाने के लिए 2.5% फेनिलेफ्रीन एचसीएल और 0.5% ट्रॉपिड की एक बूंद के साथ-साथ 0.5% प्रोपैराकेन एचसीएल सामयिक की एक बूंद लागू करें।
  4. रिकॉर्डिंग के दौरान ग्लास केशिका इलेक्ट्रोड को परेशान करने से अनजाने में हिलने से रोकने के लिए कैंची के साथ माउस मूंछ ट्रिम करें।
    नोट: ईआरजी प्रणाली के भीतर डीसी-ईआरजी प्रोत्साहन प्रोटोकॉल में कई अंतर्निहित उत्तेजना दिनचर्या है जिन्हें स्टेप (फॉरवर्ड एरो) या स्टेप (बैकवर्ड एरो) पर क्लिक करके चुना जा सकता है। डीसी-ईआरजी रिकॉर्डिंग तैयार करने और उसे करने के लिए सॉफ्टवेयर में केवल चरण 1, 4 और 5 की आवश्यकता होती है।
  5. ईआरजी सिस्टम सॉफ्टवेयर में सत्यापित करते हैं कि सही मरीज का चयन किया जाता है। ग्रीन प्रोटोकॉल बटन पर क्लिक करें। प्रोटोकॉल विवरण के तहत डीसी-ईआरजी का चयन करें। फिर रनपर क्लिक करें । सत्यापित करें कि हांपर क्लिक करके यह सही परीक्षण किया जा रहा है ।
  6. बाधा में परिवर्तन देखते हुए माउस और इलेक्ट्रोड की स्थिति में मदद करने के लिए गुंबद के अंदर लाल बत्ती चालू करने के लिए चरण 1/6 नामित लाल बत्ती उत्तेजना का उपयोग करें।
  7. माउस को एक गर्म रिकॉर्डिंग टेबल पर रखें और संदंश का उपयोग करके पीछे के पैर की त्वचा को ध्यान से तम्बू करें। सुई इलेक्ट्रोड को एक हाथ में मजबूती से पकड़ें और इसे जगह में सुरक्षित करने के लिए पीछे के पैर में चमड़े के नीचे डालें।
  8. संदर्भ एजी/एजीसीएल इलेक्ट्रोड(सामग्री की मेज)मुंह के अंदर रखें ताकि सिंटर गोली पीछे के गाल के साथ टिकी रहे और दांतों के पीछे जगह में रखी गई हो ।
    नोट: गोल्ड वायर इलेक्ट्रोड का उपयोग मुंह संदर्भ इलेक्ट्रोड के रूप में नहीं किया जाना चाहिए क्योंकि उनमें विभिन्न बाधा विशेषताएं हैं और पीक-टू-पीक शोर को बढ़ाते हैं।
  9. माउस की आंख में केशिका इलेक्ट्रोड रखने से पहले, इलेक्ट्रोड धारक को ग्लास केशिकाओं के साथ वर्टिकल पकड़ें, इलेक्ट्रोड धारक को इंडेक्स फिंगर से फ्लिक करें ताकि पेश किए गए किसी भी बुलबुले को हटाया जा सके। एक सिरिंज से जुड़ी 25 जी सुई का उपयोग करके एचबीबीएस के साथ टिप भरें और यह सुनिश्चित करने के लिए निरीक्षण करें कि टिप पर कोई हवा का बुलबुला न फंसे। इलेक्ट्रोड धारक को स्टैंड की स्थिति दें ताकि एचबीएसएस से भरी केशिकाओं की खुली नोक कॉर्निया के साथ कोमल संपर्क में रहे।
  10. स्नेहक आई जेल डिस्पेंसर को उलटा पकड़कर हवा के बुलबुले पेश करने से बचने के लिए विशेष सावधानी बरतें और प्रारंभिक बूंदों को त्याग दें। चालकता बनाए रखने और रिकॉर्डिंग के दौरान desiccation को रोकने के लिए प्रत्येक आंख पर स्नेहक आंख जेल की एक बूंद रखें।

