Summary
Ici, nous présentons une méthode pour enregistrer les réponses électriques évoquées par la lumière de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) chez la souris en utilisant une technique connue sous le nom de DC-ERGs décrite pour la première fois par Marmorstein, Peachey et ses collègues au début des années 2000.
Abstract
L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est un monocouche spécialisé de cellules stratégiquement situées entre la rétine et les choriocapillaris qui maintiennent la santé globale et l’intégrité structurale des photorécepteurs. L’EPR est polarisée, présente des récepteurs ou des canaux situés de façon apique et basique, et effectue le transport vectoriel de l’eau, des ions, des métabolites et sécrète plusieurs cytokines.
Des mesures in vivo non invasives de la fonction RPE peuvent être effectuées à l’aide d’ERGs couplés directs (DC-ERGs). La méthodologie derrière le DC-ERG a été mise au point par Marmorstein, Peachey et ses collègues à l’aide d’un système d’enregistrement de stimulation sur mesure et a ensuite démontré l’utilisation d’un système disponible dans le commerce. La technique DC-ERG utilise des capillaires en verre remplis de la solution de sel tamponné (HBSS) de Hank pour mesurer les réponses électriques plus lentes de l’EPR obtenues par les changements de concentration évoqués par la lumière dans l’espace sous-réceptif en raison de l’activité des photorécepteurs. Le stimulus léger prolongé et la longueur de l’enregistrement DC-ERG le rendent vulnérable à la dérive et au bruit, ce qui entraîne un faible rendement d’enregistrements utilisables. Ici, nous présentons une méthode rapide et fiable pour améliorer la stabilité des enregistrements tout en réduisant le bruit en utilisant la pression sous vide pour réduire/éliminer les bulles qui résultent de l’outgassing du HBSS et du support d’électrode. En outre, les artefacts de la ligne électrique sont atténués à l’aide d’un régulateur de tension / conditionneur de puissance. Nous incluons les protocoles de stimulation lumineuse nécessaires pour un système ERG disponible dans le commerce ainsi que des scripts pour l’analyse des composants DC-ERG : c-wave, oscillation rapide, pic lumineux et réponse éteinte. En raison de la facilité améliorée des enregistrements et du flux de travail rapide d’analyse, ce protocole simplifié est particulièrement utile en mesurant des changements relatifs à l’âge dans la fonction de RPE, la progression de la maladie, et dans l’évaluation de l’intervention pharmacologique.
Introduction
L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est un monocouche de cellules spécialisées qui tapissent le segment postérieur de l’œil et exercent des fonctions critiques pour maintenir l’homéostasierétinienne 1. Le RPE prend en charge les photorécepteurs en régénérant leur pigment visuel photon-capture dans un processus appelé le cycle visuel2, en participant à la phagocytose diurne des pointes du segment extérieurhangar 3, et dans le transport des nutriments et des produits métaboliques entre les photorécepteurs et les choriocapillaris4,5. Les anomalies dans la fonction de RPE sous-tendent de nombreuses maladies rétiniennes humaines, telles que la dégénérescence maculaire relative à l’âge6,l’amaurosis congénital de Leber7,8 et la dystrophie maculaire vitelliforme meilleure9. Comme les tissus oculaires des donneurs sont souvent difficiles à obtenir uniquement à des fins de recherche, les modèles animaux avec des modifications génétiques peuvent fournir une autre façon d’étudier le développement des maladiesrétiniennes 10,11. En outre, l’émergence et l’application de la technologie CRISPR cas9 permettent maintenant des introductions génomiques (knock-in) ou des suppressions (knock-out) dans un processus simple en une étape dépassant les limites des technologies antérieures de ciblagegénétique 12. L’explosion de la disponibilité de nouveaux modèles muraux13 nécessite un protocole d’enregistrement plus efficace pour évaluer non invasivement la fonction RPE.
La mesure des réponses électriques évoquées par la lumière de l’EPR peut être obtenue à l’aide d’une technique d’électrorétogramme couplé directement (DC-ERG). Lorsqu’il est utilisé en combinaison avec des enregistrements ERG conventionnels qui mesurent le photorécepteur (a-wave) et bipolaire (b-onde) réponsescellulaires 14, le DC-ERG peut définir comment les propriétés de réponse de l’EPR changer avec la dégénérescencerétinienne 15,16,17 ou si le dysfonctionnement RPE précède la perte de photorécepteur. Ce protocole décrit une méthode adaptée des travaux de Marmorstein, Peachey et ses collègues qui ont développé pour la première fois la technique DC-ERG16,18,19,20 et améliore la reproductibilité et la facilité d’utilisation.
L’enregistrement DC-ERG est difficile à réaliser en raison du long temps d’acquisition (9 min) pendant lequel toute interruption ou introduction du bruit peut compliquer l’interprétation des données. L’avantage de cette nouvelle méthode est que les lignes de base atteignent un état stable dans un laps de temps plus court réduisant la probabilité que l’animal se réveille prématurément de l’anesthésie et est moins enclin à la formation de bulles dans les électrodes capillaires.
