Summary
Her presenterer vi en metode for registrering av lys fremkalte elektriske responser av retinal pigment epitel (RPE) hos mus ved hjelp av en teknikk kjent som DC-ERGs først beskrevet av Marmorstein, Peachey, og kolleger tidlig på 2000-tallet.
Abstract
Retinal pigment epitel (RPE) er et spesialisert monolayer av celler strategisk plassert mellom netthinnen og choriocapillaris som opprettholder den generelle helse og strukturelle integriteten til fotoreseptorene. RPE er polarisert, viser apically og basalt plassert reseptorer eller kanaler, og utfører vektoral transport av vann, ioner, metabolitter, og utskiller flere cytokiner.
In vivo ikke-invasive målinger av RPE-funksjonen kan gjøres ved hjelp av direkte forbindelser (DC-ERGs). Metodikken bak DC-ERG ble banebrytende av Marmorstein, Peachey og kolleger ved hjelp av et spesialbygd stimuleringsopptakssystem og senere demonstrert ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig system. DC-ERG-teknikken bruker glasskapillærer fylt med Hanks bufrede saltløsning (HBSS) for å måle de langsommere elektriske reaksjonene til RPE fremkalt fra lyskalte konsentrasjonsendringer i subretinalrommet på grunn av fotoreseptoraktivitet. Den langvarige lysstimulansen og lengden på DC-ERG-opptaket gjør den sårbar for drift og støy som resulterer i et lavt utbytte av brukbare opptak. Her presenterer vi en rask og pålitelig metode for å forbedre stabiliteten til opptakene samtidig som vi reduserer støy ved å bruke vakuumtrykk for å redusere/eliminere bobler som følge av utgassing av HBSS og elektrodeholderen. I tillegg dempes strømledningsartefakter ved hjelp av en spenningsregulator/strømbetinging. Vi inkluderer de nødvendige lysstimuleringsprotokollene for et kommersielt tilgjengelig ERG-system, samt skript for analyse av DC-ERG-komponentene: c-bølge, rask svingning, lystopp og av respons. På grunn av den forbedrede enkle opptaks- og hurtiganalysearbeidsflyten er denne forenklede protokollen spesielt nyttig for måling av aldersrelaterte endringer i RPE-funksjon, sykdomsprogresjon og i vurderingen av farmakologisk intervensjon.
Introduction
Retinal pigment epitel (RPE) er en monolayer av spesialiserte celler som linje bakre segmentet av øyet og utøve kritiske funksjoner for å opprettholde retinal homeostase1. RPE støtter fotoreseptorer ved å regenerere deres fotonfangende visuelle pigment i en prosess som kalles den visuellesyklus 2, ved å delta i dagsfagocytose av skur ytre segmenttips3, og i transport av næringsstoffer og metabolske produkter mellom fotoreseptorer og choriocapillaris4,5. Abnormiteter i RPE-funksjonen ligger til grunn for mange humane retinale sykdommer, som aldersrelatert makuladegenerasjon6,Lebers medfødte amaurosis7,8 og Best vitelliform makuladystrofi9. Som donor øye vev er ofte vanskelig å få utelukkende for forskningsformål, dyremodeller med genetiske modifikasjoner kan gi en alternativ måte å studere utviklingen av retinal sykdommer10,11. I tillegg tillater fremveksten og anvendelsen av CRISPR cas9-teknologi nå genomiske introduksjoner (knock-in) eller slettinger (knock-out) i en enkel, ett-trinns prosess som overgår begrensninger av tidligere genmålrettingsteknologier12. Bommen i tilgjengeligheten av nye musemodeller13 krever en mer effektiv opptaksprotokoll for å ikke-invasivt evaluere RPE-funksjonen.
Måling av RPEs lyskalkede elektriske responser kan oppnås ved hjelp av en direkte skrevet elektroretinogram (DC-ERG) teknikk. Når den brukes i kombinasjon med konvensjonelle ERG-opptak som måler fotoreseptoren (a-bølge) og bipolare (b-bølge)celleresponser 14, kan DC-ERG definere hvordan responsegenskapene til RPE endres med retinal degenerasjon15,16,17 ellerom RPE-dysfunksjon går forut for fotoreseptortap. Denne protokollen beskriver en metode tilpasset fra arbeidet til Marmorstein, Peachey, og kolleger som først utviklet DC-ERG teknikk16,18,19,20 og forbedrer reproduserbarhet og brukervennlighet.
DC-ERG-opptaket er vanskelig å utføre på grunn av den lange oppkjøpstiden (9 min) der eventuelle avbrudd eller innføring av støy kan komplisere tolkningen av dataene. Fordelen med denne nye metoden er at grunnlinjene når jevn tilstand innen kortere tid, noe som reduserer sannsynligheten for at dyret vil våkne for tidlig fra anestesi og er mindre utsatt for bobledannelse i kapillære elektroder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen følger retningslinjene for dyrepleie som er beskrevet i dyrestudieprotokollen godkjent av Dyreverns- og brukskomiteen ved National Eye Institute.
