Summary
Hier presenteren we een methode voor het opnemen van licht-opgeroepen elektrische reacties van het retinale pigment epitheel (RPE) in muizen met behulp van een techniek bekend als DC-ERGs voor het eerst beschreven door Marmorstein, Peachey, en collega's in de vroege jaren 2000.
Abstract
Het retinale pigment epitheel (RPE) is een gespecialiseerde monolaag van cellen strategisch gelegen tussen het netvlies en de choriocapillaris die de algehele gezondheid en structurele integriteit van de fotoreceptoren te behouden. De RPE is gepolariseerd, vertoont apically en basaal gelegen receptoren of kanalen, en voert vectoraal transport van water, ionen, metabolieten, en scheidt verschillende cytokinen.
In vivo kunnen niet-invasieve metingen van de RPE-functie worden uitgevoerd met behulp van direct-coupled ERG's (DC-ERG's). De methodologie achter de DC-ERG werd gepionierd door Marmorstein, Peachey, en collega's met behulp van een op maat gebouwd stimulatie opnamesysteem en later aangetoond met behulp van een commercieel beschikbaar systeem. De DC-ERG techniek maakt gebruik van glazen haarvaten gevuld met Hank's gebufferde zoutoplossing (HBSS) om de tragere elektrische reacties van de RPE te meten die ontlokt worden van lichtopgevraagde concentratieveranderingen in de subretinale ruimte als gevolg van fotoreceptoractiviteit. De langdurige lichte stimulus en lengte van de DC-ERG opname maken het kwetsbaar voor drift en ruis wat resulteert in een lage opbrengst van bruikbare opnames. Hier presenteren we een snelle, betrouwbare methode voor het verbeteren van de stabiliteit van de opnames, terwijl het verminderen van ruis met behulp van vacuümdruk te verminderen / te elimineren bellen die voortvloeien uit outgassing van de HBSS en elektrode houder. Bovendien, power line artefacten worden verzwakt met behulp van een spanningsregelaar / power conditioner. We bevatten de nodige lichtstimulatieprotocollen voor een commercieel beschikbaar ERG-systeem en scripts voor analyse van de DC-ERG-componenten: c-wave, snelle oscillatie, lichtpiek en off response. Vanwege het verbeterde gemak van opnames en snelle analyse workflow, dit vereenvoudigde protocol is vooral nuttig bij het meten van leeftijdsgebonden veranderingen in RPE functie, ziekte progressie, en bij de beoordeling van farmacologische interventie.
Introduction
Het retinale pigment epitheel (RPE) is een monolaag van gespecialiseerde cellen die het achterste segment van het oog lijn en kritische functies uit te oefenen om retinale homeostase1te behouden. De RPE ondersteunt fotoreceptoren door hun foton-vastleggen visuele pigment in een proces genaamd de visuele cyclus2, door deel te nemen aan de dagelfcytose van schuur buitenste segment tips3, en in het vervoer van voedingsstoffen en metabole producten tussen fotoreceptoren en de chocaprioillaris4,5. Afwijkingen in RPE functie liggen ten grondslag aan tal van menselijke retinale ziekten, zoals leeftijdsgebonden macula degeneratie6, Leber's aangeboren amaurosis7,8 en Beste vitelliform macula dystrofie9. Aangezien donoroogweefsels vaak moeilijk te verkrijgen zijn uitsluitend voor onderzoeksdoeleinden, kunnen diermodellen met genetische modificaties een alternatieve manier bieden om de ontwikkeling van netvliesziekten te bestuderen10,11. Bovendien, de opkomst en toepassing van CRISPR cas9-technologie maakt nu genomische introducties (knock-in) of schrappingen (knock-out) mogelijk in een eenvoudig proces in één stap dat de beperkingen van eerdere gentargetingtechnologieën overtreft12. De hausse in de beschikbaarheid van nieuwe muismodellen13 vereist een efficiënter opnameprotocol om de RPE-functie niet-invasief te evalueren.
Meting van de licht-opgeroepen elektrische reacties van de RPE kan worden bereikt met behulp van een direct-gekoppelde elektroretinogram (DC-ERG) techniek. Bij gebruik in combinatie met conventionele ERG-opnames die de fotoreceptor (a-wave) en bipolaire (b-wave) celreacties14meten, kan de DC-ERG definiëren hoe de responseigenschappen van de RPE veranderen met retinale degeneratie15,16,17 of dat RPE-disfunctie voorafgaat aan fotoreceptorverlies. Dit protocol beschrijft een methode aangepast aan het werk van Marmorstein, Peachey, en collega's die voor het eerst ontwikkelde de DC-ERG techniek16,18,19,20 en verbetert de reproduceerbaarheid en het gebruiksgemak.
De DC-ERG opname is moeilijk uit te voeren vanwege de lange aanschaftijd (9 min) waarin elke onderbreking of introductie van ruis de interpretatie van de gegevens kan bemoeilijken. Het voordeel van deze nieuwe methode is dat de basislijnen binnen een kortere tijd stabiel bereik bereiken, waardoor de kans dat het dier voortijdig ontwaakt uit anesthesie vermindert en minder gevoelig is voor bellenvorming in de capillaire elektroden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol volgt de richtlijnen voor dierverzorging die zijn beschreven in het dierproevenprotocol dat is goedgekeurd door het Comité Dierverzorging en Gebruik van het Nationaal Ooginstituut.
