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Chemistry

Electroretinograma de acoplamiento directo (DC-ERG) para registrar las respuestas eléctricas evocadas por la luz del epitelio del pigmento retinivo del ratón

doi: 10.3791/61491 Published: July 14, 2020
* These authors contributed equally

Summary

Aquí, presentamos un método para registrar las respuestas eléctricas evocadas por la luz del epitelio pigmentario de la retina (RPE) en ratones utilizando una técnica conocida como DC-ERGs descrita por primera vez por Marmorstein, Peachey y sus colegas a principios de la década de 2000.

Abstract

El epitelio pigmentario de la retina (RPE) es una monocapa especializada de células ubicadas estratégicamente entre la retina y los coriocapillaris que mantienen la salud general y la integridad estructural de los fotorreceptores. El RPE está polarizado, exhibiendo receptores o canales ubicados de manera apóptica y basal, y realiza el transporte vectorial de agua, iones, metabolitos y secreta varias citoquinas.

Las mediciones in vivo no invasivas de la función RPE se pueden realizar utilizando ERG de acoplamiento directo (DC-ERG). La metodología detrás del DC-ERG fue pionera por Marmorstein, Peachey y sus colegas utilizando un sistema de grabación de estimulación personalizado y más tarde demostrado utilizando un sistema disponible comercialmente. La técnica DC-ERG utiliza capilares de vidrio llenos de solución de sal tamponada de Hank (HBSS) para medir las respuestas eléctricas más lentas del RPE provocadas por cambios de concentración evocados por la luz en el espacio subretinal debido a la actividad del fotorreceptor. El prolongado estímulo de luz y la duración de la grabación DC-ERG lo hacen vulnerable a la deriva y al ruido, lo que resulta en un bajo rendimiento de grabaciones utilizables. Aquí, presentamos un método rápido y confiable para mejorar la estabilidad de las grabaciones al tiempo que reduce el ruido mediante el uso de la presión de vacío para reducir / eliminar las burbujas que resultan de la desgasificación del HBSS y el soporte del electrodo. Además, los artefactos de la línea de alimentación se atenúan mediante un regulador de voltaje/acondicionador de potencia. Incluimos los protocolos de estimulación de la luz necesarios para un sistema ERG disponible comercialmente, así como scripts para el análisis de los componentes DC-ERG: onda c, oscilación rápida, pico de luz y respuesta desactivada. Debido a la mayor facilidad de grabaciones y el flujo de trabajo de análisis rápido, este protocolo simplificado es particularmente útil para medir los cambios relacionados con la edad en la función de RPE, la progresión de la enfermedad y en la evaluación de la intervención farmacológica.

Introduction

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El epitelio pigmentario de la retina (RPE) es una monocapa de células especializadas que recuben el segmento posterior del ojo y ejercen funciones críticas para mantener la homeostasis retinal1. El RPE soporta fotorreceptores mediante la regeneración de su pigmento visual fotones-captura en un proceso llamado ciclo visual2,participando en la fagocitosis diurna del segmento exterior del cobertizo puntas3,y en el transporte de nutrientes y productos metabólicos entre fotorreceptores y los coriocapillaris4,5. Las anomalías en la función de la EPH subyacen a numerosas enfermedades de la retina humana, como la degeneración macular relacionada con la edad6,la amaurosis congénita de Leber7,8 y la mejor distrofia macular vitelliforma9. Como los tejidos oculares de los donantes a menudo son difíciles de obtener únicamente con fines de investigación, los modelos animales con modificaciones genéticas pueden proporcionar una forma alternativa de estudiar el desarrollo de enfermedades de la retina10,11. Además, la aparición y aplicación de la tecnología CRISPR cas9 permite ahora introducciones genómicas (knock-in) o eliminaciones (knock-out) en un proceso simple de un solo paso superando las limitaciones de las tecnologías de apuntamiento genético anterior12. La auge en la disponibilidad de los nuevos modelos deratón 13 requiere un protocolo de grabación más eficiente para evaluar de forma no invasiva la función RPE.

La medición de las respuestas eléctricas evocadas por la luz del RPE se puede lograr mediante una técnica de electrorretinograma de acoplamiento directo (DC-ERG). Cuando se utiliza en combinación con grabaciones ERG convencionales que miden las respuestas celulares del fotorreceptor (onda a) y bipolar (onda b)14, el DC-ERG puede definir cómo cambian las propiedades de respuesta del RPE con la degeneración de la retina15,16,17 o si la disfunción del RPE precede a la pérdida del fotorreceptor. Este protocolo describe un método adaptado del trabajo de Marmorstein, Peachey y sus colegas que desarrollaron por primera vez la técnica DC-ERG16,18,19,20 y mejora la reproducibilidad y facilidad de uso.

La grabación DC-ERG es difícil de realizar debido al largo tiempo de adquisición (9 min) durante el cual cualquier interrupción o introducción de ruido puede complicar la interpretación de los datos. La ventaja de este nuevo método es que las líneas de base alcanzan un estado estable en un período de tiempo más corto reduciendo la probabilidad de que el animal despierte prematuramente de la anestesia y sea menos propenso a la formación de burbujas en los electrodos capilares.

