Summary
여기서, 우리는 2000년대 초에 Marmorstein, 복숭아 및 동료에 의해 처음 기술된 DC-ERGs로 알려져 있는 기술을 사용하여 마우스에서 망막 안료 상피(RPE)의 광유발 전기 반응을 기록하는 방법을 제시한다.
Abstract
망막 색소 상피 (RPE)는 광수용체의 전반적인 건강 및 구조적 무결성을 유지하는 망막과 초리오카세랄라증 사이에 전략적으로 위치한 세포의 특수 단층입니다. RPE는 편광되고, 정량적으로 그리고 기저적으로 위치한 수용체 또는 채널을 전시하고, 물, 이온, 대사 산물의 벡터 수송을 수행하고, 몇몇 사이토카인을 분비합니다.
RPGE 기능의 생체 내 비침습적 측정은 직접 결합된 ERGs(DC-ERGs)를 사용하여 이루어질 수 있다. DC-ERG의 방법론은 Marmorstein, 복숭아 및 동료가 맞춤형 자극 녹음 시스템을 사용하여 개척했으며 나중에 는 시판 가능한 시스템을 사용하여 시연되었습니다. DC-ERG 기술은 행크의 완충염 용액(HBSS)으로 채워진 유리 모세혈관을 사용하여 광수용체 활성으로 인한 감하 공간의 빛 유발 농도 변화로부터 유도된 RPE의 느린 전기 반응을 측정합니다. DC-ERG 레코딩의 장시간 광 자극과 길이는 드리프트및 노이즈에 취약하여 사용 가능한 레코딩의 수율이 낮습니다. 여기서는 진공 압력을 사용하여 HBSS 및 전극 홀더의 가스로 인한 기포를 줄이거나 제거하여 소음을 줄이면서 녹음의 안정성을 향상시키는 빠르고 신뢰할 수 있는 방법을 제시합니다. 또한 전압 레귤레이터/전원 컨디셔너를 사용하여 전력선 아티팩트가 감쇠됩니다. 우리는 시판되는 ERG 시스템에 필요한 빛 자극 프로토콜뿐만 아니라 DC-ERG 구성 요소의 분석을위한 스크립트를 포함 : c-웨이브, 빠른 진동, 빛 피크, 및 오프 응답. 기록의 용이성과 신속한 분석 워크플로우의 향상된 용이성으로 인해, 이 단순화된 프로토콜은 RPE 기능, 질병 진행 및 약리학적 개입 평가의 연령 관련 변화를 측정하는 데 특히 유용합니다.
Introduction
망막 색소 상피(RPE)는 눈의 후방 세그먼트를 일렬로 세워 망막 항상성을 유지하기 위해 중요한 기능을 발휘하는특수 세포의 단층이다. RPE는 광수용체와 초리오카필로혈관4,5사이의 영양분 및 대사 산물의 수송에 참여하여 시각 주기2라는공정에서 광자 포획 시각적 안료를 재생하여 광수용체를 지원합니다. RPE 기능의 이상은 노화와 관련된 황반 변성6,Leber의 선천성 수마우로시스7,8 및 최고의 비텔리폼 황반 이영양증9와같은 수많은 인간 망막 질환을 뒷받침합니다. 기증자 눈 조직은 종종 연구 목적으로만 얻기 어렵기 때문에 유전자 변형을 가진 동물 모델은 망막 질환의 발달을 연구하는 대체 방법을 제공 할 수있습니다(10,11). 또한, CRISPR cas9 기술의 출현 및 적용은 이제 이전 유전자 표적화기술의한계를 능가하는 간단한 1단계 공정에서 게놈 소개(knock-in) 또는 삭제(knock-out)를 허용한다. 새로운 마우스모델(13)의 가용성 붐은 비침습적으로 RPE 기능을 평가하기 위해 보다 효율적인 기록 프로토콜을 필요로 합니다.
RPE의 광 유조 전기 반응의 측정은 직접 결합된 전기 전전도(DC-ERG) 기술을 사용하여 달성될 수 있다. 광수용체(a-wave) 및 양극성(b-wave) 세포반응(14)을측정하는 기존의 ERG 레코딩과 함께 사용되는 경우, DC-ERG는 망막 변성과 RPE의 반응 특성이 어떻게 변하는지 를 정의할 수있다(15,16,17) 또는 RPE 기능 장애가 광수용체 손실보다 선행되는지 여부를 정의할 수 있다. 이 프로토콜은 DC-ERG기법16,18,19,20을 처음 개발한 Marmorstein, Peachey 및 동료의 작업에서 적응된 방법을 설명하고 재현성과 사용 편의성을 향상시킵니다.
DC-ERG 레코딩은 노이즈의 중단 이나 도입이 데이터의 해석을 복잡하게 할 수있는 동안 긴 수집 시간 (9 분)으로 인해 수행하기 가 어렵습니다. 이 새로운 방법의 장점은 기준선이 짧은 시간 내에 정상 상태에 도달하여 동물이 마취에서 조기에 깨어날 가능성을 줄이고 모세관 전극에서 거품 형성되기 쉽다는 것입니다.