1. Het invoeren van lichtstimulatieprotocollen voor DC-ERG
OPMERKING: Volg de onderstaande aanwijzingen om de lichtstimulatieprotocollen voor de DC-ERG te importeren in de ERG-systeemsoftware(Tabel van materialen). Het protocol bestaat uit een interval van 0,5 min voor de stimulus, gevolgd door een stap licht (10 cd/m2) gedurende 7 minuten en eindigt met een interval van 1,5 min na de stimulus. De lichtintensiteit van 10 cd/m2 (1 log10 cd/m2) werd geselecteerd omdat het ongeveer de helft van de maximale respons oproept voor alle componenten van de DC-ERG in WT-muizen18,21. De c-wave en snelle oscillatie zijn van bijzonder belang omdat de oorsprong van deze elektrische reacties goed worden gekarakteriseerd en verder geïsoleerd en bestudeerd kan worden in vitro RPE-modellen (bijvoorbeeld iPSC-RPE). De toepassing van andere lichtintensiteiten kan extra informatie extraheren, bijvoorbeeld, de off response ondergaat een omkering van polariteit bij helderder licht stimuli en kan verschillen vertonen bij de intensiteit waarop deze omkering plaatsvindt. De gebruiker is vrij om de instellingen van de lichtintensiteit naar eigen inzicht te wijzigen.
- Open de ERG-systeemsoftware.
- Klik op Database Center.
- Klik op Nieuw (geef een nieuwe databasebestandsnaam op). Klik op Opslaan. In het pop-upvak wordt weergegeven: 'Database gemaakt, wilt u verbinding maken met het nieuwe databasebestand.' Klik op Ja. De huidige databasenaam moet nu de nieuwe bestandsnaam weergeven.
- Klik op Inzetten in het venster Database Control Center.
- Selecteer Aanvullend Bestand 1: LightProtocols - TRANSFER. EXP. Klik op Openen.
- Klik op Sluiten (Database Control Center) na voltooiing van de voortgangsbalk.
- Klik op de groene startknop.
- Klik op Nieuw in het venster Patiënt selecteren. Maak een nieuwe naam van de patiëntfamilie die het muismodel beschrijft, voer de geboortedatum in (DOB, mm/dd/yy), schakel de knop geslacht (M/V) in op de juiste beschrijving. Klik op Sluiten om de experimentele details op te slaan.
- Klik op Protocollen. De donker-aangepaste ERG en DC-ERG protocollen moeten nu zichtbaar zijn.
- Tot slot plaatst u het bestand Long Flash.col in de volgende map C:\ERG-gebruikersbestanden\Lange Flash.col.
2. Capillaire elektrodepreparaat
- Snijd de 1,5 mm glazen haarvaten doormidden door middel van een keramische tegel(Tabel van materialen) om het glas te scoren en breek ze netjes met behulp van een tafel om fysieke tegenkracht te bieden en om het glas te stabiliseren.
LET OP: Stomp de snede eindigt als dat nodig is. - Met behulp van een Bunsen brander (Tabel van materialen) laat de warmte om een kleine bocht te maken in de capillaire terwijl het bedrijf over de vlam met tangen.
3. Vullen van capillaire elektroden
- Sluit de vacuümdesiccator aan op de vacuümlijn van het laboratorium via een in-line filter(Tabel van materialen).
- Giet 30 mL van Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (Tabel van materialen) in een open 50 mL conische buis en plaats deze (met de dop verwijderd) in de vacuümkamer.
- Zet het vacuüm aan en ontgt de HBSS terwijl u de computer en de opnameapparatuur inschakelt.
- Na 5\u201210 min zet u het vacuüm uit en gebruikt u de ontgassde HBSS om een 12 mL spuit te vullen door een bijgevoegde 25 G naald. Gebruik het om de basissen van de elektrodehouders te vullen die extra voorzorgsmaatregelen nemen om geen bellen te introduceren.
- Verwijder hiervoor de schroefdop met schroefdraad en schuif de spuitnaald voorzichtig door de siliconen rubberen pakking om de achterwand (zilver/zilverchloridepelel) van de houder te bereiken.
OPMERKING: De zilver/zilverchloridepellets zijn voordelig ten opzichte van houders die zilverdraad gebruiken omdat ze meer oppervlakte bieden, wat resulteert in een stabiele geluidsarme basislijn. Echter, zilver / zilver chloride pellets vereisen een vloeibare interface vrij van luchtbellen om een goede verbinding te bereiken. Zorg er daarom voor dat u tijdens dit proces geen luchtbellen introduceert. - Geleidelijk injecteren HBSS om de gehele micro-elektrodrode te vullen, terwijl langzaam intrekken van de spuitnaald. Sluit de schroefdraaddop opnieuw vast, maar draai niet aan. Plaats de spuitnaald opnieuw om de lege ruimte in de dop te vullen met HBSS. Vul vervolgens de glazen capillaire terwijl het horizontaal om te voorkomen dat de oplossing ontsnappen uit het andere uiteinde.
- Houd de glazen capillaire van het gebogen uiteinde en steek langzaam het tegenovergestelde uiteinde door de losgemaakte dop en draai de schroefdop op zijn plaats.
OPMERKING: Glazen elektroden gevuld met HBSS handhaven smering van het oog van de muis en voorkomen dat hoornvlies uitdroging die zou optreden bij het gebruik van standaard gouden lus elektroden.
- Verwijder hiervoor de schroefdop met schroefdraad en schuif de spuitnaald voorzichtig door de siliconen rubberen pakking om de achterwand (zilver/zilverchloridepelel) van de houder te bereiken.
- Plaats de elektrodehouders met de capillaire elektroden naar boven gekanteld om bellen naar boven te laten stromen. Voer het vacuüm voor 5\u201210 min op ontgassen. Gas dat ontsnapt uit de glas- en kunststofoppervlakken zal HBSS uit de elektrodehouders duwen.
- Stop en laat het vacuüm langzaam los. Vul de elektrodehouders en glasvattillaries zoals eerder beschreven.