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Protocol

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Este protocolo sigue las pautas de cuidado animal descritas en el protocolo de estudio animal aprobado por el Comité de Cuidado y Uso Animal del Instituto Nacional del Ojo.

1. Importación de protocolos de estimulación de la luz para DC-ERG

NOTA: Siga las instrucciones a continuación para importar los protocolos de estimulación de la luz para el DC-ERG en el software del sistema ERG (Tabla de materiales). El protocolo consiste en un intervalo de pre-estímulo de 0,5 min, seguido de un paso de luz (10 cd/m2)durante 7 min, y terminando con un intervalo post-estímulo de 1,5 min. Se seleccionó la intensidad lumínica de 10 cd/m2 (1 log10 cd/m2)ya que evoca aproximadamente la mitad de la respuesta máxima para todos los componentes del DC-ERG en ratones WT18,21. La onda c y la oscilación rápida son de particular interés, ya que los orígenes de estas respuestas eléctricas están bien caracterizados y pueden aislarse y estudiarse más adelante en modelos de RPE in vitro (por ejemplo, iPSC-RPE). La aplicación de otras intensidades de luz puede extraer información adicional, por ejemplo, la respuesta off sufre una reversión de la polaridad en estímulos de luz más brillantes y puede mostrar diferencias en la intensidad a la que se produce esta reversión. El usuario es libre de cambiar la configuración de intensidad de la luz a su discreción.

  1. Abra el software del sistema ERG.
  2. Haga clic en Centro de base de datos.
  3. Haga clic en Nuevo (proporcione un nuevo nombre de archivo de base de datos). Haga clic en Guardar. El cuadro emergente mostrará: "Base de datos creada, ¿desea conectarse al nuevo archivo de base de datos." Haga clic en . El nombre de la base de datos actual ahora debe reflejar el nuevo nombre de archivo.
  4. Haga clic en Transferir en la ventana Centro de control de base de datos.
  5. Seleccione Archivo suplementario 1: LightProtocols - TRANSFER. EXP. Haga clic en Abrir.
  6. Haga clic en Cerrar (Centro de control de bases de datos) al finalizar la barra de progreso.
  7. Haga clic en el botón verde Inicio.
  8. Haga clic en Nuevo en la ventana Seleccionar paciente. Cree un nuevo nombre de familia de pacientes que describa el modelo de ratón, introduzca la fecha de nacimiento (DOB, mm/dd/aaaa), cambie el botón de género (M/F) a la descripción adecuada. Haga clic en Cerrar para guardar los detalles experimentales.
  9. Haga clic en Protocolos. Los protocolos ERG y DC-ERG adaptados a la oscuridad ahora deberían ser visibles.
  10. Por último, coloque el archivo Long Flash.col en la siguiente carpeta C:-Archivos de usuario de ERG-Long Flash.col.

2. Preparación del electrodo capilar

  1. Corte los capilares de vidrio de 1,5 mm por la mitad utilizando una baldosa de cerámica (Tabla de materiales) para puntuar el vidrio y romperlos limpiamente usando una mesa para proporcionar contrafuerza física y estabilizar el vidrio.
    NOTA: Desde con rodeos según sea necesario.
  2. El uso de un quemador Bunsen (Tabla de Materiales) permite que el calor haga una pequeña curva en el capilar mientras lo sostiene sobre la llama con fórceps.

