Summary
Здесь мы представляем метод записи световых электрических реакций эпителия пигмента сетчатки (RPE) у мышей с использованием метода, известного как DC-ERGs, впервые описанного Марморштейном, Пичи и его коллегами в начале 2000-х годов.
Abstract
Эпителий пигмента сетчатки (RPE) является специализированным монослой клеток, стратегически расположенных между сетчаткой и choriocapillaris, которые поддерживают общее здоровье и структурную целостность фоторецепторов. RPE поляризуется, экспонирует апсически и базально расположенные рецепторы или каналы, и выполняет векторную транспортировку воды, ионов, метаболитов и выделяет несколько цитокинов.
Неинвазивные измерения функции RPE in vivo могут быть сделаны с использованием непосредственно связанных ERG (DC-ERG). Методология, стоящая за DC-ERG, была впервые разработана Марморштейном, Пичи и его коллегами с помощью специально построенной системы записи стимуляции, а затем продемонстрирована с использованием коммерчески доступной системы. Техника DC-ERG использует стеклянные капилляры, наполненные буферным соленым раствором Хэнка (HBSS), для измерения более медленных электрических реакций RPE, вызванных изменениями концентрации в подретинном пространстве из-за активности фоторецептора. Длительный световой стимул и длина записи DC-ERG делают его уязвимым для дрейфа и шума, что приводит к низкой урожайности годных к использованию записей. Здесь мы представляем быстрый и надежный метод повышения стабильности записей при одновременном снижении шума с помощью вакуумного давления для уменьшения/устранения пузырьков, которые являются результатом выброса HBSS и держателя электрода. Кроме того, артефакты линии электропередачи затухают с помощью регуляторов напряжения/кондиционера. Мы включаем необходимые протоколы стимуляции света для коммерчески доступной системы ERG, а также скрипты для анализа компонентов DC-ERG: c-волна, быстрое колебание, световой пик и реакция. Благодаря улучшенной простоте записей и быстрому анализу рабочего процесса, этот упрощенный протокол особенно полезен для измерения возрастных изменений в функции RPE, прогрессирования заболевания, а также в оценке фармакологического вмешательства.
Introduction
Эпителий пигмента сетчатки (RPE) является монослой специализированных клеток, которые высовывает задний сегмент глаза и оказывают критические функции для поддержания гомеостазасетчатки 1. RPE поддерживает фоторецепторы путем регенерации их фотон захвата визуального пигмента в процессе, называемомвизуальный цикл 2, участвуя в диурнальный фагоцитоз пролить внешнийсегмент советы 3, и в транспортировке питательных веществ и метаболических продуктов между фоторецепторами и choriocapillaris4,5. Аномалии в функции RPE лежат в основе многочисленных заболеваний сетчатки человека, таких как возрастнаямакулярная дегенерация 6, врожденныйамауроз Лебера 7,8 и лучшая вителлиформная макулярнаядистрофия 9. Поскольку донорские ткани глаз часто трудно получить исключительно для исследовательских целей, модели животных с генетическими модификациями могут предоставить альтернативный способ изученияразвития заболеваний сетчатки 10,11. Кроме того, появление и применение технологии CRISPR cas9 теперь позволяет геномные введения (стук в) или удаления (нокаут) в простой, одношаговый процесс, превосходя ограничения предыдущих технологий таргетинга генов12. Бум доступности новых моделей мыши13 требует более эффективного протокола записи для неинвазивной оценки функции RPE.
Измерение световых электрических реакций RPE может быть достигнуто с помощью метода электроретинограммы (DC-ERG). При использовании в сочетании с обычными записями ERG, которые измеряют фоторецептор (волна) и биполярные (b-волновые)ответы клеток 14, DC-ERG может определить, как ответные свойства RPE изменения с дегенерациейсетчатки 15,16,17 или же дисфункция RPE предшествует потере фоторецептора. Этот протокол описывает метод, адаптированный из работы Marmorstein, Peachey, и коллег, которые впервые разработали метод DC-ERG16,18,19,20 и улучшает воспроизводимость и простоту использования.
Запись DC-ERG затруднена из-за длительного времени приобретения (9 мин), в течение которого любое прерывание или введение шума может осложнить интерпретацию данных. Преимущество этого нового метода заключается в том, что базовые линии достигают стабильного состояния в течение более короткого периода времени, уменьшая вероятность того, что животное пробудится преждевременно от наркоза и менее подвержено образованию пузырьков в капиллярных электродах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол следует руководящим принципам по уходу за животными, изложенным в протоколе исследования животных, утвержденном Комитетом по уходу за животными и использованию Национального института глаз.