OPMERKING: Bubbels hebben de neiging om te verzamelen op of in de buurt van de siliconen rubberpakking en kan ook verbergen in de groeven van de schroefdraad dop, dus speciale aandacht moet worden besteed aan deze gebieden bubble-free te houden. - Installeer en bevestig de micro-elektrodenhouder in de op maat gemaakte T-clip/Magnetic ball joint stand(Figuur 1A, inzet). Wijzig een T-clip (5/16"-11/32" OD Tubing) #8doorde zwarte polyacetale clips aan één kant te verwijderen door de zwarte polyacetale clips te verwijderen. Laat de cilinderbasis van de magnetische kogelgewrichten in tweeën werken om de hoogte(Tabel van materialen)aan te passen. Zet de gemodificeerde T-clips vast aan de magnetische kogelmontageschroeven met M3-formaat moeren.
- Plaats de micro-elektrodenhouder in de gewijzigde T-clip en houd deze stevig op zijn plaats door in ongeveer een 1-inch taps toelopende houten handvat te schuiven gemaakt van het breken van een katoenen kip reinigingsstok(Tabel van materialen)onder een hoek. Gebruik de zeldzame aardmagneetcilinderbasis om de aangepaste elektrodehouder stevig op de metalen plaat van het podium te plaatsen, waardoor 360° rotatie op een 180° as mogelijk is.
4. Testelektroden
- Giet HBSS in een kleine container (bijvoorbeeld de dop van de 50 mL conische buis).
- Laat de volledig gemonteerde, met HBSS gevulde capillaire micro-elektroden voorzichtig in de dop met HBSS zakken om de elektroden vooraf te equiliberen en plaats de naaldgrondelektrode (staart/achterbeen) en de Ag/AgCl gesinterde pelletreferentie (mond) in dezelfde HBSS om het circuit te voltooien (Figuur 1A).
OPMERKING: Voer alle volgende stappen uit onder zwak rood licht. Gebruik een roodlichtzaklamp om de muis en capillaire elektroden te positioneren. Vergeet niet om alle lichtbronnen volledig uit te schakelen voordat u met de opname begint. - Selecteer of maak een geschikte id (familienaam) om de te testen muis te beschrijven en selecteer het DC-ERG-protocol dat moet worden uitgevoerd door de registratie volgens de volgende volgorde in te vullen.
- Klik op Protocollen. Selecteer DC-ERG. Klik op Uitvoeren. Er verschijnt een dialoogvenster: "Current patient is XXX [DOB: XX/XX/XX) Is dit correct voor de test die wordt uitgevoerd?" Klik op Ja. Ga dan naar 'Stap 1/6'.
- Sluit de deuren naar de kooi van Faraday.
- Geef de impedantiemodus weer door op Impedantie te klikken en te controleren of de waarden voor de mondverwijzing, de staartgrond en de registratie van elektroden aanvaardbaar zijn (zie figuur 1B).
- Test de stabiliteit van de basislijn (ruis en drift) door op Stap (pijl-voorwaarts) te klikken om Stap 4/6 'Long Flash No Light' te selecteren.
OPMERKING: De hoeveelheid drift die wordt waargenomen wanneer de elektroden in het HBSS-bad worden geplaatst, is over het algemeen minder dan 500 μV per 80 s zodra ze gestabiliseerd zijn en is gelijk aan de drift die wordt waargenomen wanneer de elektroden op de muis zijn aangesloten. Zo zijn de elektrische uitlezing van de elektroden in het HBSS-bad een belangrijke indicator voor de status van de elektroden. Het geluid, gemeten als piek-to-peak, is over het algemeen ~ 10\u201215% groter in de muis dan in het HBSS-bad. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de toevoeging van beweging artefacten uit de ademhaling. - Begin met het bekijken van de sporen door op Voorbeeldte klikken. De sporen moeten weinig ruis hebben met een piek-tot-piek amplitude <200 μV. Een lichte afwijking (<500 μV/80 s) die geleidelijk vervaagt naar de basislijn is aanvaardbaar(figuur 1C).
5. Muis- en elektrodepositionering
- Houd de muizen 's nachts in een goed geventileerde lichtdichte doos voor donkere aanpassing.
- Verdoven de dieren door intraperitoneale injectie van ketamine (80 mg/kg) en xylazine (8 mg/kg).
- Breng een daling van 0,5% proparacaïne HCl actueel aan om het hoornvlies te verdoven, evenals een daling van 2,5% fenylephrine HCl en 0,5% tropicamide om de leerlingen te verwijden.
- Trim de muis snorharen met een schaar om te voorkomen dat onbedoeld trillen van het verstoren van de glazen capillaire elektroden tijdens de opname.
OPMERKING: Het DC-ERG stimulusprotocol binnen het ERG-systeem heeft verschillende ingebouwde stimulusroutines die kunnen worden geselecteerd door op de Stap (pijl naar voren) of Stap (pijl naar achteren) te klikken. Alleen stappen 1, 4 en 5 in de software zijn vereist om de DC-ERG-opname voor te bereiden en uit te voeren. - Controleer in het ERG-systeem software of de juiste patiënt is geselecteerd. Klik op de groene protocollenknop. Selecteer DC-ERG onder Protocolbeschrijving. Klik vervolgens op Uitvoeren. Controleer of dit de juiste test is die wordt uitgevoerd door op Jate klikken.
- Gebruik Stap 1/6 aangewezen Roodlicht stimulus om het rode licht in de koepel in te schakelen om de muis en elektroden te helpen plaatsen terwijl de veranderingen in impedantie worden waargenomen.
- Plaats de muis op een verwarmde opnametafel en zet de huid van het achterbeen voorzichtig in de gaten met tangen. Houd de naaldelektrode stevig in één hand en steek deze onderhuids in het achterbeen om deze op zijn plaats te zetten.
