Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Eletroretinograma acoplado direto (DC-ERG) para gravar as respostas elétricas evocadas pela luz do epitélio pigmento de retina do rato

doi: 10.3791/61491 Published: July 14, 2020
* These authors contributed equally

Summary

Aqui, apresentamos um método para registrar respostas elétricas evocadas pela luz do epitélio pigmento da retina (RPE) em camundongos usando uma técnica conhecida como DC-ERGs descrita pela primeira vez por Marmorstein, Peachey, e colegas no início dos anos 2000.

Abstract

O epitélio pigmento da retina (RPE) é uma monocamada especializada de células estrategicamente localizadas entre a retina e os coriocapillaris que mantêm a saúde geral e a integridade estrutural dos fotorreceptores. O RPE é polarizado, exibindo receptores ou canais localizados apicamente e basally, e realiza transporte vetorial de água, íons, metabólitos e secreta várias citocinas.

As medidas in vivo não invasivas da função RPE podem ser feitas usando ERGs acoplados diretos (DC-ERGs). A metodologia por trás do DC-ERG foi pioneira por Marmorstein, Peachey, e colegas usando um sistema de gravação de estimulação personalizado e mais tarde demonstrou usando um sistema comercialmente disponível. A técnica DC-ERG usa capilares de vidro preenchidos com a solução de sal tampão (HBSS) de Hank para medir as respostas elétricas mais lentas do RPE provocadas a partir de mudanças de concentração evocadas pela luz no espaço subretinal devido à atividade do fotorreceptor. O estímulo de luz prolongado e o comprimento da gravação dc-ERG tornam-no vulnerável à deriva e ao ruído, resultando em um baixo rendimento de gravações de utilidade. Aqui, apresentamos um método rápido e confiável para melhorar a estabilidade das gravações, ao mesmo tempo em que reduzimos o ruído usando pressão de vácuo para reduzir/eliminar bolhas que resultam da eliminação do HBSS e do suporte de eletrodos. Além disso, os artefatos da linha de energia são atenuados usando um regulador de tensão/condicionador de energia. Incluímos os protocolos necessários de estimulação de luz para um sistema ERG comercialmente disponível, bem como scripts para análise dos componentes DC-ERG: onda c, oscilação rápida, pico de luz e resposta off. Devido à melhor facilidade de registros e ao fluxo de trabalho de análise rápida, este protocolo simplificado é particularmente útil na medição de mudanças relacionadas à idade na função RPE, progressão da doença e na avaliação da intervenção farmacológica.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

O epitélio pigmento da retina (RPE) é uma monocamada de células especializadas que alinham o segmento posterior do olho e exercem funções críticas para manter a homeostase da retina1. O RPE suporta fotorreceptores regenerando seu pigmento visual captura de fótons em um processo chamado ciclo visual2, participando da fagocitose diurna das pontas do segmento externo do galpão3, e no transporte de nutrientes e produtos metabólicos entre fotorreceptores e os choriocapillaris4,5. Anormalidades na função RPE estão por trás de inúmeras doenças da retina humana, como a degeneração macular relacionada à idade6, a amaurose congênita de Leber7,8 e Melhor distrofia macular vitelliform9. Como os tecidos oculares doadores são frequentemente difíceis de obter apenas para fins de pesquisa, modelos animais com modificações genéticas podem fornecer uma maneira alternativa de estudar o desenvolvimento de doenças da retina10,11. Além disso, o surgimento e a aplicação da tecnologia CRISPR cas9 agora permitem introduções genômicas (knock-in) ou exclusões (knock-out) em um processo simples de uma etapa superando as limitações das tecnologias anteriores de segmentação genética12. O boom na disponibilidade de novos modelos de mouse13 requer um protocolo de gravação mais eficiente para avaliar não invasivamente a função RPE.

A medição das respostas elétricas evocadas pela luz do RPE pode ser obtida utilizando uma técnica de eletroretinograma acoplado direto (DC-ERG). Quando usado em combinação com gravações convencionais de ERG que medem as respostas celulares fotorreceptoras (a-onda) e bipolar (onda b)14,o DC-ERG pode definir como as propriedades de resposta do RPE mudam com a degeneração da retina15,16,17 ou se a disfunção RPE precede a perda do fotorreceptor. Este protocolo descreve um método adaptado do trabalho de Marmorstein, Peachey e colegas que desenvolveram pela primeira vez a técnica DC-ERG16,18,19,20 e melhora a reprodutibilidade e facilidade de uso.

A gravação do DC-ERG é difícil de realizar devido ao longo tempo de aquisição (9 min) durante o qual qualquer interrupção ou introdução de ruído pode complicar a interpretação dos dados. A vantagem deste novo método é que as linhas de base atingem um estado estável em um período menor de tempo reduzindo a probabilidade de que o animal acorde prematuramente da anestesia e seja menos propenso à formação de bolhas nos eletrodos capilares.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Este protocolo segue as diretrizes de cuidado animal descritas no protocolo de estudo animal aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Instituto Nacional de Olhos.