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Protocol
Ce protocole fait suite aux lignes directrices sur les soins aux animaux décrites dans le protocole d’étude des animaux approuvé par le Comité des soins et de l’utilisation des animaux de l’Institut national de l’œil.
1. Importation de protocoles de stimulation lumineuse pour DC-ERG
REMARQUE : Suivez les instructions ci-dessous pour importer les protocoles de stimulation lumineuse du DC-ERG dans le logiciel du système ERG (Tableau des matériaux). Le protocole se compose d’un intervalle de pré-stimulus de 0,5 min, suivi d’un pas de lumière (10 cd/m2)pendant 7 min, et se terminant par un intervalle post-stimulus de 1,5 min. L’intensité lumineuse de 10 cd/m2 (1 log10 cd/m2)a été sélectionnée puisqu’elle évoque environ la moitié de la réponse maximale pour tous les composants du DC-ERG chez les sourisWT 18,21. L’onde C et l’oscillation rapide sont d’un intérêt particulier car les origines de ces réponses électriques sont bien caractérisées et peuvent être isolées et étudiées davantage de modèles d’EPR in vitro (p. ex., iPSC-RPE). L’application d’autres intensités lumineuses peut extraire des informations supplémentaires, par exemple, la réponse off subit un renversement de polarité à des stimuli lumineux plus lumineux et peut montrer des différences à l’intensité à laquelle cette inversion a lieu. L’utilisateur est libre de modifier les paramètres d’intensité lumineuse à sa discrétion.
- Ouvrez le logiciel du système ERG.
- Cliquez sur Database Center.
- Cliquez sur Nouveau (fournir un nouveau nom de fichier de base de données). Cliquez sur Enregistrer. La boîte popup s’affichera : « Base de données créée, voulez-vous vous connecter au nouveau fichier de base de données . » Cliquez sur Oui. Le nom actuel de la base de données doit maintenant refléter le nouveau nom du fichier.
- Cliquez sur Transfer In dans la fenêtre du centre de contrôle de base de données.
- Sélectionnez Fichier supplémentaire 1: LightProtocols - TRANSFER. EXP. Cliquez sur Ouvrir.
- Cliquez sur Fermer (Centre de contrôle de base de données) à la fin de la barre de progression.
- Cliquez sur le bouton Démarrer vert.
- Cliquez sur Nouveau sur la fenêtre Sélectionner le patient. Créez un nouveau nom de famille patient décrivant le modèle de souris, entrez la date de naissance (DOB, mm/dd/yyyy), basculez le bouton genre (M/F) vers la description appropriée. Cliquez sur Fermer pour enregistrer les détails expérimentaux.
- Cliquez sur Protocoles. Les protocoles ERG et DC-ERG adaptés à l’obscurité doivent maintenant être visibles.
- Enfin, placez le fichier Long Flash.col dans le dossier suivant C:\ERG User Files\Long Flash.col.
2. Préparation d’électrodes capillaires
- Couper les capillaires en verre de 1,5 mm en deux à l’aide d’une tuile en céramique (Table of Materials) pour marquer le verre et les casser proprement à l’aide d’une table pour fournir une contre-force physique et stabiliser le verre.
REMARQUE : Émoussez les extrémités coupées au besoin. - À l’aide d’un brûleur Bunsen (Table of Materials) permettent à la chaleur de faire un petit virage dans le capillaire tout en le tenant au-dessus de la flamme avec des forceps.
3. Remplissage des électrodes capillaires
- Connectez le dessiccateur sous vide à la ligne sous vide du laboratoire à l’intermédiaire d’un filtre en ligne( Tableau des matériaux).
- Verser 30 mL de solution de sel équilibré (HBSS) (Table of Materials) de Hanks dans un tube conique ouvert de 50 mL et le placer (avec le bouchon enlevé) dans la chambre à vide.
- Allumez le vide et dégazer le HBSS tout en allumez l’ordinateur et l’équipement d’enregistrement.
- Après 5\u201210 min éteignez le vide et utilisez le HBSS dégazé pour remplir une seringue de 12 mL à travers une aiguille attachée de 25 G. Utilisez-le pour remplir les bases des porte-électrodes en prenant des précautions supplémentaires pour ne pas introduire de bulles.
- Pour ce faire, retirez le bouchon à vis fileté et faites glisser soigneusement l’aiguille de seringue à travers le joint en caoutchouc de silicone pour atteindre la paroi arrière (granulé de chlorure argent/argent) du support.
REMARQUE : Les granulés de chlorure argent/argent sont avantageux par rapport aux supports qui utilisent du fil d’argent car ils fournissent plus de surface, ce qui donne une base stable à faible bruit. Cependant, les granulés de chlorure argent/argent nécessitent une interface liquide exempte de bulles d’air pour obtenir une bonne connexion. Par conséquent, prenez grand soin de ne pas introduire de bulles d’air au cours de ce processus. - Injectez graduellement du HBSS pour remplir l’ensemble de la microélectrode tout en rétractant lentement l’aiguille de seringue. Rattachez le bouchon fileté mais ne serrez pas. Réinsérer l’aiguille de seringue pour remplir l’espace vide dans le bouchon avec HBSS. Remplissez ensuite le capillaire en verre tout en le tenant horizontal pour empêcher la solution de s’échapper de l’autre extrémité.