- Plaats de referentie Ag/AgCl elektrode(Tabel van materialen) in de mond, zodat de gesinterde pellet rust langs de rug wang en wordt gehouden op zijn plaats achter de tanden.
OPMERKING: Gouden draadelektroden mogen niet worden gebruikt als de mondreferentieelektrode omdat ze verschillende impedantiekenmerken hebben en het piek-tot-piekgeluid verhogen. - Voordat u de haardige elektroden op het oog van de muis plaatst, houdt u de elektrodehouder met de glazen haarvaten verticaal, veegt u met de wijsvinger met de wijsvinger om eventuele bellen te verwijderen die mogelijk zijn geïntroduceerd. Vul de tip met HBSS met behulp van een 25 G naald bevestigd aan een spuit en inspecteren om ervoor te zorgen dat er geen luchtbel gevangen aan de tip. Plaats de elektrodehouderstandaard zodat de open punt van de met HBSS gevulde haarvaten in contact komt met het hoornvlies.
- Gebruik speciale voorzorgsmaatregelen om te voorkomen dat luchtbellen worden geïntroduceerd door de glijmiddelooggeldispenser te houden en de eerste druppels weg te gooien. Plaats een druppel glijmiddel ooggel op elk oog om de geleidbaarheid te behouden en uitdroging tijdens de opname te voorkomen.
6. DC-ERG opname
- Klik op Stap (pijl-vooruit) om Stap 4/6 'Lange Flash No Li' te selecteren.
- Klik op Impedance. Gebruik het impedancecontrolescherm om de weerstanden van de linker- en rechterogen te onderzoeken. De impedantiewaarden voor de opnameelektroden aan elk oog zullen naar verwachting vergelijkbaar zijn (~39 kΩ). De impedantiewaarden voor zowel de grond- als de referentieelektroden zullen naar verwachting minder dan 10 kΩ bedragen).
- Klik op Voorbeeld om de sporen voor het linker- en rechteroog te bekijken. Wacht tot er een stabiele basislijn is bereikt (<10 min). Klik op Stoppen om de trace preview af te sluiten.
OPMERKING: Abrupte veranderingen in driftrichting of afwijkend geluid in de opname zullen niet met de tijd verbeteren en vereisen het identificeren van de capillaire elektrode die aandacht vereist. De meest waarschijnlijke oorzaak is een bel geïntroduceerd op het puntje van de elektrode. Vul de tip bij met HBSS. Klik nogmaals op Voorbeeld om de basislijn te controleren. - Klik op Stap (pijl-vooruit) om Stap 5/6 "Long Flash 10 cd 7 min" te selecteren.
- Klik op Uitvoeren om de opname te starten(figuur 1D).
7. Gegevensexport
- Selecteer de 'Patiënt' (Familienaam) waarin de muisopname wordt beschreven die moet worden geëxporteerd.
- Klik op Oude tests.
- Selecteer DC-ERGonder Protocolbeschrijving . Klik op de groene knop Laden om de eerder verkregen gegevens te laden.
- Klik op Stap (pijl-voorwaarts) om door te gaan naar Stap 5/6 "Long Flash 10 cd 7 min."
- Klik op Exporteren.
- Geef de bestandsnaam op (bijvoorbeeld bestandsnaam.csv). Een geldige bestandsnaam moet beginnen met een letter, gevolgd door letters, cijfers of underscores. Gebruik geen speciale tekens of koppeltekens. Het data-analyseprogramma (DCERG_Analysis.exe) vereist dat tabelgegevens voldoen aan de vereisten voor variabele namen.
- Plaats een vinkje naast gegevenstabel. Selecteer naast scheidingsteken deoptie Tab . Plaats vinkjes naast Opties(Titels, Verticaal), Alle(Stappen, Chans, Resultaten),Gegevenskolommen (Inhoud, Resultaten, Vegen) en Opmaak(Bestand).
- Klik vervolgens op Exporteren (Figuur 1E). Hiermee wordt het bestand *.csv opgeslagen in de map C:\Multifocal.
8. Gegevensanalyse
- Download en installeer de juiste runtime installer(Tabel van materialen)
- Download en installeer de DCERG_Analysis.exe installer.
OPMERKING: Hiermee wordt het script geïnstalleerd waarmee de analyse van de DC-ERG-componenten wordt uitgevoerd en wordt een snelkoppeling gemaakt om het programma uit te voeren in de map Startmenu. - Klik op de sneltoets die is gemaakt in het menu Start > Programma's.
- Selecteer het geëxporteerde gegevensbestand of de geëxporteerde bestanden (*.csv) voor analyse. Klik ctrl +links op de muis om meer dan één bestand te selecteren.
OPMERKING: Het uitvoerbare bestand genereert twee soorten plots: 1) de ruwe gegevens worden uitgezet met een best passende lijn die de gemeten afwijking aangeeft; 2) de drift gecorrigeerd reactie wordt uitgezet na te zijn gladgestreken met een voortschrijdend gemiddelde (met een spanwijdte van ~ 5 s). Vanuit deze plot worden de amplitudes en time-to-peak van de DC-ERG componenten geïdentificeerd: c-wave, snelle oscillatie, lichtpiek en off response. De gegevens worden vervolgens geëxporteerd in tabelindeling om uit te blinken waar elk blad overeenkomt met een andere muisopname. Deze bladen worden gevolgd door twee overzichtsbladen: i) gecompileerde DC-ERG amplitudes (mV); ii) gecompileerde DC-ERG time-to-peaks (licht begin, t = 0 min).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 2 is een voorbeeldgegevensset van miR-204 ko/ko cre/+ (voorwaardelijke KO) en wild type (WT) muizen. MiR-204 ko/ko cre/+ zijn muizen met een voorwaardelijke knock-out van microRNA 204 in het retinale pigment epitheel. Deze muizen worden gegenereerd door het kruisen van floxed miR-204 muizen (geproduceerd door NEIGEF)22 met VMD2-CRE muizen23. MiR-204 wordt sterk uitgedrukt in de RPE waar het regelt de expressie van eiwitten die cruciaal zijn voor epitheliale functie die strakke verbinding integriteit (bijvoorbeeld, claudins), het behoud van kalium homeostase door de expressie van Kir 7.1 kaliumkanalen, en de expressie van verschillende visuele cyclus genen (bijvoorbeeld, LRAT, RPE65)24.