3. Llenado de electrodos capilares

  1. Conecte el desecador de vacío a la línea de vacío del laboratorio a través de un filtro en línea(Tabla de materiales).
  2. Vierta 30 ml de la solución de sal equilibrada (HBSS) (tabla de materiales) de Hanks en un tubo cónico abierto de 50 ml y colóquelo (con la tapa quitada) en la cámara de vacío.
  3. Encienda el vacío y desgaste el HBSS mientras enciende el ordenador y el equipo de grabación.
  4. Después de 5o 201210 min apague el vacío y utilice el HBSS desgastado para llenar una jeringa de 12 ml a través de una aguja de 25 G conectada. Utilícelo para llenar las bases de los soportes de electrodos tomando precauciones adicionales para no introducir burbujas.
    1. Para ello, retire la tapa roscada del tornillo y deslice cuidadosamente la aguja de la jeringa a través de la junta de goma de silicona para llegar a la pared posterior (pellet de cloruro de plata/plata) del soporte.
      NOTA: Los pellets de cloruro de plata/plata son ventajosos sobre los soportes que utilizan alambre de plata, ya que proporcionan más superficie, lo que resulta en una línea de base estable de bajo ruido. Sin embargo, los pellets de cloruro de plata/plata requieren una interfaz líquida libre de burbujas de aire para lograr una buena conexión. Por lo tanto, tenga mucho cuidado de no introducir burbujas de aire durante este proceso.
    2. Inyecte gradualmente HBSS para llenar todo el microelectrodo mientras retrae lentamente la aguja de la jeringa. Vuelva a colocar la tapa roscada pero no apriete. Vuelva a insertar la aguja de la jeringa para llenar el espacio vacío dentro de la tapa con HBSS. A continuación, llene el capilar de vidrio mientras lo mantiene horizontal para evitar que la solución escape del otro extremo.
    3. Sujete el capilar de vidrio del extremo doblado e inserte lentamente el extremo opuesto a través de la tapa aflojada y luego apriete la tapa del tornillo en su lugar.
      NOTA: Los electrodos de vidrio llenos de HBSS mantienen la lubricación del ojo del ratón y evitan la deshidratación corneal que se produciría con el uso de electrodos de bucle de oro estándar.
  5. Coloque los soportes de electrodos con los electrodos capilares inclinados hacia arriba para permitir que las burbujas fluyan. Ejecuta el vacío durante 5.u201210 min para desgas. El escape de gas de las superficies de vidrio y plástico expulsará a HBSS de los soportes de electrodos.
  6. Deténgase y luego suelte lentamente el vacío. Rellene los soportes de electrodos y capilares de vidrio como se describió anteriormente.
    NOTA: Las burbujas tienden a acumularse en o cerca de la junta de goma de silicona y también pueden ocultarse en las ranuras de la tapa roscada, por lo tanto se debe prestar especial atención para mantener estas áreas libres de burbujas.
  7. Instale y asegure el soporte de microelectrodo en el soporte de junta de bolas magnéticas/T-clip hecho a medida(Figura 1A, inset). Para hacer el soporte personalizado para el soporte de microelectrodo, modifique un clip T (5/16"-11/32" OD Tubing) #8 (Tabla de Materiales) eliminando los clips poliacetales negros en un lado. Tener la base del cilindro de las juntas magnéticas de bolas mecanizadas por la mitad para ajustar la altura (Tabla de materiales). Fije los clips en T modificados a los tornillos de montaje de bolas magnéticas con tuercas de tamaño M3.
  8. Coloque el soporte de microelectrodo en el clip T modificado y sostén lo sostenga firmemente en su lugar deslizando en aproximadamente un mango de madera cónico de 1 pulgada hecho de romper un palo de limpieza con punta de algodón (Tabla de Materiales) en un ángulo. Utilice la base del cilindro del imán de tierras raras para colocar de forma segura el soporte del soporte de electrodo personalizado en la placa metálica del escenario, lo que permite una rotación de 360o en un eje de 180o.

4. Electrodos de prueba

  1. Vierta EL HBSS en un recipiente pequeño (por ejemplo, la tapa del tubo cónico de 50 ml).
  2. Baje suavemente los microelectrodos capilares llenos de HBSS completamente ensamblados en la tapa que contiene HBSS para preequilibrar los electrodos y colocar el electrodo de tierra de la aguja (cola/pierna trasera) y el electrodo de referencia de pellets sinterizado Ag/AgCl (boca) en el mismo HBSS para completar el circuito (Figura 1A).
    NOTA: Realice todos los pasos posteriores bajo luz roja tenue. Utilice una linterna de luz roja para colocar el ratón y los electrodos capilares. Recuerde apagar completamente todas las fuentes de luz antes de comenzar la grabación.
  3. Seleccione o cree un identificador adecuado (nombre de familia) para describir el mouse que se va a probar y seleccione el protocolo DC-ERG que se va a realizar completando el registro de acuerdo con el siguiente orden.
    1. Haga clic en Protocolos. Seleccione DC-ERG. Haga clic en Ejecutar. Aparecerá un cuadro de diálogo: "El paciente actual es XXX [DOB: XX/XX/XX) ¿Es esto correcto para la prueba que se está realizando?" Haga clic en . A continuación, proceda a "Paso 1/6."
  4. Cierra las puertas de la jaula de Faraday.
  5. Visualice el modo de impedancia haciendo clic en Impedancia y compruebe que los valores de la referencia de la boca, el suelo de cola y los electrodos de grabación son aceptables (consulte la figura 1B).
  6. Pruebe la estabilidad de línea base (ruido y deriva) haciendo clic en Paso (flecha hacia adelante) para seleccionar el Paso 4/6 "Flash Largo Sin Luz."
    NOTA: La cantidad de deriva observada cuando los electrodos se colocan en el baño HBSS es generalmente inferior a 500 v por 80 s una vez que se han estabilizado y es equivalente a la deriva observada cuando los electrodos están conectados al ratón. Por lo tanto, la lectura eléctrica de los electrodos en el baño HBSS son un indicador importante del estado de los electrodos. El ruido, medido como pico a pico, es generalmente de 10 u201215% mayor en el ratón que en el baño HBSS. Esto es probablemente debido a la adición de artefactos de movimiento de la respiración.
  7. Comience a ver los seguimientos haciendo clic en Vista previa. Las trazas deben ser de bajo ruido con una amplitud de pico a pico <200 V. Se acepta una ligera deriva (<500 v/80 s) que se desvanece gradualmente hasta la línea de base(Figura 1C).