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Protocol
이 프로토콜은 국립 안과 연구소의 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 된 동물 연구 프로토콜에 설명 된 동물 관리 지침을 따릅니다.
1. DC-ERG용 라이트 자극 프로토콜 가져오기
참고: 아래 방향을 따라 DC-ERG용 광 자극 프로토콜을 ERG 시스템소프트웨어(재료 표)로가져옵니다. 프로토콜은 0.5 분 사전 자극 간격으로 구성되며, 7 분 동안 빛의 단계 (10 cd /m2)가이어지고 1.5 분 후 자극 간격으로 끝납니다. 10 cd/m 2(1로그10 cd/m2)의광 강도는 WT 마우스 18,21에서DC-ERG의 모든 구성 요소에 대한 최대 응답의 약 절반을 연상시키기 때문에 선택되었다. 이러한 전기 반응의 기원이 특징지어지고 시험관 내 RPE 모델(예: iPSC-RPE)에서 더 자세히 연구될 수 있기 때문에 c-wave 및 빠른 진동은 특히 흥미로워지고 있다. 다른 광 강도의 적용은 추가 정보를 추출할 수 있습니다, 예를 들어, 오프 응답은 밝은 빛 자극에서 극성의 반전을 겪고이 반전이 일어나는 강도에 차이를 표시 할 수있다. 사용자는 재량에 따라 광 강도 설정을 자유롭게 변경할 수 있습니다.
- ERG 시스템 소프트웨어를 엽니다.
- 데이터베이스 센터를클릭합니다.
- 새 를 클릭합니다(새 데이터베이스 파일 이름 제공). 저장을클릭합니다. 팝업 상자에는 "데이터베이스가 만들어졌으며 새 데이터베이스 파일에 연결하시겠습니까?" 예. 이제 현재 데이터베이스 이름에 새 파일 이름이 반영됩니다.
- 데이터베이스 제어 센터 창에서 전송을 클릭합니다.
- 보충 파일 1 선택: 라이트 프로토콜 - 전송. EXP. 열기를클릭합니다.
- 진행률 표시줄이 완료되면 닫기(데이터베이스 제어 센터)를 클릭합니다.
- 녹색 시작 버튼을 클릭합니다.
- 환자 선택 창에서 새 창을 클릭합니다. 마우스 모델을 설명하는 새 환자 가족 이름을 만들고 생년월일(DOB, mm/dd/yyyyy)을 입력하고 성별(M/F) 버튼을 적절한 설명에 전환합니다. 닫기를 클릭하여 실험 세부 정보를 저장합니다.
- 프로토콜을 클릭합니다. 이제 어두운 조정된 ERG 및 DC-ERG 프로토콜을 볼 수 있습니다.
- 마지막으로 롱 플래시.콜 파일을 다음 폴더 C:\ERG 사용자 파일\Long Flash.col에 배치합니다.
2. 모세관 전극 준비
- 1.5mm 유리 모세혈관을 반으로 자르고 세라믹타일(재료 표)을사용하여 유리점수를 매기고 테이블을 사용하여 깨끗하게 분해하여 물리적 카운터포스를 제공하고 유리를 안정화시합니다.
참고 : 필요에 따라 컷 끝을 무디게하십시오. - 분젠버너(재료표)를사용하면 열이 모세관에서 작은 구부러지는 동시에 집게로 화염위에 붙일 수 있습니다.
3. 모세관 전극 채우기
- 진공 건조기를 인라인 필터(재료 표)를 통해실험실의진공 선에 연결합니다.
- 행크스의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)(재료 표)을 50mL 원활 튜브에 넣고 진공 챔버에 (캡 제거시)를 놓습니다.
- 컴퓨터와 녹음 장비를 켜면서 진공을 켜고 HBSS를 탈가스로 전환합니다.
- 5\u201210 분 후 진공을 끄고 착질 HBSS를 사용하여 부착 된 25 G 바늘을 통해 12 mL 주사기를 채웁니다. 거품을 소개하지 않는 추가 예방 조치를 취하는 전극 홀더의 기지를 채우기 위해 사용합니다.
- 이를 위해 나사 캡을 제거하고 실리콘 고무 개스킷을 통해 주사기 바늘을 조심스럽게 밀어 홀더의 뒷벽(은/은 염화물 펠릿)에 도달합니다.
참고: 은/은 염화물 펠릿은 더 많은 표면적을 제공하므로 실버 와이어를 사용하는 홀더보다 유리하여 안정적인 저잡이 기준선을 제공합니다. 그러나 은/은 염화물 펠릿은 좋은 연결을 달성하기 위해 기포가 없는 액체 인터페이스가 필요합니다. 따라서 이 과정에서 기포를 도입하지 않도록 주의하십시오. - 점차적으로 주사기 바늘을 천천히 철회하면서 전체 미세 전극을 채우기 위해 HBSS를 주입합니다. 스레드 캡을 다시 연결하지만 조여지지 않습니다. 주사기 바늘을 다시 삽입하여 HBSS로 캡 내의 빈 공간을 채웁니다. 그런 다음 유리 모세관을 수평으로 유지하면서 유리 모세관을 채우고 용액이 다른 쪽 끝에서 벗어나지 못하게합니다.