Aangezien abnormale RPE morfologie werd gemeld in verschillende RPE-specifieke Cre uitdrukken muislijnen25, we gecontroleerd op normale RPE morfologie in Cre uitdrukken muizen met de WT fenotype. De structurele en functionele afwijkingen van de miR-204 ko/ko cre + (voorwaardelijke KO) muis netvlies lijken op de kenmerken gevonden in miR-204 null muizen15 gekenmerkt door hyper autofluorescentie (lipofuscine-achtige deposito's) en verhoogde microglia gelokaliseerd op de RPE apicale oppervlak. Bij null-muizen gingen deze veranderingen gepaard met verminderde lichtopgewondende elektrische reacties van de RPE, met minimale wijziging in fotoreceptorreacties (beoordeeld door retinale ERG). Zo wordt verwacht dat verstoring van miR-204 expressie in miR-204 ko/ko cre/+ muizen ook de elektrische respons van de RPE zal veranderen.
In het gepresenteerde voorbeeld wordt een muis op het verwarmde platform geplaatst en worden de elektroden op de juiste manier geplaatst voordat de koepel wordt verlaagd. Impedantie en drift worden gecontroleerd zoals eerder beschreven met behulp van de badoplossing. Representatieve "negatieve" resultaten worden weergegeven in figuur 2A. In figuur 2A (bovenste paneel) heeft het spoor last van minieme bellen in de elektrode die het piek-tot-piekgeluid in het spoor verhogen (in de schaduw in blauw). In een ander voorbeeld (figuur 2A, lager paneel), wanneer bellen loskomen van het oppervlak van het glas en bewegen langs de lengte van de elektrode veroorzaakt dit abrupte veranderingen in de richting van de baseline drift die niet kan worden gecompenseerd door drift aftrekken. Figuur 2B toont representatieve "positieve" opnamen van WT- en miR-204 ko/ko cre/+ muizen waarbij de bellen zijn geëlimineerd met behulp van de vacuümkamer voordat de micro-elektroden in de elektrodehouderstands worden gemonteerd.
De best passende lijn van de eerste 25 s (groen) wordt berekend en weergegeven in het blauw(figuur 2B). De drift gecorrigeerde reacties worden opnieuw weergegeven in figuur 2C, samen met de identificatie van de amplitudes van de DC-ERG componenten. Met behulp van de DC-ERG techniek beschreven in dit protocol kunnen dieren van zowel WT als miR-204 ko/ko cre/+ stammen snel worden geregistreerd en geanalyseerd.
De c-golf bestaat uit twee componenten: een hyperpolarisatie van het RPE apicale membraan als gevolg van verhoogde kaliumgeleiding als reactie op een afname van kalium in de subretinale ruimte als gevolg van fotoreceptoractiviteit en een afzonderlijke bijdrage afkomstig van binnenste retinale cellen (langzame P3-component – die de activiteit van Müller-cellen weerspiegelt). De snelle oscillatie geeft informatie over de hyperpolarisatie van de RPE basolaterale membraan26, voornamelijk als gevolg van veranderingen in de geleiding van een Cl-transporter genaamd cystische fibrose transmembrane geleiding regulator (CFTR)27. De lichtpiek wordt verondersteld voort te komen uit een verandering in de concentratie van een fotoreceptor gedreven stof28 die door middel van een tweede messenger systeem depolariseert basolaterale membraan van de RPE door het moduleren van de activiteit van Ca2 + afhankelijke Cl kanalen21. Ten slotte is de off-response een complexe interactie van reacties die verschillen in polariteit en variëren met lichtintensiteit18.
Zoals verwacht, verminderde expressie van Kir 7.1 K+ kanalen sterk verzwakt de c-golf29 en snelle oscillatie zoals weergegeven in de gemiddelde reacties in figuur 2D, wat wijst op een aanzienlijke aantasting van de elektrische eigenschappen van de RPE. Een samenvatting van de wijzigingen in de componenten van de DC-ERG is opgenomen in figuur 2E. De relatieve amplitudes van de DC-ERG componenten (genormaliseerd naar WT) worden uitgezet tegen de twee grootste licht-opgeroepen a-wave amplitudes (1 cd·s/m2; 10 cd·s/m2) (genormaliseerd naar WT) en weergegeven in figuur 2F\u2012H. De vermindering van de a-wave respons op de helderste lichtintensiteit (10cd·s/m2) (Figuur 2F\u2012H, Aanvullende figuur S1A,B) suggereert een vertraging in het herstel van de gevoeligheid als gevolg van visuele cyclusstoornissen (bijvoorbeeld als gevolg van verminderde LRAT- of RPE65-expressie als gevolg van genomische knock-out van miR-20424,30).