- Tenez le capillaire en verre de l’extrémité pliée et insérez lentement l’extrémité opposée à travers le bouchon desserré, puis serrez le bouchon de vis en place.
REMARQUE : Les électrodes en verre remplies de HBSS maintiennent la lubrification de l’œil de la souris et empêchent la déshydratation cornéenne qui se produirait avec l’utilisation d’électrodes en boucle d’or standard.
- Pour ce faire, retirez le bouchon à vis fileté et faites glisser soigneusement l’aiguille de seringue à travers le joint en caoutchouc de silicone pour atteindre la paroi arrière (granulé de chlorure argent/argent) du support.
- Placez les porte-électrodes avec les électrodes capillaires inclinées vers le haut pour permettre aux bulles de s’écouler. Exécuter le vide pendant 5\u201210 min à dégazer. Le gaz qui s’échappe des surfaces en verre et en plastique poussera HBSS hors des porte-électrodes.
- Arrêtez-vous, puis relâchez lentement le vide. Remplissez les supports d’électrode et les capillaires en verre comme décrit précédemment.
REMARQUE: Bulles ont tendance à recueillir sur ou près du joint en caoutchouc de silicone et peut également se cacher dans les rainures du bouchon fileté, donc une attention particulière doit être accordée pour garder ces zones sans bulles. - Installez et fixez le support de microélecrode dans le support commun de t-clip/boule magnétique sur mesure (figure 1A, encart). Pour faire le support personnalisé pour le support microélecrode, modifiez un T-clip (5/16 »-11/32 » OD Tubing) #8 (Table of Materials) en enlevant les clips polyacétaux noirs d’un côté. Faire machiner la base du cylindre des joints de boule magnétique en deux pour ajuster la hauteur(tableau des matériaux). Fixez les t-clips modifiés aux vis de montage de boule magnétique avec des écrous de taille M3.
- Placez le support microélecrode dans le t-clip modifié et maintenez-le fermement en place en glissant dans une poignée en bois conique d’environ 1 pouce faite à partir de la rupture d’un bâton de nettoyage à pointe de coton (Table of Materials) à un angle. Utilisez la base du cylindre d’aimant de terres rares pour positionner en toute sécurité le support d’électrode personnalisé sur la plaque métallique de la scène permettant une rotation à 360° sur un axe à 180°.
4. Testez les électrodes
- Verser le HBSS dans un petit récipient (p. ex., le bouchon du tube conique de 50 mL).
- Abaissez doucement les microélecrodes capillaires entièrement assemblées et remplies de HBSS dans le bouchon contenant du HBSS pour prééquilibrer les électrodes et placer l’électrode au sol de l’aiguille (queue/jambe arrière) et l’électrode de référence de granulés frits Ag/AgCl (bouche) dans le même HBSS pour compléter le circuit (figure 1A).
REMARQUE : Effectuez toutes les étapes suivantes sous une faible lumière rouge. Utilisez une lampe de poche rouge pour positionner la souris et les électrodes capillaires. N’oubliez pas d’éteindre complètement toutes les sources de lumière avant de commencer l’enregistrement. - Sélectionnez ou créez un identificateur approprié (nom de famille) pour décrire la souris à tester et sélectionnez le protocole DC-ERG à effectuer en remplissant l’enregistrement selon l’ordre suivant.
- Cliquez sur Protocoles. Sélectionnez DC-ERG. Cliquez sur Exécuter. Une boîte de dialogue apparaîtra : « Le patient actuel est XXX [DOB : XX/XX/XX) Est-ce correct pour le test effectué ? » Cliquez sur Oui. Passez ensuite à l’étape 1/6.
- Fermez les portes de la cage de Faraday.
- Affichez le mode d’impedance en cliquant sur Impedance et vérifiez que les valeurs de référence de la bouche, de la queue et de l’enregistrement des électrodes sont acceptables (voir la figure 1B).
- Testez la stabilité de base (bruit et dérive) en cliquant sur Étape (flèche avant) pour sélectionner l’étape 4/6 « Long Flash No Light. »
REMARQUE : La quantité de dérive observée lorsque les électrodes sont placées dans le bain HBSS est généralement inférieure à 500 μV par 80 s une fois qu’elles se sont stabilisées et équivaut à la dérive observée lorsque les électrodes sont reliées à la souris. Ainsi, la lecture électrique des électrodes dans le bain HBSS est un indicateur important de l’état des électrodes. Le bruit, mesuré comme de pointe en pointe, est généralement ~ ~ 10\u201215% plus élevé chez la souris que dans le bain HBSS. Cela est probablement dû à l’ajout d’artefacts de mouvement de la respiration. - Commencez à visualiser les traces en cliquant sur Aperçu. Les traces devraient être un faible bruit avec une amplitude de pointe à pointe <200 μV. Une légère dérive (<500 μV/80 s) qui s’estompe graduellement à la ligne de base est acceptable (figure 1C).
5. Positionnement de souris et d’électrodes
- Gardez les souris toute la nuit dans une boîte bien ventilée et étanche à la lumière pour une adaptation sombre.
- Anesthésier les animaux par injection intraperitoneal de kétamine (80 mg/kg) et de xylazine (8 mg/kg).
- Appliquer une baisse de 0,5% proparacaine HCl topique pour anesthésier la cornée ainsi qu’une baisse de 2,5% phényléphrine HCl et 0,5% tropicamide pour dilater les pupilles.
- Coupez les moustaches de souris avec des ciseaux pour éviter que les contractions accidentelles ne perturbent les électrodes capillaires en verre pendant l’enregistrement.
REMARQUE : Le protocole de stimulus DC-ERG dans le système ERG a plusieurs routines de stimulus intégrées qui peuvent être sélectionnées en cliquant sur l’étape (flèche avant) ou l’étape (flèche arrière). Seules les étapes 1, 4 et 5 du logiciel sont nécessaires pour préparer et exécuter l’enregistrement DC-ERG. - Dans le logiciel du système ERG vérifier que le patient correct est sélectionné. Cliquez sur le bouton Protocoles verts. Sous la description du protocole sélectionnez DC-ERG. Cliquez ensuite sur Exécuter. Vérifiez qu’il s’agit du bon test effectué en cliquant sur Oui.
- Utilisez l’étape 1/6 désignée stimulus de la lumière rouge pour allumer la lumière rouge à l’intérieur du dôme pour aider à positionner la souris et les électrodes tout en observant les changements d’impédance.
- Placez la souris sur une table d’enregistrement chauffée et tentez soigneusement la peau de la jambe arrière à l’aide de forceps. Tenez fermement l’électrode d’aiguille dans une main et insérez-la sous-cutanée dans la jambe arrière pour la fixer en place.
- Placez l’électrode Ag/AgCl de référence(Table of Materials)à l’intérieur de la bouche de sorte que la pastille frite repose le long de la joue arrière et soit maintenue en place derrière les dents.
REMARQUE : Les électrodes de fil d’or ne doivent pas être utilisées comme électrode de référence en bouche car elles ont des caractéristiques d’impédance différentes et augmentent le bruit de pointe à pointe. - Avant de placer les électrodes capillaires à l’œil de la souris, tenez le support d’électrode avec les capillaires en verre verticaux, faites glisser le support d’électrode avec l’index pour enlever toutes les bulles qui pourraient avoir été introduites. Remplissez la pointe avec HBSS à l’aide d’une aiguille de 25 G attachée à une seringue et inspectez pour s’assurer qu’il n’y a pas de bulle d’air piégée à la pointe. Placez le support d’électrode de sorte que la pointe ouverte des capillaires remplis de HBSS soit en contact doux avec la cornée.
- Prendre des précautions particulières pour éviter d’introduire des bulles d’air en maintenant le distributeur de gel pour les yeux lubrifiant inversé et jeter les gouttes initiales. Placez une goutte de gel pour les yeux lubrifiant sur chaque œil pour maintenir la conductivité et prévenir la dessiccation pendant l’enregistrement.
6. Enregistrement DC-ERG
- Cliquez sur Étape (flèche avant) pour sélectionner l’étape 4/6 « Long Flash No Li. »
- Cliquez sur Impedance. Utilisez l’écran de vérification de l’impédance pour examiner les résistances des yeux gauche et droit. On s’attend à ce que les valeurs d’impedance pour les électrodes d’enregistrement à chaque oeil soient semblables (~39 kΩ). On s’attend à ce que les valeurs d’impedance pour le sol et les électrodes de référence soient inférieures à 10 kΩ).
- Cliquez sur Aperçu pour afficher les traces de l’œil gauche et droit. Attendez qu’une ligne de base stable soit atteinte (<10 min). Cliquez sur Arrêt pour sortir de l’aperçu des traces.
REMARQUE : Les changements brusques dans la direction de la dérive ou le bruit aberrant dans l’enregistrement ne s’amélioreront pas avec le temps et nécessiteront d’identifier l’électrode capillaire qui nécessite une attention particulière. La cause la plus probable est une bulle introduite à l’extrémité de l’électrode. Remplissez la pointe avec HBSS. Cliquez à nouveau sur Aperçu pour vérifier la ligne de base. - Cliquez sur Étape (flèche avant) pour sélectionner l’étape 5/6 « Long Flash 10 cd 7 min. »
- Cliquez sur Exécuter pour démarrer l’enregistrement ( Figure1D).
7. Exportation de données
- Sélectionnez le « Patient » (Nom de famille) décrivant l’enregistrement de la souris à exporter.
- Cliquez sur Anciens Tests.
- Sous la description du protocole sélectionnez DC-ERG. Cliquez sur le bouton Charge verte pour charger les données précédemment acquises.
- Cliquez sur Étape (flèche avant) pour passer à l’étape 5/6 « Long Flash 10 cd 7 min. »
- Cliquez sur Export.
- Fournir le nom du fichier (p. ex., nom de .csv). Un nom de fichier valide doit commencer par une lettre, suivie de lettres, de chiffres ou de soulignements. N’utilisez pas de caractères spéciaux ou d’traits d’union. Le programme d’analyse des données (DCERG_Analysis.exe) exige que les entrées de table répondent aux exigences relatives aux noms variables.
- Placez un point de contrôle à côté de la table de données. À côté du séparateur, sélectionnez Onglet. Placez les checkmarks à côté des options (Titres, Vertical), Inclure tous (Étapes, Chans , Résultats), Colonnesde données (Contenu, Résultats, Balayages), et le format (Fichier).
- Cliquez ensuite sur Export (Figure 1E). Cela permet d'.csv fichier *.csv dans le dossier C:\Multifocal.
8. Analyse des données
- Télécharger et installer l’installateur de temps d’exécution approprié( Table of Materials)
- Téléchargez et installez le DCERG_Analysis.exe installateur.
REMARQUE : Cela installe le script qui effectuera l’analyse des composants DC-ERG et crée un raccourci pour exécuter le programme dans le dossier Menu Démarrer. - Cliquez sur le raccourci créé dans le menu Démarrer > Programmes dossier.
- Sélectionnez le fichier ou les fichiers de données exportés (*.csv) pour analyse. Utilisez Ctrl + clic gauche sur la souris pour sélectionner plus d’un fichier.
REMARQUE : Le fichier exécutable génère deux types de parcelles : 1) les données brutes sont tracées avec une ligne de montage la mieux adaptée indiquant la dérive mesurée; 2) la réponse corrigée de dérive est tracée après avoir été lissée avec une moyenne mobile (avec une envergure de ~5 s). De cette parcelle, les amplitudes et le temps de pointe des composants DC-ERG sont identifiés : onde c, oscillation rapide, pic lumineux et réponse hors tension. Les données sont ensuite exportées en format table pour exceller là où chaque feuille correspond à un enregistrement de souris différent. Ces feuilles sont suivies de deux fiches sommaires : (i) les amplitudes DC-ERG compilées (mV); (ii) compilé DC-ERG temps-à-pics (apparition de la lumière, t = 0 min).
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Representative Results
La figure 2 est un ensemble de données d’échantillons provenant de souris miR-204 ko/ko cre/+ (KO conditionnelle) et sauvages (WT). MiR-204 ko/ko cre/+ sont des souris avec un KO conditionnel de microARN 204 dans l’épithélium pigmentaire rétinien. Ces souris sont générées en croisant des souris miR-204 floxées (produites par NEIGEF)22 avec des souris VMD2-CRE23. MiR-204 est fortement exprimé dans l’EPR où il régule l’expression des protéines critiques pour la fonction épithéliale qui maintiennent l’intégrité étroite de jonction (par exemple, claudins), le maintien de l’homéostasie de potassium par l’expression des canaux de potassium de Kir 7.1, et l’expression de plusieurs gènes visuels de cycle (par exemple, LRAT, RPE65)24.
Puisque la morphologie anormale de RPE a été rapportée dans plusieurs Cre RPE-spécifiques exprimant des lignesde souris 25,nous avons surveillé pour la morphologie normale de RPE dans le Cre exprimant des souris avec le phénotype de WT. Les anomalies structurelles et fonctionnelles de la rétine de souris miR-204 ko/ko cre+ (KO conditionnelle) ressemblent aux caractéristiques trouvées chez les souris nulles miR-20415 caractérisées par une hyper autofluorescence (dépôts ressemblant à de la lipofuscine) et une augmentation des microglies localisées à la surface apical de l’EPR. Chez les souris nulles, ces changements ont été accompagnés de réponses électriques réduites évoquant la lumière de l’EPR, avec une altération minimale des réponses photoréceptrices (évaluées par ERG rétinien). Ainsi, la perturbation de l’expression miR-204 chez les souris miR-204 ko/ko cre/+ devrait également modifier la réponse électrique de l’EPR.
Dans l’exemple présenté, une souris est placée sur la plate-forme chauffée et les électrodes sont placées de manière appropriée avant d’abaisser le dôme. L’impédance et la dérive sont vérifiées comme décrit précédemment à l’aide de la solution de bain. Les résultats « négatifs » représentatifs sont indiqués à la figure 2A. Dans la figure 2A (panneau supérieur), la trace souffre de bulles minuscules dans l’électrode qui augmentent le bruit de pointe à pointe dans la trace (ombragée en bleu). Dans un autre exemple (figure 2A, panneau inférieur), lorsque les bulles se détachent de la surface du verre et se déplacent le long de la longueur de l’électrode, cela provoque des changements brusques dans la direction de la dérive de base qui ne peuvent pas être compensés par la soustraction de dérive. La figure 2B montre des enregistrements représentatifs « positifs » de souris WT et miR-204 ko/ko cre/+ où les bulles ont été éliminées à l’aide de la chambre à vide avant d’assembler les microélecrodes dans les peuplements de porte-électrodes.