5. Posicionamiento de ratón y electrodo

  1. Mantenga a los ratones durante la noche en una caja bien ventilada y apretada para una adaptación oscura.
  2. Anestesiar a los animales mediante inyección intraperitoneal de ketamina (80 mg/kg) y xilazina (8 mg/kg).
  3. Aplicar una gota de 0.5% proparacaína HCl tópicamente para anestesiar la córnea, así como una gota de 2.5% fenilefrina HCl y 0.5% tropicamida dilatar las pupilas.
  4. Recorte los bigotes de ratón con tijeras para evitar que los espasmos involuntarios molesten los electrodos capilares de vidrio durante la grabación.
    NOTA: El protocolo de estímulo DC-ERG dentro del sistema ERG tiene varias rutinas de estímulo integradas que se pueden seleccionar haciendo clic en el paso (flecha hacia adelante) o paso (flecha hacia atrás). Solo se requieren los pasos 1, 4 y 5 del software para preparar y realizar la grabación DC-ERG.
  5. En el software del sistema ERG verifique que el paciente correcto está seleccionado. Haga clic en el botón verde Protocolos. En Descripción del protocolo, seleccione DC-ERG. A continuación, haga clic en Ejecutar. Verifique que esta sea la prueba correcta que se está realizando haciendo clic en .
  6. Utilice el estímulo de luz roja designado para el paso 1/6 para encender la luz roja dentro de la cúpula para ayudar a colocar el ratón y los electrodos mientras observa los cambios en la impedancia.
  7. Coloque el ratón sobre una mesa de grabación calentada y coloque cuidadosamente la piel de la pierna trasera con fórceps. Sujete el electrodo de la aguja firmemente en una mano e insértelo por vía subcutánea en la pierna trasera para fijarlo en su lugar.
  8. Coloque el electrodo Ag/AgCl de referencia(Tabla de Materiales)dentro de la boca para que el pellet sinterado descanse a lo largo de la mejilla posterior y se mantiene en su lugar detrás de los dientes.
    NOTA: Los electrodos de alambre de oro no deben utilizarse como electrodo de referencia de boca, ya que tienen diferentes características de impedancia y aumentan el ruido de pico a pico.
  9. Antes de colocar los electrodos capilares en el ojo del ratón, sostenga el soporte del electrodo con el capilar de vidrio vertical, deslice el soporte del electrodo con el dedo índice para eliminar las burbujas que puedan haber sido introducidas. Llene la punta con HBSS con una aguja de 25 G unida a una jeringa e inspeccione para asegurarse de que no haya burbuja de aire atrapada en la punta. Coloque el soporte del soporte del electrodo de modo que la punta abierta de los capilares llenos de HBSS esté en contacto suave con la córnea.
  10. Tenga especial precaución para evitar la introducción de burbujas de aire sosteniendo el dispensador de gel para los ojos lubricante invertido y deseche las gotas iniciales. Coloque una gota de gel lubricante para los ojos en cada ojo para mantener la conductividad y evitar la desceración durante la grabación.

6. Grabación DC-ERG

  1. Haga clic en Paso (flecha hacia adelante) para seleccionar el Paso 4/6 "Largo Flash No Li."
  2. Haga clic en Impedancia. Utilice la pantalla Comprobación de impedancia para examinar las resistencias de los ojos izquierdo y derecho. Se espera que los valores de impedancia para los electrodos de grabación en cada ojo sean similares (39 ko). Se espera que los valores de impedancia tanto para los electrodos de tierra como para los electrodos de referencia sean inferiores a 10 ko).
  3. Haga clic en Vista previa para ver los rastros del ojo izquierdo y derecho. Espere a que se alcance una línea de base estable (<10 min). Haga clic en Detener para salir de la vista previa del seguimiento.
    NOTA: Los cambios bruscos en la dirección de deriva o el ruido aberrante en la grabación no mejorarán con el tiempo y requerirán identificar el electrodo capilar que requiere atención. La causa más probable es una burbuja introducida en la punta del electrodo. Rellene la punta con HBSS. Haga clic en Vista previa de nuevo para comprobar la línea base.
  4. Haga clic en Paso (flecha hacia adelante) para seleccionar el Paso 5/6 "Long Flash 10 cd 7 min."
  5. Haga clic en Ejecutar para iniciar la grabación(Figura 1D).