Figuur 1: Het diagram markeert de belangrijkste stappen in het DC-ERG-protocol. (A) Beeld van het voltooide circuit bereikt door het verlagen van de opname (glas capillaire micro-elektroden), referentie, en gemalen elektroden in dezelfde badoplossing. Met deze configuratie kunnen voorbereidende tests worden uitgevoerd (voordat de muis wordt verdoofd) om de karakteristieke impedantie, ruis en drift te evalueren. Inzet (linksboven) met een zijaanzichtschema van de aangepaste micro-elektrodenhouderstandaard. (B) Representatieve afbeelding van de impedantiecontrolemodus met de juiste waarden voor elektrode impedantie. De impedantie in de linker- en rechteroogelektroden moet vergelijkbaar zijn, binnen 5 KΩ van elkaar (bijvoorbeeld linkeroog: 38,7 KΩ vs. Rechteroog: 40,36 KΩ). De impedantie van de mondreferentieelektrode moet minder dan 1 KΩ zijn, terwijl de staartelektrode ongeveer 2,5 KΩ moet zijn. (C) Representatieve afbeelding van het voorbeeldspoor (stap 4/6) wordt weergegeven. Stap 4 (Long Flash No Light) is geselecteerd omdat er geen licht wordt geleverd tijdens de preview van deze stap. De sporen moeten weinig ruis hebben en kunnen een lichte afwijking hebben die geleidelijk vervaagt met de tijd tot de uitgangswaarde. Zodra de sporen een constante afwijking in beide kanalen hebben bereikt en vrij vlak worden, kan de daadwerkelijke opname beginnen. (D) Met behulp van Stap 5/6 (Long Flash 10 cd 7 min) na 0,5 min van de duisternis, een lichte stap van 10 cd/m2 wordt geleverd aan de muis voor 7 min, gevolgd door een terugkeer naar de duisternis voor 1,5 min. (E) Beeld van de export parameters die worden gebruikt om de gegevens om te zetten in een * .csv bestand. Dit precieze formaat is vereist om de DC-ERG analysesoftware uit te voeren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Representatieve sporen en workflow van DC-ERG analyse. Afbeelding van een negatieve DC-ERG resultaat met overmatige (A, bovenste paneel) piek-naar-piek ruis en (A, onderste paneel) drift. (B) Beelden van positieve DC-ERG opnameresultaten van een WT en miR-204 ko/ko cre/+ muis. Gegenereerde percelen van de ruwe sporen met de best passende lijnen (blauw) tot de eerste 25 s (groen) voorafgaand aan het begin van het licht. (C) Percelen van de drift gecorrigeerd DC-ERG reacties voor de WT en miR-204 ko/ko cre /+ muizen weergegeven in B. De amplitudes van de componenten van gelijkstroom-ERG worden vermeld in de legende. (D) Gemiddeld DC-ERG reacties van 3-8 maanden oude WT (n = 6) en miR-204 ko/ko cre/+ (n = 6) muizen. De DC-ERG componenten zijn gelabeld op de WT trace en de lichtstimulatie parameters zijn hieronder gedefinieerd. (E) Samenvatting van DC-ERG componenten genomen uit opnames van WT en miR-204 ko/ko cre/+ muizen. Balkstacelen vertegenwoordigen gemiddelde, foutbalken geven standaardfout aan. De relatieve amplitudes van de (F) c-wave, (G) snelle oscillatie, en (H) off response zijn uitgezet tegen de relatieve twee grootste licht-opgeroepen a-wave amplitudes (1 cd·s/m2; 10 cd·s/m2) (genormaliseerd naar WT). Betekenis wordt aangegeven door sterretjes: (Student's t-test; * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullende figuur 1: ERG reacties van WT en miR-204 ko/ko cre/+ muizen. (A) Reacties van WT (zwart) en miR-204 ko/ko cre/+ muizen (magenta) tot 4 ms lichtflitsen van toenemende intensiteit: 0,0001 cd·s/m2 (n = 5), 0,001 cd·s/m 0,001 cd·s/m2 (n = 5), 0,01 cd·s/m2 (n = 3), 0,1 cd·s/m2 (n = 3), 1 cd·s/m2 (n = 3), 10 cd·s/m2 (n = 2). (B) Gemiddelde a-golf amplitude uitgezet tegen flitsintensiteit. (C) Gemiddelde b-golf amplitude uitgezet tegen flitsintensiteit. (D) Gemiddelde time-to-peak van a-wave reacties uitgezet tegen flitsintensiteit. (E) Gemiddelde time-to-peak van b-wave reacties uitgezet tegen flitsintensiteit. Voor alle getoonde percelen geven foutbalken SEM aan. Betekenis wordt aangegeven door sterretjes: (Student's t-test; * = p < 0,05). Klik hier om dit cijfer te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Voorbeeld van een DC-offset in de hoogspanningslijn die kan worden beperkt met behulp van een spanningsregelaar/voedingsconditioner. (A) Bij gebrek aan spanningsregelgeving zorgen spanningspieken (veroorzaakt door het gebruik van apparatuur in een aangrenzende ruimte bijvoorbeeld, LGO) een DC-offset die de meting van de DC-ERG-componenten, met name de lichtpiek, kan verstoren. De storende offset wordt aan de rechterkant vergroot. (B) Met de spanningsregelaar / power conditioner ingeschakeld de eerste piek is nog steeds merkbaar, maar de schadelijke DC-offset wordt verwijderd. Het effect van de spanningsregelaar/powerconditioner wordt vergroot en rechts weergegeven. Klik hier om dit cijfer te downloaden.