1. Importação de protocolos de estimulação de luz para DC-ERG

NOTA: Siga as instruções abaixo para importar os protocolos de estimulação de luz para o DC-ERG no software do sistema ERG (Tabela de Materiais). O protocolo consiste em um intervalo pré-estímulo de 0,5 min, seguido por um passo de luz (10 cd/m2) por 7 min, e terminando com um intervalo pós-estímulo de 1,5 min. A intensidade de luz de 10 cd/m2 (1 log10 cd/m2) foi selecionada, pois evoca aproximadamente metade da resposta máxima para todos os componentes do DC-ERG em ratos WT18,21. A onda c e a oscilação rápida são de particular interesse, pois as origens dessas respostas elétricas são bem caracterizadas e podem ser isoladas e estudadas ainda mais in vitro modelos RPE (por exemplo, iPSC-RPE). A aplicação de outras intensidades de luz pode extrair informações adicionais, por exemplo, a resposta off sofre uma reversão da polaridade em estímulos de luz mais brilhantes e pode mostrar diferenças na intensidade em que essa reversão ocorre. O usuário é livre para alterar as configurações de intensidade de luz a seu critério.

  1. Abra o software do sistema ERG.
  2. Clique no Database Center.
  3. Clique em Novo (forneça um novo nome de arquivo de banco de dados). Clique em Salvar. A caixa pop-up exibirá: "Banco de dados criado, você deseja se conectar ao novo arquivo do banco de dados." Clique em Sim. O nome atual do banco de dados deve agora refletir o novo nome do arquivo.
  4. Clique em Transferir na janela do centro de controle do banco de dados.
  5. Selecione Arquivo Suplementar 1: LightProtocols - TRANSFER. EXP. Clique em Abrir.
  6. Clique em Fechar (Centro de Controle de Banco de Dados) após a conclusão da barra de progresso.
  7. Clique no botão iniciar verde.
  8. Clique em Novo na Janela de Pacientes Selecionados. Crie um novo nome de família de paciente descrevendo o modelo do mouse, digite a data de nascimento (DOB, mm/dd/yyyy), alternou o botão de gênero (M/F) para a descrição apropriada. Clique em Fechar para salvar os detalhes experimentais.
  9. Clique em Protocolos. Os protocolos ERG e DC-ERG adaptados à escuridão devem agora ser visíveis.
  10. Por fim, coloque o arquivo Long Flash.col na seguinte pasta C:\ERG User Files\Long Flash.col.

2. Preparação do eletrodo capilar

  1. Corte os capilares de vidro de 1,5 mm ao meio usando uma telha cerâmica(Tabela de Materiais) para marcar o vidro e quebrá-los limpamente usando uma mesa para fornecer contraforça física e estabilizar o vidro.
    NOTA: Corte as extremidades do corte conforme necessário.
  2. O uso de um queimador Bunsen(Tabela de Materiais)permite que o calor faça uma pequena curva no capilar enquanto o segura sobre a chama com fórceps.

3. Enchimento de eletrodos capilares

  1. Conecte o dessecador de vácuo à linha de vácuo do laboratório através de um filtro em linha(Tabela de Materiais).
  2. Despeje 30 mL da Solução de Sal Balanceado (HBSS) (Tabela de Materiais) da Hanks em um tubo cônico aberto de 50 mL e coloque-o (com a tampa removida) na câmara de vácuo.
  3. Ligue o vácuo e desgase o HBSS ao ligar o computador e o equipamento de gravação.
  4. Depois de 5\u201210 min desligue o vácuo e use o HBSS desgaseado para encher uma seringa de 12 mL através de uma agulha de 25 G anexada. Use-o para preencher as bases dos porta-eletrodos tomando precauções extras para não introduzir bolhas.
    1. Para isso, remova a tampa do parafuso roscado e deslize cuidadosamente a agulha da seringa através da junta de borracha de silicone para alcançar a parede traseira (pelota de cloreto de prata/prata) do suporte.
      NOTA: As pelotas de cloreto de prata/prata são vantajosas sobre os suportes que usam fio de prata, pois fornecem mais área de superfície, resultando em uma linha de base estável de baixo ruído. No entanto, as pelotas de cloreto de prata/prata requerem uma interface líquida livre de bolhas de ar para obter uma boa conexão. Portanto, tome muito cuidado para não introduzir bolhas de ar durante esse processo.
    2. Injete gradualmente o HBSS para preencher toda a microeletrídada enquanto retrai lentamente a agulha da seringa. Recoloque a tampa roscada, mas não aperte. Reinsera a agulha da seringa para preencher o espaço vazio dentro da tampa com HBSS. Em seguida, encha o capilar de vidro enquanto segura horizontalmente para evitar que a solução escape da outra extremidade.
    3. Segure o capilar de vidro da extremidade dobrada e insira lentamente a extremidade oposta através da tampa solta e, em seguida, aperte a tampa do parafuso no lugar.
      NOTA: Eletrodos de vidro preenchidos com HBSS mantêm a lubrificação do olho do mouse e evitam a desidratação corneal que ocorreria com o uso de eletrodos de laço dourado padrão.
  5. Posicione os suportes de eletrodos com os eletrodos capilares inclinados para cima para permitir que as bolhas fluam. Execute o vácuo por 5\u201210 min para degas. O gás que escapa das superfícies de vidro e plástico empurrará o HBSS para fora dos suportes de eletrodos.
  6. Pare e, em seguida, solte lentamente o vácuo. Reabastecer os porta-eletrodos e capilares de vidro, conforme descrito anteriormente.
    NOTA: As bolhas tendem a ser coletadas sobre ou perto da junta de borracha de silicone e também podem se esconder nas ranhuras da tampa roscada, portanto, é preciso prestar atenção especial para manter essas áreas livres de bolhas.
  7. Instale e fixe o suporte de microeletrodos no suporte de articulação T-clip/Magnetic ball(Figura 1A, inset). Para fazer o suporte personalizado para o suporte de microeletrodos, modifique um clipe T (5/16"-11/32" OD Tubing) #8(Tabela de Materiais) removendo os clipes poliacetais pretos de um lado. Tenha a base do cilindro das juntas de esfera magnética usinadas ao meio para ajustar a altura(Tabela de Materiais). Fixar os clipes T modificados nos parafusos de montagem da bola magnética com porcas do tamanho M3.
  8. Coloque o suporte de microeletroder no clipe T modificado e segure-o firmemente no lugar deslizando em aproximadamente uma alça de madeira afilada de 1 polegada feita de quebrar uma vara de limpeza com ponta de algodão(Tabela de Materiais)em um ângulo. Use a base do cilindro de ímã de terras raras para posicionar com segurança o suporte de eletrodo personalizado sobre a placa metálica do palco, permitindo a rotação de 360° em um eixo de 180°.

