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Chemistry

Direktgekoppeltes Elektroretinogramm (DC-ERG) zur Aufzeichnung der lichtbeschworenen elektrischen Reaktionen des retinalen Pigmentepithels der Maus

Published: July 14, 2020 doi: 10.3791/61491
Automatic Translation
1, *2, *3, 2, 1
1Retinal Neurophysiology Section, National Eye Institute, National Institutes of Health, 2Ocular and Stem Cell Translational Research Section, National Eye Institute, National Institutes of Health, 3Human Visual Function Core, National Eye Institute, National Institutes of Health
* These authors contributed equally

Summary

Hier stellen wir eine Methode zur Aufzeichnung lichtevokierter elektrischer Reaktionen des retinalen Pigmentepithels (RPE) bei Mäusen vor, die eine Technik verwendet, die als DC-ERGs bekannt ist und von Marmorstein, Peachey und Kollegen in den frühen 2000er Jahren beschrieben wurde.

Abstract

Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine spezialisierte Monoschicht von Zellen, die strategisch zwischen der Netzhaut und der Choriokapillare liegen und die allgemeine Gesundheit und strukturelle Integrität der Photorezeptoren erhalten. Das RPE ist polarisiert, zeigt apisch und basal lokalisierte Rezeptoren oder Kanäle, und führt vektoriell Transport von Wasser, Ionen, Metaboliten, und sezernieren mehrere Zytokine.

In vivo nichtinvasive Messungen der RPE-Funktion können mit direkt gekoppelten ERGs (DC-ERGs) durchgeführt werden. Die Methodik hinter dem DC-ERG wurde von Marmorstein, Peachey und Kollegen mit einem kundenspezifischen Stimulationsaufzeichnungssystem entwickelt und später mit einem kommerziell erhältlichen System demonstriert. Die DC-ERG-Technik verwendet Glaskapillaren, die mit Hanks gepufferter Salzlösung (HBSS) gefüllt sind, um die langsameren elektrischen Reaktionen des RPE zu messen, die durch lichtevokte Konzentrationsänderungen im subretinalen Raum aufgrund der Photorezeptoraktivität ausgelöst werden. Der verlängerte Lichtreiz und die Länge der DC-ERG-Aufnahme machen sie anfällig für Drift und Rauschen, was zu einer geringen Ausbeute an verwendbaren Aufnahmen führt. Hier präsentieren wir eine schnelle, zuverlässige Methode zur Verbesserung der Stabilität der Aufnahmen bei gleichzeitiger Reduzierung von Geräuschen durch Verwendung von Vakuumdruck zur Reduzierung/Beseitigung von Blasen, die sich aus der Ausgasung des HBSS- und Elektrodenhalters ergeben. Darüber hinaus werden Stromleitungsartefakte mit einem Spannungsregler/Leistungsaufbereiter abgeschwächt. Wir beinhalten die notwendigen Lichtstimulationsprotokolle für ein handelsübliches ERG-System sowie Skripte zur Analyse der DC-ERG-Komponenten: c-Wave, schnelle Schwingung, Lichtspitzen- und Off-Response. Aufgrund der verbesserten Leichtigkeit der Aufzeichnungen und des schnellen Analyse-Workflows ist dieses vereinfachte Protokoll besonders nützlich bei der Messung altersbedingter Veränderungen der RPE-Funktion, des Krankheitsverlaufs und bei der Bewertung pharmakologischer Interventionen.

Introduction

Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine Monoschicht spezialisierter Zellen, die das hintere Segment des Auges ausbilden und kritische Funktionen ausüben, um die netzhautige Homöostase1aufrechtzuerhalten. Das RPE unterstützt Photorezeptoren durch Regenerierung ihres photonenerfassenden visuellen Pigments in einem Prozess, der als visueller Zyklus2bezeichnet wird, durch Die Teilnahme an der tagesphagozytose der äußeren Segmentspitzen3, und beim Transport von Nährstoffen und Stoffwechselprodukten zwischen Photorezeptoren und der Choriokapillare4,5. Anomalien in der RPE-Funktion unterlegen zahlreiche menschliche Netzhauterkrankungen, wie altersbedingte Makuladegeneration6, Lebers angeborene Amaurose7,8 und Best vitelliform Makuladystrophie9. Da Spenderaugengewebe oft nur für Forschungszwecke schwer zu erhalten sind, können Tiermodelle mit genetischen Veränderungen eine alternative Möglichkeit bieten, die Entwicklung von Netzhauterkrankungen zu untersuchen10,11. Darüber hinaus ermöglicht die Entstehung und Anwendung der CRISPR cas9-Technologie nun genomische Einschleppungen (Knock-in) oder Deletionen (Knock-out) in einem einfachen, einstufigen Prozess, der die Grenzen früherer Gen-Targeting-Technologien überschreitet12. Der Boom der Verfügbarkeit neuer Mausmodelle13 erfordert ein effizienteres Aufzeichnungsprotokoll, um die RPE-Funktion nicht-invasiv auszuwerten.

Die Messung der lichtevozierten elektrischen Ansprechungen des RPE kann mit einer direkt gekoppelten Elektroretinogramm-Technik (DC-ERG) erreicht werden. In Kombination mit herkömmlichen ERG-Aufnahmen, die die Photorezeptor- (a-Welle) und bipolaren (b-Wellen) Zellreaktionen14messen, kann das DC-ERG definieren, wie sich die Ansprecheigenschaften des RPE mit Netzhautdegeneration15,16,17 ändern oder ob die RPE-Dysfunktion dem Verlust des Photorezeptors vorausgeht. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, die an die Arbeit von Marmorstein, Peachey und Kollegen angepasst wurde, die zuerst die DC-ERG-Technik16,18,19,20 entwickelt haben und die Reproduzierbarkeit und Benutzerfreundlichkeit verbessern.