- 구부러진 끝에서 유리 모세관을 잡고 느슨한 캡을 통해 반대 쪽 끝을 천천히 삽입한 다음 나사 캡을 제자리에 고정시하십시오.
참고: HBSS로 채워진 유리 전극은 마우스의 눈의 윤활을 유지하고 표준 금 루프 전극을 사용하여 발생하는 각막 탈수를 방지합니다.
- 이를 위해 나사 캡을 제거하고 실리콘 고무 개스킷을 통해 주사기 바늘을 조심스럽게 밀어 홀더의 뒷벽(은/은 염화물 펠릿)에 도달합니다.
- 전극 홀더를 모세관 전극으로 배치하여 기포가 흘러 나올 수 있도록 위쪽으로 기울어진다. 5\u201210 분 동안 진공을 실행하여 가스를 탈가스로 이동합니다. 유리와 플라스틱 표면에서 빠져나오는 가스는 전극 홀더에서 HBSS를 밀어낼 것입니다.
- 중지한 다음 천천히 진공을 놓습니다. 이전에 설명한 바와 같이 전극 홀더 및 유리 모세 혈관을 다시 채웁니다.
참고 : 거품은 실리콘 고무 개스킷 또는 근처에 수집하는 경향이 있으며 스레드 캡의 홈에 숨길 수 있으므로 이러한 영역을 거품이없는 상태로 유지하기 위해 특별한주의를 기울여야합니다. - 마이크로 전자전도 홀더를 맞춤형 T클립/마그네틱 볼 조인트 스탠드에 설치하고 고정합니다(그림1A,인세트). 마이크로 전극 홀더에 대한 사용자 정의 스탠드를 만들려면 한쪽면의 검은 폴리아세탈 클립을 제거하여 T 클립 (5/16"-11/32" OD 튜브) #8(재료 테이블)을수정합니다. 신장(재료표)을조정하기 위해 반으로 가공된 자기볼 조인트의 실린더 베이스를 갖습니다. M3 크기의 너트가 있는 마그네틱 볼 장착 나사에 수정된 T 클립을 고정합니다.
- 마이크로 전하 홀더를 수정된 T 클립에 넣고 면 기울어진 청소스틱(재료 표)을비스듬히 부수어 만든 약 1인치 테이퍼 처리된 나무 손잡이로 고정하여 제자리에 단단히 고정합니다. 희토류 자석 실린더 베이스를 사용하여 180° 축에서 360° 회전을 가능하게 하는 스테이지의 금속 판에 사용자 정의 전극 홀더 스탠드를 단단히 배치합니다.
4. 테스트 전극
- HBSS를 작은 용기에 붓습니다(예: 50mL 원상 관의 캡).
- 완전히 조립된 HBSS 채워진 모세관 마이크로전극을 HBSS를 함유한 캡으로 부드럽게 낮추고, 전극을 미리 평형화하고, 동일한 HBSS에 바늘 접지 전극(tail/rear leg)과 Ag/AgCl 소결펠릿 기준 전극(입)을 배치하여 회로를 완성한다(도1A).
참고: 희미한 적색 표시등 아래에서 모든 후속 단계를 수행합니다. 적색 손전등을 사용하여 마우스와 모세혈관 전극을 배치합니다. 레코딩을 시작하기 전에 모든 광원을 완전히 끄는 것을 기억하십시오. - 테스트할 마우스를 설명하고 다음 순서에 따라 등록을 완료하여 수행할 DC-ERG 프로토콜을 선택하기 위해 적절한 식별자(가족 이름)를 선택하거나 만듭니다.
- 프로토콜을 클릭합니다. DC-ERG를 선택합니다. 실행을클릭합니다. 대화 상자팝업: "현재 환자는 XXX [DOB: XX/XX/XX) 수행 중인 테스트에 대 한이 올바른?" 예. 그런 다음 "1/6 단계"로 진행합니다.
- 방일 케이지에 문을 닫습니다.
- 임피던스(Impedance)를 클릭하여 임피던스 모드를 표시하고 입 참조, 꼬리 접지 및 기록 전극의 값이 허용되는지 확인합니다(그림 1B참조).
- 단계(전방 화살표)를 클릭하여 기준 안정성(노이즈 및 드리프트)을 테스트하여 4/6 단계 "긴 플래시 없음 조명"을 선택합니다.
참고: 전극이 HBSS 배스(HBSS) 욕조에 배치될 때 관찰되는 드리프트의 양은 일반적으로 안정화되면 80s당 500 μV 미만이며 전극이 마우스에 연결될 때 관찰된 드리프트와 동일합니다. 따라서 HBSS 배스 내의 전극의 전기 판독은 전극의 상태를 나타내는 중요한 지표이다. 피크 투 피크로 측정된 노이즈는 일반적으로 HBSS 배스보다 마우스에서 10\u201215% 더 큽합니다. 이것은 아마도 호흡에서 모션 아티팩트의 추가 때문입니다. - 미리 보기를클릭하여 추적 보기 시작합니다. 흔적은 피크-투-피크 진폭 및 lt;200 μV로 낮은 소음이어야 합니다. 기준선으로 점진적으로 페이드되는 약간의 드리프트(&500 μV/80s)는 허용된다(그림1C).