La meilleure ligne d’ajustement aux 25 s initiaux (vert) est calculée et affichée en bleu (figure 2B). Les réponses corrigées de la dérive sont réagulées dans la figure 2C ainsi que l’identification des amplitudes des composants DC-ERG. En utilisant la technique DC-ERG décrite dans ce protocole, les animaux des souches WT et miR-204 ko/ko cre/+ peuvent rapidement être enregistrés et analysés.
L’onde c est composée de deux composantes : une hyperpolarisation de la membrane apical de l’EPR due à une conductance accrue du potassium en réponse à une diminution du potassium dans l’espace subrétinien due à l’activité des photorécepteurs et à une contribution distincte provenant des cellules rétiniennes internes (composant P3 lent – reflétant l’activité des cellules Müller). L’oscillation rapide fournit des informations concernant l’hyperpolarisation de la membrane basolateralrpe 26, principalement en raison de changements dans la conductance d’un transporteur Cl appelé régulateur de conductance transmembrane de fibrose kystique (CFTR)27. On pense que le pic lumineux provient d’un changement dans la concentration d’une substance entraînée par photorécepteur28 qui, grâce à un deuxième système de messagerie, dépolarise la membrane basolaterale de l’EPR en modulant l’activité des canaux Cl dépendants de Ca2+ 21. Enfin, l’off-response est une interaction complexe de réponses qui diffèrent dans la polarité et varient avec l’intensité lumineuse18.
Comme prévu, l’expression réduite des canaux Kir 7,1 K+ atténue considérablement la c-onde29 et l’oscillation rapide comme le montrent les réponses moyennes à la figure 2D,ce qui indique une atteinte importante aux propriétés électriques de l’EPR. Un résumé des changements dans les composantes du DC-ERG sont fournis à la figure 2E. Les amplitudes relatives des composants DC-ERG (normalisées en WT) sont tracées contre les deux plus grandes amplitudes d’ondes a évoquées par la lumière (1 cd·s/m2; 10 cd·s/m2)(normalisées en WT) et indiquées à la figure 2F\u2012H. La réduction de la réponse à l’onde a à l’intensité lumineuse la plus brillante (10cd·s/m2) (Figure 2F\u2012H, Figure supplémentaire S1A,B) suggère un retard dans le rétablissement de la sensibilité en raison d’une déficience du cycle visuel (p. ex., résultant de la réduction de l’expression LRAT ou RPE65 résultant du KO génomique de miR-20424,30).
Figure 1 : Le diagramme met en évidence les étapes clés du protocole DC-ERG. (A) Image du circuit terminé accompli en abaissant l’enregistrement (microélecrodes capillaires en verre), la référence et les électrodes au sol dans la même solution de bain. Cette configuration permet d’exécuter des tests préliminaires (avant d’anesthésier la souris) afin d’évaluer l’impedance, le bruit et la dérive caractéristiques. Encart (en haut à gauche) montrant un schéma de vue latérale du support microélecrode personnalisé. (B) Image représentative du mode de vérification de l’impédance montrant les valeurs appropriées pour les impédances d’électrodes. L’impedance dans les électrodes d’oeil gauche et droite devrait être comparable, dans un délai de 5 KΩ l’un de l’autre (par exemple, oeil gauche : 38.7 KΩ vs oeil droit : 40.36 KΩ). L’impedance de l’électrode de référence de bouche devrait être inférieure à 1 KΩ, tandis que l’électrode de queue devrait être autour de 2.5 KΩ. (C) Image représentative de la trace d’aperçu (étape 4/6) est affichée. L’étape 4 (Long Flash No Light) est sélectionnée car aucune lumière n’est livrée pendant l’aperçu de cette étape. Les traces doivent être à faible bruit et peuvent avoir une légère dérive qui s’estompe progressivement avec le temps à la ligne de base. Une fois que les traces ont atteint une dérive constante dans les deux canaux et deviennent relativement plates, l’enregistrement réel peut commencer. (D) À l’aide de l’étape 5/6 (Long Flash 10 cd 7 min) après 0,5 min d’obscurité, une étape lumineuse de 10 cd/m2 est livrée à la souris pendant 7 min suivie d’un retour à l’obscurité pendant 1,5 min(E)Image des paramètres d’exportation utilisés pour convertir les données en un fichier *.csv. Ce format précis est nécessaire pour exécuter le logiciel d’analyse DC-ERG. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Traces représentatives et flux de travail de l’analyse DC-ERG. Image d’un résultat négatif dc-ERG affichant un bruit excessif (A, panneau supérieur) de pointe en pointe et (A, panneau inférieur) dérive. (B) Images de résultats positifs d’enregistrement DC-ERG à partir d’une souris WT et miR-204 ko/ko cre/+ Parcelles générées des traces brutes montrant les meilleures lignes d’ajustement (bleu) aux 25 premiers s (vert) avant le début de la lumière. (C) Les parcelles de la dérive corrigé DC-ERG réponses pour les WT et miR-204 ko / ko cre / + souris montrées en B. Les amplitudes des composants du DC-ERG sont indiquées dans la légende. (D) Réponses moyennes DC-ERG de 3-8 mois WT (n = 6) et miR-204 ko/ko cre/+ (n = 6) souris. Les composants DC-ERG sont étiquetés sur la trace WT et les paramètres de stimulation lumineuse sont définis ci-dessous. (E) Résumé des composants DC-ERG prélevés à partir d’enregistrements de souris WT et miR-204 ko/ko cre/+ Les tracés de barres représentent la moyenne, les barres d’erreur indiquent l’erreur standard. Les amplitudes relatives de l’onde c (F), (G) oscillation rapide, et (H) hors réponse sont tracées contre les deux plus grandes amplitudes d’ondes a évoquées par la lumière (1 cd·s/m2; 10 cd·s/m2) (normalisées en WT). L’importance est indiquée par les astérisques : (T-test de l’élève; * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure supplémentaire 1 : Réponses ERG des souris WT et miR-204 ko/ko cre/+ (A) Réponses des souris WT (noir) et miR-204 ko/ko cre/+ (magenta) à 4 ms clignote de lumière d’intensité croissante : 0,0001 cd·s/m2 (n = 5), 0,001 cd·s/m 2 (n = 5), 0,001 cd·s/m22 (n = 5), 0,01 cd·s/m2 (n = 3), 0,1 cd·s/m2 (n = 3), 1 cd·s/m2 (n = 3), 10 cd·s/m2 (n = 2). (B) Amplitude moyenne d’onde a tracée contre l’intensité du flash. (C) Amplitude moyenne b-onde tracée contre l’intensité du flash. (D) Temps moyen de pointe des réponses d’onde tracées contre l’intensité du flash. (E) Temps moyen de pointe des réponses b-wave tracées contre l’intensité du flash. Pour toutes les parcelles affichées, les barres d’erreur indiquent sem. L’importance est indiquée par les astérisques : (T-test de l’élève; * = p < 0,05). S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.
Figure supplémentaire 2 : Exemple d’un décalage dc dans la ligne électrique qui peut être atténué par l’utilisation d’un régulateur de tension/conditionneur de puissance. (A) En l’absence de pointes de tension de régulation de la tension (causées par l’utilisation de l’équipement dans une pièce adjacente par exemple, OCT) génèrent un décalage DC qui peut interférer avec la mesure des composants DC-ERG, en particulier le pic lumineux. Le décalage perturbateur est amplifié sur la droite. (B) Avec le régulateur de tension / conditionneur de puissance activé le pic initial est encore perceptible, mais l’endommagement DC-offset est supprimé. L’effet du régulateur de tension/conditionneur de puissance est amplifié et montré à droite. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.
Fichiers supplémentaires. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ces fichiers.
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Discussion
Étapes critiques
Un bon enregistrement DC-ERG nécessite des électrodes stables qui sont exemptes de bulles qui créent des artefacts et des dérives indésirables car elles sont extrêmement sensibles au dégazage et aux changements de température. Il est essentiel qu’une ligne de base stable soit atteinte lorsque les électrodes sont placées dans la solution de bain HBSS avant d’aller de l’avant avec l’enregistrement de la souris. Les petites bulles ont tendance à s’accumuler à la base de l’électrode capillaire ou autour du joint en silicone et sont difficiles à voir une fois que le support d’électrode est entièrement assemblé. Lorsque peu de bulles sont présentes, le fait de feuilleter légèrement le support les libérera pour l’enlèvement. S’il y a trop de bulles ou si la dérive ou le bruit ne peut pas être enlevé, il est souvent préférable de démonter l’électrode et de recommencer tout en inspectant soigneusement les bulles à chaque étape du processus.
Modifications et dépannage
Les personnalisations suivantes peuvent être apportées à la configuration (Table of Materials) afin d’améliorer la fidélité des enregistrements DC-ERG. Des câbles à faible bruit pour les supports microélecrodés peuvent être utilisés pour étendre les câbles existants de l’amplificateur 32 bits à la table d’enregistrement. La longueur supplémentaire permet le placement et l’ajustement soignux du support d’électrode sans perturber leur position une fois le dôme ganzfeld fermé. Un régulateur de tension/conditionneur de puissance peut être utilisé pour éliminer le bruit en ligne et les surtensions générées par les lumières ou l’équipement dans les pièces adjacentes étant allumées et éteintes (figure S2). En outre, le stimulateur de dôme ganzfeld de table et l’amplificateur 32 bits peuvent être placés à l’intérieur d’une cage faraday cloué au sol à la barre de sol du bâtiment pour se protéger contre tout bruit électrique supplémentaire.