1. Импорт протоколов стимуляции света для DC-ERG
ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте указаниям ниже, чтобы импортировать протоколы стимуляции света для DC-ERG в программное обеспечение системы ERG(Таблица материалов). Протокол состоит из 0,5 мин предварительно стимул интервал, а затем шаг света (10 cd/m2) в течение 7 минут, и заканчивая 1,5 мин после стимула интервал. Интенсивность света 10 cd/m2 (1журнал 10 cd/m 2 ) былавыбранав виду того что она вызывает приблизительно половину максимального ответа для всех компонентов DC-ERG в мышах WT18,21. C-волна и быстрое колебание имеют особый интерес, поскольку истоки этих электрических реакций хорошо характеризуются и могут быть изолированы и изучены далее в пробирке RPE моделей (например, iPSC-RPE). Применение других интенсивностей света может извлечь дополнительную информацию, например, выключенный ответ претерпевает разворот полярности при более ярких световых стимулах и может показать различия в интенсивности, при которой происходит этот разворот. Пользователь может изменить настройки интенсивности света по своему усмотрению.
- Откройте программное обеспечение системы ERG.
- Нажмите на Центр базы данных.
- Нажмите на New (предоставьте новое имя файла базы данных). Нажмите на Сохранить. Всплывающее окно будет отображаться: "База данных создана, вы хотите подключиться к новому файлу базы данных". Нажмите на Да. Текущее название базы данных теперь должно отражать новое название файла.
- Нажмите на кнопку "Передача в окно центра управления базами данных".
- Выберите дополнительный файл 1: LightProtocols - TRANSFER. EXP. Нажмите на Open.
- Нажмите на кнопку Закрыть (Центр управления базами данных) по завершении работы над баром прогресса.
- Нажмите на зеленую кнопку «Пуск».
- Нажмите на новое в окне выберите пациента. Создайте новую фамилию пациента, описывающую модель мыши, введите дату рождения (DOB, mm/dd/yy), наведите кнопку пола (M/F) на соответствующее описание. Нажмите на close, чтобы сохранить экспериментальные детали.
- Нажмите на Протоколы. Теперь должны быть видны темно-адаптированные протоколы ERG и DC-ERG.
- Наконец, поместите файл Long Flash.col в следующую папку C: «ERG Пользовательские файлы»Long Flash.col.
2. Подготовка капиллярных электродов
- Разрежьте 1,5 мм стеклянные капилляры пополам с помощью керамической плитки(Таблица материалов), чтобы забить стекло и разбить их чисто с помощью стола, чтобы обеспечить физическую контрсилу и стабилизировать стекло.
ПРИМЕЧАНИЕ: Блант срезать концы по мере необходимости. - Использование горелки Bunsen (Таблица материалов) позволяют тепла, чтобы сделать небольшой изгиб в капилляре, удерживая его над пламенем с типсами.
3. Заполнение капиллярных электродов
- Подключите вакуумный децикатор к вакуумной линии лаборатории через линейный фильтр(Таблица материалов).
- Налейте 30 мл сбалансированного раствора соли Хэнкса (HBSS) (Таблица материалов) в открытую коническую трубку 50 мл и поместите ее (с крышкой удалены) в вакуумную камеру.
- Включите вакуум и дегазации HBSS при включение компьютера и записывающего оборудования.
- После 5'u201210 мин выключите вакуум и использовать дегазации HBSS для заполнения 12 мл шприца через прилагается 25 G иглы. Используйте его, чтобы заполнить основания держателей электродов, принимая дополнительные меры предосторожности, чтобы не вводить пузырьки.
- Для этого снимите резьбовую крышку винта и осторожно сдвиньте шприц-иглу через силиконовую резиновую прокладку, чтобы добраться до задней стенки (серебряно-серебряная хлоридная гранула) держателя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Серебристые/серебряные гранулы хлорида выгодны держателям, которые используют серебряную проволоку, поскольку они обеспечивают большую площадь поверхности, что приводит к стабильной низкошумной базовой линии. Тем не менее, серебряные / серебряные гранулы хлорида требуют жидкого интерфейса, свободного от пузырьков воздуха для достижения хорошего соединения. Поэтому позаботьтесь о том, чтобы не вводить пузырьки воздуха во время этого процесса. - Постепенно вводить HBSS для заполнения всего микроэлектрода в то время как медленно втягивая шприц иглы. Прикрепите резьбовую крышку, но не затяните. Переустановить шприц иглы, чтобы заполнить пустое пространство в крышке с HBSS. Затем заполните стеклянный капилляр, удерживая его горизонтально, чтобы предотвратить выход раствора с другого конца.
- Держите стеклянный капилляр от согнутого конца и медленно вставьте противоположный конец через ослабленную крышку, а затем затяните крышку винта на место.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стеклянные электроды, заполненные HBSS, поддерживают смазку глаза мыши и предотвращают обезвоживание роговицы, которое может произойти с использованием стандартных электродов золотой петли.
- Для этого снимите резьбовую крышку винта и осторожно сдвиньте шприц-иглу через силиконовую резиновую прокладку, чтобы добраться до задней стенки (серебряно-серебряная хлоридная гранула) держателя.
- Располагайте держатели электродов с капиллярными электродами, наклоненными вверх, чтобы пузырьки вытекали. Вы запустите вакуум в течение 5'u201210 мин для дега. Газ, ускользающий из стеклянных и пластиковых поверхностей, выталкивает HBSS из держателей электродов.