Die DC-ERG-Aufnahme ist aufgrund der langen Erfassungszeit (9 min), in der eine Unterbrechung oder Einschleppung von Rauschen die Interpretation der Daten erschweren kann, schwierig durchzuführen. Der Vorteil dieser neuen Methode ist, dass die Basislinien innerhalb einer kürzeren Zeitzeit einen stabilen Zustand erreichen und die Wahrscheinlichkeit verringern, dass das Tier vorzeitig aus der Anästhesie erwacht und weniger anfällig für Blasenbildung in den Kapillarelektroden ist.

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Protocol

Dieses Protokoll folgt den Leitlinien für die Tierpflege, die in dem vom Tierpflege- und Verwendungsausschuss des National Eye Institute genehmigten Tierstudienprotokoll summiert sind.

1. Importieren von Lichtstimulationsprotokollen für DC-ERG

HINWEIS: Folgen Sie den anweisungen unten, um die Lichtstimulationsprotokolle für das DC-ERG in die ERG-Systemsoftware (Tabelle der Materialien )zu importieren. Das Protokoll besteht aus einem 0,5 min Pre-Stimulus-Intervall, gefolgt von einem Lichtschritt (10 cd/m2) für 7 min und endet mit einem 1,5 min Post-Stimulus-Intervall. Die Lichtintensität von 10cd/m2 (1 log10 cd/m2 ) wurde ausgewählt, da sie etwa die Hälfte der maximalen Reaktion für alle Komponenten der DC-ERG bei WT-Mäusen18,21evoziert. Die c-Welle und die schnelle Schwingung sind von besonderem Interesse, da die Ursprünge dieser elektrischen Reaktionen gut charakterisiert sind und isoliert und weiter in vitro RPE-Modelle (z.B. iPSC-RPE) untersucht werden können. Die Anwendung anderer Lichtintensitäten kann zusätzliche Informationen extrahieren, z. B. durchläuft die Off-Response eine Umkehrung der Polarität bei helleren Lichtreizen und kann Unterschiede bei der Intensität aufweisen, mit der diese Umkehrung stattfindet. Dem Benutzer steht es frei, die Lichtintensitätseinstellungen nach eigenem Ermessen zu ändern.

  1. Öffnen Sie die ERG-Systemsoftware.
  2. Klicken Sie auf Datenbankcenter.
  3. Klicken Sie auf Neu (geben Sie einen neuen Datenbankdateinamen an). Klicken Sie auf Speichern. Im Popup-Feld wird angezeigt: "Datenbank erstellt, möchten Sie eine Verbindung mit der neuen Datenbankdatei herstellen." Klicken Sie auf Ja. Der aktuelle Datenbankname sollte nun den neuen Dateinamen widerspiegeln.
  4. Klicken Sie im Fenster Datenbanksteuerungszentrale auf "Ein übertragen".
  5. Wählen Sie Ergänzende Datei 1: LightProtocols - TRANSFER. EXP. Klicken Sie auf Öffnen.
  6. Klicken Sie nach Abschluss der Statusleiste auf Schließen (Datenbank-Kontrollzentrum).
  7. Klicken Sie auf den grünen Start-Button.
  8. Klicken Sie auf Neu im Fenster Patienten auswählen. Erstellen Sie einen neuen Patientenfamiliennamen, der das Mausmodell beschreibt, geben Sie das Geburtsdatum ein (DOB, mm/dd/yyyy), schalten Sie die Schaltfläche Geschlecht (M/F) auf die entsprechende Beschreibung um. Klicken Sie auf Schließen, um die experimentellen Details zu speichern.
  9. Klicken Sie auf Protokolle. Die dunkel angepassten ERG- und DC-ERG-Protokolle sollen nun sichtbar sein.
  10. Platzieren Sie schließlich die Datei Long Flash.col im folgenden Ordner C:-ERG-Benutzerdateien, Long Flash.col.

2. Kapillarelektrodenzubereitung

  1. Schneiden Sie die 1,5 mm Glaskapillaren in die Hälfte, indem Sie eine Keramikfliese(Materialtabelle) verwenden, um das Glas zu bewerten und sie sauber mit einem Tisch zu brechen, um physikalische Gegenkraft zu liefern und das Glas zu stabilisieren.
    HINWEIS: Blunt den Schnitt endet nach Bedarf.
  2. Mit einem Bunsenbrenner(Materialtabelle) kann die Wärme eine kleine Biegung in der Kapillare machen, während sie sie mit Zangen über die Flamme hält.

