Summary
Här presenterar vi en metod för att registrera ljus-evoked elektriska svar av retinal pigment epitel (RPE) i möss med hjälp av en teknik som kallas DC-ERGs först beskrivs av Marmorstein, Peachey, och kollegor i början av 2000-talet.
Abstract
Näthinnans pigmentepitelet (RPE) är en specialiserad monolayer av celler som är strategiskt placerade mellan näthinnan och choriocapillaris som upprätthåller fotoreceptorernas allmänna hälsa och strukturella integritet. Den RPE är polariserad, uppvisar apiskt och basalt belägna receptorer eller kanaler, och utför vektorala transporter av vatten, joner, metaboliter, och utsöndrar flera cytokiner.
In vivo noninvasive mätningar av RPE-funktionen kan göras med hjälp av direkt-kopplade ERGs (DC-ERGs). Metoden bakom DC-ERG var pionjärer marmorstein, Peachey, och kollegor med hjälp av en specialbyggd stimulering inspelningssystem och senare visat med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt system. DC-ERG-tekniken använder glaskapillärer fyllda med Hanks buffrade saltlösning (HBSS) för att mäta de långsammare elektriska svaren från RPE som framkallas från ljusuppmanade koncentrationsförändringar i det subretinala utrymmet på grund av fotoreceptoraktivitet. Den långvariga ljusstimulansen och längden på DC-ERG-inspelningen gör den sårbar för drift och buller vilket resulterar i en låg avkastning på användbara inspelningar. Här presenterar vi en snabb, tillförlitlig metod för att förbättra stabiliteten i inspelningarna samtidigt som du minskar bullret genom att använda vakuumtryck för att minska/eliminera bubblor som resulterar från utgasning av HBSS och elektrodhållaren. Dessutom är kraftledningsartefakter försvagade med hjälp av en spänningsregulator / power-balsam. Vi inkluderar nödvändiga protokoll för ljusstimulering för ett kommersiellt tillgängligt ERG-system samt skript för analys av DC-ERG-komponenterna: c-wave, snabb svängning, ljustopp och off-respons. På grund av den förbättrade lätt för inspelningar och snabb analys arbetsflöde, detta förenklade protokollet är särskilt användbart för att mäta åldersrelaterade förändringar i RPE funktion, sjukdomsprogression, och i bedömningen av farmakologiska intervention.
Introduction
Den näthinnans pigment epitel (RPE) är en monolayer av specialiserade celler som linje den bakre delen av ögat och utöva kritiska funktioner för att upprätthålla näthinnans homeostas1. Den RPE stöder fotoreceptorer genom att regenerera deras foton-fånga visuella pigment i en process som kallas den visuellacykeln 2, genom att delta i dagaktiva fagocytos av skjul yttre segment tips3, och i transporten av näringsämnen och metaboliska produkter mellan fotoreceptorer och choriocapillaris4,5. Avvikelser i RPE funktion ligger bakom ett flertal mänskliga näthinnesjukdomar, såsom åldersrelaterad makuladegeneration6, Lebers medfödda amaurosis7,8 och Bästa vitelliform makuladystrofi9. Eftersom donatorögonvävnader ofta är svåra att få enbart för forskningsändamål kan djurmodeller med genetiska modifieringar ge ett alternativt sätt att studera utvecklingen av näthinnesjukdomar10,11. Dessutom tillåter framväxten och tillämpningen av CRISPR cas9-tekniken nu genomiska introduktioner (knock-in) eller strykningar (knock-out) i en enkel enstegsprocess som överträffar begränsningarna av tidigare geninriktningsteknik12. Bommen i tillgången på nya musmodeller13 nödvändiggör ett effektivare inspelningsprotokoll för att icke-invasivt utvärdera RPE-funktionen.
Mätning av de ljusuppmanade elektriska svaren från RPE kan uppnås med hjälp av en direktkoppling elektroretinogram (DC-ERG) teknik. När de används i kombination med konventionella ERG-inspelningar som mäter fotoreceptorn (a-wave) och bipolär (b-wave) cellsvar14, kan DC-ERG definiera hur RPE-nas responsegenskaper förändras med retinal degeneration15,16,17 eller om RPE-dysfunktion föregår fotoreceptorförlust. Detta protokoll beskriver en metod som anpassas från arbetet av Marmorstein, Peachey, och kollegor som först framkallade DC-ERG-tekniken16,18,19,20 och förbättrar på reproducerbarheten och lindrar av bruk.
DC-ERG-inspelningen är svår att utföra på grund av den långa förvärvstiden (9 min) under vilken eventuella avbrott eller införande av buller kan försvåra tolkningen av uppgifterna. Fördelen med denna nya metod är att baslinjerna når steady state inom en kortare tid som minskar sannolikheten för att djuret kommer att vakna i förtid från anestesi och är mindre benägna att bubbla bildas i kapillärelektroderna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll följer de riktlinjer för djurvård som beskrivs i djurstudieprotokollet som godkänts av Animal Care and Use Committee of the National Eye Institute.