1. Importere lysstimuleringsprotokoller for DC-ERG
MERK: Følg instruksjonene nedenfor for å importere lysstimuleringsprotokollene for DC-ERG til ERG-systemprogramvaren (Materials tabell). Protokollen består av et intervall på 0,5 min før stimulans, etterfulgt av et lystrinn (10 cd/m2) i 7 min, og slutter med et intervall etter stimulans på 1,5 minutter. Lysintensiteten på 10 cd/m2 (1logg 10 cd/m2) ble valgt siden den fremkaller omtrent halvparten av maksimal respons for alle komponentene i DC-ERG i WT-mus18,21. C-bølge og rask oscillasjon er av spesiell interesse som opprinnelsen til disse elektriske svarene er godt preget og kan isoleres og studeres videre in vitro RPE modeller (f.eks iPSC-RPE). Anvendelsen av andre lysintensiteter kan trekke ut tilleggsinformasjon, for eksempel gjennomgår avresponsen en reversering av polariteten ved lysere lysstimuli og kan vise forskjeller på intensiteten som denne reverseringen finner sted. Brukeren står fritt til å endre innstillingene for lysintensitet etter eget skjønn.
- Åpne ERG-systemprogramvaren.
- Klikk på Databasesenter.
- Klikk på Ny (angi et nytt databasefilnavn). Klikk på Lagre. Popup-boksen vil vise: "Database opprettet, vil du koble til den nye databasefilen." Klikk på Ja. Gjeldende databasenavn skal nå gjenspeile det nye filnavnet.
- Klikk på Overfør i vinduet Databasekontrollsenter.
- Velg Tilleggsfil 1: LightProtocols - TRANSFER. EXP. Klikk på Åpne.
- Klikk på Lukk (Database Control Center) ved fullføring av fremdriftslinjen.
- Klikk på den grønne Start-knappen.
- Klikk på Ny i vinduet Velg pasient. Opprett et nytt pasientfamilienavn som beskriver musemodellen, skriv inn fødselsdatoen (DOB, mm/dd/åyyy), og sett kjønnsknappen (M/F) til riktig beskrivelse. Klikk på Lukk for å lagre eksperimentelle detaljer.
- Klikk på Protokoller. De mørktilpassede ERG- og DC-ERG-protokollene skal nå være synlige.
- Til slutt plasserer du filen Long Flash.col i følgende mappe C:\ERG User Files\Long Flash.col.
2. Kapillær elektrode forberedelse
- Skjær 1,5 mm glasskapillærer i to ved hjelp av en keramisk flis (Table of Materials) for å score glasset og bryte dem rent ved hjelp av et bord for å gi fysisk motkraft og for å stabilisere glasset.
MERK: Sløv de kuttede endene etter behov. - Ved hjelp av en Bunsen brenner (Table of Materials) tillate varmen å gjøre en liten bøyning i kapillæren mens du holder den over flammen med tang.
3. Fylle kapillære elektroder
- Koble vakuumdesiccatoren til laboratoriets vakuumledning gjennom et in-line filter (Materialsekk).
- Hell 30 ml Hanks' balanserte saltløsning (HBSS) (Materials tabell) i et åpent konisk rør på 50 ml og plasser det (med hetten fjernet) i vakuumkammeret.
- Slå på vakuumet og degas HBSS mens du slår på datamaskinen og opptaksutstyret.
- Etter 5\u201210 min slå av vakuumet og bruk avgassede HBSS til å fylle en 12 ml sprøyte gjennom en vedlagt 25 G kanyle. Bruk den til å fylle basene på elektrodeholderne som tar ekstra forholdsregler for ikke å introdusere bobler.
- For å gjøre dette, fjern den gjengede skruehetten og skyv forsiktig sprøytenålen gjennom silikongummipakningen for å nå bakveggen (sølv/sølvkloridpellet) på holderen.
MERK: Kloridpellets i sølv/sølv er en fordel over holdere som bruker sølvtråd, da de gir mer overflateareal som resulterer i en stabil lavstøy. Sølv/sølvkloridpellets krever imidlertid et flytende grensesnitt uten luftbobler for å oppnå en god forbindelse. Derfor må du være forsiktig så du ikke introduserer luftbobler under denne prosessen. - Injiser HBSS gradvis for å fylle hele mikroelektrogen mens du langsomt trekker sprøytenålen langsomt tilbake. Sett på den gjengede hetten igjen, men ikke stram. Sett på sprøyten på plass igjen for å fylle det tomme rommet i hetten med HBSS. Fyll deretter glasskapillæren mens du holder den horisontal for å hindre at løsningen rømmer fra den andre enden.
- Hold glasskapileriet fra den bøyde enden og sett langsomt den motsatte enden gjennom den løsnede hetten og trekk deretter skrukorken på plass.
MERK: Glasselektroder fylt med HBSS opprettholder smøring av musens øye og forhindrer hornhinnedehydrering som ville oppstå ved bruk av standard gullsløyfeelektroder.
- For å gjøre dette, fjern den gjengede skruehetten og skyv forsiktig sprøytenålen gjennom silikongummipakningen for å nå bakveggen (sølv/sølvkloridpellet) på holderen.
- Plasser elektrodeholderne med kapillære elektrodene vippet oppover slik at bobler kan strømme ut. Kjør vakuumet i 5\u201210 min til degas. Gass som rømmer fra glass- og plastoverflatene vil skyve HBSS ut av elektrodeholderne.