Aanvullende bestanden. Klik hier om deze bestanden te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritieke stappen
Een goede DC-ERG opname vereist stabiele elektroden die vrij zijn van bellen die artefacten en ongewenste drift te creëren als ze zijn zeer gevoelig voor outgassing en temperatuurveranderingen. Het is essentieel dat een stabiele basislijn wordt bereikt wanneer de elektroden in de HBSS-badoplossing worden geplaatst voordat u verder gaat met de muisopname. Kleine belletjes hebben de neiging om te verzamelen aan de basis van de capillaire elektrode of rond de siliconen pakking en zijn moeilijk te zien zodra de elektrodehouder volledig is gemonteerd. Wanneer er weinig bellen aanwezig zijn, zal licht flicking de houder hen vrij maken voor verwijdering. Als er te veel bellen of de drift of ruis niet kan worden verwijderd, is het vaak beter om de elektrode te demonteren en opnieuw te beginnen, terwijl zorgvuldig inspecteren op bellen bij elke stap van het proces.
Wijzigingen en probleemoplossing
De volgende aanpassingen kunnen worden gemaakt om de setup(Table of Materials) om de getrouwheid van de DC-ERG opnames te verbeteren. Low-noise kabels voor micro-elektrodenhouders kunnen worden gebruikt om de bestaande kabels uit te breiden van de 32-bits versterker naar de opnametafel. De extra lengte maakt het mogelijk de elektrodehouder zorgvuldig te plaatsen en af te stellen zonder hun positie te verstoren zodra de Ganzfeldkoepel gesloten is. Een spanningsregelaar / powerconditioner kan worden gebruikt om te elimineren in lijn lawaai en spanningspieken gegenereerd uit verlichting of apparatuur in aangrenzende kamers worden ingeschakeld en uitgeschakeld (Figuur S2). Daarnaast kunnen de tafelblad Ganzfeld dome stimulator en de 32-bits versterker worden geplaatst in een Kooi van Faraday aan de grondbalk van de bouwplaats om te beschermen tegen extra elektrische ruis.
Beperkingen van de methode
De DC-ERG kan alleen trouw worden geregistreerd op donkere aangepaste dieren, wat betekent dat zodra de lichtprikkel is ingeschakeld, er weinig kan worden gedaan om ongewenste potentialen of drift te elimineren. Een andere beperking is dat de polariteit van sommige componenten van de DC-ERG (licht-piek, off-response) afhankelijk is van de gebruikte lichtintensiteit16. Dit betekent dat de grootste afwijkingen van WT kunnen optreden bij intensiteiten die niet inherent aanwezig zijn bij de lichtintensiteit die dit protocol gebruikt (10 cd/m2). Tot op dit punt, de DC-ERG analyse software is ontworpen uitgaande van een negatieve off response (een respons minimum). Helderdere lichtintensiteiten die resulteren in de omkering van polariteit van de off-respons vereisen de noodzaak om het opgenomen analysescriptbestand te wijzigen.
Betekenis
De RPE is betrokken bij het homeostatische onderhoud van de retinale omgeving en speelt een cruciale rol in de pathologie van verschillende netvliesziekten. Deze methode legt in detail uit hoe u een DC-ERG-systeem instelt om de RPE-elektrische respons op te nemen die wanneer deze wordt uitgevoerd in combinatie met conventionele ERG-opnamen, een objectieve maat biedt voor de buitenste retinale en RPE-functie. Deze metingen van RPE-functionaliteit kunnen worden gebruikt om transgene muislijnen met degeneratieve fenotypen te evalueren of om te testen op drug-werkzaamheid of door drugs geïnduceerde cytotoxiciteit aan de RPE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door nei intramurale fondsen. De auteurs erkennen oprecht Dr. Sheldon Miller voor zijn wetenschappelijke begeleiding, technisch advies, en deskundigheid in fysiologie RPE en ziekte. De auteurs bedanken Megan Kopera en de dierenverzorging personeel voor het beheer van de muis kolonies, en Dr Tarun Bansal, Raymond Zhou, en Yuan Wang voor technische ondersteuning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ag/AgCl (mouth) Electrode | WPI Inc | EP1 | Mouth reference electrode for mouse |
| Ceramic Tile | Sutter Instrument | CTS | Used to cut the glass capillary tube to an appropriate size |
| Cotton Tipped Cleaning Stick | Puritan Medical Products | 867-WC No Glue | To be used as a spacer to improve the fit of the electrode holder assembly |
| Electroretinogram (ERG) System | Diagnosys LLC | E3 System | Visual electrophysiology system to diagnose ophthalmic conditions in vision research and drug trials |
| Bunsen Burner | Argos Technologies | BW20002460 | Or equivlaent to shape glass under flame |
| Glass Capillary Tube (1.5 mm) | Sutter Instruments | BF150-75 | For filling with HBSS and making contact to the cornea |
| Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific Inc | 14175-095 | Commercially available. Maintain at RT |
| In-Line Filter | Whatman | 6722-5001 | To protect vacuum pump from aerosols |
| Low Noise Cable for Microelectrode Holders | WPI Inc | 5372 | Suggested for improving the length and placement of the cables and electrode holder assemblies |
| Magnetic Ball Joint | WPI Inc | 500871 | For magnetically positioning the electrode holder assembly on the stage |
| MatLab | Mathworks | MatLab: For editing the analysis software | |
| MatLab Curvefit Toolbox | Mathworks | Toolbox for MatLab (only required for editing the analysis software) | |
| MatLab Compiler | Mathworks | Toolbox for MatLab (only required for editing and re-releasing the analysis software) | |
| MatLab Runtime version 9.5 | Mathworks | R2018b (9.5) | Required to run the analysis software: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html |
| Microelectrode Holders (45 degrees) | WPI Inc | MEH345-15 | For holding the capillaries |
| Needle (25 ga) | Covidien | 8881250313 | For filling the capillary tubes with HBSS |
| Needle (ground) Electrode | Rhythmlink | 13mm - one elctrode | Subdermal needle electrode (ground) for mouse (13mm long, 0.4mm diameter needle, 1.5m leadwire) |
| Regulator/Power Conditioner | Furman | P-1800 | Or equivalent to remove DC-offset from noise introduced through power line |
| Syringe (12 mL) | Monoject | 1181200777 | For filling the capillary tubes with HBSS |
| T-clip | Cole-Parmer | 06852-20 | For electrode holder assembly |
| Vacuum Desiccator | Bel-Art | 420120000 | Clear polycarbonate bottom & cover |
| Pharmacological treatment | |||
| Lubricant eye gel | Alcon | 0078-0429-47 | Helps lubricate corneal surface and maintain electrical contact with capillary electrodes |
| Phenylephrine Hydrochloride 2.5% | Akorn | 17478-201-15 | Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation) |
| Proparacaine Hydrochloride 0.5% | Akorn | 17478-263-12 | Local anesthetic for ophthalmic instillation |
| Tropicamide 0.5% | Akorn | 17478-101-12 | Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation) |
| Xylazine | AnaSed | sc-362949Rx | Analgesic and muscle relaxant |
| Zetamine (Ketamine HCl) | VetOne | 501072 | Anesthetic for intramuscular injections |
References
- Steinberg, R. H. Interactions between the retinal pigment epithelium and the neural retina. Documenta Ophthalmologica. 60 (4), 327-346 (1985).