5. 마우스 및 전극 위치 지정
- 어두운 적응을 위해 통풍이 잘 되는 밝은 상자에 하룻밤 동안 쥐를 유지하십시오.
- 케타민 (80 mg/kg) 및 자일라진 (8 mg/kg)의 관면 주사로 동물을 마취시킵니다.
- 0.5%의 프로파라카인 HCl을 투골적으로 적용하여 각막을 마취하고 2.5% 페닐레프린 HCl과 0.5% 트로피아미드를 떨어뜨려 동공을 증분한다.
- 마우스 수염을 가위로 트리밍하여 기록 중에 실수로 경련이 유리 모세관 전극을 방해하지 않도록 합니다.
참고: ERG 시스템 내의 DC-ERG 자극 프로토콜에는 단계(앞으로 화살표) 또는 단계(뒤로 화살표)를 클릭하여 선택할 수 있는 여러 가지 기본 제공 자극 루틴이 있습니다. DC-ERG 레코딩을 준비하고 수행하기 위해서는 소프트웨어의 1단계, 4단계 및 5단계만 필요합니다. - ERG 시스템 소프트웨어에서 올바른 환자가 선택되었는지 확인합니다. 녹색 프로토콜 버튼을 클릭합니다. 프로토콜 설명에서 DC-ERG를 선택합니다. 그런 다음 실행을 클릭합니다. 이 테스트가 예를 클릭하여 수행되는 올바른 테스트인지 확인합니다.
- 1/6단계 지정 적색광 자극을 사용하여 돔 내부의 적색 광을 켜어 임피던스의 변화를 관찰하면서 마우스와 전극을 배치합니다.
- 가열 된 녹음 테이블에 마우스를 놓고 조심스럽게 집게를 사용하여 후면 다리의 피부를 텐트. 바늘 전극을 한 손에 단단히 잡고 뒤쪽 다리에 피하로 삽입하여 제자리에 고정하십시오.
- 소결된 펠릿이 뒤쪽 뺨을 따라 놓여 치아 뒤에 제자리에 고정되도록 참조 Ag /AgCl 전극(재료 표)을입 안에 놓습니다.
참고: 금 와이어 전극은 임피던스 특성이 다르고 피크 투 피크 노이즈를 증가시키기 때문에 입 참조 전극으로 사용해서는 안됩니다. - 마우스의 눈에 모세혈관 전극을 배치하기 전에, 유리 모세 혈관으로 전극 홀더를 수직으로 잡고, 전극 홀더를 검지 손가락으로 쓸어 들어 도입되었을 수 있는 기포를 제거한다. 주사기에 부착된 25G 바늘을 사용하여 HBSS로 팁을 채우고 끝에 기포가 갇혀 있지 않도록 검사합니다. 전극 홀더를 배치하여 HBSS가 채워진 모세혈관의 열린 끝이 각막과 부드럽게 접촉할 수 있도록 합니다.
- 윤활유 아이 젤 디스펜서를 뒤집어 서 기포를 도입하지 않도록 특별한 예방 조치를 사용하고 초기 방울을 폐기하십시오. 전도도를 유지하고 녹음 중에 탈수를 방지하기 위해 각 눈에 윤활제 눈 젤 한 방울을 놓습니다.
6. DC-ERG 녹음
- 단계(앞으로 화살표)를 클릭하여 4/6 단계 "긴 플래시 없음 Li"를 선택합니다.
- 임피던스를 클릭합니다. 임피던스 검사 화면을 사용하여 왼쪽 과 오른쪽 눈의 저항을 검사합니다. 각 눈의 기록 전극에 대한 임피던스 값은 유사할 것으로 예상됩니다(~39kΩ). 접지 및 기준 전극 모두에 대한 임피던스 값은 10kΩ 미만일 것으로 예상됩니다.
- 미리보기를 클릭하여 왼쪽 눈과 오른쪽 눈의 흔적을 봅니다. 안정적인 기준을 달성할 때까지 기다립니다(&10분). 추적 미리 보기를 종료하려면 중지를 클릭합니다.
참고: 기록의 드리프트 방향 또는 비정상적인 소음의 갑작스러운 변화는 시간이 지남에 따라 개선되지 않으며 주의가 필요한 모세관 전극을 식별해야 합니다. 가장 가능성이 원인은 전극의 끝에 도입 된 거품입니다. 팁을 HBSS로 리필합니다. 미리 보기를 다시 클릭하여 기준선을 확인합니다. - 단계(앞으로 화살표)를 클릭하여 5/6 "긴 플래시 10 cd 7분"을 선택합니다.
- 녹화를 시작하려면 실행을 클릭합니다(그림1D).
7. 데이터 내보내기
- 내보낼 마우스 레코딩을 설명하는 "환자"(패밀리 이름)를 선택합니다.
- 이전 테스트를클릭합니다.
- 프로토콜 설명에서 DC-ERG를 선택합니다. 녹색 로드 버튼을 클릭하여 이전에 획득한 데이터를 로드합니다.
- 단계 (앞으로 화살표)를 클릭하여 5/6 "긴 플래시 10 cd 7 분"으로 진행하십시오.