3. Füllen von Kapillarelektroden

  1. Verbinden Sie den Vakuumausticcator über einen Inline-Filter(Materialtabelle)mit der Vakuumleitung des Labors.
  2. 30 ml von Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (Materialtabelle) in ein offenes 50 ml konisches Rohr geben und (mit entfernter Kappe) in die Vakuumkammer geben.
  3. Schalten Sie das Vakuum ein und entgasen Sie den HBSS, während Sie den Computer und das Aufnahmegerät einschalten.
  4. Schalten Sie nach 5-u201210 min das Vakuum aus und füllen Sie mit dem entgasten HBSS eine 12 ml Spritze durch eine befestigte 25 G Nadel. Verwenden Sie es, um die Basen der Elektrodenhalter zu füllen, die zusätzliche Vorsichtsmaßnahmen treffen, um keine Blasen einzuführen.
    1. Entfernen Sie dazu den Gewindeschraubenverschluss und schieben Sie die Spritzennadel vorsichtig durch die Silikon-Gummidichtung, um die Rückwand (Silber/Silberchlorid-Pellet) des Halters zu erreichen.
      HINWEIS: Die Silber-Silberchlorid-Pellets sind vorteilhaft gegenüber Haltern, die Silberdraht verwenden, da sie mehr Oberfläche bieten, was zu einer stabilen geräuscharmen Grundlinie führt. Silber/Silberchlorid-Pellets benötigen jedoch eine flüssige Schnittstelle, die frei von Luftblasen ist, um eine gute Verbindung zu erreichen. Achten Sie daher darauf, während dieses Prozesses keine Luftblasen einzuführen.
    2. Nach und nach HBSS injizieren, um die gesamte Mikroelektrode zu füllen, während die Spritzennadel langsam zurückgezogen wird. Schließen Sie die Gewindekappe wieder an, ziehen Sie sie jedoch nicht fest. Setzen Sie die Spritzennadel wieder ein, um den leeren Raum innerhalb der Kappe mit HBSS zu füllen. Dann füllen Sie die Glaskapillare, während Sie sie horizontal halten, um zu verhindern, dass die Lösung vom anderen Ende entweicht.
    3. Halten Sie die Glaskapillare vom gebogenen Ende und legen Sie das gegenüberliegende Ende langsam durch die gelockerte Kappe ein und ziehen Sie dann die Schraubkappe an Ort und Stelle.
      HINWEIS: Glaselektroden, die mit HBSS gefüllt sind, erhalten die Schmierung des Mausauges und verhindern hornhautdehydrierung, die bei Verwendung von Standard-Goldschleifenelektroden auftreten würde.
  5. Positionieren Sie die Elektrodenhalter mit den nach oben geneigten Kapillarelektroden, damit Blasen herausfließen können. Führen Sie das Vakuum für 5-u201210 min zum Entgasen aus. Gas, das aus den Glas- und Kunststoffoberflächen entweicht, wird HBSS aus den Elektrodenhaltern herausdrücken.
  6. Stoppen Sie und lösen Sie dann langsam das Vakuum. Füllen Sie die Elektrodenhalter und Glaskapillaren wie zuvor beschrieben nach.
    HINWEIS: Blasen neigen dazu, sich auf oder in der Nähe der Silikonkautschukdichtung zu sammeln und können sich auch in den Rillen der Gewindekappe verstecken, daher muss besondere Aufmerksamkeit darauf zu achten, dass diese Bereiche blasenfrei bleiben.
  7. Installieren und befestigen Sie den Mikroelektrodenhalter in den kundenspezifischen T-Clip/Magnetic Kugelgelenkständer(Abbildung 1A, Einschub). Um den benutzerdefinierten Ständer für den Mikroelektrodenhalter herzustellen, modifizieren Sie einen T-Clip (5/16"-11/32" OD Tubing) #8 (Tabelle der Materialien), indem Sie die schwarzen Polyacetal-Clips auf einer Seite entfernen. Lassen Sie die Zylinderbasis der magnetischen Kugelgelenke in der Hälfte bearbeitet, um die Höhe einzustellen (Tabelle der Materialien). Befestigen Sie die modifizierten T-Clips an den magnetischen Kugelbefestigungsschrauben mit Muttern im M3-Format.
  8. Legen Sie den Mikroelektrodenhalter in den modifizierten T-Clip und halten Sie ihn fest an Ort und Stelle, indem Sie in etwa einem 1-Zoll-verjüngten Holzgriff aus dem Brechen eines wattestgekippten Reinigungsstabs(Tisch aus Materialien) in einem Winkel schieben. Verwenden Sie den Seltenerdmagnetzylinderboden, um den kundenspezifischen Elektrodenhalter sicher auf der Metallplatte der Bühne zu positionieren und so eine 360°-Drehung auf einer 180°-Achse zu ermöglichen.

4. Testelektroden

  1. Gießen Sie HBSS in einen kleinen Behälter (z. B. die Kappe des 50 ml konischen Rohres).
  2. Senken Sie die vollständig montierten, MIT HBSS gefüllten Kapillarmikroelektroden vorsichtig in die Kappe, die HBSS enthält, um die Elektroden vorzugleichen und die Nadelbodenelektrode (Schwanz/hinteres Bein) und die Geinterpellet-Referenzelektrode Ag/AgCl (Mund) in demselben HBSS zu platzieren, um den Kreislauf zu vervollständigen (Abbildung 1A).
    HINWEIS: Führen Sie alle nachfolgenden Schritte unter roter Lichtlampe aus. Verwenden Sie eine Rotlicht-Taschenlampe, um die Maus und Kapillarelektroden zu positionieren. Denken Sie daran, alle Lichtquellen vollständig auszuschalten, bevor Sie mit der Aufnahme beginnen.
  3. Wählen Sie einen geeigneten Bezeichner (Familienname) aus, um die zu prüfende Maus zu beschreiben, und wählen Sie das DC-ERG-Protokoll aus, das durchgeführt werden soll, indem Sie die Registrierung gemäß der folgenden Reihenfolge abschließen.
    1. Klicken Sie auf Protokolle. Wählen Sie DC-ERG. Klicken Sie auf Ausführen. Ein Dialogfeld wird angezeigt: "Aktueller Patient ist XXX [DOB: XX/XX/XX) Ist das für den durchgeführten Test richtig?" Klicken Sie auf Ja. Fahren Sie dann mit "Schritt 1/6" fort.
  4. Schließen Sie die Türen zum Faraday-Käfig.
  5. Anzeige imPedanzmodus durch Klicken auf Impedanz und überprüfen Sie, ob die Werte für die Mundreferenz, den Schwanzboden und die Aufzeichnungselektroden akzeptabel sind (siehe Abbildung 1B).
  6. Testen Sie die Ausgangsstabilität (Rauschen und Drift), indem Sie auf Schritt (Vorwärtspfeil) klicken, um Schritt 4/6 "Long Flash No Light" auszuwählen.
    ANMERKUNG: Die Menge der Drift, die beobachtet wird, wenn die Elektroden im HBSS-Bad platziert werden, beträgt in der Regel weniger als 500 V pro 80 s, sobald sie sich stabilisiert haben, und entspricht der Drift, die beobachtet wird, wenn die Elektroden mit der Maus verbunden sind. Somit ist die elektrische Auslesung der Elektroden im HBSS-Bad ein wichtiger Indikator für den Zustand der Elektroden. Das Geräusch, gemessen als Peak-to-Peak, ist in der Maus im Allgemeinen um 10 bis 201215 % höher als im HBSS-Bad. Dies ist wahrscheinlich auf die Zugabe von Bewegungsartefakten aus der Atmung zurückzuführen.
  7. Beginnen Sie mit der Anzeige der Ablaufverfolgungen, indem Sie auf Vorschauklicken. Die Spuren sollten mit einer Peak-to-Peak-Amplitude <200 V geräuscharm sein. Eine leichte Drift (<500 V/80 s), die allmählich auf Basiswert abfällt, ist akzeptabel (Abbildung 1C).