6. डीसी-ईआरजी रिकॉर्डिंग

  1. चरण 4/6 "लांग फ्लैश नो ली" का चयन करने के लिए चरण (फॉरवर्ड एरो) पर क्लिक करें।
  2. बाधापर क्लिक करें । बाईं और दाईं आंखों के प्रतिरोधों की जांच करने के लिए बाधा जांच स्क्रीन का उपयोग करें। प्रत्येक आंख पर रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के लिए बाधा मूल्यों के समान होने की उम्मीद है (~39 kΩ)। जमीन और संदर्भ इलेक्ट्रोड दोनों के लिए बाधा मूल्यों को 10 kΩ से कम होने की उम्मीद है।
  3. बाईं और दाईं आंख के लिए निशान देखने के लिए पूर्वावलोकन पर क्लिक करें । एक स्थिर बेसलाइन हासिल करने के लिए प्रतीक्षा करें (<10 मिनट) । ट्रेस पूर्वावलोकन से बाहर निकलने के लिए स्टॉप पर क्लिक करें।
    नोट: बहाव दिशा या रिकॉर्डिंग में गुमराह शोर में अचानक परिवर्तन समय के साथ सुधार नहीं होगा और केशिका इलेक्ट्रोड है कि ध्यान देने की आवश्यकता की पहचान की आवश्यकता होगी । सबसे अधिक संभावना कारण इलेक्ट्रोड की नोक पर पेश किया गया एक बुलबुला है। एचबीएसएस के साथ टिप को फिर से भरें। बेसलाइन की जांच करने के लिए फिर से पूर्वावलोकन पर क्लिक करें।
  4. चरण 5/6 "लांग फ्लैश 10 सीडी 7 मिनट का चयन करने के लिए Step (आगे तीर) पर क्लिक करें।
  5. रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए रन पर क्लिक करें(चित्रा 1D)

7. डेटा निर्यात

  1. निर्यात किए जाने वाले माउस रिकॉर्डिंग का वर्णन करने वाले "रोगी" (परिवार का नाम) का चयन करें।
  2. पुराने परीक्षणोंपर क्लिक करें ।
  3. प्रोटोकॉल विवरण के तहत डीसी-ईआरजीका चयन करें । पहले अधिग्रहीत डेटा लोड करने के लिए ग्रीन लोड बटन पर क्लिक करें।
  4. चरण (आगे तीर) पर क्लिक करें कदम 5/6 "लांग फ्लैश 10 सीडी 7 मिनट के लिए अग्रिम करने के लिए."
  5. निर्यातपर क्लिक करें ।
  6. फाइलनेम (जैसे, फाइलनेम.csv) प्रदान करें। एक वैध फ़ाइलनाम एक पत्र के साथ शुरू होना चाहिए, इसके बाद पत्र, संख्या या रेखांकित होते हैं। विशेष पात्रों या हाइफन का उपयोग न करें। डेटा विश्लेषण कार्यक्रम (DCERG_Analysis.exe) के लिए आवश्यक है कि तालिका प्रविष्टियां चर नामों के लिए आवश्यकताओं को पूरा करें।
  7. डेटा टेबलके बगल में एक चेकमार्क रखें । सेपरेटर के बगल में, टैबका चयन करें । विकल्पों के बगल में चेकमार्क रखें(शीर्षक, ऊर्ध्वाधर),सभी शामिल हैं(कदम, चांस, परिणाम),डेटा कॉलम(सामग्री, परिणाम, स्वीप्स),और प्रारूप(फ़ाइल)
  8. इसके बाद एक्सपोर्ट (चित्रा 1E)पर क्लिक करें । यह सी के लिए * .csv फ़ाइल बचाता है: \ मल्टीफोकल फ़ोल्डर ।