- 내보내기를클릭합니다.
- 파일 이름(예: 파일 이름.csv)을 제공합니다. 유효한 파일 이름은 문자, 숫자 또는 밑줄이 뒤따르는 문자로 시작해야 합니다. 특수 문자 나 하이픈을 사용하지 마십시오. 데이터 분석 프로그램(DCERG_Analysis.exe)은 테이블 항목이 변수 이름에 대한 요구 사항을 충족하도록 요구합니다.
- 데이터 테이블 옆에 체크표시를 배치합니다. 분리기 옆에 탭을선택합니다. 옵션(제목, 세로)옆에 체크 표시를 배치, 모든 포함(단계, 찬, 결과),데이터 열(내용, 결과, 청소),및 형식(파일).
- 그런 다음 내보내기를 클릭합니다(그림1E). 이렇게 하면 *.csv 파일을 C:\Multifocal 폴더에 저장합니다.
8. 데이터 분석
- 적절한 런타임 설치 프로그램(자료 표)다운로드 및 설치
- DCERG_Analysis.exe 설치 프로그램을 다운로드하고 설치합니다.
참고: DC-ERG 구성 요소 의 분석을 수행하는 스크립트를 설치하고 시작 메뉴 폴더에서 프로그램을 실행하는 바로 가기를 만듭니다. - 시작 메뉴 및 프로그램 폴더에서 만든 바로 가기를 클릭합니다.
- 분석을 위해 내보낸 데이터 파일 또는 파일(*.csv)을 선택합니다. Ctrl + 마우스를 클릭하여 두 개 이상의 파일을 선택하십시오.
참고: 실행 파일은 두 가지 유형의 플롯을 생성합니다: 1) 원시 데이터는 측정된 드리프트를 나타내는 가장 적합한 선으로 플로팅됩니다. 2) 드리프트 보정 응답은 이동 평균(~5s의 범위)으로 부드럽게 된 후 플롯됩니다. 이 플롯에서 DC-ERG 구성 요소의 진폭과 시간-피크가 식별됩니다: c-wave, 빠른 진동, 라이트 피크 및 오프 응답. 그런 다음 각 시트가 다른 마우스 레코딩에 해당하는 경우 데이터를 테이블 형식으로 내보내탁월니다. 이 시트다음에는 두 개의 요약 시트가 뒤따릅니다: (i) 컴파일된 DC-ERG 진폭(mV); (ii) DC-ERG 시간-피크(라이트 발병, t = 0분)를 컴파일했습니다.
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Representative Results
도 2는 miR-204 ko/ko cre/+(조건부 KO) 및 야생형(WT) 마우스로부터의 샘플 데이터 집합이다. MiR-204 ko/ko cre/+는 망막 색소 상피에서 마이크로RNA 204의 조건부 녹아웃을 가진 마우스입니다. 이들 마우스는 VMD2-CRE마우스(23)를통해 플로스 미R-204 마우스(NEIGEF에 의해 생성된)22를 교차시킴으로써 생성된다. MiR-204는 엄격한 접합 무결성(예를 들어, 클라이딘), Kir 7.1 칼륨 채널의 발현을 통한 칼륨 항상성의 유지, 여러 가지 시각적 주기 유전자(예를 들어, LRAT, RPE65)의발현을 유지하는 상피 기능에 중요한 단백질의 발현을 조절하는 RPE에서 높게 발현된다.
비정상적인 RPE 형태는 마우스라인(25)을발현하는 여러 RPE 특이적 Cre에서 보고되었기 때문에, 우리는 WT 표현형을 가진 마우스를 발현하는 Cre에서 정상적인 RPE 형태에 대해 모니터링하였다. miR-204 ko/ko cre+ (조건부 KO) 마우스 망막의 구조적 및 기능적 이상은 하이퍼 오토플루오레시전(lipofuscin-like deposits)을 특징으로 하는 miR-204 null마우스(15)에서 발견되는 특징과 유사하며 RPE 정면으로 국한된 증가된 마이크로글리아를 특징으로 한다. null 마우스에서 이러한 변화는 광수용체 반응(망막 ERG에 의해 평가됨)에 대한 최소한의 변경과 함께 RPE의 감소된 광유 전기 반응과 함께 동반되었다. 따라서, miR-204 ko/ko cre/+ 마우스에서 miR-204 발현의 교류도 RPE의 전기 반응을 변화할 것으로 예상된다.
제시된 예에서, 마우스는 가열된 플랫폼에 배치되고 전극은 돔을 낮추기 전에 적절하게 배치된다. 임피던스와 드리프트는 이전에 설명된 바와 같이 목욕 용액을 사용하여 확인됩니다. 대표적인 "음수" 결과는 그림 2A에표시됩니다. 도 2A(상단 패널)에서 트레이스는 전극의 미세한 거품으로 인해 트레이스의 피크-피크 노이즈(파란색으로 그늘)를 증가시다. 또 다른 예에서(도 2A,하부 패널)에서는 기포가 유리 표면에서 분리되어 전극의 길이를 따라 이동하면 드리프트 뺄셈에 의해 보상될 수 없는 기준선 드리프트 방향으로 갑작스러운 변화를 일으킨다. 도 2B는 전극 홀더 스탠드로 마이크로전극을 조립하기 전에 진공 챔버를 사용하여 거품이 제거된 WT 및 miR-204 ko/ko cre/+ 마우스의 대표적인 "양수" 기록을 나타낸다.