- Остановитесь, а затем медленно отпустите вакуум. Пополнить держатели электродов и стеклянные капилляры, как описано ранее.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пузыри, как правило, собирают на или вблизи силиконовой резиновой прокладки, а также может спрятаться в канавки резьбовой крышкой, поэтому особое внимание должно быть уделено держать эти области пузырь бесплатно. - Установите и закрепите держатель microelectrode в изготовленный на заказ стенд T-clip/Magnetic ball(рисунок 1A, вставка). Чтобы сделать пользовательский стенд для держателя микроэлектрода, изменить T-клип (5/16"-11/32" OD Tubing) #8 (Таблица материалов), удалив черные полиацетальные клипы с одной стороны. Имитируют цилиндрический основание магнитных шаровых суставов пополам, чтобы регулировать высоту(Таблица материалов). Безопасные модифицированные T-клипы на магнитный шар монтажа винты с M3 размера гайки.
- Поместите держатель microelectrode в модифицированный T-клип и удерживайте его плотно на месте, скользя примерно в 1-дюймовый конические деревянные ручки, сделанные из взлома хлопка наконечником очисткипалку( Таблица материалов ) под углом. Используйте редкоземельные магнитные цилиндрические основания, чтобы надежно располагать индивидуальный держатель электрода стоять на металлической пластине сцены позволяет 360 "вращение на 180" оси.
4. Тест электродов
- Налейте HBSS в небольшой контейнер (например, крышка конической трубки 50 мл).
- Аккуратно опустите полностью собранные, заполненные HBSS капиллярные микроэлектроды в крышку, содержащую HBSS, чтобы предварительно уравночные электроды и поместите иглы наземного электрода (хвост / задняя нога) и Ag /AgCl спек гранулы эталонный электрод (рот) в том же HBSS для завершения цепи (Рисунок 1A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все последующие шаги под тусклым красным светом. Используйте фонарик с красным светом, чтобы распоидать мышь и капиллярные электроды. Не забудьте полностью отключить все источники света до начала записи. - Выберите или создайте соответствующий идентификатор (фамилия) для описания мыши для тестирования и выбора протокола DC-ERG, который будет выполнен путем завершения регистрации в соответствии со следующим заказом.
- Нажмите на Протоколы. Выберите DC-ERG. Нажмите на Run. Диалоговое окно будет всплывающее окно: "Текущий пациент XXX (DOB: XX/XX/XX) Правильно ли это для теста выполняется?" Нажмите на Да. Затем перейти к "Шаг 1/6".
- Закройте двери в клетку фарадей.
- Отображение режима impedance, нажав на Impedance и убедитесь, что значения для рот ссылки, хвостовой части земли, и записи электродов являются приемлемыми (см. рисунок 1B).
- Проверьте базовую стабильность (шум и дрейф), нажав на Шаг (вперед стрелка), чтобы выбрать шаг 4/6 "Длинная вспышка нет света".
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество дрейфа наблюдается, когда электроды помещаются в ванну HBSS, как правило, меньше, чем 500 ЗВ на 80 с, как только они стабилизировались и эквивалентно дрейф наблюдается, когда электроды подключены к мыши. Таким образом, электрическая считывание электродов в ванне HBSS является важным показателем состояния электродов. Шум, измеряемый как пик-пик, как правило, на 10-201215% больше в мыши, чем в ванне HBSS. Это, вероятно, связано с добавлением движения артефактов от дыхания. - Начните просматривать следы, нажав на Предварительный просмотр. Следы должны быть низким уровнем шума с пик-пик амплитуды и lt;200 ЗВ. Небольшой дрейф (Lt;500 ЗВ/80 с), который постепенно исчезает до базового уровня является приемлемым (Рисунок 1C).
5. Позиционирование мыши и электрода
- Держите мышей на ночь в хорошо проветриваемой светло-жесткой коробке для темной адаптации.
- Анестезировать животных путем внутриперитонеальной инъекции кетамина (80 мг/кг) и ксилазина (8 мг/кг).
- Применить падение на 0,5% пропаракаин HCl местно анестезировать роговицу, а также падение на 2,5% фенилэфрин HCl и 0,5% тропикамида для расширения зрачков.
- Обрезать усы мыши ножницами, чтобы предотвратить непреднамеренное подергивание от тревожных стеклянных капиллярных электродов во время записи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол стимула DC-ERG в системе ERG имеет несколько встроенных процедур стимулирования, которые могут быть выбраны, нажав на шаг (передняя стрелка) или Шаг (отсталая стрелка). Только шаги 1, 4 и 5 в программном обеспечении необходимы для подготовки и выполнения записи DC-ERG. - В системе ERG программное обеспечение проверить, что правильный пациент выбран. Нажмите на кнопку «Зеленые протоколы». В соответствии с описанием протокола выберите DC-ERG. Затем нажмите на Run. Убедитесь, что это правильный тест выполняется, нажав на Да.
- Используйте шаг 1/6 назначенный красный свет стимул, чтобы включить красный свет внутри купола, чтобы помочь положение мыши и электродов при наблюдении за изменениями в impedance.
- Поместите мышь на нагретый записывающий стол и тщательно палатку кожи задней ноги с помощью типсов. Держите иглу электрическим током твердо в одной руке и вставьте его подкожно в заднюю ногу, чтобы закрепить его на месте.