8. डेटा विश्लेषण

  1. उपयुक्त रनटाइम इंस्टॉलर डाउनलोड करें और इंस्टॉलकरें (सामग्रियों की तालिका)
  2. डाउनलोड करें और DCERG_Analysis.exe इंस्टॉलर स्थापित करें।
    नोट: यह स्क्रिप्ट स्थापित करता है जो डीसी-ईआरजी घटकों का विश्लेषण करेगा और स्टार्ट मेनू फ़ोल्डर में कार्यक्रम चलाने के लिए एक शॉर्टकट बनाता है।
  3. स्टार्ट मेन्यू और जीटी और प्रोग्राम फोल्डर में बनाए गए शॉर्टकट पर क्लिक करें।
  4. विश्लेषण के लिए निर्यात की गई डेटा फ़ाइल या फ़ाइलों (*.csv) का चयन करें। एक से अधिक फ़ाइल का चयन करने के लिए माउस पर Ctrl + बाएं क्लिक का उपयोग करें।
    नोट: निष्पादित फ़ाइल दो प्रकार के भूखंड उत्पन्न करती है: 1) कच्चे डेटा को मापा गया बहाव का संकेत देते हुए एक सर्वश्रेष्ठ फिट लाइन के साथ प्लॉट किया जाता है; 2) बहाव सही प्रतिक्रिया एक चलती औसत (~ 5 एस की अवधि के साथ) के साथ चिकना होने के बाद साजिश रची है । इस भूखंड से डीसी-ईआरजी घटकों के आयाम और समय-से-चोटी की पहचान की जाती है: सी-वेव, तेज दोलन, प्रकाश चोटी, और ऑफ रिस्पांस। डेटा तो तालिका प्रारूप में निर्यात करने के लिए उत्कृष्टता जहां प्रत्येक शीट एक अलग माउस रिकॉर्डिंग से मेल खाती है । इन चादरों के बाद दो सारांश चादरें हैं: (i) संकलित डीसी-ईआरजी आयाम (एमवी); (ii) संकलित डीसी-ईआरजी समय-से-चोटियों (प्रकाश शुरुआत, टी = 0 मिनट)।

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Representative Results

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चित्रा 2 एमआईआर-204 को/को क्रे/+ (सशर्त KO) और जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) चूहों से एक नमूना डेटासेट है। MiR-204 ko/ko cre/+ रेटिना वर्णक एपिथेलियम में माइक्रोआरएनए २०४ के सशर्त नॉकआउट के साथ चूहों हैं । ये चूहे वीएमडी2-सीआरई चूहों 23 के साथ22 फ्लॉक्सेड एमआईआर-204 चूहों (NEIGEF द्वारा उत्पादित) को पार करके उत्पन्नहोतेहैं। एमआईआर-204 को आरपीई में अत्यधिक व्यक्त किया जाता है जहां यह एपिथेलियल फ़ंक्शन के लिए महत्वपूर्ण प्रोटीन की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है जो तंग जंक्शन अखंडता (जैसे, क्लाउड्स) को बनाए रखता है, कीर 7.1 पोटेशियम चैनलों की अभिव्यक्ति के माध्यम से पोटेशियम होयोस्टेसिस का रखरखाव, और कई दृश्य चक्र जीन (जैसे, एलआरटी, आरपीई 65)24की अभिव्यक्ति।

चूंकि असामान्य आरपीई आकृति विज्ञान कई आरपीई-विशिष्ट सीआरई में माउस लाइनों25को व्यक्त करने की सूचना दी गई थी, इसलिए हमने डब्ल्यूटी फेनोटाइप के साथ चूहों को व्यक्त करते हुए सीआरई में सामान्य आरपीई आकृति विज्ञान के लिए निगरानी की। एमआईआर-204 को/को क्रे + (सशर्त को) माउस रेटिना की संरचनात्मक और कार्यात्मक असामान्यताएं एमआईआर-204 नल चूहों में पाई जाने वाली विशेषताओं के समान हैं15 हाइपर ऑटोफ्लोरेसेंस (लिपोफुसिन जैसी जमा) और आरपीई एपिकल सतह के लिए स्थानीय माइक्रोग्लिया में वृद्धि हुई है। नल चूहों में इन परिवर्तनों को आरपीई की कम प्रकाश-पैदा वाली विद्युत प्रतिक्रियाओं के साथ किया गया था, जिसमें फोटोरिसेप्टर प्रतिक्रियाओं में न्यूनतम परिवर्तन (रेटिना ईआरजी द्वारा मूल्यांकन) था। इस प्रकार, एमआईआर-204 को/को क्रे/+ चूहों में एमआईआर-204 अभिव्यक्ति के क्षोभ से भी आरपीई की विद्युत प्रतिक्रिया में परिवर्तन होने की संभावना है।