초기 25s(녹색)에 가장 적합한 선이 계산되고파란색(도 2B)으로표시됩니다. 드리프트 수정 된 응답은 DC-ERG 구성 요소의 진폭을 식별하는 와 함께 그림 2C에서 다시 플로팅됩니다. WT 및 miR-204 ko/ko cre/+ 균주 모두에서 이 프로토콜 동물에 설명된 DC-ERG 기술을 사용하여 신속하게 기록 및 분석할 수 있습니다.
상기 c-wave는 두 가지 성분으로 구성된다: 광수용체 활성으로 인한 칼륨의 감소에 대응하여 칼륨 전도도증가로 인한 RPE 정압막의 과다편화및 내부 망막 세포로부터 유래되는 별도의 기여(느린 P3 성분 - 뮐러 세포의 활성을 반영함). 상기 빠른 진동은 주로 낭포성 섬유증 막 전도조절(CFTR) (CFTR)27이라고불리는 Cl 수송기의 전도성 변화로 인해 RPE 바편막(26)의 과극성 에 관한 정보를 제공한다. 빛 피크는 제2 메신저 시스템을 통해 Ca2+ 종속 Cl채널(21)의활성을 조절하여 RPE의 혈관막을 탈극화하는 광수용체 구동물질(28)의 농도 변화에서 비롯된 것으로 생각된다. 마지막으로, 오프 응답은 극성에서 다르고광강도(18)에따라 변화하는 반응의 복잡한 상호 작용이다.
예상대로, Kir 7.1 K+ 채널의 감소된 발현은 도 2D의평균 응답에 도시된 바와 같이 c-wave29 및 빠른 진동을 크게 감쇠하여 RPE의 전기적 특성에 상당한 손상을 나타냅니다. DC-ERG구성 요소의 변경 사항에 대한 요약은 그림 2E에제공됩니다. DC-ERG 구성 요소(WT로 정규화됨)의 상대진폭은 상대적인 두 개의 가장 큰 광방출 a-wave 진폭(1cd·s/m2;10 cd·s/m2)에대해 플롯되고(WT로 정규화됨) 그림 2F\u2012H에도시된다. 가장 밝은 광 강도(10cd·s/m2)에대한 파반응감소(도2F\u2012H, 보충도 S1A,B)는시각 사이클 장애로 인한 감도 회복지연을 시사한다(예를 들어, MIR-20의 게놈 녹아웃의 결과로 감소된 LRAT 또는 RPE65 발현으로 인한).
그림 1: 다이어그램은 DC-ERG 프로토콜의 주요 단계를 강조합니다. (A)레코딩(유리 모세관 미세 전극), 참조 및 접지 전극을 동일한 목욕 용액으로 하강하여 완성된 회로의 이미지. 이 구성을 사용하면 예비 테스트를 실행(마우스 마취 하기 전에)을 실행하여 특성 임피던스, 노이즈 및 드리프트를 평가할 수 있습니다. 사용자 지정 마이크로 전극 홀더 스탠드의 측면 뷰 회로도를 나타내는 인셋(왼쪽 위). (B)전극 임피던스에 적합한 값을 보여주는 임피던스 검사 모드의 대표적인 이미지. 왼쪽 및 오른쪽 눈 전극의 임피던스는 서로 5KΩ 내에서 비교되어야 합니다(예: 왼쪽 눈: 38.7 KΩ vs. 오른쪽 눈: 40.36 KΩ). 입 참조 전극의 임피던스는 1 KΩ 미만이어야하는 반면 꼬리 전극은 약 2.5 KΩ이어야합니다. (C)미리 보기 추적의 대표적인 이미지(4단계 4/6)가 표시됩니다. 4단계(긴 플래시 없음 라이트)는 이 단계의 미리 보기 중에 빛이 전달되지 않아 선택됩니다. 추적은 소음이 적어야 하며 기준선까지 시간이 지남에 따라 서서히 사라지는 약간의 드리프트가 있을 수 있습니다. 추적이 두 채널 모두에서 일정한 드리프트를 달성하고 상대적으로 평평해지면 실제 기록이 시작될 수 있습니다. (D)0.5분 후 5단계(롱플래시 10cd 7분)를 사용하여 10cd/m2의 가벼운 걸음이 마우스로 전달되고 1.5분 동안 어둠으로 복귀합니다. (E)데이터를 *.csv 파일로 변환하는 데 사용되는 수출 파라미터의 이미지가 있습니다. DC-ERG 분석 소프트웨어를 실행하려면 이 정확한 형식이 필요합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: DC-ERG 분석의 대표적인 추적 및 워크플로우입니다. 과도 한 표시 부정적인 DC-ERG 결과 의 이미지(A, 상단 패널)피크 - 투 - 피크 노이즈 및(A, 하단 패널)드리프트. (B)WT 및 miR-204 ko/ko cre/+ 마우스로부터 의 양수 DC-ERG 기록 결과의 이미지. 