7. Exportación de datos

  1. Seleccione el "Paciente" (Nombre de la familia) que describe la grabación del ratón que se va a exportar.
  2. Haga clic en Pruebas antiguas.
  3. En Descripción del protocolo, seleccione DC-ERG. Haga clic en el botón verde Cargar para cargar los datos adquiridos anteriormente.
  4. Haga clic en Paso (flecha hacia adelante) para avanzar al paso 5/6 "Long Flash 10 cd 7 min."
  5. Haga clic en Exportar.
  6. Proporcione el nombre de archivo (por ejemplo, nombre de archivo.csv). Un nombre de archivo válido debe comenzar con una letra, seguido de letras, números o guiones bajos. No utilice caracteres especiales ni guiones. El programa de análisis de datos (DCERG_Analysis.exe) requiere que las entradas de tabla cumplan los requisitos para los nombres de variables.
  7. Coloque una marca de verificación junto a Tabla de datos. Junto al separador, seleccione Tabulador. Coloque las marcas de verificación situadas junto a Opciones (Títulos, Vertical), Incluir todo (Pasos, Chans , Resultados), Columnasde datos (Contenido, Resultados, Barridos) y Formato (Archivo).
  8. A continuación, haga clic en Exportar (Figura 1E). De este modo, se guarda el archivo *.csv en la carpeta C:-Multifocal.

8. Análisis de datos

  1. Descargue e instale el instalador en tiempo de ejecución adecuado (Tabla de materiales)
  2. Descargue e instale el instalador de DCERG_Analysis.exe.
    NOTA: Esto instala el script que realizará el análisis de los componentes DC-ERG y crea un acceso directo para ejecutar el programa en la carpeta Menú Inicio.
  3. Haga clic en el acceso directo creado en la carpeta Menú Inicio > Programas.
  4. Seleccione el archivo o archivos de datos exportados (*.csv) para el análisis. Utilice Ctrl + clic izquierdo en el ratón para seleccionar más de un archivo.
    NOTA: El archivo ejecutable genera dos tipos de trazados: 1) los datos sin procesar se trazan con una línea de ajuste mejor que indica la deriva medida; 2) la respuesta corregida de deriva se traza después de ser suavizada con una media móvil (con un lapso de 5 s). A partir de esta gráfica se identifican las amplitudes y el tiempo de pico de los componentes DC-ERG: onda c, oscilación rápida, pico de luz y respuesta desactivada. A continuación, los datos se exportan en formato de tabla para sobresalir, donde cada hoja corresponde a una grabación de ratón diferente. Estas hojas van seguidas de dos hojas de resumen: (i) amplitudes de DC-ERG compiladas (mV); (ii) tiempo de pico de DC-ERG compilados (inicio de luz, t a 0 min).

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Representative Results

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La Figura 2 es un conjunto de datos de muestra de miR-204 ko/ko cre/+ (KO condicional) y ratones de tipo salvaje (WT). MiR-204 ko/ko cre/+ son ratones con un nocaut condicional de microRNA 204 en el epitelio pigmentario de la retina. Estos ratones se generan cruzando ratones miR-204 con floxed (producidos por NEIGEF)22 con ratones VMD2-CRE23. MiR-204 se expresa en gran medida en el RPE donde regula la expresión de proteínas críticas para la función epitelial que mantienen una integridad de unión estrecha (por ejemplo, claudins), el mantenimiento de la homeostasis de potasio a través de la expresión de canales de potasio Kir 7.1, y la expresión de varios genes del ciclo visual (por ejemplo, LRAT, RPE65)24.

Dado que se notificó morfología anormal de RPE en varias líneas de ratón Cre específicas de RPE25,monitoreamos para la morfología normal de RPE en Cre expresando ratones con el fenotipo WT. Las anomalías estructurales y funcionales de la retina de ratón miR-204 ko/ko cre+ (KO condicional) se asemejan a las características encontradas en ratones nulos miR-20415 caracterizados por hiperfluorescencia (depósitos similares a lipofuscina) y una mayor microglia localizada en la superficie apical de RPE. En ratones nulos, estos cambios fueron acompañados de una disminución de las respuestas eléctricas evocadas por la luz del IH, con una alteración mínima de las respuestas de los fotorreceptores (evaluadas por ERG de la retina). Por lo tanto, también se espera que la perturbación de la expresión miR-204 en ratones miR-204 ko/ko cre/+ altere la respuesta eléctrica del RPE.

En el ejemplo presentado, se coloca un ratón en la plataforma calentada y los electrodos se colocan adecuadamente antes de bajar la cúpula. La impedancia y la deriva se comprueban como se describió anteriormente utilizando la solución de baño. Los resultados "negativos" representativos se muestran en la Figura 2A. En la Figura 2A (panel superior), el rastro sufre de burbujas di minutos en el electrodo que aumentan el ruido pico a pico en el trazo (sombreado en azul). En otro ejemplo(Figura 2A, panel inferior), cuando las burbujas se separan de la superficie del vidrio y se mueven a lo largo de la longitud del electrodo esto provoca cambios bruscos en la dirección de la deriva de línea de base que no se pueden compensar con la resta de deriva. La Figura 2B muestra grabaciones representativas "positivas" de ratones WT y miR-204 ko/ko cre/+ donde las burbujas han sido eliminadas utilizando la cámara de vacío antes de ensamblar los microelectrodos en los soportes del soporte del electrodo.