4. Testar eletrodos

  1. Despeje o HBSS em um recipiente pequeno (por exemplo, a tampa do tubo cônico de 50 mL).
  2. Abaixe suavemente os microeletrodos capilares totalmente montados, cheios de HBSS na tampa contendo HBSS para pré-equilibrar os eletrodos e colocar o eletrodo moído da agulha (parte traseira/traseira) e o eletrodo de referência de pelotização de pelotização Ag/AgCl (boca) no mesmo HBSS para completar o circuito(Figura 1A).
    NOTA: Execute todas as etapas subsequentes sob luz vermelha fraca. Use uma lanterna de luz vermelha para posicionar o mouse e os eletrodos capilares. Lembre-se de desligar completamente todas as fontes de luz antes de iniciar a gravação.
  3. Selecione ou crie um identificador apropriado (nome da família) para descrever o mouse a ser testado e selecione o protocolo DC-ERG a ser realizado completando o registro de acordo com a seguinte ordem.
    1. Clique em Protocolos. Selecione DC-ERG. Clique em Executar. Uma caixa de diálogo aparecerá: "O paciente atual é XXX [DOB: XX/XX/XX) Isso está correto para o teste que está sendo realizado?" Clique em Sim. Em seguida, prossiga para "Passo 1/6".
  4. Feche as portas da jaula de Faraday.
  5. Exibir o modo de impedância clicando em Impedance e verificar se os valores para a referência da boca, o solo da cauda e os eletrodos de gravação são aceitáveis (ver Figura 1B).
  6. Teste a estabilidade da linha de base (ruído e deriva) clicando em Passo (seta para frente) para selecionar o passo 4/6 "Flash longo sem luz".
    NOTA: A quantidade de deriva observada quando os eletrodos são colocados no banho HBSS é geralmente inferior a 500 μV por 80 s uma vez que eles estabilizaram e é equivalente à deriva observada quando os eletrodos estão conectados ao mouse. Assim, a leitura elétrica dos eletrodos no banho HBSS é um importante indicador do estado dos eletrodos. O ruído, medido como pico ao pico, é geralmente ~ 10\u201215% maior no mouse do que no banho HBSS. Isso é provavelmente devido à adição de artefatos de movimento de respiração.
  7. Comece a visualizar os traços clicando em Visualização. Os traços devem ser de baixo ruído com amplitude de pico ao pico <200 μV. Uma leve deriva (<500 μV/80 s) que gradualmente desaparece para a linha de base é aceitável(Figura 1C).

5. Posicionamento de rato e eletrodo

  1. Mantenha os ratos durante a noite em uma caixa bem ventilada para adaptação escura.
  2. Anestesiar os animais por injeção intraperitoneal de cetamina (80 mg/kg) e xilazina (8 mg/kg).
  3. Aplique uma queda de 0,5% de proparacaine HCl topicamente para anestesiar a córnea, bem como uma queda de 2,5% de fenilefrina HCl e 0,5% de trópico para dilatar as pupilas.
  4. Apare os bigodes do mouse com uma tesoura para evitar que a contração inadvertida perturnou os eletrodos capilares de vidro durante a gravação.
    NOTA: O protocolo de estímulo DC-ERG dentro do sistema ERG tem várias rotinas de estímulo incorporadas que podem ser selecionadas clicando na etapa (seta para frente) ou passo (seta para trás). Apenas as etapas 1, 4 e 5 do software são necessárias para preparar e executar a gravação dc-ERG.
  5. No sistema ERG, verifique se o paciente correto está selecionado. Clique no botão protocolos verdes. De acordo com a descrição do protocolo, selecione DC-ERG. Em seguida, clique em Executar. Verifique se este é o teste correto que está sendo realizado clicando em Sim.
  6. Use o estímulo da Luz Vermelha designada para o passo 1/6 para acender a luz vermelha dentro da cúpula para ajudar a posicionar o mouse e os eletrodos enquanto observa as mudanças na impedância.
  7. Coloque o mouse sobre uma mesa de gravação aquecida e tenda cuidadosamente a pele da perna traseira usando fórceps. Segure o eletrodo da agulha firmemente em uma mão e insira-o subcutâneamente na perna traseira para fixá-lo no lugar.
  8. Coloque a referência Eletrodo Ag/AgCl(Tabela de Materiais) dentro da boca para que a pelota sinteresse ao longo da bochecha traseira e seja mantida no lugar atrás dos dentes.
    NOTA: Os eletrodos de fio de ouro não devem ser usados como eletrodo de referência bucal, pois possuem características diferentes de impedância e aumentam o ruído de pico ao pico.
  9. Antes de colocar os eletrodos capilares no olho do mouse, segure o suporte de eletrodo com os capilares de vidro vertical, pisque o suporte do eletrodo com o dedo indicador para remover quaisquer bolhas que possam ter sido introduzidas. Encha a ponta com HBSS usando uma agulha de 25 G presa a uma seringa e inspecione para garantir que não haja bolha de ar presa na ponta. Posicione o suporte do suporte do eletrodo para que a ponta aberta dos capilares cheios de HBSS esteja em contato suave com a córnea.
  10. Use precauções especiais para evitar a introdução de bolhas de ar segurando o distribuidor de gel de olho lubrificante invertido e descarte as gotas iniciais. Coloque uma gota de gel lubrificante em cada olho para manter a condutividade e evitar a dessecação durante a gravação.