प्रस्तुत उदाहरण में, एक माउस गर्म मंच पर रखा जाता है और गुंबद को कम करने से पहले इलेक्ट्रोड उचित रूप से तैनात होते हैं। बाधा और बहाव की जांच की जाती है जैसा कि पहले स्नान समाधान का उपयोग करके वर्णित है। प्रतिनिधि "नकारात्मक" परिणाम चित्रा 2Aमें दिखाए जाते हैं । चित्रा 2A (शीर्ष पैनल) में, ट्रेस इलेक्ट्रोड में मिनट के बुलबुले से ग्रस्त है जो ट्रेस में पीक-टू-पीक शोर को बढ़ाता है (नीले रंग में छायांकित)। एक अन्य उदाहरण में(चित्रा 2A, निचलेपैनल), जब बुलबुले कांच की सतह से अलग हो जाते हैं और इलेक्ट्रोड की लंबाई के साथ चलते हैं तो यह बेसलाइन बहाव की दिशा में अचानक परिवर्तन का कारण बनता है जिसे बहाव घटाव द्वारा मुआवजा नहीं दिया जा सकता है। चित्रा 2B प्रतिनिधि से पता चलता है "सकारात्मक" WT और miR-204 ko/ko cre/+ चूहों की रिकॉर्डिंग जहां बुलबुले इलेक्ट्रोड धारक खड़ा में माइक्रोइलेक्ट्रोड कोडांतरण से पहले वैक्यूम चैंबर का उपयोग कर समाप्त कर दिया गया है ।

प्रारंभिक 25 एस (ग्रीन) के लिए सबसे अच्छी फिट लाइन की गणना की जाती है और नीले रंग(चित्रा 2B) में दिखाया जाताहै। बहाव सही प्रतिक्रियाओं को डीसी-ईआरजी घटकों के आयामों की पहचान के साथ-साथ चित्रा 2सी में पुनर्प्रावर्तित किया जाता है। डीसी-ईआरजी तकनीक का उपयोग करना इस प्रोटोकॉल में वर्णित जानवरों दोनों WT और miR-204 ko/ko cre/+ उपभेदों से जल्दी से दर्ज और विश्लेषण किया जा सकता है ।

सी-वेव दो घटकों से बना है: फोटोरिसेप्टर गतिविधि के कारण सबरेटिनल अंतरिक्ष में पोटेशियम में कमी के जवाब में पोटेशियम चालन में वृद्धि के कारण आरपीई एपिकल झिल्ली का एक अतिध्रुवीकरण और आंतरिक रेटिना कोशिकाओं (धीमी गति से पी 3 घटक - मुलर कोशिकाओं की गतिविधि को दर्शाता है) से उत्पन्न एक अलग योगदान। तेज दोलन आरपीई बेसोलेटरल झिल्ली26के अतिध्रुवीकरण के बारे में जानकारी प्रदान करता है, जिसका मुख्य कारण सिस्टिक फाइब्रोसिस ट्रांसमेम्ब्रान कंडेंस रेगुलेटर (सीएफटीआर)27नामक सीएल ट्रांसपोर्टर के आचरण में परिवर्तन है । प्रकाश शिखर को एक फोटोरिसेप्टर संचालित पदार्थ28 की एकाग्रता में परिवर्तन से उत्पन्न माना जाता है कि एक दूसरे दूत प्रणाली के माध्यम से सीए 2 + निर्भर सीएल चैनल21 की गतिविधि को मॉडुलेट करके आरपीई की बेसलेटरल झिल्ली को depolarizes । अंत में, ऑफ-रिस्पांस प्रतिक्रियाओं की एक जटिल बातचीत है जो ध्रुवीयता में भिन्न होती है और हल्की तीव्रता18के साथ बदलती है।

जैसा कि अपेक्षित था,केआर 7.1 K+ चैनलों की कम अभिव्यक्ति सी-वेव29 और तेजी से दोलन को कम करती है जैसा कि चित्र 2 डीमें औसत प्रतिक्रियाओं में दिखाया गया है, जो आरपीई के विद्युत गुणों की एक महत्वपूर्ण हानि का संकेत देता है। डीसी-ईआरजी के घटकों में परिवर्तन का सारांश चित्र 2 ईईमें प्रदान किया जाता है। डीसी-ईआरजी घटकों (डब्ल्यूटीई के लिए सामान्यीकृत) के सापेक्ष आयामों को सापेक्ष दो सबसे बड़े प्रकाश-पैदा किए गए ए-वेव आयाम (1 cd·s/m2;10 cd·s/m2)(डब्ल्यूटीई को सामान्यीकृत) के खिलाफ प्लॉट किया जाता है और चित्रा 2F\u2012Hमें दिखाया गया है। प्रतिभाशाली प्रकाश तीव्रता (10cds/m2)(चित्रा 2F\u2012H, अनुपूरक चित्रा S1A, बी)के लिए एक लहर प्रतिक्रिया में कमी दृश्य चक्र हानि के कारण संवेदनशीलता की वसूली में देरी का सुझाव देता है (जैसे, कम LRAT या RPE65 अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप miR-20424,3, 3 00

Figure 1
चित्रा 1: आरेख डीसी-ईआरजी प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरणों पर प्रकाश डाला गया। (क)रिकॉर्डिंग (ग्लास केशिका माइक्रोइलेक्ट्रोड्स), संदर्भ और ग्राउंड इलेक्ट्रोड को एक ही स्नान समाधान में कम करके पूरा सर्किट की छवि। यह विन्यास प्रारंभिक परीक्षणों को चलाने में सक्षम बनाता है (माउस को एनेस्थेट करने से पहले) विशेषता बाधा, शोर और बहाव का मूल्यांकन करने के लिए। इनसेट (ऊपरी बाएं) कस्टम माइक्रोइलेक्ट्रोड धारक स्टैंड के एक पक्ष-दृश्य योजनाबद्ध दिखा रहा है। (ख)बाधा जांच मोड की प्रतिनिधि छवि इलेक्ट्रोड बाधाओं के लिए उचित मूल्यों को दिखा । बाईं और दाईं आंख इलेक्ट्रोड में बाधा तुलनीय होना चाहिए, एक दूसरे के 5 KΩ के भीतर (जैसे, बाईं आंख: ३८.७ KΩ बनाम दाहिनी आंख: ४०.३६ KΩ) । माउथ रेफरेंस इलेक्ट्रोड की बाधा 1 KΩ से कम होनी चाहिए, जबकि टेल इलेक्ट्रोड 2.5 KΩ के आसपास होना चाहिए। (ग)प्रिव्यू ट्रेस (स्टेप 4/6) की प्रतिनिधि छवि दिखाई गई है । चरण 4 (लांग फ्लैश नो लाइट) का चयन किया जाता है क्योंकि इस चरण के पूर्वावलोकन के दौरान कोई प्रकाश नहीं दिया जाता है। निशान कम शोर होना चाहिए और एक मामूली बहाव हो सकता है जो धीरे-धीरे बेसलाइन के लिए समय के साथ फीका हो जाता है। एक बार निशान दोनों चैनलों में एक निरंतर बहाव हासिल किया है और अपेक्षाकृत फ्लैट हो जाते हैं, वास्तविक रिकॉर्डिंग शुरू कर सकते हैं । (घ)0.5 मिनट के अंधेरे के बाद चरण 5/6 (लांग फ्लैश 10 सीडी 7 मिनट) का उपयोग करके, 10 सीडी/एम2 का एक हल्का चरण माउस को 7 मिनट के लिए दिया जाता है जिसके बाद 1.5 मिनट के लिए अंधेरे में वापसी होती है।(ई)डेटा को * .csv फ़ाइल में परिवर्तित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले निर्यात मापदंडों की छवि। डीसी-ईआरजी एनालिसिस सॉफ्टवेयर चलाने के लिए इस सटीक फॉर्मेट की जरूरत होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: डीसी-ईआरजी विश्लेषण के प्रतिनिधि निशान और कार्यप्रवाह। एक नकारात्मक डीसी-ईआरजी परिणाम की छवि अत्यधिक(ए, शीर्ष पैनल)पीक-टू-पीक शोर और(ए, बॉटम पैनल)बहाव प्रदर्शित करता है। (ख)एक डब्ल्यूटीई और एमआईआर-204 को/को क्रे/+ माउस से सकारात्मक डीसी-ईआरजी रिकॉर्डिंग परिणामों की छवियां । प्रकाश शुरुआत से पहले प्रारंभिक 25 एस (हरे) के लिए सबसे अच्छा फिट लाइनों (नीला) दिखा कच्चे निशान के उत्पन्न भूखंड। (ग)बहाव के भूखंडों ने डब्ल्यूटीऔर एमआईआर-२०४ को/को क्रे/+ चूहों के लिए डीसी-ईआरजी प्रतिक्रियाओं को सही किया जो बी में दिखाए गए हैं । डीसी-ईआरजी के घटकों के आयाम किंवदंती में इंगित किए गए हैं। (घ)3-8 महीने पुराने डब्ल्यूटीई (एन = 6) और एमआईआर-204 को/को क्रे/+ (एन = 6) चूहों की औसत डीसी-ईआरजी प्रतिक्रियाएं । डीसी-ईआरजी घटकों को डब्ल्यूटी ट्रेस पर लेबल किया जाता है और प्रकाश उत्तेजना मापदंडों को नीचे परिभाषित किया जाता है। (ई)डब्ल्यूटीई और एमआईआर-204 को/को क्रे/+ चूहों की रिकॉर्डिंग से लिए गए डीसी-ईआरजी घटकों का सारांश । बार प्लॉट का प्रतिनिधित्व करते हैं मतलब, त्रुटि सलाखों मानक त्रुटि का संकेत मिलता है। (एफ)सी-वेव,(जी)फास्ट दोलन, और(एच)ऑफ रिस्पांस के सापेक्ष आयामों को सापेक्ष दो सबसे बड़े प्रकाश-पैदा किए गए ए-वेव आयाम (1 सीडी एस/एम2; 10सीडी एस/एम2)(डब्ल्यूटीई के लिए सामान्यीकृत) के खिलाफ साजिश रची जाती है। महत्व तारक द्वारा इंगित किया गया है: (छात्र का टी-टेस्ट; *=p< 0.05, **= पी एंड एलटी; 0.01, ***= पी < 0.001)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 1: डब्ल्यूटीई और एमआईआर-204 को/को क्रे/+ चूहों की ईआरजी प्रतिक्रियाएं। (A)डब्ल्यूटीई (ब्लैक) और एमआईआर-204 को/को क्रे/+ चूहों (मजेंटा) की प्रतिक्रियाएं बढ़ती तीव्रता के प्रकाश की 4 एमएस चमक: 0.0001 cd·s/m2 (n = 5), 0.001 cd·s/m2 (n = 5), 0.01 cd·s/m2 (n = 3), 0.1 cd·s/m2 (n = 3), 1 cd·s/m2 (n = 3), 10 cd·s/m2 (n = 2) । (ख)औसत ए-वेव आयाम फ्लैश तीव्रता के खिलाफ साजिश रची । (ग)औसत बी-वेव आयाम फ्लैश तीव्रता के खिलाफ साजिश रची । (घ)फ्लैश तीव्रता के खिलाफ साजिश रची गई एक लहर प्रतिक्रियाओं के औसत समय-से-पीक । (ई)बी-वेव प्रतिक्रियाओं के औसत समय-से-पीक फ्लैश तीव्रता के खिलाफ साजिश रची । त्रुटि सलाखों को दिखाए गए सभी भूखंडों के लिए एसईएम को इंगित किया गया है। महत्व तारक द्वारा इंगित किया जाता है: (छात्र का टी-टेस्ट; * = पी & 0.05)। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 2: बिजली लाइन में डीसी-ऑफसेट का उदाहरण जिसे वोल्टेज नियामक/पावर कंडीशनर के उपयोग के साथ कम किया जा सकता है । (क)वोल्टेज विनियमन वोल्टेज स्पाइक्स के अभाव में (एक आसन्न कमरे में उपकरणों के उपयोग के कारण जैसे, OCT) एक डीसी-ऑफसेट उत्पन्न करता है जो डीसी-ईआरजी घटकों, विशेष रूप से प्रकाश चोटी के माप में हस्तक्षेप कर सकता है। विघटनकारी ऑफसेट सही पर बढ़ाया जाता है । (ख)वोल्टेज नियामक/पावर कंडीशनर सक्षम के साथ प्रारंभिक स्पाइक अभी भी ध्यान देने योग्य है, लेकिन हानिकारक डीसी ऑफसेट हटा दिया जाता है । वोल्टेज रेगुलेटर/पावर कंडीशनर का प्रभाव बढ़ाया जाता है और सही को दिखाया जाता है । इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक फाइलें। इन फाइलों को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