La mejor línea de ajuste a los 25 s iniciales (verde) se calcula y se muestra en azul (Figura 2B). Las respuestas corregidas por deriva se vuelven a trazar en la Figura 2C junto con la identificación de las amplitudes de los componentes DC-ERG. Utilizando la técnica DC-ERG descrita en este protocolo, los animales de las cepas WT y miR-204 ko/ko cre/+ se pueden registrar y analizar rápidamente.

La onda c se compone de dos componentes: una hiperpolarización de la membrana apical de RPE debido al aumento de la conductancia de potasio en respuesta a una disminución del potasio en el espacio subretiniano debido a la actividad del fotorreceptor y una contribución separada originada de las células de la retina interna (componente lento de P3 – reflejando la actividad de las células de M-ller). La oscilación rápida proporciona información sobre la hiperpolarización de la membrana basolateral RPE26, principalmente debido a cambios en la conductancia de un transportador Cl llamado regulador de conductancia transmembrana de fibrosis quística (CFTR)27. Se cree que el pico de luz se origina a partir de un cambio en la concentración de una sustancia accionada por fotorreceptores28 que a través de un segundo sistema de mensajería despolariza la membrana basolateral del RPE modulando la actividad de los canales dependientes de Ca2+ Cl21. Por último, la respuesta fuera de respuesta es una interacción compleja de respuestas que difieren en polaridad y varían con la intensidad de la luz18.

Como era de esperar, la expresión reducida de los canales Kir 7.1 K+ atenúa en gran medida la onda c29 y la oscilación rápida como se muestra en las respuestas promediadas en la Figura 2D,lo que indica un deterioro significativo de las propiedades eléctricas del RPE. En la Figura 2Ese proporciona un resumen de los cambios en los componentes del DC-ERG. Las amplitudes relativas de los componentes DC-ERG (normalizados a WT) se trazan contra las dos amplitudes de onda a evocadas por luz más grandes (1 cd-s/m2; 10 cd-s/m2) (normalizadas a WT) y se muestran en la Figura 2F-u2012H. La reducción de la respuesta a onda a la intensidad lumínica más brillante (10cd-s/m2) (Figura 2F-u2012H, Figura suplementaria S1A,B) sugiere un retraso en la recuperación de la sensibilidad debido a la insuficiencia del ciclo visual (por ejemplo, resultante de la reducción de la expresión LRAT o RPE65 como resultado de la expresión geno knockoutmica de miR-20424,300).

Figure 1
Figura 1: El diagrama resalta los pasos clave en el protocolo DC-ERG. (A) Imagen del circuito completado lograda bajando la grabación (microelectrodos capilares de vidrio), referencia y electrodos de tierra en la misma solución de baño. Esta configuración permite ejecutar pruebas preliminares (antes de anestesiar el ratón) para evaluar la impedancia característica, el ruido y la deriva. Inserción (arriba a la izquierda) que muestra un esquema de vista lateral del soporte de microelectrodo personalizado. (B) Imagen representativa del modo de comprobación de impedancia que muestra los valores adecuados para las impedancias de electrodos. La impedancia en los electrodos del ojo izquierdo y derecho debe ser comparable, dentro de 5 Ko entre sí (por ejemplo, Ojo izquierdo: 38,7 Ko frente a Ojo derecho: 40,36 Ko). La impedancia del electrodo de referencia de la boca debe ser inferior a 1 K, mientras que el electrodo de cola debe ser de alrededor de 2,5 K. (C) Se muestra la imagen representativa del seguimiento de vista previa (paso 4/6). Paso 4 (Flash largo sin luz) se selecciona ya que no se entrega ninguna luz durante la vista previa de este paso. Las trazas deben ser de bajo ruido y pueden tener una ligera deriva que se desvanece gradualmente con el tiempo hasta la línea de base. Una vez que las trazas han logrado una deriva constante en ambos canales y se vuelven relativamente planas, la grabación real puede comenzar. (D) Usando el Paso 5/6 (Long Flash 10 cd 7 min) después de 0.5 min de oscuridad, un paso de luz de 10 cd/m2 se entrega al ratón durante 7 minutos seguido de un retorno a la oscuridad durante 1.5 min . (E) Imagen de los parámetros de exportación utilizados para convertir los datos a un *.csv archivo. Este formato preciso es necesario para ejecutar el software de análisis DC-ERG. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Seguimientos representativos y flujo de trabajo del análisis DC-ERG. Imagen de un resultado negativo de DC-ERG que muestra un ruido de pico a pico(A)y (A, panel inferior). (B) Imágenes de la grabación dc-ERG positiva resultan de un ratón WT y miR-204 ko/ko cre/+. Gráficas generadas de los trazos en bruto que muestran las mejores líneas de ajuste (azul) a los 25 s iniciales (verde) antes del inicio de la luz. (C) Gráficas de las respuestas DC-ERG corregidas por deriva para los ratones WT y miR-204 ko/ko cre/+ mostrados en B. Las amplitudes de los componentes del DC-ERG se indican en la leyenda. (D) Promedio de respuestas DC-ERG de 3-8 meses de edad WT (n a 6) y miR-204 ko/ko cre/+ (n a 6) ratones. Los componentes DC-ERG están etiquetados en la traza WT y los parámetros de estimulación de la luz se definen a continuación. (E) Resumen de los componentes DC-ERG tomados de grabaciones de ratones WT y miR-204 ko/ko cre/+. Los trazados de barras representan la media, las barras de error indican un error estándar. Las amplitudes relativas de la(F) onda c, (G) oscilación rápida, y (H) apagado respuesta se trazan contra las dos amplitudes de onda a evocadas por luz más grandes (1 cd s/m2; 10 cd s/m2) (normalizado a WT). La importancia se indica con asteriscos: (Prueba t del estudiante; * á p < 0,05, ** á p < 0,01, *** a p < 0,001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Respuestas ERG de ratones WT y miR-204 ko/ko cre/+. (A) Respuestas de ratones WT (negro) y miR-204 ko/ko cre/+ (magenta) a destellos de 4 ms de luz de intensidad creciente: 0.0001 cd-s/m2 (n a 5), 0,001 cd-s/m2 (n a 5), 0,01 cd-s/m2 (n a 3), 0,1 cd s/m 2 (n a 3), 1 cd-s/m2 (n a 3), 10 cd-s/m2 (n á 2). (B) Amplitud de onda media trazada contra la intensidad del flash. (C) Amplitud media de onda b trazada contra la intensidad del flash. (D) Tiempo medio de respuestas de onda en forma de onda trazadas contra la intensidad del flash. (E) Tiempo medio de respuestas de onda b trazadas contra la intensidad del flash. Para todas las gráficas mostradas las barras de error indican SEM. Importancia se indica con asteriscos: (Prueba t del estudiante; * p < 0.05). Haga clic aquí para descargar esta figura.