6. Gravação DC-ERG

  1. Clique em Passo (seta para frente) para selecionar o passo 4/6 "Long Flash No Li".
  2. Clique em Impedance. Use a tela de verificação de impedância para examinar as resistências dos olhos esquerdo e direito. Espera-se que os valores de impedância dos eletrodos de gravação em cada olho sejam semelhantes (~39 kΩ). Espera-se que os valores de impedância tanto para os eletrodos de terra quanto para referência sejam inferiores a 10 kΩ).
  3. Clique em Visualização para ver os traços do olho esquerdo e direito. Aguarde que uma linha de base estável seja alcançada (<10 min). Clique em Parar para sair da visualização do rastreamento.
    NOTA: Mudanças bruscas na direção de deriva ou ruído aberrante na gravação não melhorarão com o tempo e exigirão a identificação do eletrodo capilar que requer atenção. A causa mais provável é uma bolha introduzida na ponta do eletrodo. Reabastecer a ponta com HBSS. Clique em Preview novamente para verificar a linha de base.
  4. Clique em Passo (seta para frente) para selecionar o passo 5/6 "Long Flash 10 cd 7 min.".
  5. Clique em Executar para iniciar a gravação (Figura 1D).

7. Exportação de dados

  1. Selecione o "Paciente" (Nome da Família) descrevendo a gravação do mouse a ser exportada.
  2. Clique em Testes Antigos.
  3. Em Descrição do protocolo selecione DC-ERG. Clique no botão verde Carregar para carregar os dados adquiridos anteriormente.
  4. Clique em Passo (seta para frente) para avançar para o Passo 5/6 "Long Flash 10 cd 7 min."
  5. Clique em Exportar.
  6. Forneça o nome do arquivo (e.g., nome de arquivo.csv). Um nome de arquivo válido deve começar com uma letra, seguida de letras, números ou sublinhados. Não use caracteres especiais ou hífens. O programa de análise de dados (DCERG_Analysis.exe) exige que as entradas de tabela satisfalham os requisitos para nomes variáveis.
  7. Coloque uma marca de verificação ao lado da Tabela de Dados. Ao lado do separador, selecione Guia. Marcar as marcas de verificação ao lado de Opções(Títulos, Vertical),Incluir Todos(Etapas, Chans, Resultados),Colunas de Dados(Conteúdo, Resultados, Varreduras)e Formato(Arquivo).
  8. Em seguida, clique em Exportar (Figura 1E). Isso salva o arquivo *.csv para a pasta C:\Multifocal.

8. Análise de dados

  1. Baixe e instale o instalador de tempo de execução apropriado(Tabela de Materiais)
  2. Baixe e instale o instalador de DCERG_Analysis.exe.
    NOTA: Isso instala o script que executará a análise dos componentes DC-ERG e cria um atalho para executar o programa na pasta Menu Iniciar.
  3. Clique no atalho criado na pasta Menu Iniciar > Programas.
  4. Selecione o arquivo de dados ou arquivos exportados (*.csv) para análise. Use Ctrl + clique esquerdo no mouse para selecionar mais de um arquivo.
    NOTA: O arquivo executável gera dois tipos de parcelas: 1) os dados brutos são plotados com uma linha de ajuste melhor indicando a deriva medida; 2) a resposta corrigida à deriva é plotada após ser suavizada com uma média móvel (com um intervalo de ~5 s). A partir deste gráfico são identificadas as amplitudes e o tempo-a-pico dos componentes DC-ERG: onda c, oscilação rápida, pico de luz e resposta off. Os dados são então exportados em formato de tabela para se destacar onde cada folha corresponde a uma gravação de mouse diferente. Essas folhas são seguidas por duas folhas de resumo: (i) amplitudes DC-ERG compiladas (mV); (ii) compilado dc-erg tempo-para-picos (início de luz, t = 0 min).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Figura 2 é um conjunto de dados de amostra de miR-204 ko/ko cre/+ (KO condicional) e ratos do tipo selvagem (WT). MiR-204 ko/ko cre/+ são camundongos com um nocaute condicional de microRNA 204 no epitélio pigmento da retina. Esses camundongos são gerados pela travessia de camundongos miR-204 floxed (produzidos pela NEIGEF)22 com ratos VMD2-CRE23. O MiR-204 é altamente expresso no RPE, onde regula a expressão de proteínas críticas para a função epitelial que mantêm a integridade da junção apertada (por exemplo, claudins), a manutenção da homeostase de potássio através da expressão dos canais de potássio Kir 7.1, e a expressão de vários genes de ciclo visual (por exemplo, LRAT, RPE65)24.