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महत्वपूर्ण कदम

एक अच्छा डीसी-ईआरजी रिकॉर्डिंग के लिए स्थिर इलेक्ट्रोड की आवश्यकता होती है जो बुलबुले से मुक्त होते हैं जो कलाकृतियों और अवांछित बहाव बनाते हैं क्योंकि वे आउटगैसिंग और तापमान परिवर्तन के प्रति बेहद संवेदनशील होते हैं। यह आवश्यक है कि माउस रिकॉर्डिंग के साथ आगे बढ़ने से पहले इलेक्ट्रोड को एचबीबीएस बाथ समाधान में रखे जाने पर एक स्थिर आधारभूत हासिल किया जाए। छोटे बुलबुले केशिका इलेक्ट्रोड के आधार पर या सिलिकॉन गैसकेट के आसपास इकट्ठा होते हैं और इलेक्ट्रोड धारक को पूरी तरह से इकट्ठा करने के बाद देखना मुश्किल होता है। जब कुछ बुलबुले मौजूद होते हैं, तो धारक को हल्के से फ़्लिकिंग उन्हें हटाने के लिए मुक्त कर देगा। यदि बहुत सारे बुलबुले हैं या बहाव या शोर को हटाया नहीं जा सकता है, तो अक्सर इलेक्ट्रोड को अलग करना बेहतर होता है और प्रक्रिया के प्रत्येक चरण में बुलबुले के लिए सावधानीपूर्वक निरीक्षण करते समय शुरू करना बेहतर होता है।

संशोधन और समस्या निवारण

डीसी-ईआरजी रिकॉर्डिंग की निष्ठा को बेहतर बनाने के लिए सेटअप(सामग्री की तालिका)में निम्नलिखित अनुकूलन किए जा सकते हैं। माइक्रोइलेक्ट्रोड धारकों के लिए कम शोर केबल का उपयोग मौजूदा केबल को 32-बिट एम्पलीफायर से रिकॉर्डिंग टेबल तक बढ़ाने के लिए किया जा सकता है। अतिरिक्त लंबाई एक बार गंजफेल्ड गुंबद बंद होने के बाद उनकी स्थिति को परेशान किए बिना इलेक्ट्रोड धारक के सावधानीपूर्वक प्लेसमेंट और समायोजन को सक्षम बनाती है। एक वोल्टेज नियामक/बिजली कंडीशनर लाइन शोर और बिजली के आसन्न कमरे में रोशनी या उपकरणों से उत्पन्न उछाल में खत्म करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है पर और बंद(चित्रा S2)बंद किया जा रहा है । इसके अतिरिक्त, टेबलटॉप गंजफेल्ड गुंबद उत्तेजक और 32-बिट एम्पलीफायर को किसी भी अतिरिक्त विद्युत शोर के खिलाफ ढालने के लिए बिल्डिंग ग्राउंड बार पर आधारित फैराडे पिंजरे के अंदर रखा जा सकता है।

विधि की सीमाएं

डीसी-ईआरजी केवल अंधेरे अनुकूलित जानवरों पर ईमानदारी से दर्ज किया जा सकता है जिसका अर्थ है कि एक बार प्रकाश उत्तेजना चालू हो जाती है तो वहां थोड़ा सा है जो अवांछनीय क्षमता या बहाव को खत्म करने के लिए किया जा सकता है। एक और सीमा यह है कि डीसी-ईआरजी (लाइट-पीक, ऑफ-रिस्पांस) के कुछ घटकों की ध्रुवीयता16उपयोग की जाने वाली हल्की तीव्रता के अधीन है। इसका मतलब यह है कि डब्ल्यूटीई से सबसे बड़ा विचलन तीव्रता पर हो सकता है जो इस प्रोटोकॉल का उपयोग करता है (10 सीडी/एम2)प्रकाश तीव्रता पर स्वाभाविक रूप से मौजूद नहीं है। इस बिंदु पर, डीसी-ईआरजी विश्लेषण सॉफ्टवेयर को नकारात्मक ऑफ रिस्पांस (एक प्रतिक्रिया न्यूनतम) मानते हुए डिजाइन किया गया था। उज्जवल प्रकाश तीव्रता है कि बंद प्रतिक्रिया के ध्रुवत्व के उलट में परिणाम के लिए शामिल विश्लेषण स्क्रिप्ट फ़ाइल को बदलने की आवश्यकता होगी ।