1. Importerande ljusstimuleringsprotokoll för DC-ERG
OBS: Följ anvisningarna nedan för att importera protokollen för ljusstimulering för DC-ERG till ERG-systemets programvara (Table of Materials). Protokollet består av en 0,5 min pre-stimulus intervall, följt av ett steg av ljus (10 cd/m2) för 7 min, och slutar med en 1,5 min post-stimulus intervall. Den ljusa intensiteten av 10 cd/m2 (1 logga10 cd/m2) var utvald, sedan den frammanar ungefärligt halva maximala svaret för alla delarna av DCEN-ERG i WT-möss18,21. C-vågen och snabb svängning är av särskilt intresse eftersom ursprunget till dessa elektriska svar är väl karakteriserade och kan isoleras och studeras ytterligare in vitro RPE-modeller (t.ex. iPSC-RPE). Tillämpningen av andra ljusnivåer kan extrahera ytterligare information, till exempel genomgår off response en återföring av polaritet vid ljusare ljusstimuli och kan visa skillnader vid den intensitet vid vilken denna omsvängning sker. Användaren är fri att ändra ljusintensitetsinställningarna efter eget gottfinnande.
- Öppna erg-systemets programvara.
- Klicka på Database Center.
- Klicka på Nytt (ange ett nytt namn databas fil). Klicka på Spara. Popup rutan kommer att visa: "Databas skapas, vill du ansluta till den nya databasfilen." Klicka på Ja. Det aktuella databasnamnet ska nu återspegla det nya filnamnet.
- Klicka på Överför in i fönstret Databaskontrollcenter.
- Välj Tilläggsfil 1: LjusProtocols - ÖVERFÖRING. EXP. Klicka på Öppna.
- Klicka på Stäng (Databaskontrollcentralen) efter avslutad förloppsindikator.
- Klicka på den gröna Start-knappen.
- Klicka på Nytt på fönstret Välj patient. Skapa en ny patient familjenamn som beskriver musmodell, ange födelsedatum (DOB, mm/ dd / yyyy), växla kön (M / F) knappen till lämplig beskrivning. Klicka på Stäng för att spara de experimentella detaljerna.
- Klicka på Protokoll. De mörkanpassade PROTOKOLLEN FÖR ERG och DC-ERG bör nu vara synliga.
- Slutligen placera long flash.col filen i följande mapp C:\ERG Användarfiler\Lång Flash.col.
2. Kapillärelektrodpreparering
- Skär 1,5 mm glas kapillärerna i hälften genom att använda en keramisk bricka (Table of Materials) för att göra mål på glaset och bryta dem rent med hjälp av en tabell för att ge fysisk motkraft och för att stabilisera glaset.
OBS: Trubbiga snittändarna efter behov. - Med hjälp av en Bunsenbrännare (Table of Materials) låta värmen att göra en liten böj i kapillären medan du håller den över lågan med tänjningar.
3. Påfyllning av kapillärelektroder
- Anslut vakuumutsiktorn till laboratoriets vakuumledning genom ett in-line filter (Table of Materials).
- Häll 30 mL av Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (Table of Materials) i ett öppet koniskt rör på 50 mL och placera det (med locket borttaget) i vakuumkammaren.
- Sätt på vakuumet och avgasa HBSS samtidigt som du slår på datorn och inspelningsutrustningen.
- Efter 5\u201210 min stänga av vakuum och använda den avgasade HBSS att fylla en 12 mL spruta genom en bifogad 25 G nål. Använd den för att fylla baserna av elektrodhållarna med extra försiktighet för att inte införa bubblor.
- För att göra detta, ta bort det gängade skruvlocket och skjut försiktigt sprutan nålen genom silikongummi packning för att nå den bakre väggen (silver / silverklorid pellet) av hållaren.
OBS: Den silver / silverklorid pellets är fördelaktigt jämfört med hållare som använder silvertråd eftersom de ger mer yta vilket resulterar i en stabil låg-buller baslinje. Silver/silverklorid pellets kräver dock ett flytande gränssnitt fritt från luftbubblor för att uppnå en bra anslutning. Därför, var mycket noga med att inte införa luftbubblor under denna process. - Injicera gradvis HBSS för att fylla hela mikroelektroden medan du långsamt drar tillbaka sprutnålen. Sätt fast det gängade locket igen men dra inte åt. Sätt i sprutans nål igen för att fylla det tomma utrymmet inom locket med HBSS. Fyll sedan glas kapillären medan du håller den horisontellt för att förhindra att lösningen läcker ut från den andra änden.
- Håll glaskafillären från den böjda änden och för långsamt in den motsatta änden genom det lossade locket och dra sedan åt skruvlocket på plats.
OBS: Glas elektroder fyllda med HBSS upprätthålla smörjning av musens öga och förhindra hornhinnans uttorkning som skulle uppstå vid användning av standard guld loop elektroder.
- För att göra detta, ta bort det gängade skruvlocket och skjut försiktigt sprutan nålen genom silikongummi packning för att nå den bakre väggen (silver / silverklorid pellet) av hållaren.
- Placera elektrodhållarna med kapillärelektroderna lutade uppåt för att bubblor ska rinna ut. Kör vakuumet för 5\u201210 min till degas. Gas som läcker ut från glas- och plastytorna kommer att trycka ut HBSS från elektrodhållarna.
- Stanna och släpp sedan långsamt upp vakuumet. Fyll på elektrodhållarna och glaskafillärerna enligt tidigare beskrivning.