Uma vez que a morfologia anormal de RPE foi relatada em várias linhas de rato25específicas da Cre, monitoramos a morfologia normal de RPE em Cre expressando camundongos com o fenótipo WT. As anormalidades estruturais e funcionais do miR-204 ko/ko cre+ (ko condicional) se assemelham às características encontradas em camundongos nulos miR-20415 caracterizados por hiperfluorescência (depósitos semelhantes à lipofuscina) e aumento da microglia localizada à superfície apical RPE. Em camundongos nulos essas alterações foram acompanhadas de respostas elétricas evocadas pela luz do RPE, com alteração mínima nas respostas fotorreceptoras (avaliadas pela retina ERG). Assim, espera-se que a perturbação da expressão miR-204 em camundongos miR-204 ko/ko cre/+ altere também a resposta elétrica do RPE.

No exemplo apresentado, um mouse é colocado na plataforma aquecida e os eletrodos são posicionados adequadamente antes de baixar a cúpula. Impedância e deriva são verificados como descrito anteriormente usando a solução de banho. Os resultados "negativos" representativos são mostrados na Figura 2A. Na Figura 2A (painel superior), o traço sofre de bolhas minúsculas no eletrodo que aumentam o ruído de pico ao pico no traço (sombreado em azul). Em outro exemplo (Figura 2A, painel inferior), quando as bolhas se desprendem da superfície do vidro e se movem ao longo do comprimento do eletrodo isso causa mudanças abruptas na direção da deriva da linha de base que não podem ser compensadas pela subtração de deriva. A Figura 2B mostra gravações representativas "positivas" de ratos WT e miR-204 ko/ko cre/+ onde as bolhas foram eliminadas usando a câmara de vácuo antes de montar os microeletrodos nas bancadas do porta-eletrodos.

A linha de ajuste mais adequada para os 25 s iniciais (verde) é calculada e mostrada em azul (Figura 2B). As respostas corrigidas à deriva são replotadas na Figura 2C, juntamente com a identificação das amplitudes dos componentes DC-ERG. Usando a técnica DC-ERG descrita neste protocolo, animais de cepas WT e miR-204 ko/ko cre/+ podem ser rapidamente gravados e analisados.

A onda c é composta por dois componentes: uma hiperpolarização da membrana apical RPE devido ao aumento da condutância de potássio em resposta a uma diminuição do potássio no espaço subretinal devido à atividade fotorreceptora e uma contribuição separada originária das células internas da retina (componente P3 lento – refletindo a atividade das células Müller). A rápida oscilação fornece informações sobre a hiperpolarização da membrana basolateral RPE26,principalmente devido a alterações na condutância de um transportador cl chamado regulador de condução transmembrana de fibrose cística (CFTR)27. Acredita-se que o pico de luz se origine de uma mudança na concentração de uma substância movida a fotorreceptor28 que através de um segundo sistema mensageiro despolariza a membrana basolateral do RPE modulando a atividade dos canais Cl dependentes ca2+ 21. Por fim, o off-response é uma interação complexa de respostas que diferem na polaridade e variam com a intensidade da luz18.

Como esperado, a expressão reduzida dos canais Kir 7.1 K+ atenua muito a onda C29 e a oscilação rápida, como mostrado nas respostas médias na Figura 2D,indicando um prejuízo significativo das propriedades elétricas do RPE. Um resumo das alterações nos componentes do DC-ERG são fornecidos na Figura 2E. As amplitudes relativas dos componentes DC-ERG (normalizadas para WT) são traçadas contra as duas maiores amplitudes de onda a evocadas por luz relativas (1 cd·s/m2; 10 cd·s/m2) (normalizadas para WT) e mostradas na Figura 2F\u2012H. A redução da resposta de onda A à intensidade de luz mais brilhante (10cd·s/m2) (Figura 2F\u2012H, Figura Suplementar S1A,B) sugere um atraso na recuperação da sensibilidade devido à deficiência do ciclo visual (por exemplo, resultante da redução da expressão LRAT ou RPE65 como resultado do nocaute genômico do miR-20424,30).