Figura suplementaria 2: Ejemplo de un desplazamiento de CC en la línea de alimentación que se puede mitigar con el uso de un regulador de voltaje / acondicionador de potencia. (A) En ausencia de picos de tensión de regulación de voltaje (causados por el uso de equipos en una habitación adyacente, por ejemplo, OCT) generan un desplazamiento de CC que puede interferir con la medición de los componentes DC-ERG, especialmente el pico de luz. El desplazamiento disruptivo se magnifica a la derecha. (B) Con el regulador de voltaje/acondicionador de potencia activado el pico inicial sigue siendo notable, pero se elimina el D-offset dañino. El efecto del regulador de voltaje/acondicionador de potencia se magnifica y se muestra a la derecha. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Archivos suplementarios. Haga clic aquí para descargar estos archivos.

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Discussion

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Pasos críticos

Una buena grabación DC-ERG requiere electrodos estables que están libres de burbujas que crean artefactos y deriva no deseada, ya que son extremadamente sensibles a la desgasificación y los cambios de temperatura. Es esencial que se alcance una línea de base estable cuando los electrodos se colocan en la solución de baño HBSS antes de continuar con la grabación del ratón. Las pequeñas burbujas tienden a acumularse en la base del electrodo capilar o alrededor de la junta de silicona y son difíciles de ver una vez que el soporte del electrodo está completamente montado. Cuando hay pocas burbujas presentes, parpadeando ligeramente el soporte las liberará para su eliminación. Si hay demasiadas burbujas o la deriva o el ruido no se pueden eliminar, a menudo es mejor desmontar el electrodo y empezar de nuevo mientras se inspecciona cuidadosamente si hay burbujas en cada paso del proceso.

Modificaciones y solución de problemas

Las siguientes personalizaciones se pueden realizar a la configuración (Tabla de materiales) con el fin de mejorar la fidelidad de las grabaciones DC-ERG. Los cables de bajo ruido para soportes de microelectrodos se pueden utilizar para extender los cables existentes desde el amplificador de 32 bits a la mesa de grabación. La longitud adicional permite la colocación cuidadosa y el ajuste del soporte del electrodo sin perturbar su posición una vez que la cúpula de Ganzfeld está cerrada. Se puede utilizar un regulador de voltaje/acondicionador de potencia para eliminar el ruido en línea y las sobretensiones de potencia generadas por luces o equipos en habitaciones adyacentes que se encienden y apagan (Figura S2). Además, el estimulador de cúpula Ganzfeld de mesa y el amplificador de 32 bits se pueden colocar dentro de una jaula Faraday conectada a tierra a la barra de tierra del edificio para proteger contra cualquier ruido eléctrico adicional.