OBS: Bubbles tenderar att samla på eller nära silikongummi packning och kan också gömma sig i spåren av den gängade locket, därför särskild uppmärksamhet måste ägnas för att hålla dessa områden bubbelfri. - Montera och säkra mikroelektodhållaren i det specialtillverkade T-clip/Magnetic-kulledsstället (Bild 1A, inset). För att få den anpassade stativ för mikroelektrodhållaren, modifiera en T-clip (5/16"-11/32" OD Tubing) #8 (Tabell of Materials) genom att ta bort de svarta polyacetalclips på ena sidan. Har cylinderbasen av de magnetiska kulfogarna bearbetas i hälften för att justera höjden (Table of Materials). Säkra de modifierade T-clipsen på fästskruvarna för magnetkulan med M3-storleksötter.
- Placera mikroelektodhållaren i det modifierade T-klämman och håll den tätt på plats genom att glida in ungefär ett 1-tums avsmalnande trähandtag tillverkat av att bryta en bomullspetsad rengöringspinne (Table of Materials) i vinkel. Använd den sällsynta jordartsmagnet cylindern bas för att säkert placera den anpassade elektrodhållaren stå på metallplattan av scenen möjliggör 360 ° rotation på en 180 ° axel.
4. Testa elektroder
- Häll HBSS i en liten behållare (t.ex. locket på det koniska röret på 50 mL).
- Sänk försiktigt ned de helmonterade, HBSS-fyllda kapillärmikroderna i locket som innehåller HBSS för att i förväg jämvikta elektroderna och placera nålens jordelektrod (svans/bakre ben) och Ag/AgCl sintrat pelletreferenselektrod (mun) i samma HBSS för att färdigställa kretsen (Figur 1A).
OBS: Utför alla efterföljande steg under svagt rött ljus. Använd en ficklampa med rött ljus för att placera mus- och kapillärelektroderna. Kom ihåg att helt stänga av alla ljuskällor innan inspelningen påbörjas. - Välj eller skapa en lämplig identifierare (familjenamn) för att beskriva musen som ska testas och välj dc-ERG-protokollet som ska utföras genom att slutföra registreringen enligt följande ordning.
- Klicka på Protokoll. Välj DC-ERG. Klicka på Kör. En dialogruta kommer att popup: "Nuvarande patient är XXX [DOB: XX/XX/XX) Är detta korrekt för testet som utförs?" Klicka på Ja. Fortsätt sedan till "Steg 1/6."
- Stäng dörrarna till faradayburen.
- Display impedansläge genom att klicka på Impedans och verifiera att värdena för munreferensen, svansmarken och inspelningselektroderna är acceptabla (se figur 1B).
- Testa baslinjen stabilitet (brus och drift) genom att klicka på Steg (framåt pil) för att välja Steg 4 /6 "Lång Blixt inget ljus."
OBS: Den mängd avdrift som observerats när elektroderna placeras i HBSS-badet är i allmänhet mindre än 500 μV per 80 s när de har stabiliserats och motsvarar den drift som observerats när elektroderna är anslutna till musen. Således är elektrodernas elektriska avläsning i HBSS-badet en viktig indikator på elektrodernas status. Bullret, mätt som topp-till-topp, är i allmänhet ~ 10\u201215% större i musen än i HBSS-badet. Detta beror förmodligen på tillägg av rörelse artefakter från andning. - Börja visa spåren genom att klicka på Förhandsgranska. Spåren bör vara låg ljudnivå med en topp-till-topp-amplitud <200 μV. En lätt avdrift (<500 μV/80 s) som gradvis tonas till baslinjen är acceptabelt (Bild 1C).
5. Mus- och elektrodpositionering
- Håll mössen över natten i en väl ventilerad ljustät låda för mörk anpassning.
- Bedöva djuren genom intraperitoneal injektion av ketamin (80 mg/kg) och xylazin (8 mg/kg).
- Applicera en droppe 0,5% proparakain HCl utvärtes att bedöva hornhinnan samt en droppe 2,5% fenylefrin HCl och 0,5% tropicamide att vidga pupillerna.
- Trimma mus morrhåren med sax för att förhindra att oavsiktliga ryckningar stör glaskexärelektroderna under inspelningen.
OBS: DC-ERG stimulans protokoll inom ERG-systemet har flera inbyggda stimulans rutiner som kan väljas genom att klicka på Step (framåt pil) eller Steg (bakåt pil). Endast steg 1, 4 och 5 i programvaran krävs för att förbereda och utföra DC-ERG-inspelningen. - I ERG-systemets programvara verifiera att rätt patient är vald. Klicka på den gröna Protokoll knappen. Under Protokoll Beskrivning välj DC-ERG. Klicka sedan på Kör. Kontrollera att detta är rätt test som utförs genom att klicka på Ja.
- Använd Steg 1/6 utsedda Red Light stimulus för att slå på det röda ljuset inuti kupolen för att hjälpa till att positionera musen och elektroderna samtidigt som de observerar förändringarna i impedans.
- Placera musen på en uppvärmd inspelning bord och försiktigt tält huden på det bakre benet med hjälp av forceps. Håll nålelektroden stadigt i ena handen och för in den subkutant i det bakre benet för att säkra den på plats.
- Placera referensEn Ag/AgCl elektrod (Tabell of Materials) inne i munnen så att den sintrad pellet vilar längs bak kinden och hålls på plats bakom tänderna.
OBS: Guldtrådelektroder bör inte användas som munreferenselektrod eftersom de har olika impedansegenskaper och ökar topp-till-topp-bruset. - Innan kapillärelektroderna placeras mot musens öga, håll elektrodhållaren med glasmönsorna vertikala, snärta fast elektrodhållaren med pekfingret för att avlägsna eventuella bubblor som kan ha införts. Fyll spetsen med HBSS med hjälp av en 25 G-nål som sitter fast på en spruta och inspektera för att säkerställa att det inte finns någon luftbubbla som sitter fast i spetsen. Placera elektrodhållarstativ så att den öppna spetsen på de HBSS-fyllda kapillärerna är i skonsam kontakt med hornhinnan.
- Använd särskilda försiktighetsåtgärder för att undvika att införa luftbubblor genom att hålla smörjmedel ögon gel dispenser inverterad och kassera de inledande dropparna. Placera en droppe smörjmedelsögongel på varje öga för att upprätthålla ledningsförmågan och förhindra uttorkning under inspelningen.
6. INSPELNING AV DC-ERG
- Klicka på Steg (framåtpil) för att välja Steg 4/6 "Lång Flash No Li."
- Klicka på Impedance. Använd Impedanskontrollskärmen för att undersöka motståndet från vänster och höger ögon. Impedansvärdena för de registrerande elektroderna vid varje öga förväntas vara likartade (~39 kΩ). Impedansvärdena för både jord- och referenselektroder förväntas vara mindre än 10 kΩ).
- Klicka på Förhandsgranska för att visa spåren för vänster och höger öga. Vänta tills en stabil baslinje uppnås (<10 min). Klicka på Stopp för att avsluta spårningen förhandsvisning.
OBS: Abrupta förändringar i avdriftsriktning eller avvikande brus i inspelningen kommer inte att förbättras med tiden och kommer att kräva att identifiera kapillärelektroden som kräver uppmärksamhet. Den mest sannolika orsaken är en bubbla som introduceras till spetsen av elektroden. Fyll på spetsen med HBSS. Klicka på Förhandsgranska igen för att kontrollera baslinjen. - Klicka på Steg (framåtpil) för att välja Steg 5/6 "Lång Flash 10 cd 7 min."
- Klicka på Kör för att starta inspelningen ( Bild1D).
7. Dataexport
- Välj den "Patient" (Familjenamn) som beskriver den musinspelning som ska exporteras.
- Klicka på Gamla tester.
- Under Protokoll Beskrivning välj DC-ERG. Klicka på den gröna Knappen Ladda för att ladda de tidigare förvärvade uppgifterna.
- Klicka på Steg (framåt pil) för att avancera till Steg 5 / 6 "Lång Flash 10 cd 7 min."
- Klicka på Export.
- Tillhandahåll filnamnet (t.ex. filnamn.csv). Ett giltigt filnamn måste börja med en bokstav, följt av bokstäver, siffror eller understreck. Använd inte specialtecken eller bindestreck. Dataanalysprogrammet (DCERG_Analysis.exe) kräver att tabellposter uppfyller kraven för variabelnamn.
- Placera en bock bredvid Datatabell. Välj Tabb bredvid avgränsare. Placera bockar bredvid Alternativ ( Titlar ,Lodrätt), Inkludera alla (steg, Chans, Resultat),Datakolumner( Innehåll , Resultat, Svep) och Format (Fil).
- Klicka sedan på Export (Bild 1E). Då sparas filen *.csv till mappen C:\Multifocal.
8. Dataanalys
- Ladda ner och installera lämplig installationsprogram för körtid (Table of Materials)
- Ladda ned och installera DCERG_Analysis.exe installationsprogrammet.
OBS: Detta installerar skriptet som kommer att utföra analysen av DC-ERG komponenter och skapar en genväg för att köra programmet i Start-menyn mappen. - Klicka på genvägen som skapats i Start-menyn > Mappen Program.
- Välj den exporterade datafilen eller filerna (*.csv) för analys. Använd Ctrl + vänsterklicka på musen för att markera mer än en fil.
OBS: Den körbara filen genererar två typer av tomter: 1) de rådata ritas med en bästa passar linje som anger den uppmätta avdrift; 2) den drift korrigerade svaret ritas efter att jämnas med ett glidande medelvärde (med en spännvidd på ~ 5 s). Från denna tomt amplituderna och tiden till topp av DC-ERG komponenter identifieras: c-wave, snabb svängning, ljus topp, och off svar. Data exporteras sedan i tabellformat till Excel där varje ark motsvarar en annan musinspelning. Dessa blad följs av två sammanfattningsblad: (i) kompilerade DC-ERG-amplituder (mV); (ii) kompilerade DC-ERG tid-till-toppar (ljus påset, t = 0 min).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 är en exempeldatauppsättning från möss med MIR-204 ko/ko cre/+ (villkorlig KO) och vildtyp (WT). MiR-204 ko/ko cre/+ är möss med villkorlig knockout av mikroRNA 204 i näthinnepigmentepitel. Dessa möss genereras genom att korsa floxed miR-204 möss (producerad av NEIGEF)22 med VMD2-CRE möss23. MiR-204 uttrycks högt i RPE där den reglerar uttrycket av proteiner som är kritiska för epitelfunktion som upprätthåller stram junction integritet (t.ex. claudins), upprätthållandet av kaliumhomeostas genom uttryck av Kir 7.1 kaliumkanaler, och uttryck av flera visuella cykel gener (t.ex. LRAT, RPE65)24.