Figure 1
Figura 1: O diagrama destaca os principais passos do protocolo DC-ERG. (A) Imagem do circuito concluído realizado pela redução da gravação (microeletrodos capilares de vidro), referência e eletrodos de solo na mesma solução de banho. Esta configuração permite que testes preliminares sejam executados (antes de anestesiar o mouse) para avaliar a impedância, ruído e deriva característicos. Inset (superior esquerdo) mostrando um esquema de visão lateral do suporte de microeletrídro personalizado. (B) Imagem representativa do Modo de Verificação de Impedância mostrando os valores apropriados para impedâncias eletrodos. A impedância nos eletrodos oculares esquerdo e direito deve ser comparável, dentro de 5 KΩ um do outro (por exemplo, olho esquerdo: 38,7 KΩ vs. Olho direito: 40,36 KΩ). A impedância do eletrodo de referência bucal deve ser inferior a 1 KΩ, enquanto o eletrodo da cauda deve ser em torno de 2,5 KΩ. (C) A imagem representativa do traço de visualização (Etapa 4/6) é mostrada. O passo 4 (Long Flash No Light) é selecionado, pois nenhuma luz é entregue durante a pré-visualização desta etapa. Os traços devem ser de baixo ruído e podem ter uma leve deriva que gradualmente desaparece com o tempo para a linha de base. Uma vez que os traços tenham alcançado uma deriva constante em ambos os canais e se tornem relativamente planos, a gravação real pode começar. (D) Utilizando o Passo 5/6 (Long Flash 10 cd 7 min) após 0,5 min de escuridão, um passo leve de 10 cd/m2 é entregue ao mouse por 7 minutos seguido de um retorno à escuridão por 1,5 min. (E) Imagem dos parâmetros de exportação usados para converter os dados em um arquivo *.csv. Este formato preciso é necessário para executar o software de análise DC-ERG. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Traços representativos e fluxo de trabalho da análise DC-ERG. Imagem de um resultado DC-ERG negativo exibindo ruído excessivo(A, painel superior) de pico para pico e (A, painel inferior) deriva. (B) Imagens de gravação positiva do DC-ERG resultam de um mouse WT e miR-204 ko/ko cre/+. Gráficos gerados dos traços brutos mostrando as melhores linhas de ajuste (azul) para os 25 s iniciais (verde) antes do início da luz. (C) Parcelas das respostas DC-ERG corrigidas à deriva para os mouses WT e miR-204 ko/ko cre/+ mostrados em B. As amplitudes dos componentes do DC-ERG estão indicadas na legenda. (D) Respostas médias dc-ERG de 3-8 meses de idade WT (n = 6) e miR-204 ko/ko cre/+ (n = 6) ratos. Os componentes DC-ERG são rotulados no traço WT e os parâmetros de estimulação da luz são definidos abaixo. (E) Resumo dos componentes DC-ERG extraídos das gravações dos ratos WT e miR-204 ko/ko cre/+. As parcelas da barra representam médias, as barras de erro indicam erro padrão. As amplitudes relativas da(F) c-wave,(G) de oscilação rápida, e (H) off response são plotadas contra as duas maiores amplitudes de onda a evocadas por luz (1 cd·s/m2; 10 cd·s/m2) (normalizada para WT). A significância é indicada por asteriscos: (Teste t do aluno; * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Respostas ERG de ratos WT e miR-204 ko/ko cre/+ (A) Respostas de WT (preto) e miR-204 ko/ko cre/+ ratos (magenta) a 4 ms flashes de luz de intensidade crescente: 0,0001 cd·s/m2 (n = 5), 0,001 cd·s/m2 2 (n = 5), 0,01 cd·s/m2 (n = 3), 0,1 cd·s/m2 (n = 3), 1 cd·s/m2 (n = 3), 10 cd·s/m2 (n = 2). (B) Amplitude média de onda a plotada contra a intensidade do flash. (C) Amplitude média de onda b plotada contra a intensidade do flash. (D) Tempo médio-pico de respostas de onda plotada contra intensidade de flash. (E) Tempo médio-pico de respostas de ondas b plotados contra intensidade flash. Para todas as parcelas mostradas as barras de erro indicam SEM. A significância é indicada por asteriscos: (Teste t do aluno; * = p < 0,05). Clique aqui para baixar este número.

Figura suplementar 2: Exemplo de compensação dc na linha de alimentação que pode ser mitigada com o uso de um regulador de tensão/condicionador de energia. (A) Na ausência de picos de tensão (causados pelo uso de equipamentos em uma sala adjacente, por exemplo, OCT) geram um deslocamento DC que pode interferir na medição dos componentes DC-ERG, especialmente o pico de luz. O deslocamento disruptivo é ampliado à direita. (B) Com o regulador de tensão/condicionador de energia habilitado, o pico inicial ainda é perceptível, mas o deslocamento dc prejudicial é removido. O efeito do regulador de tensão/condicionador de energia é ampliado e mostrado à direita. Clique aqui para baixar este número.

Arquivos Suplementares. Clique aqui para baixar esses arquivos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Passos críticos

Uma boa gravação DC-ERG requer eletrodos estáveis que estão livres de bolhas que criam artefatos e deriva indesejada, pois são extremamente sensíveis à superagação e mudanças de temperatura. É essencial que uma linha de base estável seja alcançada quando os eletrodos são colocados na solução de banho HBSS antes de prosseguir com a gravação do mouse. Pequenas bolhas tendem a ser coletadas na base do eletrodo capilar ou ao redor da junta de silicone e são difíceis de ver uma vez que o suporte de eletrodo é totalmente montado. Quando poucas bolhas estiverem presentes, o suporte irá libertá-las para remoção. Se há muitas bolhas ou a deriva ou ruído não pode ser removido, muitas vezes é melhor desmontar o eletrodo e começar de novo enquanto inspeciona cuidadosamente as bolhas em cada etapa do processo.