Limitaciones del método

El DC-ERG sólo se puede registrar fielmente en animales adaptados oscuros, lo que significa que una vez que se enciende el estímulo de la luz hay poco que se puede hacer para eliminar potenciales indeseables o deriva. Otra limitación es que la polaridad de algunos de los componentes del DC-ERG (pico de luz, fuera de respuesta) está sujeta a la intensidad de luz utilizada16. Esto significa que las mayores desviaciones de WT pueden ocurrir a intensidades no inherentemente presentes en la intensidad de la luz que utiliza este protocolo (10 cd/m2). Hasta este punto, el software de análisis DC-ERG fue diseñado asumiendo una respuesta negativa fuera de respuesta (un mínimo de respuesta). Las intensidades de luz más brillantes que dan como resultado la inversión de la polaridad de la respuesta desactivada requerirán la necesidad de modificar el archivo de script de análisis incluido.

Significado

El RPE participa en el mantenimiento homeostático del entorno de la retina y desempeña un papel crítico en la patología de varias enfermedades de la retina. Este método explica en detalle cómo configurar un sistema DC-ERG para registrar la respuesta eléctrica RPE que cuando se realiza en conjunto con las grabaciones ERG convencionales proporciona una medida objetiva de la función externa de retina y RPE. Estas medidas de la funcionalidad de RPE se pueden utilizar para evaluar líneas transgénicas de ratón que muestran fenotipos degenerativos o para probar la eficacia de los fármacos o la citotoxicidad inducida por fármacos para el RPE.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por los fondos intramuros de NEI. Los autores reconocen sinceramente al Dr. Sheldon Miller por su orientación científica, asesoramiento técnico y experiencia en fisiología y enfermedades de RPE. Los autores agradecen a Megan Kopera y al personal de cuidado de animales por administrar las colonias de ratones, y al Dr. Tarun Bansal, Raymond Zhou y Yuan Wang por el apoyo técnico.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ag/AgCl (mouth) Electrode WPI Inc EP1 Mouth reference electrode for mouse
Ceramic Tile Sutter Instrument CTS Used to cut the glass capillary tube to an appropriate size
Cotton Tipped Cleaning Stick Puritan Medical Products 867-WC No Glue To be used as a spacer to improve the fit of the electrode holder assembly
Electroretinogram (ERG) System Diagnosys LLC E3 System Visual electrophysiology system to diagnose ophthalmic conditions in vision research and drug trials
Bunsen Burner Argos Technologies BW20002460 Or equivlaent to shape glass under flame
Glass Capillary Tube (1.5 mm) Sutter Instruments BF150-75 For filling with HBSS and making contact to the cornea
Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) Thermo Fisher Scientific Inc 14175-095 Commercially available. Maintain at RT
In-Line Filter Whatman 6722-5001 To protect vacuum pump from aerosols
Low Noise Cable for Microelectrode Holders WPI Inc 5372 Suggested for improving the length and placement of the cables and electrode holder assemblies
Magnetic Ball Joint WPI Inc 500871 For magnetically positioning the electrode holder assembly on the stage
MatLab Mathworks MatLab: For editing the analysis software
MatLab Curvefit Toolbox Mathworks Toolbox for MatLab (only required for editing the analysis software)
MatLab Compiler Mathworks Toolbox for MatLab (only required for editing and re-releasing the analysis software)
MatLab Runtime version 9.5 Mathworks R2018b (9.5) Required to run the analysis software: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html
Microelectrode Holders (45 degrees) WPI Inc MEH345-15 For holding the capillaries
Needle (25 ga) Covidien 8881250313 For filling the capillary tubes with HBSS
Needle (ground) Electrode Rhythmlink 13mm - one elctrode Subdermal needle electrode (ground) for mouse (13mm long, 0.4mm diameter needle, 1.5m leadwire)
Regulator/Power Conditioner Furman P-1800 Or equivalent to remove DC-offset from noise introduced through power line
Syringe (12 mL) Monoject 1181200777 For filling the capillary tubes with HBSS
T-clip Cole-Parmer 06852-20 For electrode holder assembly
Vacuum Desiccator Bel-Art 420120000 Clear polycarbonate bottom & cover
Pharmacological treatment
Lubricant eye gel Alcon 0078-0429-47 Helps lubricate corneal surface and maintain electrical contact with capillary electrodes
Phenylephrine Hydrochloride 2.5% Akorn 17478-201-15 Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation)
Proparacaine Hydrochloride 0.5% Akorn 17478-263-12 Local anesthetic for ophthalmic instillation
Tropicamide 0.5% Akorn 17478-101-12 Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation)
Xylazine AnaSed sc-362949Rx Analgesic and muscle relaxant
Zetamine (Ketamine HCl) VetOne 501072 Anesthetic for intramuscular injections

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References

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Electroretinograma de acoplamiento directo (DC-ERG) para registrar las respuestas eléctricas evocadas por la luz del epitelio del pigmento retinivo del ratón
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Miyagishima, K. J., Zhang, C., Malechka, V. V., Bharti, K., Li, W. Direct-Coupled Electroretinogram (DC-ERG) for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (161), e61491, doi:10.3791/61491 (2020).More

Miyagishima, K. J., Zhang, C., Malechka, V. V., Bharti, K., Li, W. Direct-Coupled Electroretinogram (DC-ERG) for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (161), e61491, doi:10.3791/61491 (2020).

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