- Stopp og slipp deretter vakuumet langsomt. Fyll elektrodeholderne og glasskapillærer som beskrevet tidligere.
MERK: Bobler har en tendens til å samle seg på eller i nærheten av silikongummipakningen og kan også gjemme seg i sporene på den gjengede hetten, derfor må det tas spesiell oppmerksomhet for å holde disse områdene boblefrie. - Monter og fest mikroelektrogenholderen inn i det skreddersydde T-klipset/magnetisk kuleleddstativ (figur 1A, innfelt). For å gjøre det egendefinerte stativet for mikroelektrogenholderen, modifisere en T-klips (5/16"-11/32" OD Tubing) #8 (Materialsepp) ved å fjerne de svarte polyacetalklemmene på den ene siden. Ha sylinderbasen på de magnetiske kuleleddene maskinert i to for å justere høyden (Materials bord). Fest de modifiserte T-klipsene til de magnetiske kulemonteringsskruene med muttere i M3-størrelse.
- Plasser mikroelektrogenholderen i den modifiserte T-klipsen og hold den tett på plass ved å skyve i omtrent et 1-tommers konisk trehåndtak laget av å bryte en bomullstippet rengjøringspinne (Table of Materials) i en vinkel. Bruk den sjeldne jordmagnetsylinderbasen til å plassere det tilpassede elektrodeholderstativet på metallplaten på scenen slik at 360° rotasjon på en 180° akse.
4. Test elektroder
- Hell HBSS i en liten beholder (f.eks. hetten på det koniske røret på 50 ml).
- Senk forsiktig de ferdigmonterte, HBSS-fylte kapillære mikroelektrodene forsiktig ned i hetten som inneholder HBSS for å pre-likevekte elektrodene og plassere nålebakken elektroden (hale / bakre ben) og Ag / AgCl sintret pellet referanseelektroden (munn) i samme HBSS for å fullføre kretsen (figur 1A).
MERK: Utfør alle påfølgende trinn under svakt rødt lys. Bruk en lommelykt i rødt lys til å plassere musen og kapillære elektroder. Husk å slå av alle lyskilder helt før innspillingen startes. - Velg eller opprett en passende identifikator (familienavn) for å beskrive musen som skal testes, og velg DC-ERG-protokollen som skal utføres ved å fullføre registreringen i henhold til følgende rekkefølge.
- Klikk på Protokoller. Velg DC-ERG. Klikk på Kjør. En dialogboks vil popup: "Nåværende pasient er XXX [DOB: XX/ XX / XX) Er dette riktig for testen som utføres?" Klikk på Ja. Fortsett deretter til "Trinn 1 /6."
- Lukk dørene til faraday buret.
- Vis impedansmodus ved å klikke på Impedans og kontroller at verdiene for munnreferansen, halebakken og opptakselektrodene er akseptable (se figur 1B).
- Test baseline stabilitet (støy og drift) ved å klikke på Trinn (fremover pil) for å velge Trinn 4 /6 "Long Flash No Light."
MERK: Mengden drift som observeres når elektrodene plasseres i HBSS-badet, er vanligvis mindre enn 500 μV per 80 s når de har stabilisert seg og tilsvarer driften som observeres når elektrodene er koblet til musen. Dermed er den elektriske avlesningen av elektrodene i HBSS-badet en viktig indikator på elektrodenes status. Støyen, målt som topp-til-topp, er vanligvis ~ 10 \\ u201215% større i musen enn i HBSS-badet. Dette skyldes sannsynligvis tilsetning av bevegelsesartefakter fra å puste. - Begynn å vise sporene ved å klikke forhåndsvisning. Sporene skal være lav støy med en topp-til-topp amplitude <200 μV. En liten drift (<500 μV/80 s) som gradvis falmer til baseline er akseptabelt (figur 1C).
5. Mus og elektrodeposisjonering
- Hold musene over natten i en godt ventilert lystett boks for mørk tilpasning.
- Bedøve dyrene ved intraperitoneal injeksjon av ketamin (80 mg/kg) og xyazin (8 mg/kg).
- Påfør en dråpe på 0,5% proparacaine HCl lokalt for å bedøve hornhinnen samt en dråpe på 2,5% fenylefrin HCl og 0,5% tropicamid for å utvide elevene.
- Trim musen whiskers med saks for å hindre utilsiktet rykninger fra å forstyrre glass kapillære elektroder under opptaket.
MERK: DC-ERG-stimulansprotokollen i ERG-systemet har flere innebygde stimulansrutiner som kan velges ved å klikke på Trinn (fremoverpil) eller Trinn (bakoverpil). Bare trinn 1, 4 og 5 i programvaren er nødvendig for å klargjøre og utføre DC-ERG-opptaket. - I ERG-systemprogramvaren må du kontrollere at riktig pasient er valgt. Klikk på den grønne Protokoller-knappen. Velg DC-ERG under Protokollbeskrivelse. Klikk deretter på Kjør. Kontroller at dette er den riktige testen som utføres ved å klikke på Ja.
- Bruk trinn 1/6 utpekt Red Light stimulus for å slå på det røde lyset inne i kuppelen for å plassere musen og elektrodene mens du observerer endringene i impedans.
- Plasser musen på et oppvarmet opptaksbord og sett forsiktig huden på bakbenet ved hjelp av tang. Hold nåleelektroden godt fast i den ene hånden og sett den subkutant inn i bakbenet for å feste den på plass.
- Plasser referansen Ag/AgCl elektrode (Table of Materials) inne i munnen slik at sintret pellet hviler langs baksiden kinnet og holdes på plass bak tennene.
MERK: Gulltrådelektroder bør ikke brukes som munnreferanseelektrode, da de har forskjellige impedansegenskaper og øker topp-til-topp-støyen. - Før du plasserer kapillærelektrodene mot musens øye, holder du elektrodeholderen med glasskapillene vertikale, knips elektrodeholderen med pekefingeren for å fjerne eventuelle bobler som kan ha blitt introdusert. Fyll spissen med HBSS med en 25 G kanyle festet til en sprøyte og inspiser for å sikre at det ikke er noen luftboble fanget på spissen. Plasser elektrodeholderstativet slik at den åpne spissen av de HBSS-fylte kapillærene er i skånsom kontakt med hornhinnen.
- Bruk spesielle forholdsregler for å unngå å innføre luftbobler ved å holde smøremiddelet øyegeldispenseren invertert og kast de første dråpene. Legg en dråpe smøremiddel øyegel på hvert øye for å opprettholde konduktiviteten og forhindre uticcation under opptaket.
6. DC-ERG-opptak
- Klikk på Trinn (fremoverpil) for å velge Trinn 4 / 6 "Long Flash No Li."
- Klikk på Impedans. Bruk impedanskontrollskjermen til å undersøke motstandene til venstre og høyre øyne. Impedansverdiene for opptakselektrodene ved hvert øye forventes å være like (~39 kΩ). Impedansverdiene for både bakken og referanseelektrodene forventes å være mindre enn 10 kΩ).
- Klikk på Forhåndsvisning for å vise sporene for venstre og høyre øye. Vent til en stabil grunnlinje oppnås (<10 min). Klikk på Stopp for å avslutte sporingsforhåndsvisningen.
MERK: Brå endringer i drift retning eller avvikende støy i opptaket vil ikke bli bedre med tiden, og vil kreve identifisering av kapillærelektroden som krever oppmerksomhet. Den mest sannsynlige årsaken er en boble introdusert til spissen av elektroden. Fyll på spissen med HBSS. Klikk på Forhåndsvisning på nytt for å sjekke grunnlinjen. - Klikk på Trinn (fremover pil) for å velge Trinn 5/6 "Long Flash 10 cd 7 min."
- Klikk Kjør for å starte opptaket (Figur 1D).
7. Dataeksport
- Velg "Pasient" (familienavn) som beskriver museopptaket som skal eksporteres.
- Klikk på Gamle tester.
- Velg DC-ERG under Protokollbeskrivelse. Klikk på den grønne Last inn-knappen for å laste inn de tidligere anskaffede dataene.
- Klikk på Trinn (fremover pil) for å gå videre til Trinn 5/6 "Long Flash 10 cd 7 min."
- Klikk på Eksporter.
- Oppgi filnavnet (f.eks. filnavn.csv). Et gyldig filnavn må begynne med en bokstav, etterfulgt av bokstaver, tall eller understrekingstegn. Ikke bruk spesialtegn eller bindestreker. Dataanalyseprogrammet (DCERG_Analysis.exe) krever at tabelloppføringer oppfyller kravene for variabelnavn.
- Merk av for Datatabell. Velg Tabulator ved siden av skilletegnet. Merk av for Alternativer(Titler , Loddrett), Inkluder alle (Trinn, Chans, Resultater), Datakolonner (Innhold, Resultater, Feier) og Format (Fil).
- Klikk deretter på Eksport (Figur 1E). Dette lagrer *.csv filen i mappen C:\Multifocal.
8. Dataanalyse
- Laste ned og installere riktig kjøretidsinstallatør (Materialse tabell)
- Last ned og installer DCERG_Analysis.exe installasjonsprogrammet.
Merk: Dette installerer skriptet som vil utføre analysen av DC-ERG-komponentene og oppretter en snarvei for å kjøre programmet i Start-menymappen. - Klikk på snarveien som er opprettet i Start-menyen > Programmer-mappen.
- Velg den eksporterte datafilen eller filene (*.csv) for analyse. Bruk Ctrl + venstreklikk på musen for å velge mer enn én fil.
MERK: Den kjørbare filen genererer to typer tomter: 1) rådataene er plottet med en best passform linje som indikerer målt drift; 2) drift korrigert respons er plottet etter å ha blitt glattet med et glidende gjennomsnitt (med et spenn på ~ 5 s). Fra dette plottet identifiseres amplitudene og tid-til-toppen av DC-ERG-komponentene: c-bølge, rask oscillasjon, lystopp og av respons. Dataene eksporteres deretter i tabellformat for å excel der hvert ark tilsvarer et annet museopptak. Disse arkene etterfølges av to sammendragsark: (i) kompilerte DC-ERG amplituder (mV); (ii) kompilerte DC-ERG tid-til-topper (lys utbruddet, t = 0 min).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 er et eksempeldatasett fra miR-204 ko/ko cre/+ (betinget KO) og villtypemus (WT). MiR-204 ko/ko cre/+ er mus med betinget knockout av microRNA 204 i retinal pigment epitel. Disse musene genereres ved å krysse floxed miR-204 mus (produsert av NEIGEF)22 med VMD2-CRE mus23. MiR-204 er høyt uttrykt i RPE hvor det regulerer uttrykket av proteiner som er kritiske for epitelfunksjon som opprettholder tett koblingsintegritet (f.eks. claudins), vedlikehold av kalium homeostase gjennom uttrykket av Kir 7.1 kaliumkanaler, og uttrykket av flere visuelle syklus gener (f.eks LRAT, RPE65)24.
Siden unormal RPE morfologi ble rapportert i flere RPE-spesifikke Cre uttrykker muselinjer25,overvåket vi for normal RPE morfologi i Cre uttrykke mus med WT fenotype. De strukturelle og funksjonelle abnormitetene i miR-204 ko/ko cre+ (betinget KO) mus retina ligner funksjonene som finnes i miR-204 nullmus15 preget av hyper autofluorescence (lipofuscin-lignende forekomster) og økt microglia lokalisert til RPE apical overflaten. Hos nullmus ble disse endringene ledsaget av reduserte lysfremkallede elektriske responser av RPE, med minimal endring av fotoreseptorresponser (vurdert av retinal ERG). Dermed forventes perturbasjon av miR-204 uttrykk i miR-204 ko / ko cre / + mus også å endre den elektriske responsen til RPE.
I eksemplet som presenteres, plasseres en mus på den oppvarmede plattformen, og elektrodene plasseres riktig før du senker kuppelen. Impedans og drift kontrolleres som tidligere beskrevet ved hjelp av badeløsningen. Representative "negative" resultater vises i figur 2A. I figur 2A (topppanel) lider sporet av små bobler i elektroden som øker topp-til-topp-støyen i sporet (skyggelagt i blått). I et annet eksempel (Figur 2A, nedre panel), når bobler løsner fra overflaten av glasset og beveger seg langs lengden av elektroden dette fører til brå endringer i retning av baseline drift som ikke kan kompenseres ved drift subtraksjon. Figur 2B viser representative "positive" opptak av WT- og miR-204 ko/ko cre/+ mus hvor boblene er eliminert ved hjelp av vakuumkammeret før mikroelektrodene monteres i elektrodeholderstativene.
Den beste tilpasningslinjen til de første 25 s (grønn) beregnes og vises i blått (figur 2B). Drift korrigerte svarene er replotted i figur 2C sammen med identifisering av amplitudene til DC-ERG-komponentene. Ved hjelp av DC-ERG teknikken beskrevet i denne protokollen dyr fra både WT og miR-204 ko / ko cre / + stammer kan raskt registreres og analyseres.
C-bølgen består av to komponenter: en hyperpolarisering av RPE-aksembranen på grunn av økt kaliumledning som svar på en reduksjon i kalium i subretinalrommet på grunn av fotoreseptoraktivitet og et eget bidrag som stammer fra indre retinale celler (langsom P3-komponent – som reflekterer aktiviteten til Müller-celler). Den raske svingningen gir informasjon om hyperpolarisering av RPE basolateral membran26, hovedsakelig på grunn av endringer i ledningen til en Cl transportør kalt cystisk fibrose transmembrane ledende regulator (CFTR)27. Lystoppen antas å stamme fra en endring i konsentrasjonen av et fotoreseptordrevetstoff 28 som gjennom et annet budbringersystem depolariserer RPes basolaterale membran ved å modulere aktiviteten til Ca2 + avhengige Cl-kanaler21. Til slutt er off-response en kompleks interaksjon av svar som varierer i polaritet og varierer med lysintensitet18.
Som forventet demper redusert uttrykk for Kir 7,1 K+ kanaler i stor grad c-bølge29 og rask svingning som vist i de gjennomsnittlige svarene i figur 2D, noe som indikerer en betydelig svekkelse av RPE elektriske egenskaper. Et sammendrag av endringene i komponentene i DC-ERG er gitt i figur 2E. De relative amplitudene til DC-ERG-komponentene (normalisert til WT) plottes mot de relativt to største lyskalte abølge-amplitudene (1 cd·s/m2; 10 cd·s/m2) (normalisert til WT) og vist i figur 2F\u2012H. Reduksjonen i a-bølgeresponsen på den lyseste lysintensiteten (10cd·s/m2) (Figur 2F\u2012H, tilleggsfigur S1A,B) antyder en forsinkelse i følsomheten på grunn av synssyklusforringelse (f.eks. som følge av redusert LRAT- eller RPE65-uttrykk som følge av genomisk knockout av miR-20424,30).
Figur 1: Diagrammet fremhever viktige trinn i DC-ERG-protokollen. (A) Bilde av den ferdige kretsen oppnådd ved å senke opptaket (glasskapillære mikroelekroder), referanse og jordelektroder i samme badeløsning. Denne konfigurasjonen gjør det mulig å kjøre foreløpige tester (før du bedøver musen) for å evaluere den karakteristiske impedansen, støyen og drift. Innvalg (øverst til venstre) som viser en sidevisningsskjema for det egendefinerte mikroelektrodholderstativet. (B) Representativt bilde av impedanskontrollmodus som viser de riktige verdiene for elektrodeimpedanser. Impedansen i venstre og høyre øyeelektroder bør være sammenlignbar, innenfor 5 KΩ fra hverandre (f.eks. Venstre øye: 38,7 KΩ vs. Høyre øye: 40,36 KΩ). Impedansen til munnreferanseelektroden bør være mindre enn 1 KΩ, mens haleelektroden skal være rundt 2,5 KΩ. (C) Representativt bilde av forhåndsvisningssporingen (trinn 4/6) vises. Trinn 4 (Long Flash No Light) er valgt da ingen lys leveres under forhåndsvisningen av dette trinnet. Sporene skal være lite støy og kan ha en liten drift som gradvis falmer med tiden til baseline. Når sporene har oppnådd en konstant drift i begge kanaler og blitt relativt flate, kan selve opptaket begynne. (D)Ved hjelp av trinn 5/ 6 (Long Flash 10 cd 7 min) etter 0,5 min mørke, et lystrinn på 10 cd / m2 leveres til musen i 7 min etterfulgt av en retur til mørket i 1,5 min. (E) Bilde av eksportparametrene som brukes til å konvertere dataene til en * .csv-fil. Dette nøyaktige formatet er nødvendig for å kjøre DC-ERG analyseprogramvare. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representative spor og arbeidsflyt for DC-ERG-analyse. Bilde av et negativt DC-ERG-resultat som viser overdreven (A, topppanel) topp-til-topp-støy og (A, bunnpanel) drift. (B) Bilder av positiv DC-ERG-opptak skyldes en WT- og miR-204 ko/ko cre/+-mus. Genererte plott av rå spor som viser de beste tilpasningslinjene (blå) til de første 25 s (grønn) før lys utbruddet. (C) Plott av drift korrigert DC-ERG svar for WT og miR-204 ko / ko cre / + mus vist i B. Amplitudene til komponentene i DC-ERG er angitt i forklaringen. (D) Gjennomsnittlig DC-ERG svar på 3-8 måneder gamle WT (n = 6) og miR-204 ko / ko cre / + (n = 6) mus. DC-ERG-komponentene er merket på WT-sporet, og lysstimuleringsparametrene er definert nedenfor. (E) Sammendrag av DC-ERG komponenter hentet fra opptak av WT og miR-204 ko / ko cre / + mus. Stolpetegn representerer gjennomsnitt, feilfelt indikerer standardfeil. De relative amplitudene til (F) c-bølgen, (G) rask svingning, og (H) av respons er plottet mot de relative to største lys-fremkalte a-bølge amplituder (1 cd·s/m2; 10 cd·s/m2) (normalisert til WT). Betydning indikeres av stjerner: (Studentens t-test; * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur 1: ERG-responser av WT- og miR-204 ko/ko cre/+ mus. (A)Svar på WT (svart) og miR-204 ko / ko cre / + mus (magenta) til 4 ms blinker av lys av økende intensitet: 0.0001 cd · s / m2 (n = 5), 0.001 cd · s / m22 (n = 5), 0,01 cd·s/m2 (n = 3), 0,1 cd·s/m2 (n = 3), 1 cd·s/m2 (n = 3), 10 cd·s/m2 (n = 2). (B) Gjennomsnittlig a-bølge amplitude plottet mot blitsintensitet. (C) Gjennomsnittlig b-bølge amplitude plottet mot blitsintensitet. (D) Gjennomsnittlig tid-til-topp av a-bølge svar plottet mot blitsintensitet. (E) Gjennomsnittlig tid-til-topp av b-bølge svar plottet mot blitsintensitet. For alle plott som vises feilfelt indikerer SEM. Betydning indikeres av stjerner: (Studentens t-test; * = p < 0,05). Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Tilleggsfigur 2: Eksempel på en LIKESTRØMSforskyvning i kraftledningen som kan reduseres ved bruk av en spenningsregulator/strømbetingelse. (A)I fravær av spenningsregulering spenning pigger (forårsaket av bruk av utstyr i et tilstøtende rom f.eks OCT) generere en DC-offset som kan forstyrre målingen av DC-ERG komponenter, spesielt lystoppen. Den forstyrrende forskyvningen forstørres til høyre. (B) Med spenningsregulatoren/strømbetingelsen aktivert er den første spissen fortsatt merkbar, men den skadelige LIKESTRØMforskyvningen fjernes. Effekten av spenningsregulatoren/strømbetingelsen forstørres og vises til høyre. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Tilleggsfiler. Vennligst klikk her for å laste ned disse filene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trinn
Et godt DC-ERG-opptak krever stabile elektroder som er fri for bobler som skaper artefakter og uønsket drift, da de er ekstremt følsomme for utgassing og temperaturendringer. Det er viktig at en stabil grunnlinje oppnås når elektrodene plasseres i HBSS-badeløsningen før de fortsetter med museopptaket. Små bobler har en tendens til å samle seg ved foten av kapillærelektroden eller rundt silikonpakningen og er vanskelig å se når elektrodeholderen er ferdig montert. Når det er få bobler til stede, vil lett flikke holderen frigjøre dem for fjerning. Hvis det er for mange bobler eller drift eller støy ikke kan fjernes, er det ofte bedre å demontere elektroden og starte på nytt mens du nøye inspiserer for bobler i hvert trinn av prosessen.
Endringer og feilsøking
Følgende tilpassinger kan gjøres i oppsettet (Materials tabell) for å forbedre gjengivelsen av DC-ERG-opptakene. Lavstøykabler for mikroelektrodholdere kan brukes til å utvide de eksisterende kablene fra 32-biters forsterkeren til opptaksbordet. Den ekstra lengden gjør det mulig å plassere og justere elektrodeholderen forsiktig uten å forstyrre posisjonen når Ganzfeld-kuppelen er lukket. En spenningsregulator/effektbetinger kan brukes til å eliminere i linjestøy og overspenninger generert fra lys eller utstyr i tilstøtende rom som slås av og på (figur S2). I tillegg kan bordplaten Ganzfeld kuppelstimulator og 32-bits forsterker plasseres inne i et Faraday-bur jordet til bygningens bakkelinje for å skjerme mot ytterligere elektrisk støy.
Begrensninger av metoden
DC-ERG kan bare registreres trofast på mørke tilpassede dyr, noe som betyr at når lysstimulansen er slått på, er det lite som kan gjøres for å eliminere uønskede potensialer eller drift. En annen begrensning er at polariteten til noen av komponentene i DC-ERG (lys-peak, off-response) er underlagt lysintensiteten sombrukes 16. Dette betyr at de største avvikene fra WT kan oppstå med intensiteter som ikke er iboende tilstede med lysintensiteten som denne protokollen bruker (10 cd / m2). Til dette punktet ble DC-ERG analyseprogramvaren designet forutsatt en negativ respons (et minimum av svar). Lysere lysintensiteter som resulterer i reversering av polariteten til off-responsen vil kreve behovet for å endre den inkluderte analyseskriptfilen.
Betydning
RPE er involvert i homeostatisk vedlikehold av det retinale miljøet og spiller en kritisk rolle i patologien til flere retinale sykdommer. Denne metoden forklarer i detalj hvordan du konfigurerer et DC-ERG-system for å registrere RPE elektrisk respons som når det utføres i forbindelse med konvensjonelle ERG-opptak, gir et objektivt mål på ytre retinal- og RPE-funksjon. Disse målene for RPE-funksjonalitet kan brukes til å evaluere transgene muselinjer som viser degenerative fenotyper eller for å teste for legemiddeleffekt eller legemiddelindusert cytotoksisitet til RPE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NEI intramural midler. Forfatterne anerkjenner oppriktig Dr. Sheldon Miller for hans vitenskapelige veiledning, tekniske råd og ekspertise innen RPE fysiologi og sykdom. Forfatterne takker Megan Kopera og dyrepleiepersonalet for å administrere musekoloniene, og Dr. Tarun Bansal, Raymond Zhou og Yuan Wang for teknisk støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ag/AgCl (mouth) Electrode | WPI Inc | EP1 | Mouth reference electrode for mouse |
| Ceramic Tile | Sutter Instrument | CTS | Used to cut the glass capillary tube to an appropriate size |
| Cotton Tipped Cleaning Stick | Puritan Medical Products | 867-WC No Glue | To be used as a spacer to improve the fit of the electrode holder assembly |
| Electroretinogram (ERG) System | Diagnosys LLC | E3 System | Visual electrophysiology system to diagnose ophthalmic conditions in vision research and drug trials |
| Bunsen Burner | Argos Technologies | BW20002460 | Or equivlaent to shape glass under flame |
| Glass Capillary Tube (1.5 mm) | Sutter Instruments | BF150-75 | For filling with HBSS and making contact to the cornea |
| Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific Inc | 14175-095 | Commercially available. Maintain at RT |
| In-Line Filter | Whatman | 6722-5001 | To protect vacuum pump from aerosols |
| Low Noise Cable for Microelectrode Holders | WPI Inc | 5372 | Suggested for improving the length and placement of the cables and electrode holder assemblies |
| Magnetic Ball Joint | WPI Inc | 500871 | For magnetically positioning the electrode holder assembly on the stage |
| MatLab | Mathworks | MatLab: For editing the analysis software | |
| MatLab Curvefit Toolbox | Mathworks | Toolbox for MatLab (only required for editing the analysis software) | |
| MatLab Compiler | Mathworks | Toolbox for MatLab (only required for editing and re-releasing the analysis software) | |
| MatLab Runtime version 9.5 | Mathworks | R2018b (9.5) | Required to run the analysis software: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html |
| Microelectrode Holders (45 degrees) | WPI Inc | MEH345-15 | For holding the capillaries |
| Needle (25 ga) | Covidien | 8881250313 | For filling the capillary tubes with HBSS |
| Needle (ground) Electrode | Rhythmlink | 13mm - one elctrode | Subdermal needle electrode (ground) for mouse (13mm long, 0.4mm diameter needle, 1.5m leadwire) |
| Regulator/Power Conditioner | Furman | P-1800 | Or equivalent to remove DC-offset from noise introduced through power line |
| Syringe (12 mL) | Monoject | 1181200777 | For filling the capillary tubes with HBSS |
| T-clip | Cole-Parmer | 06852-20 | For electrode holder assembly |
| Vacuum Desiccator | Bel-Art | 420120000 | Clear polycarbonate bottom & cover |
| Pharmacological treatment | |||
| Lubricant eye gel | Alcon | 0078-0429-47 | Helps lubricate corneal surface and maintain electrical contact with capillary electrodes |
| Phenylephrine Hydrochloride 2.5% | Akorn | 17478-201-15 | Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation) |
| Proparacaine Hydrochloride 0.5% | Akorn | 17478-263-12 | Local anesthetic for ophthalmic instillation |
| Tropicamide 0.5% | Akorn | 17478-101-12 | Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation) |
| Xylazine | AnaSed | sc-362949Rx | Analgesic and muscle relaxant |
| Zetamine (Ketamine HCl) | VetOne | 501072 | Anesthetic for intramuscular injections |
References
- Steinberg, R. H. Interactions between the retinal pigment epithelium and the neural retina. Documenta Ophthalmologica. 60 (4), 327-346 (1985).
- Sahu, B., Maeda, A. RPE Visual Cycle and Biochemical Phenotypes of Mutant Mouse Models. Methods in Molecular Biology. 1753, 89-102 (2018).
- Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture. Experimental Eye Resarch. 126, 51-60 (2014).
- Wimmers, S., Karl, M. O., Strauss, O. Ion channels in the RPE. Progress in Retinal Eye Research. 26 (3), 263-301 (2007).
- Gundersen, D., Orlowski, J., Rodriguez-Boulan, E. Apical polarity of Na,K-ATPase in retinal pigment epithelium is linked to a reversal of the ankyrin-fodrin submembrane cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 112 (5), 863-872 (1991).
- Fletcher, E. L., et al. Studying age-related macular degeneration using animal models. Optometry and Vision Science. 91 (8), 878-886 (2014).
- Gu, S. M., et al. Mutations in RPE65 cause autosomal recessive childhood-onset severe retinal dystrophy. Nature Genetics. 17 (2), 194-197 (1997).
- Marlhens, F., et al. Mutations in RPE65 cause Leber's congenital amaurosis. Nature Genetics. 17 (2), 139-141 (1997).
- Marmorstein, A. D., et al. the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).
- Chang, B. Mouse models for studies of retinal degeneration and diseases. Methods in Molecular Biology. 935, 27-39 (2013).
- Collin, G. B., et al. Mouse Models of Inherited Retinal Degeneration with Photoreceptor Cell Loss. Cells. 9 (4), (2020).
- Shrock, E., Güell, M. CRISPR in Animals and Animal Models. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 152, 95-114 (2017).
- Smalley, E. CRISPR mouse model boom, rat model renaissance. Nature Biotechnology. 34 (9), 893-894 (2016).
- Benchorin, G., Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Vollrath, D. Assessment of Murine Retinal Function by Electroretinography. Bio Protocol. 7 (7), (2017).
- Zhang, C., et al. Regulation of phagolysosomal activity by miR-204 critically influences structure and function of retinal pigment epithelium/retina. Human Molecular Genetics. 28 (20), 3355-3368 (2019).
- Samuels, I. S., et al. Light-evoked responses of the retinal pigment epithelium: changes accompanying photoreceptor loss in the mouse. Journal of Neurophysiology. 104 (1), 391-402 (2010).
- Wu, J., Marmorstein, A. D., Peachey, N. S. Functional abnormalities in the retinal pigment epithelium of CFTR mutant mice. Experimental Eye Research. 83 (2), 424-428 (2006).
- Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Neurophysiology. 91 (3), 1134-1142 (2004).
- Peachey, N. S., Stanton, J. B., Marmorstein, A. D. Noninvasive recording and response characteristics of the rat dc-electroretinogram. Visual Neuroscience. 19 (6), 693-701 (2002).
- Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
- Marmorstein, L. Y., et al. The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1). Journal of General Physiology. 127 (5), 577-589 (2006).
- Zhang, C., et al. Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. Annual Meeting for the Association for Research in Vision and Ophthalmology. , 3568 (2017).
- Iacovelli, J., et al. Generation of Cre transgenic mice with postnatal RPE-specific ocular expression. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (3), 1378-1383 (2011).
- Wang, F. E., et al. MicroRNA-204/211 alters epithelial physiology. FASEB Journal. 24 (5), 1552-1571 (2010).
- He, L., Marioutina, M., Dunaief, J. L., Marneros, A. G. Age- and gene-dosage-dependent cre-induced abnormalities in the retinal pigment epithelium. American Journal of Pathology. 184 (6), 1660-1667 (2014).
- Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation. Journal of Neurophysiology. 70 (4), 1669-1680 (1993).
- Blaug, S., Quinn, R., Quong, J., Jalickee, S., Miller, S. S. Retinal pigment epithelial function: a role for CFTR. Documenta Ophthalmologica. 106 (1), 43-50 (2003).
- Gallemore, R. P., Griff, E. R., Steinberg, R. H. Evidence in support of a photoreceptoral origin for the "light-peak substance". Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (4), 566-571 (1988).
- Shahi, P. K., et al. Abnormal Electroretinogram after Kir7.1 Channel Suppression Suggests Role in Retinal Electrophysiology. Science Reports. 7 (1), 10651 (2017).
- Li, Y., et al. Mouse model of human RPE65 P25L hypomorph resembles wild type under normal light rearing but is fully resistant to acute light damage. Human Molecular Genetics. 24 (15), 4417-4428 (2015).