- Sahu, B., Maeda, A. RPE Visual Cycle and Biochemical Phenotypes of Mutant Mouse Models. Methods in Molecular Biology. 1753, 89-102 (2018).
- Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture. Experimental Eye Resarch. 126, 51-60 (2014).
- Wimmers, S., Karl, M. O., Strauss, O. Ion channels in the RPE. Progress in Retinal Eye Research. 26 (3), 263-301 (2007).
- Gundersen, D., Orlowski, J., Rodriguez-Boulan, E. Apical polarity of Na,K-ATPase in retinal pigment epithelium is linked to a reversal of the ankyrin-fodrin submembrane cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 112 (5), 863-872 (1991).
- Fletcher, E. L., et al. Studying age-related macular degeneration using animal models. Optometry and Vision Science. 91 (8), 878-886 (2014).
- Gu, S. M., et al. Mutations in RPE65 cause autosomal recessive childhood-onset severe retinal dystrophy. Nature Genetics. 17 (2), 194-197 (1997).
- Marlhens, F., et al. Mutations in RPE65 cause Leber's congenital amaurosis. Nature Genetics. 17 (2), 139-141 (1997).
- Marmorstein, A. D., et al. the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).
- Chang, B. Mouse models for studies of retinal degeneration and diseases. Methods in Molecular Biology. 935, 27-39 (2013).
- Collin, G. B., et al. Mouse Models of Inherited Retinal Degeneration with Photoreceptor Cell Loss. Cells. 9 (4), (2020).
- Shrock, E., Güell, M. CRISPR in Animals and Animal Models. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 152, 95-114 (2017).
- Smalley, E. CRISPR mouse model boom, rat model renaissance. Nature Biotechnology. 34 (9), 893-894 (2016).
- Benchorin, G., Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Vollrath, D. Assessment of Murine Retinal Function by Electroretinography. Bio Protocol. 7 (7), (2017).
- Zhang, C., et al. Regulation of phagolysosomal activity by miR-204 critically influences structure and function of retinal pigment epithelium/retina. Human Molecular Genetics. 28 (20), 3355-3368 (2019).
- Samuels, I. S., et al. Light-evoked responses of the retinal pigment epithelium: changes accompanying photoreceptor loss in the mouse. Journal of Neurophysiology. 104 (1), 391-402 (2010).
- Wu, J., Marmorstein, A. D., Peachey, N. S. Functional abnormalities in the retinal pigment epithelium of CFTR mutant mice. Experimental Eye Research. 83 (2), 424-428 (2006).
- Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Neurophysiology. 91 (3), 1134-1142 (2004).
- Peachey, N. S., Stanton, J. B., Marmorstein, A. D. Noninvasive recording and response characteristics of the rat dc-electroretinogram. Visual Neuroscience. 19 (6), 693-701 (2002).
- Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
- Marmorstein, L. Y., et al. The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1). Journal of General Physiology. 127 (5), 577-589 (2006).
- Zhang, C., et al. Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. Annual Meeting for the Association for Research in Vision and Ophthalmology. , 3568 (2017).
- Iacovelli, J., et al. Generation of Cre transgenic mice with postnatal RPE-specific ocular expression. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (3), 1378-1383 (2011).
- Wang, F. E., et al. MicroRNA-204/211 alters epithelial physiology. FASEB Journal. 24 (5), 1552-1571 (2010).
- He, L., Marioutina, M., Dunaief, J. L., Marneros, A. G. Age- and gene-dosage-dependent cre-induced abnormalities in the retinal pigment epithelium. American Journal of Pathology. 184 (6), 1660-1667 (2014).
- Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation. Journal of Neurophysiology. 70 (4), 1669-1680 (1993).
- Blaug, S., Quinn, R., Quong, J., Jalickee, S., Miller, S. S. Retinal pigment epithelial function: a role for CFTR. Documenta Ophthalmologica. 106 (1), 43-50 (2003).
- Gallemore, R. P., Griff, E. R., Steinberg, R. H. Evidence in support of a photoreceptoral origin for the "light-peak substance". Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (4), 566-571 (1988).
- Shahi, P. K., et al. Abnormal Electroretinogram after Kir7.1 Channel Suppression Suggests Role in Retinal Electrophysiology. Science Reports. 7 (1), 10651 (2017).
- Li, Y., et al. Mouse model of human RPE65 P25L hypomorph resembles wild type under normal light rearing but is fully resistant to acute light damage. Human Molecular Genetics. 24 (15), 4417-4428 (2015).