Eftersom onormal RPE morfologi rapporterades i flera RPE-specifika Cre uttrycker mus linjer25, vi övervakas för normal RPE morfologi i Cre uttrycker möss med den WT fenotyp. De strukturella och funktionella avvikelser av miR-204 ko/ko cre + (villkorlig KO) mus näthinnan likna de funktioner som finns i miR-204 null möss15 kännetecknas av hyper autofluorescens (lipofuscin-liknande avlagringar) och ökad microglia lokaliserade till RPE apikala ytan. I null möss dessa förändringar åtföljdes med minskad ljus-framkallade elektriska svar av RPE, med minimal ändring av photoreceptor svar (bedömas av retinal ERG). Således förväntas också perturbation av miR-204-uttryck i miR-204 ko/ko cre/+ möss ändra den elektriska responsen hos RPE.
I det förelagda exemplet placeras en mus på den uppvärmda plattformen och elektroderna placeras på lämpligt sätt innan kupolen sänks. Impedans och drift kontrolleras som tidigare beskrivits med hjälp av badlösningen. Representativa "negativa" resultat visas i figur 2A. I figur 2A (topppanelen) lider spårspåret av minutbubblor i elektroden som ökar topp-till-topp-bruset i spårningen (skuggat i blått). I ett annat exempel (Figur 2A, nedre panelen), när bubblor lossnar från ytan av glaset och flytta längs längden av elektroden detta orsakar abrupta förändringar i riktning mot baslinjen drift som inte kan kompenseras med drift subtraktion. Bild 2B visar representativa "positiva" inspelningar av WT- och miR-204 ko/ko cre/+ möss där bubblorna eliminerats med hjälp av vakuumkammaren innan mikroelektroderna monteras in i elektrodhållarnas stativ.
Den bästa passningslinjen till de inledande 25 s (grön) beräknas och visas i blått (Bild 2B). De drift korrigerade svaren omlottas i figur 2C tillsammans med identifieringen av amplituderna för DC-ERG-komponenterna. Med hjälp av DC-ERG teknik som beskrivs i detta protokoll djur från både WT och miR-204 ko/ko cre/+ stammar kan snabbt registreras och analyseras.
C-vågen är sammansatt av två komponenter: en hyperpolarisering av RPE apikala membranet på grund av ökad kaliumkonduktivans som svar på en minskning av kalium i subretinal utrymmet på grund av fotoreceptor aktivitet och ett separat bidrag som härrör från inre näthinnans celler (långsam P3 komponent – återspeglar aktiviteten av Müller celler). Den snabba svängningen ger information angående hyperpolariseringen av RPE basolateralmembranet 26, främst på grund av förändringar i conductance av en Cl transportör kallas cystisk fibros transmembrane conductance regulator (CFTR)27. Ljustoppen tros härröra från en förändring i koncentrationen av en fotoreceptor driven substans28 som genom en andra budbärare system depolariserar RPE: s basolateralmembran genom modulering aktiviteten av Ca2 + beroende Cl kanaler21. Slutligen är off-response en komplex interaktion av svar som skiljer sig i polaritet och varierar med ljusintensitet18.
Som väntat dämpar minskat uttryck för Kir 7.1 K+ kanaler kraftigt c-våg29 och snabb svängning som visas i de genomsnittliga svaren i figur 2D, vilket indikerar en betydande försämring av RPE:s elektriska egenskaper. En sammanfattning av ändringarna i komponenterna i DC-ERG ges i figur 2E. De relativa amplituderna för DC-ERG-komponenterna (normaliserade till WT) plottas mot de relativa två största ljus-framkallade a-våg-amplituderna (1 cd·s/m2; 10 cd·s/m2) (normaliserad till WT) och visas i figur 2F\u2012H. Minskningen av a-wave-svaret på den ljusstarkaste ljusintensiteten (10cd·s/m2) (Figur 2F\u2012H, Tilläggsfigur S1A,B) tyder på en fördröjning av återvinningen av känsligheten på grund av nedsattsyncykel(t.ex.till följd av minskat LRAT- eller RPE65-uttryck till följd av genomisk knockout av miR-20424, 30 ).
Bild 1: Diagrammet markerar viktiga steg i protokollet DC-ERG. (A) Bild av den färdiga kretsen åstadkommit genom att sänka inspelningen (glas kapillär mikroelektroder), referens, och jord elektroder i samma bad lösning. Den här konfigurationen gör det möjligt att köra preliminära tester (före sövning av musen) för att utvärdera den karakteristiska impedansen, bullret och driften. Inset (övre vänstra) som visar en side-view schematisk av den anpassade microelektrode innehavaren stativ. (B) Representativ bild av Impedans KontrollSätt som visar lämpliga värden för elektrod impedanser. Impedansen i vänster och höger ögonelektroder ska vara jämförbara, inom 5 KΩ av varandra (t.ex., Vänster öga: 38,7 KΩ vs. Höger öga: 40,36 KΩ). Impedansen i munreferenselektroden ska vara mindre än 1 KΩ, medan stjärtelektroden ska vara runt 2,5 KΩ. (C) Representativ bild av förhandsvisningen spårning (Steg 4/6) visas. Steg 4 (Long Flash No Light) väljs som inget ljus levereras under förhandsvisningen av detta steg. Spåren ska vara låg ljudnivå och kan ha en lätt avdrift som gradvis avtar med tiden till baslinjen. När spåren har uppnått en konstant drift i båda kanalerna och blivit relativt platt, kan själva inspelningen börja. (D) Använda Steg 5/6 (Long Flash 10 cd 7 min) efter 0,5 min mörker, ett ljussteg på 10 cd/m2 levereras till musen i 7 min följt av en återgång till mörker i 1,5 min. (E) Bild av de exportparametrar som används för att konvertera data till en *.csv-fil. Detta exakta format krävs för att köra DC-ERG-analysprogramvaran. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Representativa spår och arbetsflöde av DC-ERG-analys. Bild av ett negativt DC-ERG-resultat som visar överdrivet (A, topppanel) topp-till-topp-brus och (A, bottenpanel) drift. (B) Bilder av positiva DC-ERG-inspelningsresultat från en WT- och miR-204 ko/ko cre/+ mus. Genererade tomter av de råa spår som visar de bästa passform linjer (blå) till den ursprungliga 25 s (grön) före ljus påset. (C) Tomter av drift korrigerade DC-ERG svar för WT och miR-204 ko/ ko cre / + möss som visas i B. Amplituderna för komponenterna i DC-ERG anges i förklaringen. (D) Genomsnitt DC-ERG svar av 3–8 månader gamla WT (n = 6) och miR-204 ko/ko cre/+ (n = 6) möss. DC-ERG-komponenterna är märkta på WT-spårningen och ljusstimuleringsparametrarna definieras nedan. (E) Sammanfattning av DC-ERG-komponenter hämtade från inspelningar av WT- och miR-204 ko/ko cre/+-möss. Barterter representerar medelvärde, felstaplar indikerar standardfel. De relativa amplituderna hos (F) c-wave, (G) snabb svängning, och (H) av responsen plottas mot de relativa två största ljus-framkallade a-wave amplituderna (1 cd·s/m2; 10 cd·s/m2) (normaliserat till WT). Signifikans anges med asterisker: (Students t-test; * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Kompletterande figur 1: ERG-svar av WT- och miR-204 ko/ko cre/+ möss. (A) Svar på WT (svart) och miR-204 ko/ko cre/+ möss (magenta) till 4 ms blixtar av ljus med ökande intensitet: 0,0001 cd·s/m2 (n = 5), 0.001 cd·s/m2 (n = 5), 0,01 cd·s/m2 (n = 3), 0,1 cd·s/m2 (n = 3), 1 cd·s/m2 (n = 3), 10 cd·s/m2 (n = 2). (B) Averaged a-wave amplitud plottas mot blixtintensitet. (C) Averaged b-wave amplitud ritas mot blixtintensitet. (D) Genomsnitt tid till topp av a-wave svar plottas mot blixt intensitet. (E) Genomsnitt tid till topp av b-wave svar ritas mot blixt intensitet. För alla yttriger visade felstaplar indikerar SEM. Signifikans indikeras av asterisker: (Deltagarens t-testa; * = p < 0.05). Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 2: Exempel på en DC-offset i kraftledningen som kan mildras med användning av en spänningsregulator/kraftkonditionerare. (A) I avsaknad av spänningsreglering spänningsspikar (orsakas av användning av utrustning i ett angränsande rum t.ex., OKT) generera en DC-offset som kan störa mätningen av DC-ERG komponenter, särskilt ljustopp. Den störande förskjutningen förstoras till höger. (B) Med spänningsregulator / power conditioner aktiverat den inledande spike är fortfarande märkbar men den skadliga DC-offset tas bort. Effekten av spänningsregulatorn/effektanläggningen förstoras och visas till höger. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande Filer. Vänligen klicka här för att ladda ner dessa filer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiska steg
En bra DC-ERG-inspelning kräver stabila elektroder som är fria från bubblor som skapar artefakter och oönskad drift då de är extremt känsliga för utgasning och temperaturförändringar. Det är väsentligt att en stabil baslinje uppnås när elektroderna placeras i HBSS-badlösningen innan man går vidare med musinspelningen. Små bubblor tenderar att samla vid basen av kapillärelektroden eller runt silikonpackningen och är svåra att se när elektrodhållaren är helt hopmonterad. När få bubblor är närvarande, lätt snärta hållaren kommer att befria dem för borttagning. Om det finns för många bubblor eller drift eller buller inte kan tas bort, är det ofta bättre att ta isär elektroden och börja om medan noggrant inspektera för bubblor vid varje steg i processen.
Ändringar och Felsökning
Följande anpassningar kan göras till uppställningen (Table of Materials) för att förbättra troheten hos DC-ERG-inspelningarna. Lågljudskablar för mikroelektrodhållare kan användas för att förlänga de befintliga kablarna från 32-bitarsförstärkaren till inspelningsbordet. Den extra längden möjliggör en noggrann placering och justering av elektrodhållaren utan att störa deras position när Ganzfeld-kupolen är stängd. En spänningsregulator/kraftanläggning kan användas för att eliminera i linjebrus och strömtopar som genereras från lampor eller utrustning i angränsande rum som slås på och av (Bild S2). Dessutom bordsskivan Ganzfeld kupol stimulator och 32-bitars förstärkare kan placeras inuti en Faraday bur jordad till byggnaden marken baren för att skydda mot ytterligare elektriska buller.
Metodens begränsningar
DC-ERG kan endast registreras troget på mörka anpassade djur vilket innebär att när ljuset stimulans är påslagen finns det lite som kan göras för att eliminera oönskade potentialer eller drift. En annan begränsning är att polariteten för vissa av komponenterna i DC-ERG (light-peak, off-response) är föremål för den ljusintensitet somanvänds 16. Detta innebär att de största avvikelserna från WT kan förekomma vid intensiteter som inte är i sig närvarande vid den ljusintensitet som detta protokoll använder (10 cd/m2). Till denna punkt, DC-ERG analysprogramvara utformades förutsatt att en negativ off svar (ett svar minimum). Ljusare ljusintensiteter som resulterar i återföring av polaritet av off-svaret kommer att kräva behovet av att ändra den medföljande analysskriptfilen.
Betydelse
RPE är involverad i det homeostatiska upprätthållandet av retinal miljön och spelar en avgörande roll i patologin av flera näthinnesjukdomar. Denna metod förklarar i detalj hur man setup ett DC-ERG-system för att registrera RPE elektriska svar som när de utförs i samband med konventionella ERG inspelningar ger ett objektivt mått på yttre retinal och RPE funktion. Dessa mått på RPE-funktionalitet kan användas för att utvärdera transgena muslinjer som visar degenerativa fenotyper eller för att testa för läkemedelseffekt eller läkemedelsinducerad cytotoxicitet till RPE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NEI intramural fonder. Författarna erkänner uppriktigt Dr Sheldon Miller för hans vetenskapliga vägledning, teknisk rådgivning och expertis inom RPE fysiologi och sjukdom. Författarna tackar Megan Kopera och djurvårdspersonal för att hantera musen kolonier, och Dr Tarun Bansal, Raymond Zhou, och Yuan Wang för tekniskt stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ag/AgCl (mouth) Electrode | WPI Inc | EP1 | Mouth reference electrode for mouse |
| Ceramic Tile | Sutter Instrument | CTS | Used to cut the glass capillary tube to an appropriate size |
| Cotton Tipped Cleaning Stick | Puritan Medical Products | 867-WC No Glue | To be used as a spacer to improve the fit of the electrode holder assembly |
| Electroretinogram (ERG) System | Diagnosys LLC | E3 System | Visual electrophysiology system to diagnose ophthalmic conditions in vision research and drug trials |
| Bunsen Burner | Argos Technologies | BW20002460 | Or equivlaent to shape glass under flame |
| Glass Capillary Tube (1.5 mm) | Sutter Instruments | BF150-75 | For filling with HBSS and making contact to the cornea |
| Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific Inc | 14175-095 | Commercially available. Maintain at RT |
| In-Line Filter | Whatman | 6722-5001 | To protect vacuum pump from aerosols |
| Low Noise Cable for Microelectrode Holders | WPI Inc | 5372 | Suggested for improving the length and placement of the cables and electrode holder assemblies |
| Magnetic Ball Joint | WPI Inc | 500871 | For magnetically positioning the electrode holder assembly on the stage |
| MatLab | Mathworks | MatLab: For editing the analysis software | |
| MatLab Curvefit Toolbox | Mathworks | Toolbox for MatLab (only required for editing the analysis software) | |
| MatLab Compiler | Mathworks | Toolbox for MatLab (only required for editing and re-releasing the analysis software) | |
| MatLab Runtime version 9.5 | Mathworks | R2018b (9.5) | Required to run the analysis software: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html |
| Microelectrode Holders (45 degrees) | WPI Inc | MEH345-15 | For holding the capillaries |
| Needle (25 ga) | Covidien | 8881250313 | For filling the capillary tubes with HBSS |
| Needle (ground) Electrode | Rhythmlink | 13mm - one elctrode | Subdermal needle electrode (ground) for mouse (13mm long, 0.4mm diameter needle, 1.5m leadwire) |
| Regulator/Power Conditioner | Furman | P-1800 | Or equivalent to remove DC-offset from noise introduced through power line |
| Syringe (12 mL) | Monoject | 1181200777 | For filling the capillary tubes with HBSS |
| T-clip | Cole-Parmer | 06852-20 | For electrode holder assembly |
| Vacuum Desiccator | Bel-Art | 420120000 | Clear polycarbonate bottom & cover |
| Pharmacological treatment | |||
| Lubricant eye gel | Alcon | 0078-0429-47 | Helps lubricate corneal surface and maintain electrical contact with capillary electrodes |
| Phenylephrine Hydrochloride 2.5% | Akorn | 17478-201-15 | Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation) |
| Proparacaine Hydrochloride 0.5% | Akorn | 17478-263-12 | Local anesthetic for ophthalmic instillation |
| Tropicamide 0.5% | Akorn | 17478-101-12 | Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation) |
| Xylazine | AnaSed | sc-362949Rx | Analgesic and muscle relaxant |
| Zetamine (Ketamine HCl) | VetOne | 501072 | Anesthetic for intramuscular injections |
References
- Steinberg, R. H. Interactions between the retinal pigment epithelium and the neural retina. Documenta Ophthalmologica. 60 (4), 327-346 (1985).