5. Maus- und Elektrodenpositionierung

  1. Halten Sie die Mäuse über Nacht in einer gut belüfteten, lichtdichten Box für dunkle Anpassung.
  2. Anästhesisieren Sie die Tiere durch intraperitoneale Injektion von Ketamin (80 mg/kg) und Xylazin (8 mg/kg).
  3. Tragen Sie einen Tropfen von 0,5% Proparacain HCl topisch auf die Hornhaut zu anästhesieren sowie einen Tropfen von 2,5% Phenylephrin HCl und 0,5% Tropicamid, um die Pupillen zu verdünnen.
  4. Trimmen Sie die Mausschnurrhaare mit einer Schere, um zu verhindern, dass unbeabsichtigtes Zucken die Glaskapillarelektroden während der Aufnahme stören.
    HINWEIS: Das DC-ERG-Stimulusprotokoll innerhalb des ERG-Systems verfügt über mehrere integrierte Stimulusroutinen, die durch Klicken auf den Schritt (Vorwärtspfeil) oder Schritt (Rückwärtspfeil) ausgewählt werden können. Nur die Schritte 1, 4 und 5 in der Software sind erforderlich, um die DC-ERG-Aufnahme vorzubereiten und durchzuführen.
  5. Überprüfen Sie in der ERG-Systemsoftware, ob der richtige Patient ausgewählt ist. Klicken Sie auf die grüne Schaltfläche Protokolle. Wählen Sie unter Protokollbeschreibung DC-ERG. Klicken Sie dann auf Ausführen. Stellen Sie sicher, dass dies der richtige Test ist, indem Sie auf Jaklicken.
  6. Verwenden Sie Schritt 1/6 bezeichneten Rotlicht-Stimulus, um das rote Licht in der Kuppel einzuschalten, um die Maus und Elektroden zu positionieren und dabei die Änderungen der Impedanz zu beobachten.
  7. Legen Sie die Maus auf einen beheizten Aufnahmetisch und zelten Sie vorsichtig die Haut des hinteren Beins mit Zangen. Halten Sie die Nadelelektrode fest in einer Hand und legen Sie sie subkutan in das hintere Bein ein, um sie an Ort und Stelle zu befestigen.
  8. Legen Sie die Referenz-Ag/AgCl-Elektrode (Materialtabelle) in den Mund, so dass das gesinter Pellet entlang der hinteren Wange ruht und hinter den Zähnen gehalten wird.
    HINWEIS: Golddrahtelektroden sollten nicht als Mundreferenzelektrode verwendet werden, da sie unterschiedliche Impedanzeigenschaften aufweisen und das Peak-to-Peak-Rauschen erhöhen.
  9. Bevor Sie die Kapillarelektroden auf das Auge der Maus legen, halten Sie den Elektrodenhalter mit den Glaskapillaren vertikal, streichen Sie den Elektrodenhalter mit dem Zeigefinger, um eventuelle Blasen zu entfernen. Füllen Sie die Spitze mit HBSS mit einer 25 G Nadel, die an einer Spritze befestigt ist, und prüfen Sie, ob an der Spitze keine Luftblase gefangen ist. Positionieren Sie den Elektrodenhaltersoals so, dass die offene Spitze der HBSS-gefüllten Kapillaren in schonendem Kontakt mit der Hornhaut steht.
  10. Verwenden Sie besondere Vorsichtsmaßnahmen, um das Einführen von Luftblasen zu vermeiden, indem Sie den Schmierstoff-Augengelspender invertiert halten und die ersten Tropfen entsorgen. Legen Sie einen Tropfen Schmiermittel-Augengel auf jedes Auge, um die Leitfähigkeit aufrechtzuerhalten und die Austrocknung während der Aufnahme zu verhindern.

6. DC-ERG-Aufnahme

  1. Klicken Sie auf Schritt (Vorwärtspfeil), um Schritt 4/6 "Long Flash No Li" auszuwählen.
  2. Klicken Sie auf Impedanz. Verwenden Sie den Bildschirm Impedanzprüfung, um die Widerstände der linken und rechten Augen zu untersuchen. Die Impedanzwerte für die Aufnahmeelektroden an jedem Auge werden voraussichtlich ähnlich sein (ca. 39 k). Die Impedanzwerte für die Masse- und Referenzelektroden werden voraussichtlich weniger als 10 k" betragen).
  3. Klicken Sie auf Vorschau, um die Spuren für das linke und rechte Auge anzuzeigen. Warten Sie, bis eine stabile Basislinie erreicht ist (<10 min). Klicken Sie auf Stopp, um die Ablaufverfolgungsvorschau zu beenden.
    HINWEIS: Abrupte Änderungen in Driftrichtung oder abnormes Rauschen in der Aufnahme werden mit der Zeit nicht verbessert und erfordern die Identifizierung der Kapillarelektrode, die Aufmerksamkeit erfordert. Die wahrscheinlichste Ursache ist eine Blase, die an die Spitze der Elektrode eingeführt wird. Füllen Sie die Spitze mit HBSS. Klicken Sie erneut auf Vorschau, um die Baseline zu überprüfen.
  4. Klicken Sie auf Schritt (Vorwärtspfeil), um Schritt 5/6 "Long Flash 10 cd 7 min" auszuwählen.
  5. Klicken Sie auf Ausführen, um die Aufzeichnung zu starten (Abbildung 1D).

7. Datenexport

  1. Wählen Sie den "Patienten" (Familienname), der die zu exportierende Mausaufzeichnung beschreibt.
  2. Klicken Sie auf Alte Tests.
  3. Wählen Sie unter Protokollbeschreibung DC-ERG. Klicken Sie auf die grüne Schaltfläche Laden, um die zuvor erfassten Daten zu laden.
  4. Klicken Sie auf Schritt (Vorwärtspfeil), um zu Schritt 5/6 "Long Flash 10 cd 7 min" vorzuschreiten.
  5. Klicken Sie auf Exportieren.
  6. Geben Sie den Dateinamen (z. B. Dateiname.csv) an. Ein gültiger Dateiname muss mit einem Buchstaben beginnen, gefolgt von Buchstaben, Zahlen oder Unterstrichen. Verwenden Sie keine Sonderzeichen oder Bindestriche. Das Datenanalyseprogramm (DCERG_Analysis.exe) erfordert, dass Tabelleneinträge die Anforderungen für Variablennamen erfüllen.
  7. Platzieren Sie ein Häkchen neben der Datentabelle. Wählen Sie neben dem Trennzeichen Tab. Setzen Sie Häkchen neben Optionen (Titel, Vertikal), Alle (Schritte, Chans, Ergebnisse), Datenspalten (Inhalt, Ergebnisse, Sweeps) und Format (Datei) ein.
  8. Klicken Sie dann auf Exportieren (Abbildung 1E). Dadurch wird die *.csv-Datei im Ordner "C:-Multifocal" gespeichert.

8. Datenanalyse

  1. Laden Sie das entsprechende Laufzeitinstallationsprogramm herunter und installieren Sie es (Tabelle der Materialien)
  2. Laden Sie das DCERG_Analysis.exe-Installationsprogramm herunter, und installieren Sie es.
    HINWEIS: Dadurch wird das Skript installiert, das die Analyse der DC-ERG-Komponenten durchführt, und es wird eine Verknüpfung erstellt, um das Programm im Ordner Startmenü auszuführen.
  3. Klicken Sie auf die Verknüpfung, die im Ordner Startmenü > Programme erstellt wurde.
  4. Wählen Sie die exportierte Datendatei oder die exportierten Dateien (*.csv) für die Analyse aus. Verwenden Sie Strg + Linksklick auf die Maus, um mehr als eine Datei auszuwählen.
    ANMERKUNG: Die ausführbare Datei generiert zwei Arten von Plots: 1) die Rohdaten werden mit einer am besten passenden Linie dargestellt, die die gemessene Drift angibt; 2) die driftkorrigierte Reaktion wird nach dem Glätten mit einem gleitenden Durchschnitt (mit einer Spannweite von 5 s) geglättet. Aus diesem Diagramm werden die Amplituden und die Zeit bis zur Spitze der DC-ERG-Komponenten identifiziert: c-Welle, schnelle Schwingung, Lichtspitzen- und Off-Response. Die Daten werden dann im Tabellenformat exportiert, um dort zu übertreffen, wo jedes Blatt einer anderen Mausaufzeichnung entspricht. Auf diese Blätter folgen zwei Zusammenfassendblätter: (i) kompilierte DC-ERG-Amplituden (mV); ii) kompilierte DC-ERG-Zeit-zu-Spitzen (Lichtbeginn, t = 0 min).

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Representative Results

Abbildung 2 ist ein Beispiel-Dataset von miR-204 ko/ko cre/+ (bedingte KO) und Wildtyp (WT) Mäuse. MiR-204 ko/ko cre/+ sind Mäuse mit einem bedingten Knockout von microRNA 204 im retinalen Pigmentepithel. Diese Mäuse werden durch Kreuzung von floxed miR-204 Mäusen (produziert von NEIGEF)22 mit VMD2-CRE Mäusen23erzeugt. MiR-204 wird stark in der RPE exprimiert, wo es die Expression von Proteinen reguliert, die für die Epithelfunktion kritisch sind und eine enge Knotenintegrität (z. B. Claudine), die Aufrechterhaltung der Kaliumhomöostase durch die Expression von Kir 7.1 Kaliumkanälen und die Expression mehrerer visueller Zyklusgene (z. B. LRAT, RPE65)24.

Da die abnormale RPE-Morphologie in mehreren RPE-spezifischen Cre-exemitten Mauslinien25berichtet wurde, überwachten wir die normale RPE-Morphologie bei Cre-exemitten Mäusen mit dem WT-Phänotyp. Die strukturellen und funktionellen Anomalien der miR-204 ko/ko cre+ (bedingte KO) Maus-Retina ähneln den Merkmalen von miR-204 null Mäusen15, die durch Hyperautofluoreszenz (Lipofuscin-ähnliche Ablagerungen) und erhöhte Mikroglia lokalisiert auf der RPE-apischen Oberfläche gefunden werden. Bei Null-Mäusen wurden diese Veränderungen mit verminderten lichtevozierten elektrischen Reaktionen des RPE begleitet, mit minimaler Veränderung der Photorezeptorreaktionen (bewertet durch retinale ERG). Somit wird erwartet, dass die Störung der miR-204-Expression in miR-204 ko/ko cre/+ Mäusen auch das elektrische Ansprechen des RPE verändern wird.

Im vorgestellten Beispiel wird eine Maus auf die beheizte Plattform und die Elektroden vor dem Absenken der Kuppel entsprechend positioniert. Impedanz und Drift werden wie zuvor beschrieben mit der Badlösung überprüft. Repräsentative "negative" Ergebnisse sind in Abbildung 2Adargestellt. In Abbildung 2A (obere Platte) leidet die Spur unter winzigen Blasen in der Elektrode, die das Peak-to-Peak-Rauschen in der Spur erhöhen (blau schattiert). In einem anderen Beispiel(Abbildung 2A, untere Platte), wenn Sich Blasen von der Oberfläche des Glases lösen und sich entlang der Länge der Elektrode bewegen, verursacht dies abrupte Änderungen in der Richtung der Basisdrift, die nicht durch Driftsubtraktion kompensiert werden können. Abbildung 2B zeigt repräsentative "positive" Aufnahmen von WT- und miR-204-Ko/Ko-Cre/+-Mäusen, bei denen die Blasen mit Hilfe der Vakuumkammer eliminiert wurden, bevor die Mikroelektroden in die Elektrodenhalterständer montiert wurden.

Die beste Passungslinie zu den ursprünglichen 25 s (grün) wird berechnet und in blau dargestellt (Abbildung 2B). Die driftkorrigierten Antworten werden in Abbildung 2C zusammen mit der Identifizierung der Amplituden der DC-ERG-Komponenten nachgezeichnet. Mit der in diesem Protokoll beschriebenen DC-ERG-Technik können Tiere sowohl von WT- als auch von miR-204 ko/ko cre/+ Stämmen schnell aufgezeichnet und analysiert werden.

Die c-Welle besteht aus zwei Komponenten: einer Hyperpolarisation der RPE-Apsischen Membran aufgrund erhöhter Kaliumleitfähigkeit als Reaktion auf eine Abnahme des Kaliums im subretinalen Raum aufgrund der Photorezeptoraktivität und einem separaten Beitrag, der von inneren Netzhautzellen ausgeht (langsame P3-Komponente – die die Aktivität von Müller-Zellen widerspiegelt). Die schnelle Oszillation liefert Informationen über die Hyperpolarisation der BAsolateralmembran26rpE , hauptsächlich aufgrund von Veränderungen in der Leitfähigkeit eines Cl-Transporters namens Mukoviszidose-Transmembranleitregulator (CFTR)27. Es wird angenommen, dass die Lichtspitze aus einer Veränderung der Konzentration einer photorezeptorgesteuerten Substanz28 stammt, die durch ein zweites Botensystem die basolaterale Membran des RPE depolarisiert, indem sie die Aktivität von Ca2+ abhängigenCl-Kanälen 21moduliert. Schließlich ist die Off-Response ein komplexes Zusammenspiel von Antworten, die sich in der Polarität unterscheiden und mit der Lichtintensität18variieren.

Wie erwartet dämft die reduzierte Expression von Kir 7.1 K+ Kanälen die c-Welle29 und die schnelle Schwingung stark, wie in den gemittelten Antworten in Abbildung 2Ddargestellt, was auf eine erhebliche Beeinträchtigung der elektrischen Eigenschaften des RPE hindeutet. Eine Zusammenfassung der Änderungen in den Komponenten des DC-ERG ist in Abbildung 2Ezu finden. Die relativen Amplituden der DC-ERG-Komponenten (normalisiert zu WT) werden gegen die relativ en beiden größten lichtevokierten a-Wellen-Amplituden (1 cd/m2; 10 cd/m2) (normalisiert zu WT) geplottet und in Abbildung 2F'u2012Hdargestellt. Die Verringerung der A-Wellen-Reaktion auf die hellste Lichtintensität (10cd/m2) (Abbildung 2F'u2012H, Zusatzabbildung S1A,B) deutet auf eine Verzögerung bei der Wiederherstellung der Empfindlichkeit aufgrund einer Sehzyklusbeeinträchtigung hin (z. B. infolge einer reduzierten LRAT- oder RPE65-Expression infolge des genomischen Knockouts von miR-20424,30).

Figure 1
Abbildung 1: Das Diagramm zeigt die wichtigsten Schritte im DC-ERG-Protokoll. (A) Bild des abgeschlossenen Schaltkreises, der durch Senken der Aufnahme (Glaskapillarmikroelektroden), Referenz und gemahlener Elektroden in dieselbe Badlösung erreicht wird. Diese Konfiguration ermöglicht die Ausführung von Vorversuchen (vor der Anästhesisierung der Maus), um die charakteristische Impedanz, das Rauschen und das Driften zu bewerten. Einschub (oben links) mit einem Seitenansichtsschema des benutzerdefinierten Mikroelektrodenhalterständers. (B) Repräsentatives Bild des Impedanzprüfmodus mit den entsprechenden Werten für Elektrodenimpedanzen. Die Impedanz in den Elektroden des linken und rechten Auges sollte innerhalb von 5 k voneinander vergleichbar sein (z. B. linkes Auge: 38,7 K/ Rechtes Auge: 40,36 K' ). Die Impedanz der Mund-Referenzelektrode sollte weniger als 1 K' betragen, während die Schwanzelektrode etwa 2,5 K' betragen sollte. (C) Repräsentatives Bild der Vorschauspur (Schritt 4/6) wird angezeigt. Schritt 4 (Long Flash No Light) ist ausgewählt, da während der Vorschau dieses Schritts kein Licht geliefert wird. Die Spuren sollten geräuscharm sein und können eine leichte Drift haben, die allmählich mit der Zeit bis zur Grundlinie verblasst. Sobald die Spuren ein konstantes Driften in beiden Kanälen erreicht haben und relativ flach geworden sind, kann die eigentliche Aufnahme beginnen. (D) Mit Schritt 5/6 (Long Flash 10 cd 7 min) nach 0,5 min Dunkelheit wird ein Lichtschritt von 10 cd/m2 für 7 min an die Maus geliefert, gefolgt von einer Rückkehr in die Dunkelheit für 1,5 min. (E) Bild der Exportparameter, die verwendet werden, um die Daten in eine *.csv Datei zu konvertieren. Dieses präzise Format ist erforderlich, um die DC-ERG Analysesoftware auszuführen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Repräsentative Ablaufverfolgungen und Workflow der DC-ERG-Analyse. Bild eines negativen DC-ERG-Ergebnisses, das übermäßiges (A, oberes Panel) Peak-to-Peak-Rauschen und (A, untere Platte) Drift zeigt. (B) Bilder von positiven DC-ERG-Aufzeichnungsergebnissen einer WT- und miR-204-Ko/Ko-Cre/+-Maus. Generierte Diagramme der Rohspuren, die die am besten passenden Linien (blau) zu den anfänglichen 25 s (grün) vor dem Lichtbeginn anzeigen. (C) Diagramme der driftkorrigierten DC-ERG-Antworten für die in Bgezeigten WT- und miR-204-Ko/Ko-Cre/+-Mäuse Die Amplituden der Komponenten des DC-ERG sind in der Legende angegeben. (D) Durchschnittliche DC-ERG-Antworten von 3–8 Monate alten WT-Mäusen (n = 6) und miR-204 ko/ko cre/+ (n = 6) Mäuse. Die DC-ERG-Komponenten sind auf der WT-Spur beschriftet und die Lichtstimulationsparameter sind unten definiert. (E) Zusammenfassung der DC-ERG-Komponenten aus Aufnahmen von WT- und miR-204-ko/ko cre/+-Mäusen. Balkendiagramme stellen einen Mittelwert dar, Fehlerbalken weisen auf Standardfehler hin. Die relativen Amplituden der (F) c-Welle, (G) schnellen Schwingungen und (H) Off-Antwort werden gegen die relativen beiden größten lichtevokierten a-Wellen-Amplituden (1 c/m2; 10 c/m2) (normalisiert zu WT) geplottet. Die Signifikanz wird durch Sternchen angezeigt: (Schüler-t-Test; * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: ERG-Antworten von WT- und miR-204-Ko/Ko-Cre/+-Mäusen. (A) Reaktionen von WT (schwarz) und miR-204 ko/ko cre/+ Mäusen (Magenta) auf 4 ms Lichtblitze mit zunehmender Intensität: 0,0001 cd/m2 (n = 5), 0,001 cd s/m2 (n = 5), 0,01 cd/m2 (n = 3), 0,1 ccm/m2 (n = 3), 1 cd/m2 (n = 3), 10 ccm/m2 (n = 2). (B) Durchschnittliche A-Wellen-Amplitude, die gegen Diebintensität geplottet wird. (C) Durchschnittliche B-Wellen-Amplitude gegen Blitzintensität geplottet. (D) Durchschnittliche Zeit bis zur Spitze der A-Wellen-Antworten, die gegen die Blitzintensität geplottet werden. (E) Durchschnittliche Zeit bis zur Spitze der B-Wellen-Antworten, die gegen die Blitzintensität geplottet werden. Für alle dargestellten Diagramme zeigen Fehlerbalken SEM an. Signifikanz wird durch Sternchen angezeigt: (Schüler-t-Test; * = p < 0,05). Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Beispiel für einen DC-Offset in der Hochspannungsfreileitung, der mit dem Einsatz eines Spannungsreglers/Leistungskonditionierers abgemildert werden kann. (A) In Ermangelung von Spannungsregelung erzeugen Spannungsspitzen (verursacht durch den Einsatz von Geräten in einem angrenzenden Raum z.B. OCT) einen DC-Offset, der die Messung der DC-ERG-Komponenten, insbesondere der Lichtspitze, stören kann. Der störende Offset wird auf der rechten Seite vergrößert. (B) Mit aktiviertem Spannungsregler/Leistungskonditionierer ist die anfängliche Spitze noch spürbar, aber der schädliche DC-Offset wird entfernt. Die Wirkung des Spannungsreglers/Leistungskonditionierers wird vergrößert und rechts dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Ergänzende Dateien. Bitte klicken Sie hier, um diese Dateien herunterzuladen.

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Discussion

Kritische Schritte

Eine gute DC-ERG-Aufnahme erfordert stabile Elektroden, die frei von Blasen sind, die Artefakte und unerwünschte Drift erzeugen, da sie extrem empfindlich auf Ausgasung und Temperaturänderungen reagieren. Es ist wichtig, dass eine stabile Ausgangsbasis erreicht wird, wenn die Elektroden in der HBSS-Badelösung platziert werden, bevor sie mit der Mausaufzeichnung fortfahren. Kleine Blasen neigen dazu, sich an der Basis der Kapillarelektrode oder um die Silikondichtung zu sammeln und sind schwer zu erkennen, sobald der Elektrodenhalter vollständig montiert ist. Wenn nur wenige Blasen vorhanden sind, wird der Halter leicht streichen sie zum Entfernen befreien. Wenn es zu viele Blasen gibt oder das Drift oder Rauschen nicht entfernt werden kann, ist es oft besser, die Elektrode zu zerlegen und von vorne zu beginnen, während sie bei jedem Schritt des Prozesses sorgfältig auf Blasen untersucht werden.

Änderungen und Fehlerbehebung

Die folgenden Anpassungen können an der Einrichtung vorgenommen werden (Tabelle der Materialien), um die Genauigkeit der DC-ERG-Aufnahmen zu verbessern. Geräuscharme Kabel für Mikroelektrodenhalter können verwendet werden, um die vorhandenen Kabel vom 32-Bit-Verstärker bis zum Aufnahmetisch zu erweitern. Die zusätzliche Länge ermöglicht die sorgfältige Platzierung und Einstellung des Elektrodenhalters, ohne deren Position zu stören, sobald die Ganzfeldkuppel geschlossen ist. Ein Spannungsregler/Leistungsaufbereiter kann verwendet werden, um In-Line-Geräusche und Stromstöße zu beseitigen, die von Lichtern oder Geräten in angrenzenden Räumen erzeugt werden, die ein- und ausgeschaltet werden (Abbildung S2). Zusätzlich können der Tischschildkröte Ganzfeld und der 32-Bit-Verstärker in einem Faraday-Käfig platziert werden, der an der Baugrundstange geerdet ist, um zusätzliche elektrische Geräusche abzuschirmen.

Einschränkungen der Methode

Die DC-ERG kann nur an dunkel angepassten Tieren originalgetreu erfasst werden, was bedeutet, dass, sobald der Lichtreiz eingeschaltet ist, wenig getan werden kann, um unerwünschte Potenziale oder Drift zu beseitigen. Eine weitere Einschränkung ist, dass die Polarität einiger Komponenten des DC-ERG (Lichtspitzen, Off-Response) der verwendeten Lichtintensität16unterliegt. Dies bedeutet, dass die größten Abweichungen von WT bei Intensitäten auftreten können, die nicht von Natur aus bei der Lichtintensität vorhanden sind, die dieses Protokoll verwendet (10 cd/m2). Bis zu diesem Zeitpunkt wurde die DC-ERG-Analysesoftware unter der Annahme einer negativen Off-Antwort (ein Antwortminimum) entwickelt. Hellere Lichtintensitäten, die zur Umkehrung der Polarität der Off-Antwort führen, erfordern die Notwendigkeit, die enthaltene Analyseskriptdatei zu ändern.

Bedeutung

Das RPE ist an der patostatischen Erhaltung der Netzhautumgebung beteiligt und spielt eine entscheidende Rolle bei der Pathologie mehrerer Netzhauterkrankungen. Diese Methode erklärt im Detail, wie ein DC-ERG-System eingerichtet wird, um das elektrische RPE-Ansprechen aufzuzeichnen, das in Verbindung mit herkömmlichen ERG-Aufnahmen ein objektives Maß für die äußere Netzhaut- und RPE-Funktion liefert. Diese Messungen der RPE-Funktionalität können verwendet werden, um transgene Mauslinien zu bewerten, die degenerative Phänotypen anzeigen, oder um auf Arzneimittelwirksamkeit oder medikamentinduzierte Zytotoxizität an der RPE zu testen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von nei-Intramural-Fonds unterstützt. Die Autoren würdigen Dr. Sheldon Miller aufrichtig für seine wissenschaftliche Beratung, technische Beratung und Expertise in RPE-Physiologie und Krankheit. Die Autoren danken Megan Kopera und dem Tierpfleger für die Verwaltung der Mauskolonien und Dr. Tarun Bansal, Raymond Zhou und Yuan Wang für die technische Unterstützung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ag/AgCl (mouth) Electrode WPI Inc EP1 Mouth reference electrode for mouse
Ceramic Tile Sutter Instrument CTS Used to cut the glass capillary tube to an appropriate size
Cotton Tipped Cleaning Stick Puritan Medical Products 867-WC No Glue To be used as a spacer to improve the fit of the electrode holder assembly
Electroretinogram (ERG) System Diagnosys LLC E3 System Visual electrophysiology system to diagnose ophthalmic conditions in vision research and drug trials
Bunsen Burner Argos Technologies BW20002460 Or equivlaent to shape glass under flame
Glass Capillary Tube (1.5 mm) Sutter Instruments BF150-75 For filling with HBSS and making contact to the cornea
Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) Thermo Fisher Scientific Inc 14175-095 Commercially available. Maintain at RT
In-Line Filter Whatman 6722-5001 To protect vacuum pump from aerosols
Low Noise Cable for Microelectrode Holders WPI Inc 5372 Suggested for improving the length and placement of the cables and electrode holder assemblies
Magnetic Ball Joint WPI Inc 500871 For magnetically positioning the electrode holder assembly on the stage
MatLab Mathworks MatLab: For editing the analysis software
MatLab Curvefit Toolbox Mathworks Toolbox for MatLab (only required for editing the analysis software)
MatLab Compiler Mathworks Toolbox for MatLab (only required for editing and re-releasing the analysis software)
MatLab Runtime version 9.5 Mathworks R2018b (9.5) Required to run the analysis software: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html
Microelectrode Holders (45 degrees) WPI Inc MEH345-15 For holding the capillaries
Needle (25 ga) Covidien 8881250313 For filling the capillary tubes with HBSS
Needle (ground) Electrode Rhythmlink 13mm - one elctrode Subdermal needle electrode (ground) for mouse (13mm long, 0.4mm diameter needle, 1.5m leadwire)
Regulator/Power Conditioner Furman P-1800 Or equivalent to remove DC-offset from noise introduced through power line
Syringe (12 mL) Monoject 1181200777 For filling the capillary tubes with HBSS
T-clip Cole-Parmer 06852-20 For electrode holder assembly
Vacuum Desiccator Bel-Art 420120000 Clear polycarbonate bottom & cover
Pharmacological treatment
Lubricant eye gel Alcon 0078-0429-47 Helps lubricate corneal surface and maintain electrical contact with capillary electrodes
Phenylephrine Hydrochloride 2.5% Akorn 17478-201-15 Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation)
Proparacaine Hydrochloride 0.5% Akorn 17478-263-12 Local anesthetic for ophthalmic instillation
Tropicamide 0.5% Akorn 17478-101-12 Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation)
Xylazine AnaSed sc-362949Rx Analgesic and muscle relaxant
Zetamine (Ketamine HCl) VetOne 501072 Anesthetic for intramuscular injections

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References

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Tags

Chemie Ausgabe 161 DC-ERG retinale Pigmentepithel Elektroretinogramm Mausmodell c-Welle schnelle Oszillation Lichtspitze Off-Response
Direktgekoppeltes Elektroretinogramm (DC-ERG) zur Aufzeichnung der lichtbeschworenen elektrischen Reaktionen des retinalen Pigmentepithels der Maus
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Miyagishima, K. J., Zhang, C., Malechka, V. V., Bharti, K., Li, W. Direct-Coupled Electroretinogram (DC-ERG) for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (161), e61491, doi:10.3791/61491 (2020).

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