Modificações e solução de problemas

As seguintes personalizações podem ser feitas na configuração (Tabela de Materiais) a fim de melhorar a fidelidade das gravações DC-ERG. Cabos com baixo ruído para suportes de microeletrodo podem ser usados para estender os cabos existentes do amplificador de 32 bits para a mesa de gravação. O comprimento adicional permite a colocação cuidadosa e ajuste do suporte de eletrodo sem perturbar sua posição uma vez que a cúpula de Ganzfeld é fechada. Um regulador de tensão/condicionador de energia pode ser usado para eliminar em ruídos de linha e surtos de energia gerados a partir de luzes ou equipamentos em salas adjacentes sendo ligados e desligados(Figura S2). Além disso, o estimulador da cúpula ganzfeld e o amplificador de 32 bits podem ser colocados dentro de uma gaiola faraday aterrada à barra de terra do edifício para proteger contra qualquer ruído elétrico adicional.

Limitações do Método

O DC-ERG só pode ser gravado fielmente em animais adaptados escuros, o que significa que uma vez que o estímulo de luz é ligado há pouco que pode ser feito para eliminar potenciais indesejáveis ou deriva. Outra limitação é que a polaridade de alguns dos componentes do DC-ERG (pico de luz, off-response) está sujeita à intensidade de luz utilizada16. Isso significa que os maiores desvios da TT podem ocorrer em intensidades não inerentemente presentes na intensidade de luz que este protocolo usa (10 cd/m2). Até este ponto, o software de análise DC-ERG foi projetado assumindo uma resposta negativa fora (um mínimo de resposta). Intensidades de luz mais brilhantes que resultam na inversão da polaridade da resposta off exigirão a necessidade de alterar o arquivo de script de análise incluído.

Significado

O RPE está envolvido na manutenção homeostática do ambiente da retina e desempenha um papel crítico na patologia de diversas doenças da retina. Este método explica em detalhes como configurar um sistema DC-ERG para registrar a resposta elétrica RPE que, quando realizada em conjunto com gravações ERG convencionais, fornece uma medida objetiva da função retina e RPE externa. Estas medidas da funcionalidade RPE podem ser usadas para avaliar linhas de camundongos transgênicos que exibem fenótipos degenerativos ou para testar a eficácia de drogas ou citotoxicidade induzida por drogas para o RPE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por fundos intramuros do NEI. Os autores reconhecem sinceramente o Dr. Sheldon Miller por sua orientação científica, aconselhamento técnico e especialização em fisiologia e doenças RPE. Os autores agradecem a Megan Kopera e a equipe de cuidados com animais por gerenciar as colônias de ratos, e o Dr. Tarun Bansal, Raymond Zhou e Yuan Wang pelo apoio técnico.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ag/AgCl (mouth) Electrode WPI Inc EP1 Mouth reference electrode for mouse
Ceramic Tile Sutter Instrument CTS Used to cut the glass capillary tube to an appropriate size
Cotton Tipped Cleaning Stick Puritan Medical Products 867-WC No Glue To be used as a spacer to improve the fit of the electrode holder assembly
Electroretinogram (ERG) System Diagnosys LLC E3 System Visual electrophysiology system to diagnose ophthalmic conditions in vision research and drug trials
Bunsen Burner Argos Technologies BW20002460 Or equivlaent to shape glass under flame
Glass Capillary Tube (1.5 mm) Sutter Instruments BF150-75 For filling with HBSS and making contact to the cornea
Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) Thermo Fisher Scientific Inc 14175-095 Commercially available. Maintain at RT
In-Line Filter Whatman 6722-5001 To protect vacuum pump from aerosols
Low Noise Cable for Microelectrode Holders WPI Inc 5372 Suggested for improving the length and placement of the cables and electrode holder assemblies
Magnetic Ball Joint WPI Inc 500871 For magnetically positioning the electrode holder assembly on the stage
MatLab Mathworks MatLab: For editing the analysis software
MatLab Curvefit Toolbox Mathworks Toolbox for MatLab (only required for editing the analysis software)
MatLab Compiler Mathworks Toolbox for MatLab (only required for editing and re-releasing the analysis software)
MatLab Runtime version 9.5 Mathworks R2018b (9.5) Required to run the analysis software: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html
Microelectrode Holders (45 degrees) WPI Inc MEH345-15 For holding the capillaries
Needle (25 ga) Covidien 8881250313 For filling the capillary tubes with HBSS
Needle (ground) Electrode Rhythmlink 13mm - one elctrode Subdermal needle electrode (ground) for mouse (13mm long, 0.4mm diameter needle, 1.5m leadwire)
Regulator/Power Conditioner Furman P-1800 Or equivalent to remove DC-offset from noise introduced through power line
Syringe (12 mL) Monoject 1181200777 For filling the capillary tubes with HBSS
T-clip Cole-Parmer 06852-20 For electrode holder assembly
Vacuum Desiccator Bel-Art 420120000 Clear polycarbonate bottom & cover
Pharmacological treatment
Lubricant eye gel Alcon 0078-0429-47 Helps lubricate corneal surface and maintain electrical contact with capillary electrodes
Phenylephrine Hydrochloride 2.5% Akorn 17478-201-15 Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation)
Proparacaine Hydrochloride 0.5% Akorn 17478-263-12 Local anesthetic for ophthalmic instillation
Tropicamide 0.5% Akorn 17478-101-12 Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation)
Xylazine AnaSed sc-362949Rx Analgesic and muscle relaxant
Zetamine (Ketamine HCl) VetOne 501072 Anesthetic for intramuscular injections