- Поместите эталонный электрод Ag/AgCl(Таблица материалов)во рту так, чтобы спекаемая гранула лежит вдоль задней щеки и удерживалась на месте за зубами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Электроды золотой проволоки не должны использоваться в качестве эталонного электрода рта, поскольку они имеют различные характеристики и увеличивают пиковый до пика шум. - Перед размещением капиллярных электродов к глазу мыши, удерживайте держатель электрода с вертикальными стеклянными капиллярами, флик держатель электрода указательным пальцем, чтобы удалить любые пузырьки, которые, возможно, были введены. Заполните наконечник с HBSS с помощью 25 G иглы прилагается к шприцу и проверить, чтобы убедиться, что нет воздушного пузыря в ловушке на кончике. Позиция держатель электрода стоять так, что открытый кончик HBSS заполненные капилляры находятся в нежном контакте с роговицей.
- Используйте специальные меры предосторожности, чтобы избежать введения пузырьков воздуха, удерживая смазки глаз гель дозатор перевернутый и отказаться от первоначальных капель. Поместите каплю смазочного геля для глаз на каждый глаз, чтобы поддерживать проводимость и предотвратить высыхание во время записи.
6. Запись DC-ERG
- Нажмите на шаг (вперед стрелка), чтобы выбрать шаг 4/6 "Длинная вспышка нет Ли".
- Нажмите на Impedance. Используйте экран Impedance Checking для изучения сопротивления левого и правого глаз. Значения неустумности для записывающих электродов на каждом глазу, как ожидается, будут аналогичными (39 кЗ). Значения неустумности как для наземных, так и для эталонных электродов, как ожидается, будут меньше 10 кЗ).
- Нажмите на Предварительный просмотр, чтобы просмотреть следы для левого и правого глаза. Подождите, пока будет достигнут стабильный базовый уровень (Lt;10 мин). Нажмите на Stop, чтобы выйти из предварительного просмотра трассировки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Резкие изменения в направлении дрейфа или аномальные шумы в записи не улучшится со временем и потребует выявления капиллярного электрода, который требует внимания. Наиболее вероятной причиной является пузырь, введенный в кончик электрода. Пополнить наконечник с HBSS. Нажмите на Предварительный просмотр еще раз, чтобы проверить базовый уровень. - Нажмите на шаг (вперед стрелка), чтобы выбрать шаг 5/6 "Длинная вспышка 10 CD 7 мин".
- Нажмите Run, чтобы начать запись (Рисунок 1D).
7. Экспорт данных
- Выберите "Пациент" (Семейное имя), описывающее запись мыши для экспорта.
- Нажмите на старые тесты.
- В соответствии с описанием протокола выберите DC-ERG. Нажмите на кнопку «Зеленая нагрузка», чтобы загрузить ранее приобретенные данные.
- Нажмите на шаг (перед стрелка), чтобы перейти к шагу 5/6 "Длинная вспышка 10 CD 7 мин".
- Нажмите на экспорт.
- Предоставьте имя файла (например, имя файла.csv). Действительное имя файла должно начинаться с письма, а затем букв, цифр или подчеркивает. Не используйте специальные символы или дефисы. Программа анализа данных (DCERG_Analysis.exe) требует, чтобы записи таблиц соответствовали требованиям к переменным именам.
- Поместите галочку рядом с таблицей данных. Рядом с сепаратором выберите Tab. Поместите галочки рядом с вариантами(заголовки, Вертикальные), Включитевсе (Шаги, Chans, Результаты), Столбцы данных(Содержимое ,Результаты , Sweeps), и Формат (Файл).
- Затем нажмите на экспорт (рисунок 1E). Это сохраняет файл .csv файла в папку C:'Multifocal.
8. Анализ данных
- Скачать и установить соответствующий установщик времени выполнения(Таблица материалов)
- Скачать и установить DCERG_Analysis.exe установку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это устанавливает скрипт, который будет выполнять анализ компонентов DC-ERG и создает ярлык для запуска программы в папке Меню Пуск. - Нажмите на ярлык, созданный в папке «Пуск меню» и программы.
- Выберите экспортируемый файл данных или файлы (.csv) для анализа. Используйте Ctrl и левое нажатие на мышь, чтобы выбрать более одного файла.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполненный файл генерирует два типа участков: 1) необработанные данные построены с наилучшей линией, указывающей на измеренный дрейф; 2) дрейф исправленный ответ построен после сглаживания с движущийся средней (с пролетом 5 с). Из этого сюжета определены амплитуды и время до пика компонентов DC-ERG: c-волна, быстрое колебание, пик света и реакция. Затем данные экспортируются в формате таблицы, чтобы преуспеть там, где каждый лист соответствует другой записи мыши. За этими листами следуют два сводных листа: i) составленные амплитуды DC-ERG (mV); ii) составлено время dc-ERG до пиков (начало света, т 0 мин).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 2 — выборочный набор данных мышей miR-204 ko/ko cre/' (условный KO) и диких мышей типа (WT). MiR-204 ko/ko cre/ - это мыши с условным нокаутом микроРНК 204 в эпителии пигмента сетчатки. Эти мыши генерируются путем скрещивания floxed miR-204 мышей (производится NEIGEF)22 с VMD2-CREмышей 23. MiR-204 высоко выражен в RPE, где он регулирует экспрессию белков, критически важных для эпителиальной функции, которые поддерживают плотную целостность соединения (например, клаудины), поддержание гомеостаза калия через экспрессию киров 7.1 калийных каналов, и выражение нескольких генов визуального цикла (например, LRAT, RPE65)24.
Так как аномальные RPE морфологии было сообщено в нескольких RPE-специфических Creвыражая линии мыши 25, мы наблюдали за нормальной морфологии RPE в Cre выражая мышей с фенотипом WT. Структурные и функциональные аномалии сетчатки мыши miR-204 ko/ko (условный KO) напоминают особенности, обнаруженные в miR-204 null mice15, характеризующиеся гиперэффуоресценцией (липофусцин-подобного отложения) и увеличенными микроглиями, локализованными на апической поверхности RPE. У нулевых мышей эти изменения сопровождались снижением световых электрических реакций RPE, с минимальным изменением реакций фоторецепторов (оцениваемых ERG сетчатки). Таким образом, возмущение экспрессией miR-204 в miR-204 ko/ko cre/' мышей также, как ожидается, изменит электрическую реакцию RPE.
В представленном примере мышь помещается на нагретую платформу, а электроды расположены надлежащим образом перед опускание купола. Impedance и дрейф проверяются, как описано ранее с помощью раствора ванны. Репрезентативные "негативные" результаты показаны на рисунке 2A. На рисунке 2A (верхняя панель) след страдает от мельчайших пузырьков в электроде, которые увеличивают пиково-пиковый шум в следе (затененном синим цветом). В другом примере(рисунок 2A, нижняя панель), когда пузырьки отделяются от поверхности стекла и перемещаются по длине электрода, это вызывает резкие изменения в направлении базового дрейфа, которые не могут быть компенсированы вычитанием дрейфа. Рисунок 2B показывает репрезентативные "положительные" записи WT и miR-204 ko/ko cre/' мышей, где пузырьки были устранены с помощью вакуумной камеры до сборки микроэлектродов в держатель электрода стоит.
Наилучшее соответствие линии к первоначальным 25 с (зеленый) рассчитывается и показано синим цветом(рисунок 2B). Реакции на дрейф исправляются на рисунке 2C наряду с определением амплитуд компонентов DC-ERG. С помощью метода DC-ERG, описанного в этом протоколе, животные из штаммов WT и miR-204 ko/ko cre/' могут быть быстро записаны и проанализированы.
C-волна состоит из двух компонентов: гиперполяризации апиакальной мембраны RPE из-за повышенной проводимости калия в ответ на уменьшение калия в подтритонном пространстве из-за активности фоторецептора и отдельного вклада, исходя из внутренних клеток сетчатки (медленный компонент P3 , отражающий активность клеток Мюллера). Быстрое колебание предоставляет информацию о гиперполяризации базолатеральноймембраны RPE 26,в первую очередь из-за изменений в проводимости Cl транспортера называется муковисцидоз трансмембранной регулятора проводимости (CFTR)27. Световой пик, как полагают, происходит от изменения концентрации фоторецептораdriven вещества 28, что через вторую систему посыльного деполяризирует базолатеральной мембраны RPE путем модуляции деятельности Ca2 "зависимых каналов Cl21. Наконец, ответ вне ответа является сложным взаимодействием ответов, которые отличаются полярностью и варьируются в зависимости от интенсивностисвета 18.
Как и ожидалось, снижениеэкспрессии каналов K ir 7.1K значительно снижает c-волну29 и быстрое колебание, как показано в усредних ответах на рисунке 2D,что указывает на значительное ухудшение электрических свойств RPE. Резюме изменений в компонентах DC-ERG приводится на рисунке 2E. Относительные амплитуды компонентов DC-ERG (нормализуются до WT) построены против относительно двух крупнейших световых амплитуд (1 cd's/m2; 10 cd's/m2) (нормализованных до WT) и показаны на рисунке 2F'u2012H. Снижение волновой реакции на яркую интенсивность света (10cd's/m2)(рисунок 2F'u2012H, Дополнительный рисунок S1A,B) предполагает задержку в восстановлении чувствительности из-за нарушения зрительного цикла (например, в результате снижения экспрессии LRAT или RPE65 в результате геномного нокаута miR-20424,30).