라이트 개시 전에 초기 25s(녹색)에 가장 적합한 선(파란색)을 나타내는 원시 트레이스의 플롯이 생성됩니다. (C)B에 도시된 WT 및 miR-204 ko/ko cre/+ 마우스에 대한 드리프트의 플롯은 DC-ERG 응답을 수정하였다. DC-ERG 구성 요소의 진폭은 범례에 표시됩니다. (D)3-8개월 된 WT(n=6) 및 miR-204 ko/ko cre/+ (n=6) 마우스의 평균 DC-ERG 응답. DC-ERG 구성 요소는 WT 추적에 레이블이 지정되고 빛 자극 매개 변수는 아래에 정의됩니다. (E)WT 및 miR-204 ko/ko cre/+ 마우스의 레코딩에서 가져온 DC-ERG 성분의 요약. 막대 플롯은 평균을 나타내고 오류 막대는 표준 오류를 나타냅니다. (F)c-wave,(G)빠른 진동, 및(H)오프 응답은 상대적인 두 개의 가장 큰 광유발 a-wave 진폭(1cd/s/m2;10 cd s/m2)에대하여 플롯된다(WT로 정규화). 유의성은 별표로 표시됩니다: (학생의 t-테스트; * = p&05, ** = p & 0.01, *** = p & 0.001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 1: WT 및 miR-204 ko/ko cre/+ 마우스의 ERG 응답. (A)WT(블랙) 및 miR-204 ko/ko cre/+ 마우스(마젠타)의 반응- 강도 증가의 빛의 4ms 깜박임: 0.0001 cd·m2 (n=5), 0.001 cd·0.001 cd·0.001 cd·0.001 cd·0.001 cd·0.001 cd·0.001 cd·0.001 cd·001 cd·0.001 cd·0.001 cd·104·104·104·104·104·104 s/m2 (n = 5), 0.01 cd·m2 (n = 3), 0.1 cd·m2 (n = 3), 1 cd·s/m2 (n = 3), 10 cd·s/m2 (n=2). (B)플래시 강도에 대해 플롯 평균 a-웨이브 진폭. (C)플래시 강도에 대해 플롯 평균 b 웨이브 진폭. (D)플래시 강도에 대해 플롯 된 파도 응답의 평균 시간 - 투 - 피크. (E)플래시 강도에 대해 플롯 b 웨이브 응답의 평균 시간 - 투 - 피크. 표시된 모든 플롯에 대해 오류 막대는 SEM. 중요성이 별표로 표시됩니다: (학생의 t-test; * p & 0.05). 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보조 도 2: 전압 레귤레이터/전원 컨디셔너를 사용하여 완화할 수 있는 전력선의 DC 오프셋의 예입니다. (A)전압 조절 전압 스파이크가 없는 경우(예를 들어, 10월)는 DC-ERG 부품, 특히 라이트 피크의 측정을 방해할 수 있는 DC 오프셋을 생성한다. 파괴적인 오프셋은 오른쪽에 확대됩니다. (B)전압 레귤레이터/전원 컨디셔너를 사용하면 초기 스파이크가 여전히 눈에 띄지만 손상된 DC 오프셋이 제거됩니다. 전압 레귤레이터/전원 컨디셔너의 효과가 확대되고 오른쪽에 표시됩니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
중요한 단계
좋은 DC-ERG 레코딩에는 마법물체와 원치 않는 드리프트를 만드는 거품이 없는 안정적인 전극이 필요합니다. 마우스 레코딩을 진행하기 전에 전극을 HBSS 목욕 용액에 배치할 때 안정적인 기준선이 달성되는 것이 필수적입니다. 작은 기포는 모세관 전극의 기저또는 실리콘 개스킷 주위에서 수집되는 경향이 있으며 전극 홀더가 완전히 조립되면 보기가 어렵습니다. 거품이 거의 없는 경우 홀더를 가볍게 가볍게 쓸어 넘기면 제거가 해제됩니다. 너무 많은 기포가 있거나 드리프트 또는 노이즈를 제거할 수 없는 경우, 공정의 각 단계에서 기포를 주의 깊게 검사하면서 전극을 분해하고 다시 시작하는 것이 좋습니다.
수정 및 문제 해결
DC-ERG 레코딩의 충실도를 향상시키기 위해 다음 사용자 정의설정(재료표)을설정할 수 있습니다. 마이크로 전기차 홀더를 위한 저소음 케이블을 사용하여 기존 케이블을 32비트 앰프에서 레코딩 테이블로 확장할 수 있습니다. 추가 길이는 간즈펠트 돔이 닫히면 위치를 방해하지 않고 전극 홀더의 신중한 배치 및 조정을 가능하게 합니다. 전압 조절기/전원 컨디셔너를 사용하여 인접 한 방의 조명 이나 장비에서 발생하는 라인 소음 및 전원 서지를 제거할 수있습니다(그림 S2). 또한, 탁상 간즈펠트 돔 자극기와 32비트 앰프는 추가적인 전기 소음을 막기 위해 건물 지상 바에 접지된 패러데이 케이지 내부에 배치할 수 있습니다.