Limitations de la méthode
Le DC-ERG ne peut être enregistré fidèlement que sur des animaux sombres adaptés, ce qui signifie qu’une fois que le stimulus lumineux est allumé, il y a peu de choses qui peuvent être faites pour éliminer les potentiels indésirables ou la dérive. Une autre limitation est que la polarité de certains composants du DC-ERG (pic lumineux, hors réponse) est soumise à l’intensité lumineuseutilisée 16. Cela signifie que les écarts les plus importants par rapport aux WT peuvent se produire à des intensités qui ne sont pas intrinsèquement présentes à l’intensité lumineuse que ce protocole utilise (10 cd/m2). Jusqu’à présent, le logiciel d’analyse DC-ERG a été conçu en supposant une réponse négative (un minimum de réponse). Des intensités lumineuses plus lumineuses qui entraînent l’inversion de la polarité de la réponse off nécessiteront la nécessité de modifier le fichier de script d’analyse inclus.
Importance
L’EPR est impliqué dans le maintien homéostatique de l’environnement rétinien et joue un rôle critique dans la pathologie de plusieurs maladies rétiniennes. Cette méthode explique en détail comment configurer un système DC-ERG pour enregistrer la réponse électrique rpe qui, lorsqu’il est effectué en conjonction avec les enregistrements ERG conventionnels fournit une mesure objective de la rétine externe et rpe fonction. Ces mesures de la fonctionnalité rpe peuvent être utilisées pour évaluer les lignées de souris transgéniques affichant des phénotypes dégénératifs ou pour tester l’efficacité des médicaments ou la cytotoxicité induite par les médicaments à l’EPR.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des fonds intra-muros nei. Les auteurs reconnaissent sincèrement le Dr Sheldon Miller pour ses conseils scientifiques, ses conseils techniques et son expertise en physiologie et en maladie de l’EPR. Les auteurs remercient Megan Kopera et le personnel de soins aux animaux pour la gestion des colonies de souris, ainsi que le Dr Tarun Bansal, Raymond Zhou et Yuan Wang pour leur soutien technique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ag/AgCl (mouth) Electrode | WPI Inc | EP1 | Mouth reference electrode for mouse |
| Ceramic Tile | Sutter Instrument | CTS | Used to cut the glass capillary tube to an appropriate size |
| Cotton Tipped Cleaning Stick | Puritan Medical Products | 867-WC No Glue | To be used as a spacer to improve the fit of the electrode holder assembly |
| Electroretinogram (ERG) System | Diagnosys LLC | E3 System | Visual electrophysiology system to diagnose ophthalmic conditions in vision research and drug trials |
| Bunsen Burner | Argos Technologies | BW20002460 | Or equivlaent to shape glass under flame |
| Glass Capillary Tube (1.5 mm) | Sutter Instruments | BF150-75 | For filling with HBSS and making contact to the cornea |
| Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific Inc | 14175-095 | Commercially available. Maintain at RT |
| In-Line Filter | Whatman | 6722-5001 | To protect vacuum pump from aerosols |
| Low Noise Cable for Microelectrode Holders | WPI Inc | 5372 | Suggested for improving the length and placement of the cables and electrode holder assemblies |
| Magnetic Ball Joint | WPI Inc | 500871 | For magnetically positioning the electrode holder assembly on the stage |
| MatLab | Mathworks | MatLab: For editing the analysis software | |
| MatLab Curvefit Toolbox | Mathworks | Toolbox for MatLab (only required for editing the analysis software) | |
| MatLab Compiler | Mathworks | Toolbox for MatLab (only required for editing and re-releasing the analysis software) | |
| MatLab Runtime version 9.5 | Mathworks | R2018b (9.5) | Required to run the analysis software: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html |
| Microelectrode Holders (45 degrees) | WPI Inc | MEH345-15 | For holding the capillaries |
| Needle (25 ga) | Covidien | 8881250313 | For filling the capillary tubes with HBSS |
| Needle (ground) Electrode | Rhythmlink | 13mm - one elctrode | Subdermal needle electrode (ground) for mouse (13mm long, 0.4mm diameter needle, 1.5m leadwire) |
| Regulator/Power Conditioner | Furman | P-1800 | Or equivalent to remove DC-offset from noise introduced through power line |
| Syringe (12 mL) | Monoject | 1181200777 | For filling the capillary tubes with HBSS |
| T-clip | Cole-Parmer | 06852-20 | For electrode holder assembly |
| Vacuum Desiccator | Bel-Art | 420120000 | Clear polycarbonate bottom & cover |
| Pharmacological treatment | |||
| Lubricant eye gel | Alcon | 0078-0429-47 | Helps lubricate corneal surface and maintain electrical contact with capillary electrodes |
| Phenylephrine Hydrochloride 2.5% | Akorn | 17478-201-15 | Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation) |
| Proparacaine Hydrochloride 0.5% | Akorn | 17478-263-12 | Local anesthetic for ophthalmic instillation |
| Tropicamide 0.5% | Akorn | 17478-101-12 | Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation) |
| Xylazine | AnaSed | sc-362949Rx | Analgesic and muscle relaxant |
| Zetamine (Ketamine HCl) | VetOne | 501072 | Anesthetic for intramuscular injections |
References
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