Рисунок 1: Диаграмма выделяет ключевые шаги в протоколе DC-ERG. (A) Изображение завершенной цепи, выполненной путем снижения записи (стеклянные капиллярные микроэлектроды), ссылки и наземные электроды в тот же раствор ванны. Эта конфигурация позволяет проводить предварительные тесты (до обезболиивации мыши) для оценки характерных проблем, шума и дрейфа. Вставка (верхняя левая сторона), показывающая схему бокового просмотра пользовательского держателя микроэлектрода. (B)Репрезентативное изображение режима проверки неустумности, показывающее соответствующие значения для электродных импульсов. Посяг в электродах левого и правого глаза должен быть сопоставим, в пределах 5 КЗ друг от друга (например, левый глаз: 38,7 КЗ против правого глаза: 40,36 КЗ). Увезде эталонного электрода рта должно быть меньше 1 КЗ, в то время как хвостовой электрод должен быть около 2,5 КЗ. (C)Отображается репрезентативное изображение трассировки предварительного просмотра (Шаг 4/6). Шаг 4 (Long Flash No Light) выбирается, так как во время предварительного просмотра этого шага свет не доставляется. Следы должны быть низким уровнем шума и могут иметь небольшой дрейф, который постепенно исчезает со временем до базовой линии. После того, как следы достигли постоянного дрейфа в обоих каналах и становятся относительно плоскими, фактическая запись может начаться. (D) Использование шага 5/6 (Длинная вспышка 10 cd 7 мин) после 0,5 мин темноты, легкая шаг 10 cd/m2 доставляется на мышь в течение 7 минут с последующим возвращением в темноту в течение 1,5 мин. (E) Изображение параметров экспорта, используемых для преобразования данных в файл .csv. Этот точный формат необходим для запуска программного обеспечения для анализа DC-ERG. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Репрезентативные следы и рабочий процесс анализа DC-ERG. Изображение отрицательного результата DC-ERG, отображая чрезмерный(A, верхняя панель) пиково-пиковый шум и(A, нижняя панель)дрейф. (B) Изображения положительных результатов записи DC-ERG от WT и miR-204 ko/ko cre/' mouse. Сгенерированные участки необработанных следов, показывающие наиболее подходящие линии (синие) до начальных 25 с (зеленых) до наступления света. (C) Участки дрейфа исправлены DC-ERG ответы на WT и miR-204 ко / ко cre / мышей показано в B. Амплитуды компонентов DC-ERG указаны в легенде. (D) Усредняя реакция DC-ERG 3-8 месяцев WT (n No 6) и miR-204 ko/ko cre /' (n No 6) мышей. Компоненты DC-ERG помечены на следе WT, а параметры стимуляции света определены ниже. (E) Резюме компонентов DC-ERG, взятых из записей WT и miR-204 ko/ko cre/' мышей. Диаграммы бара представляют среднее, бары ошибок указывают на стандартную ошибку. Относительные амплитудыc-волны (G) и (H) от реакции построены против относительно двух крупнейших световых амплитуд (1 cd's/m2; 10 cd's/m2)(нормализуется до WT). Значение указывается звездочками: (Студенческий т-тест; Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная цифра 1: ERG ответы WT и miR-204 ко / ко cre / мышей. (A) Ответы WT (черный) и miR-204 ко / ко cre / мышей (пурента) до 4 мс вспышки света возрастающей интенсивности: 0.0001 cd's/m2 (n No 5), 0.001 cd's/m2 (n No 5), 0,01 cd's/m2 (n q 3), 0,1 cd's/m2 (n q 3), 1 cd's/m2 (n No 3), 10 cd's/m2 (n No 2). (B)Усредняя амплитуда волны, построенная против интенсивности вспышки. (C)Усредняя амплитуда b-волны, построенная против интенсивности вспышки. (D)Среднее время до пика волновых реакций, построенных против интенсивности вспышки. (E)Среднее время до пика b-волновых реакций, построенных против интенсивности вспышки. Для всех участков, показанных в барах ошибок, укажите SEM. Значение указывается звездочками: (Студенческий т-тест; Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Дополнительная цифра 2: Пример DC-смещение в линии электропередачи, которые могут быть смягчены с помощью регулятора напряжения / кондиционер питания. (A) При отсутствии напряжения регулирования напряжения шипы (вызванные использованием оборудования в соседней комнате, например, OCT) генерировать DC-смещение, которые могут помешать измерению компонентов DC-ERG, особенно световой пик. Разрушительное смещение увеличивается справа. (B) С регулятором напряжения / кондиционер включен первоначальный всплеск по-прежнему заметно, но повреждения DC-смещение удаляется. Эффект регуляторов напряжения/кондиционера увеличивается и отображается справа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Дополнительные файлы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эти файлы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Критические шаги
Хорошая запись DC-ERG требует стабильных электродов, которые свободны от пузырьков, которые создают артефакты и нежелательный дрейф, поскольку они чрезвычайно чувствительны к outgassing и изменения температуры. Очень важно, чтобы стабильный базовый уровень достигается, когда электроды помещаются в раствор ванны HBSS, прежде чем двигаться вперед с записью мыши. Небольшие пузырьки, как правило, собирают у основания капиллярного электрода или вокруг силиконовой прокладки и трудно увидеть, как только держатель электрода полностью собран. Когда несколько пузырьков присутствуют, слегка стряхивая держатель освободит их для удаления. Если пузырьков слишком много или дрейф или шум не могут быть удалены, часто лучше разобрать электрод и начать все сначала, тщательно осматривая пузырьки на каждом этапе процесса.
Модификации и устранение неполадок
Следующие настройки могут быть сделаны дляустановки (Таблица материалов) для того, чтобы улучшить точность записей DC-ERG. Низкошумные кабели для держателей микроэлектродов могут быть использованы для расширения существующих кабелей от 32-битного усилителя до записывающей таблицы. Дополнительная длина позволяет тщательное размещение и регулировка держателя электрода, не нарушая их положение после того, как купол Ганцфельда закрыт. Регулятор напряжения/кондиционер питания может быть использован для устранения в линии шума и скачков напряжения, генерируемых от света или оборудования в соседних помещениях, включаемых и выключаемых(рисунок S2). Кроме того, на столешнице Ganzfeld купол стимулятор и 32-разрядный усилитель могут быть размещены внутри клетки Фарадей заземлены на землю здания бар, чтобы защитить от любого дополнительного электрического шума.
Ограничения метода
DC-ERG может быть точно записан только на темных адаптированных животных означает, что как только свет стимул включен мало, что можно сделать для устранения нежелательных потенциалов или дрейфа. Другим ограничением является то, что полярность некоторых компонентов DC-ERG (свет-пик, вне реакции) зависит от интенсивности света используется16. Это означает, что наибольшие отклонения от WT могут происходить при интенсивности, не присутствуют по своей сути при интенсивности света, которую использует этот протокол (10 cd/m2). К этому моменту программное обеспечение для анализа DC-ERG было разработано с условием отрицательного ответа (минимум ответа). Более яркие интенсивности света, которые приводят к развороту полярности от ответа потребует необходимости изменения включенного файла сценария анализа.
Значение
RPE участвует в гомеостатической поддержании среды сетчатки и играет важную роль в патологии нескольких заболеваний сетчатки. Этот метод подробно объясняет, как настроить систему DC-ERG для записи RPE электрической реакции, что при исполнении в сочетании с обычными записями ERG обеспечивает объективную меру внешней функции сетчатки и RPE. Эти показатели функциональности RPE могут быть использованы для оценки трансгенных линий мыши, отображающих дегенеративные фенотипы, или для тестирования на цитотоксику, вызванную наркотиками, в RPE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана интрамуральными фондами НЭИ. Авторы искренне признают д-р Шелдон Миллер за его научные рекомендации, технические консультации, и опыт в области физиологии RPE и болезней. Авторы благодарят Меган Копера и персонал по уходу за животными за управление колониями мышей, а также доктора Таруна Бансала, Раймонда Чжоу и Yuan Wang за техническую поддержку.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ag/AgCl (mouth) Electrode | WPI Inc | EP1 | Mouth reference electrode for mouse |
| Ceramic Tile | Sutter Instrument | CTS | Used to cut the glass capillary tube to an appropriate size |
| Cotton Tipped Cleaning Stick | Puritan Medical Products | 867-WC No Glue | To be used as a spacer to improve the fit of the electrode holder assembly |
| Electroretinogram (ERG) System | Diagnosys LLC | E3 System | Visual electrophysiology system to diagnose ophthalmic conditions in vision research and drug trials |
| Bunsen Burner | Argos Technologies | BW20002460 | Or equivlaent to shape glass under flame |
| Glass Capillary Tube (1.5 mm) | Sutter Instruments | BF150-75 | For filling with HBSS and making contact to the cornea |
| Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific Inc | 14175-095 | Commercially available. Maintain at RT |
| In-Line Filter | Whatman | 6722-5001 | To protect vacuum pump from aerosols |
| Low Noise Cable for Microelectrode Holders | WPI Inc | 5372 | Suggested for improving the length and placement of the cables and electrode holder assemblies |
| Magnetic Ball Joint | WPI Inc | 500871 | For magnetically positioning the electrode holder assembly on the stage |
| MatLab | Mathworks | MatLab: For editing the analysis software | |
| MatLab Curvefit Toolbox | Mathworks | Toolbox for MatLab (only required for editing the analysis software) | |
| MatLab Compiler | Mathworks | Toolbox for MatLab (only required for editing and re-releasing the analysis software) | |
| MatLab Runtime version 9.5 | Mathworks | R2018b (9.5) | Required to run the analysis software: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html |
| Microelectrode Holders (45 degrees) | WPI Inc | MEH345-15 | For holding the capillaries |
| Needle (25 ga) | Covidien | 8881250313 | For filling the capillary tubes with HBSS |
| Needle (ground) Electrode | Rhythmlink | 13mm - one elctrode | Subdermal needle electrode (ground) for mouse (13mm long, 0.4mm diameter needle, 1.5m leadwire) |
| Regulator/Power Conditioner | Furman | P-1800 | Or equivalent to remove DC-offset from noise introduced through power line |
| Syringe (12 mL) | Monoject | 1181200777 | For filling the capillary tubes with HBSS |
| T-clip | Cole-Parmer | 06852-20 | For electrode holder assembly |
| Vacuum Desiccator | Bel-Art | 420120000 | Clear polycarbonate bottom & cover |
| Pharmacological treatment | |||
| Lubricant eye gel | Alcon | 0078-0429-47 | Helps lubricate corneal surface and maintain electrical contact with capillary electrodes |
| Phenylephrine Hydrochloride 2.5% | Akorn | 17478-201-15 | Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation) |
| Proparacaine Hydrochloride 0.5% | Akorn | 17478-263-12 | Local anesthetic for ophthalmic instillation |
| Tropicamide 0.5% | Akorn | 17478-101-12 | Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation) |
| Xylazine | AnaSed | sc-362949Rx | Analgesic and muscle relaxant |
| Zetamine (Ketamine HCl) | VetOne | 501072 | Anesthetic for intramuscular injections |
References
- Steinberg, R. H. Interactions between the retinal pigment epithelium and the neural retina. Documenta Ophthalmologica. 60 (4), 327-346 (1985).