메서드의 제한 사항
DC-ERG는 어두운 적응된 동물만충실하게 기록할 수 있으며, 이는 빛 자극이 켜지면 바람직하지 않은 잠재력이나 드리프트를 제거하기 위해 할 수 있는 일이 거의 없다는 것을 의미합니다. 또 다른 한계는 DC-ERG의 일부 구성 요소(라이트 피크, 오프 응답)의 극성이 사용되는 빛강도(16)의적용된다는 것이다. 즉, WT의 가장 큰 편차는 이 프로토콜이 사용하는 광 강도(10 cd/m2)에본질적으로 존재하지 않는 강도에서 발생할 수 있습니다. 이 시점까지 DC-ERG 분석 소프트웨어는 부정적인 응답(응답 최소)을 가정하도록 설계되었습니다. 오프 응답의 극성을 반전시키는 밝은 빛 강도는 포함된 분석 스크립트 파일을 변경해야 합니다.
중요성
RPE는 망막 환경의 동종 요법 유지에 관여하고 몇몇 망막 질병의 병리에서 중요한 역할을 합니다. 이 방법은 기존의 ERG 레코딩과 함께 수행될 때 외부 망막 및 RPE 기능을 객관적으로 측정하는 RPE 전기 응답을 기록하기 위해 DC-ERG 시스템을 설정하는 방법을 자세히 설명합니다. 이러한 RPE 기능 측정은 퇴행성 표현형을 표시하는 형질전환 마우스 라인을 평가하거나 RPE에 약물 효능 또는 약물 유발 세포 독성을 테스트하는 데 사용될 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NEI 교내 기금에 의해 지원되었다. 저자는 진심으로 RPE 생리학 및 질병에 대한 그의 과학적 지도, 기술 조언 및 전문 지식에 대한 박사 셸던 밀러를 인정합니다. 저자들은 메건 코페라와 마우스 식민지 관리를 위한 동물 관리 직원에게 감사를 표하고, 타룬 반살 박사, 레이몬드 저우, 위안 왕박사에게 기술 지원을 해주었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ag/AgCl (mouth) Electrode | WPI Inc | EP1 | Mouth reference electrode for mouse |
| Ceramic Tile | Sutter Instrument | CTS | Used to cut the glass capillary tube to an appropriate size |
| Cotton Tipped Cleaning Stick | Puritan Medical Products | 867-WC No Glue | To be used as a spacer to improve the fit of the electrode holder assembly |
| Electroretinogram (ERG) System | Diagnosys LLC | E3 System | Visual electrophysiology system to diagnose ophthalmic conditions in vision research and drug trials |
| Bunsen Burner | Argos Technologies | BW20002460 | Or equivlaent to shape glass under flame |
| Glass Capillary Tube (1.5 mm) | Sutter Instruments | BF150-75 | For filling with HBSS and making contact to the cornea |
| Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific Inc | 14175-095 | Commercially available. Maintain at RT |
| In-Line Filter | Whatman | 6722-5001 | To protect vacuum pump from aerosols |
| Low Noise Cable for Microelectrode Holders | WPI Inc | 5372 | Suggested for improving the length and placement of the cables and electrode holder assemblies |
| Magnetic Ball Joint | WPI Inc | 500871 | For magnetically positioning the electrode holder assembly on the stage |
| MatLab | Mathworks | MatLab: For editing the analysis software | |
| MatLab Curvefit Toolbox | Mathworks | Toolbox for MatLab (only required for editing the analysis software) | |
| MatLab Compiler | Mathworks | Toolbox for MatLab (only required for editing and re-releasing the analysis software) | |
| MatLab Runtime version 9.5 | Mathworks | R2018b (9.5) | Required to run the analysis software: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html |
| Microelectrode Holders (45 degrees) | WPI Inc | MEH345-15 | For holding the capillaries |
| Needle (25 ga) | Covidien | 8881250313 | For filling the capillary tubes with HBSS |
| Needle (ground) Electrode | Rhythmlink | 13mm - one elctrode | Subdermal needle electrode (ground) for mouse (13mm long, 0.4mm diameter needle, 1.5m leadwire) |
| Regulator/Power Conditioner | Furman | P-1800 | Or equivalent to remove DC-offset from noise introduced through power line |
| Syringe (12 mL) | Monoject | 1181200777 | For filling the capillary tubes with HBSS |
| T-clip | Cole-Parmer | 06852-20 | For electrode holder assembly |
| Vacuum Desiccator | Bel-Art | 420120000 | Clear polycarbonate bottom & cover |
| Pharmacological treatment | |||
| Lubricant eye gel | Alcon | 0078-0429-47 | Helps lubricate corneal surface and maintain electrical contact with capillary electrodes |
| Phenylephrine Hydrochloride 2.5% | Akorn | 17478-201-15 | Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation) |
| Proparacaine Hydrochloride 0.5% | Akorn | 17478-263-12 | Local anesthetic for ophthalmic instillation |
| Tropicamide 0.5% | Akorn | 17478-101-12 | Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation) |
| Xylazine | AnaSed | sc-362949Rx | Analgesic and muscle relaxant |
| Zetamine (Ketamine HCl) | VetOne | 501072 | Anesthetic for intramuscular injections |
References
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