- Sahu, B., Maeda, A. RPE Visual Cycle and Biochemical Phenotypes of Mutant Mouse Models. Methods in Molecular Biology. 1753, 89-102 (2018).
- Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture. Experimental Eye Resarch. 126, 51-60 (2014).
- Wimmers, S., Karl, M. O., Strauss, O. Ion channels in the RPE. Progress in Retinal Eye Research. 26 (3), 263-301 (2007).
- Gundersen, D., Orlowski, J., Rodriguez-Boulan, E. Apical polarity of Na,K-ATPase in retinal pigment epithelium is linked to a reversal of the ankyrin-fodrin submembrane cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 112 (5), 863-872 (1991).
- Fletcher, E. L., et al. Studying age-related macular degeneration using animal models. Optometry and Vision Science. 91 (8), 878-886 (2014).
- Gu, S. M., et al. Mutations in RPE65 cause autosomal recessive childhood-onset severe retinal dystrophy. Nature Genetics. 17 (2), 194-197 (1997).
- Marlhens, F., et al. Mutations in RPE65 cause Leber's congenital amaurosis. Nature Genetics. 17 (2), 139-141 (1997).
- Marmorstein, A. D., et al. the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).
- Chang, B. Mouse models for studies of retinal degeneration and diseases. Methods in Molecular Biology. 935, 27-39 (2013).
- Collin, G. B., et al. Mouse Models of Inherited Retinal Degeneration with Photoreceptor Cell Loss. Cells. 9 (4), (2020).
- Shrock, E., Güell, M. CRISPR in Animals and Animal Models. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 152, 95-114 (2017).
- Smalley, E. CRISPR mouse model boom, rat model renaissance. Nature Biotechnology. 34 (9), 893-894 (2016).
- Benchorin, G., Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Vollrath, D. Assessment of Murine Retinal Function by Electroretinography. Bio Protocol. 7 (7), (2017).
- Zhang, C., et al. Regulation of phagolysosomal activity by miR-204 critically influences structure and function of retinal pigment epithelium/retina. Human Molecular Genetics. 28 (20), 3355-3368 (2019).
- Samuels, I. S., et al. Light-evoked responses of the retinal pigment epithelium: changes accompanying photoreceptor loss in the mouse. Journal of Neurophysiology. 104 (1), 391-402 (2010).
- Wu, J., Marmorstein, A. D., Peachey, N. S. Functional abnormalities in the retinal pigment epithelium of CFTR mutant mice. Experimental Eye Research. 83 (2), 424-428 (2006).
- Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Neurophysiology. 91 (3), 1134-1142 (2004).
- Peachey, N. S., Stanton, J. B., Marmorstein, A. D. Noninvasive recording and response characteristics of the rat dc-electroretinogram. Visual Neuroscience. 19 (6), 693-701 (2002).
- Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
- Marmorstein, L. Y., et al. The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1). Journal of General Physiology. 127 (5), 577-589 (2006).
- Zhang, C., et al. Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. Annual Meeting for the Association for Research in Vision and Ophthalmology. , 3568 (2017).
- Iacovelli, J., et al. Generation of Cre transgenic mice with postnatal RPE-specific ocular expression. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (3), 1378-1383 (2011).
- Wang, F. E., et al. MicroRNA-204/211 alters epithelial physiology. FASEB Journal. 24 (5), 1552-1571 (2010).
- He, L., Marioutina, M., Dunaief, J. L., Marneros, A. G. Age- and gene-dosage-dependent cre-induced abnormalities in the retinal pigment epithelium. American Journal of Pathology. 184 (6), 1660-1667 (2014).
- Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation. Journal of Neurophysiology. 70 (4), 1669-1680 (1993).
- Blaug, S., Quinn, R., Quong, J., Jalickee, S., Miller, S. S. Retinal pigment epithelial function: a role for CFTR. Documenta Ophthalmologica. 106 (1), 43-50 (2003).
- Gallemore, R. P., Griff, E. R., Steinberg, R. H. Evidence in support of a photoreceptoral origin for the "light-peak substance". Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (4), 566-571 (1988).
- Shahi, P. K., et al. Abnormal Electroretinogram after Kir7.1 Channel Suppression Suggests Role in Retinal Electrophysiology. Science Reports. 7 (1), 10651 (2017).
- Li, Y., et al. Mouse model of human RPE65 P25L hypomorph resembles wild type under normal light rearing but is fully resistant to acute light damage. Human Molecular Genetics. 24 (15), 4417-4428 (2015).