- Sahu, B., Maeda, A. RPE Visual Cycle and Biochemical Phenotypes of Mutant Mouse Models. Methods in Molecular Biology. 1753, 89-102 (2018).
- Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture. Experimental Eye Resarch. 126, 51-60 (2014).
- Wimmers, S., Karl, M. O., Strauss, O. Ion channels in the RPE. Progress in Retinal Eye Research. 26 (3), 263-301 (2007).
- Gundersen, D., Orlowski, J., Rodriguez-Boulan, E. Apical polarity of Na,K-ATPase in retinal pigment epithelium is linked to a reversal of the ankyrin-fodrin submembrane cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 112 (5), 863-872 (1991).
- Fletcher, E. L., et al. Studying age-related macular degeneration using animal models. Optometry and Vision Science. 91 (8), 878-886 (2014).
- Gu, S. M., et al. Mutations in RPE65 cause autosomal recessive childhood-onset severe retinal dystrophy. Nature Genetics. 17 (2), 194-197 (1997).
- Marlhens, F., et al. Mutations in RPE65 cause Leber's congenital amaurosis. Nature Genetics. 17 (2), 139-141 (1997).
- Marmorstein, A. D., et al. the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).
- Chang, B. Mouse models for studies of retinal degeneration and diseases. Methods in Molecular Biology. 935, 27-39 (2013).
- Collin, G. B., et al. Mouse Models of Inherited Retinal Degeneration with Photoreceptor Cell Loss. Cells. 9 (4), (2020).
- Shrock, E., Güell, M. CRISPR in Animals and Animal Models. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 152, 95-114 (2017).
- Smalley, E. CRISPR mouse model boom, rat model renaissance. Nature Biotechnology. 34 (9), 893-894 (2016).
- Benchorin, G., Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Vollrath, D. Assessment of Murine Retinal Function by Electroretinography. Bio Protocol. 7 (7), (2017).
- Zhang, C., et al. Regulation of phagolysosomal activity by miR-204 critically influences structure and function of retinal pigment epithelium/retina. Human Molecular Genetics. 28 (20), 3355-3368 (2019).
- Samuels, I. S., et al. Light-evoked responses of the retinal pigment epithelium: changes accompanying photoreceptor loss in the mouse. Journal of Neurophysiology. 104 (1), 391-402 (2010).
- Wu, J., Marmorstein, A. D., Peachey, N. S. Functional abnormalities in the retinal pigment epithelium of CFTR mutant mice. Experimental Eye Research. 83 (2), 424-428 (2006).
- Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Neurophysiology. 91 (3), 1134-1142 (2004).
- Peachey, N. S., Stanton, J. B., Marmorstein, A. D. Noninvasive recording and response characteristics of the rat dc-electroretinogram. Visual Neuroscience. 19 (6), 693-701 (2002).
- Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
- Marmorstein, L. Y., et al. The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1). Journal of General Physiology. 127 (5), 577-589 (2006).
- Zhang, C., et al. Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. Annual Meeting for the Association for Research in Vision and Ophthalmology. , 3568 (2017).
- Iacovelli, J., et al. Generation of Cre transgenic mice with postnatal RPE-specific ocular expression. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (3), 1378-1383 (2011).
- Wang, F. E., et al. MicroRNA-204/211 alters epithelial physiology. FASEB Journal. 24 (5), 1552-1571 (2010).
- He, L., Marioutina, M., Dunaief, J. L., Marneros, A. G. Age- and gene-dosage-dependent cre-induced abnormalities in the retinal pigment epithelium. American Journal of Pathology. 184 (6), 1660-1667 (2014).
- Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation. Journal of Neurophysiology. 70 (4), 1669-1680 (1993).
- Blaug, S., Quinn, R., Quong, J., Jalickee, S., Miller, S. S. Retinal pigment epithelial function: a role for CFTR. Documenta Ophthalmologica. 106 (1), 43-50 (2003).
- Gallemore, R. P., Griff, E. R., Steinberg, R. H. Evidence in support of a photoreceptoral origin for the "light-peak substance". Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (4), 566-571 (1988).
- Shahi, P. K., et al. Abnormal Electroretinogram after Kir7.1 Channel Suppression Suggests Role in Retinal Electrophysiology. Science Reports. 7 (1), 10651 (2017).
- Li, Y., et al. Mouse model of human RPE65 P25L hypomorph resembles wild type under normal light rearing but is fully resistant to acute light damage. Human Molecular Genetics. 24 (15), 4417-4428 (2015).