महत्व

आरपीई रेटिना वातावरण के होम्योस्टिटिक रखरखाव में शामिल है और कई रेटिना रोगों की विकृति में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इस विधि में विस्तार से बताया गया है कि आरपीई विद्युत प्रतिक्रिया को रिकॉर्ड करने के लिए डीसी-ईआरजी सिस्टम को कैसे सेटअप किया जाए, जब पारंपरिक ईआरजी रिकॉर्डिंग के साथ किया जाता है तो बाहरी रेटिना और आरपीई फ़ंक्शन का एक उद्देश्य उपाय प्रदान करता है। आरपीई कार्यक्षमता के इन उपायों का उपयोग अपीजेनेरेटिव फेनोटाइप प्रदर्शित करने वाली ट्रांसजेनिक माउस लाइनों का मूल्यांकन करने या आरपीई को दवा-प्रभावकारिता या दवा-प्रेरित साइटोटॉक्सिकिटी के लिए परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को एनईआई इंट्राम्यूरल फंड्स ने सपोर्ट किया था । लेखक ईमानदारी से डॉ शेल्डन मिलर को उनके वैज्ञानिक मार्गदर्शन, तकनीकी सलाह और आरपीई फिजियोलॉजी और रोग में विशेषज्ञता के लिए स्वीकार करते हैं। लेखकों ने मेगन कोपेरा और माउस कालोनियों के प्रबंधन के लिए एनिमल केयर स्टाफ और डॉ तरुण बंसल, रेमंड झोउ और युआन वांग को तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद दिया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ag/AgCl (mouth) Electrode WPI Inc EP1 Mouth reference electrode for mouse
Ceramic Tile Sutter Instrument CTS Used to cut the glass capillary tube to an appropriate size
Cotton Tipped Cleaning Stick Puritan Medical Products 867-WC No Glue To be used as a spacer to improve the fit of the electrode holder assembly
Electroretinogram (ERG) System Diagnosys LLC E3 System Visual electrophysiology system to diagnose ophthalmic conditions in vision research and drug trials
Bunsen Burner Argos Technologies BW20002460 Or equivlaent to shape glass under flame
Glass Capillary Tube (1.5 mm) Sutter Instruments BF150-75 For filling with HBSS and making contact to the cornea
Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) Thermo Fisher Scientific Inc 14175-095 Commercially available. Maintain at RT
In-Line Filter Whatman 6722-5001 To protect vacuum pump from aerosols
Low Noise Cable for Microelectrode Holders WPI Inc 5372 Suggested for improving the length and placement of the cables and electrode holder assemblies
Magnetic Ball Joint WPI Inc 500871 For magnetically positioning the electrode holder assembly on the stage
MatLab Mathworks MatLab: For editing the analysis software
MatLab Curvefit Toolbox Mathworks Toolbox for MatLab (only required for editing the analysis software)
MatLab Compiler Mathworks Toolbox for MatLab (only required for editing and re-releasing the analysis software)
MatLab Runtime version 9.5 Mathworks R2018b (9.5) Required to run the analysis software: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html
Microelectrode Holders (45 degrees) WPI Inc MEH345-15 For holding the capillaries
Needle (25 ga) Covidien 8881250313 For filling the capillary tubes with HBSS
Needle (ground) Electrode Rhythmlink 13mm - one elctrode Subdermal needle electrode (ground) for mouse (13mm long, 0.4mm diameter needle, 1.5m leadwire)
Regulator/Power Conditioner Furman P-1800 Or equivalent to remove DC-offset from noise introduced through power line
Syringe (12 mL) Monoject 1181200777 For filling the capillary tubes with HBSS
T-clip Cole-Parmer 06852-20 For electrode holder assembly
Vacuum Desiccator Bel-Art 420120000 Clear polycarbonate bottom & cover
Pharmacological treatment
Lubricant eye gel Alcon 0078-0429-47 Helps lubricate corneal surface and maintain electrical contact with capillary electrodes
Phenylephrine Hydrochloride 2.5% Akorn 17478-201-15 Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation)
Proparacaine Hydrochloride 0.5% Akorn 17478-263-12 Local anesthetic for ophthalmic instillation
Tropicamide 0.5% Akorn 17478-101-12 Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation)
Xylazine AnaSed sc-362949Rx Analgesic and muscle relaxant
Zetamine (Ketamine HCl) VetOne 501072 Anesthetic for intramuscular injections

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References

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माउस रेटिना पिगमेंट एपिथेलियम की लाइट-पैदा हुई विद्युत प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड करने के लिए डायरेक्ट-युग्मित इलेक्ट्रोरेटिनोग्राम (डीसी-ईआरजी)
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Miyagishima, K. J., Zhang, C., Malechka, V. V., Bharti, K., Li, W. Direct-Coupled Electroretinogram (DC-ERG) for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (161), e61491, doi:10.3791/61491 (2020).More

Miyagishima, K. J., Zhang, C., Malechka, V. V., Bharti, K., Li, W. Direct-Coupled Electroretinogram (DC-ERG) for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (161), e61491, doi:10.3791/61491 (2020).

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