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Steinberg, R. H. Interactions between the retinal pigment epithelium and the neural retina. Documenta Ophthalmologica. 60, (4), 327-346 (1985).
  2. Sahu, B., Maeda, A. RPE Visual Cycle and Biochemical Phenotypes of Mutant Mouse Models. Methods in Molecular Biology. 1753, 89-102 (2018).
  3. Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture. Experimental Eye Resarch. 126, 51-60 (2014).
  4. Wimmers, S., Karl, M. O., Strauss, O. Ion channels in the RPE. Progress in Retinal Eye Research. 26, (3), 263-301 (2007).
  5. Gundersen, D., Orlowski, J., Rodriguez-Boulan, E. Apical polarity of Na,K-ATPase in retinal pigment epithelium is linked to a reversal of the ankyrin-fodrin submembrane cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 112, (5), 863-872 (1991).
  6. Fletcher, E. L., et al. Studying age-related macular degeneration using animal models. Optometry and Vision Science. 91, (8), 878-886 (2014).
  7. Gu, S. M., et al. Mutations in RPE65 cause autosomal recessive childhood-onset severe retinal dystrophy. Nature Genetics. 17, (2), 194-197 (1997).
  8. Marlhens, F., et al. Mutations in RPE65 cause Leber's congenital amaurosis. Nature Genetics. 17, (2), 139-141 (1997).
  9. Marmorstein, A. D., et al. the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97, (23), 12758-12763 (2000).
  10. Chang, B. Mouse models for studies of retinal degeneration and diseases. Methods in Molecular Biology. 935, 27-39 (2013).
  11. Collin, G. B., et al. Mouse Models of Inherited Retinal Degeneration with Photoreceptor Cell Loss. Cells. 9, (4), (2020).
  12. Shrock, E., Güell, M. CRISPR in Animals and Animal Models. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 152, 95-114 (2017).
  13. Smalley, E. CRISPR mouse model boom, rat model renaissance. Nature Biotechnology. 34, (9), 893-894 (2016).
  14. Benchorin, G., Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Vollrath, D. Assessment of Murine Retinal Function by Electroretinography. Bio Protocol. 7, (7), (2017).
  15. Zhang, C., et al. Regulation of phagolysosomal activity by miR-204 critically influences structure and function of retinal pigment epithelium/retina. Human Molecular Genetics. 28, (20), 3355-3368 (2019).
  16. Samuels, I. S., et al. Light-evoked responses of the retinal pigment epithelium: changes accompanying photoreceptor loss in the mouse. Journal of Neurophysiology. 104, (1), 391-402 (2010).
  17. Wu, J., Marmorstein, A. D., Peachey, N. S. Functional abnormalities in the retinal pigment epithelium of CFTR mutant mice. Experimental Eye Research. 83, (2), 424-428 (2006).
  18. Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Neurophysiology. 91, (3), 1134-1142 (2004).
  19. Peachey, N. S., Stanton, J. B., Marmorstein, A. D. Noninvasive recording and response characteristics of the rat dc-electroretinogram. Visual Neuroscience. 19, (6), 693-701 (2002).
  20. Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113, (4), 1085-1099 (2015).
  21. Marmorstein, L. Y., et al. The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1). Journal of General Physiology. 127, (5), 577-589 (2006).
  22. Zhang, C., et al. Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. Annual Meeting for the Association for Research in Vision and Ophthalmology. 3568 (2017).
  23. Iacovelli, J., et al. Generation of Cre transgenic mice with postnatal RPE-specific ocular expression. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52, (3), 1378-1383 (2011).
  24. Wang, F. E., et al. MicroRNA-204/211 alters epithelial physiology. FASEB Journal. 24, (5), 1552-1571 (2010).
  25. He, L., Marioutina, M., Dunaief, J. L., Marneros, A. G. Age- and gene-dosage-dependent cre-induced abnormalities in the retinal pigment epithelium. American Journal of Pathology. 184, (6), 1660-1667 (2014).
  26. Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation. Journal of Neurophysiology. 70, (4), 1669-1680 (1993).
  27. Blaug, S., Quinn, R., Quong, J., Jalickee, S., Miller, S. S. Retinal pigment epithelial function: a role for CFTR. Documenta Ophthalmologica. 106, (1), 43-50 (2003).
  28. Gallemore, R. P., Griff, E. R., Steinberg, R. H. Evidence in support of a photoreceptoral origin for the "light-peak substance". Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29, (4), 566-571 (1988).
  29. Shahi, P. K., et al. Abnormal Electroretinogram after Kir7.1 Channel Suppression Suggests Role in Retinal Electrophysiology. Science Reports. 7, (1), 10651 (2017).
  30. Li, Y., et al. Mouse model of human RPE65 P25L hypomorph resembles wild type under normal light rearing but is fully resistant to acute light damage. Human Molecular Genetics. 24, (15), 4417-4428 (2015).
Eletroretinograma acoplado direto (DC-ERG) para gravar as respostas elétricas evocadas pela luz do epitélio pigmento de retina do rato
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Miyagishima, K. J., Zhang, C., Malechka, V. V., Bharti, K., Li, W. Direct-Coupled Electroretinogram (DC-ERG) for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (161), e61491, doi:10.3791/61491 (2020).More

Miyagishima, K. J., Zhang, C., Malechka, V. V., Bharti, K., Li, W. Direct-Coupled Electroretinogram (DC-ERG) for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (161), e61491, doi:10.3791/61491 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter