Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Mouse Retinal Pigment Epitelinin Işık Uyarılmış Elektriksel Tepkilerini Kaydetmek için Doğrudan Birleştirilmiş Elektroretinogram (DC-ERG)

doi: 10.3791/61491 Published: July 14, 2020
* These authors contributed equally

Summary

Burada, ilk olarak Marmorstein, Peachey ve meslektaşları tarafından 2000'li yılların başında tanımlanan DC-ERGs olarak bilinen bir tekniği kullanarak farelerde retina pigment epitelinin (RPE) ışık uyarılmış elektriksel tepkilerini kaydetmek için bir yöntem saklı tutuyoruz.

Abstract

Retina pigmentepiteli (RPE), fotoreseptörlerin genel sağlığını ve yapısal bütünlüğünü koruyan retina ve korokapiller arasında stratejik olarak bulunan özel bir tek hücre katmanıdır. RPE polarize, apically ve bazal bulunan reseptörleri veya kanalları sergileyen, ve su vektörel taşıma gerçekleştirir, iyonlar, metabolitler, ve çeşitli sitokinler salgılar.

RPE fonksiyonunun in vivo noninvaziv ölçümleri doğrudan birleşen ERG'ler (DC-ERGs) kullanılarak yapılabilir. DC-ERG arkasındaki metodoloji Marmorstein, Peachey ve meslektaşları tarafından özel olarak inşa edilmiş bir stimülasyon kayıt sistemi kullanılarak öncülük edildi ve daha sonra ticari olarak kullanılabilir bir sistem kullanılarak gösterdi. DC-ERG tekniği, fotoreseptör aktivitesi nedeniyle alt retinal alandaki ışık uyarılmış konsantrasyon değişikliklerinden kaynaklanan RPE'nin yavaş elektriksel tepkilerini ölçmek için Hank'in tamponlu tuz çözeltisi (HBSS) ile dolu cam kılcal damarlar kullanır. Dc-ERG kaydının uzun süreli ışık uyaranları ve uzunluğu, onu sürüklenmeye ve gürültüye karşı savunmasız hale getirerek kullanılabilir kayıtların düşük verimine neden olur. Burada, HBSS ve elektrot tutucunun gaz dan kaynaklanan kabarcıkları azaltmak/ortadan kaldırmak için vakum basıncı nı kullanarak gürültüyü azaltırken kayıtların stabilitesini artırmak için hızlı ve güvenilir bir yöntem salıyoruz. Ayrıca, güç hattı eserler bir voltaj regülatörü / güç kremi kullanılarak zayıflatılır. Ticari olarak kullanılabilen bir ERG sistemi için gerekli ışık stimülasyon protokollerini ve DC-ERG bileşenlerinin analizi için komut dosyalarını içeririz: c-dalgası, hızlı salınım, ışık tepe ve kapalı yanıt. Kayıtların kolaylığı ve hızlı analiz iş akışı nedeniyle, bu basitleştirilmiş protokol özellikle RPE fonksiyonunda yaşa bağlı değişikliklerin ölçülmesinde, hastalığın ilerlemesinde ve farmakolojik müdahalenin değerlendirilmesinde yararlıdır.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Retina pigment epitel (RPE) gözün arka segmentinde çizgi ve retinahomestaz korumak için kritik fonksiyonlar uygulamak özel hücrelerin bir monolayerolduğunu 1. RPE görseldöngü2 denilen bir süreç içinde foton yakalama görsel pigment rejenerasyon tarafından fotoreseptörleri destekler , dış segment ipuçları döken diurnal fagositoz katılarak3, ve fotoreseptörler ve koryokapiller arasında besin ve metabolik ürünlerin taşınmasında 4,5. RPE fonksiyonundaki anormallikler yaşa bağlı makula dejenerasyonu6,Leber'in konjenital amaurosis7,8 ve En İyi vitelliform makula distrofisi9gibi çok sayıda insan retinası hastalığının altında yatan. Donör göz dokuları genellikle araştırma amaçlı sadece elde etmek zor olduğundan, genetik modifikasyonlar ile hayvan modelleri retina hastalıklarının gelişimini incelemek için alternatif bir yol sağlayabilir10,11. Ayrıca, CRISPR cas9 teknolojisinin ortaya çıkması ve uygulanması artık genomik tanıtımlara (knock-in) veya silmelere (knock-out) önceki gen hedefleme teknolojilerinin sınırlamalarını aşan basit, tek adımlı bir süreçte izin vermektedir12. Yeni fare modelleri13 kullanılabilirliği patlama non-invaziv RPE işlevini değerlendirmek için daha verimli bir kayıt protokolü gerektirir.

RPE'nin ışık uyarılmış elektriksel tepkilerinin ölçümü doğrudan birleştirilmiş elektroretinogram (DC-ERG) tekniği ile sağlanabilir. Fotoreseptör (a-dalga) ve bipolar (b-dalga) hücre yanıtlarını ölçen geleneksel ERG kayıtları ile birlikte kullanıldığında14, DC-ERG retinadejenerasyon15ile RPE değişim nasıl tanımlayabilirsiniz,16,17 veya RPE disfonksiyonu fotoreseptör kaybı öncesinde olup olmadığını. Bu protokol, Marmorstein, Peachey ve ilk DC-ERG tekniği 16 ,18,19,20 geliştirilen meslektaşlarının çalışmalarından uyarlanmış bir yöntem açıklar ve tekrarlanabilirlik ve kullanım kolaylığı üzerine geliştirir.

DC-ERG kaydının, herhangi bir kesintinin veya gürültünün tanıtılmasının verilerin yorumlanmasını zorlaştırabileceği uzun satın alma süresi (9 dk) nedeniyle gerçekleşme zordur. Bu yeni yöntemin avantajı, taban çizgilerinin hayvanın anesteziden erken uyanma olasılığını azaltarak ve kılcal elektrotlarda kabarcık oluşumuna daha az yatkın olma olasılığını azaltarak daha kısa bir süre içinde sabit bir duruma ulaşmasıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu protokol, Ulusal Göz Enstitüsü Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan hayvan çalışma protokolünde belirtilen hayvan bakım yönergelerini izler.

1. DC-ERG için ışık stimülasyon protokollerinin ithal edilmesi

NOT: DC-ERG ışık stimülasyon protokollerini ERG sistem yazılımına(Malzeme Tablosu)almak için aşağıdaki yönergeleri izleyin. Protokol 0,5 dk ön uyaran aralığından oluşur, ardından 7 dk için bir ışık (10 cd/m2)ve 1,5 dk uyarıcı sonrası aralıkla sona erdir. 10 cd/m2 ışık yoğunluğu (1 log10 cd/m2)WT farelerde DC-ERG'nin tüm bileşenleri için maksimal tepkinin yaklaşık yarısını çağrıştırdığından seçildi18,21. Bu elektriksel yanıtların kökenleri iyi karakterize ve izole edilebilir ve daha fazla in vitro RPE modelleri (örneğin, iPSC-RPE) incelenebilir gibi c-dalga ve hızlı salınım özellikle ilgi vardır. Diğer ışık yoğunluklarının uygulanması ek bilgi ayıklayabilir, örneğin, kapalı tepki parlak ışık uyaranlarında polaritenin tersine dönmesine uğrar ve bu geri dönüşün gerçekleştiği yoğunlukta farklılıklar gösterebilir. Kullanıcı kendi takdirine bağlı olarak ışık yoğunluğu ayarlarını değiştirmekte serbesttir.

  1. ERG sistem yazılımını açın.
  2. Veritabanı Merkezi'netıklayın.
  3. Yeni'yi tıklatın (yeni bir veritabanı dosya adı sağlayın). Kaydet'etıklayın. Açılır pencere görüntülenir: "Veritabanı oluşturuldu, yeni veritabanı dosyasına bağlanmak istiyor musunuz." Evet'etıklayın. Geçerli veritabanı adı artık yeni dosya adını yansıtmalıdır.
  4. Veritabanı Denetim Merkezi Penceresinde Niçin Aktar'ı tıklatın.
  5. Ek Dosya 1: LightProtocols - TRANSFER'i seçin. EXP. Aç'atıklayın.
  6. İlerleme çubuğu tamamlandıktan sonra Kapat 'a (Veritabanı Denetim Merkezi) tıklayın.
  7. Yeşil Başlat düğmesine tıklayın.
  8. Hasta Seç Penceresinde Yeni'ye tıklayın. Fare modelini açıklayan yeni bir hasta aile adı oluşturun, doğum tarihini girin (DOB, mm/dd/yyyy), cinsiyet (M/F) düğmesini uygun açıklamaya takla. Deneysel ayrıntıları kaydetmek için Kapat'a tıklayın.
  9. Protokoller'etıklayın. Karanlık uyarlanmış ERG ve DC-ERG protokolleri artık görünür olmalıdır.
  10. Son olarak, Uzun Flash.col dosyasını aşağıdaki klasöre yerleştirin C:\ERG Kullanıcı Dosyaları\Uzun Flash.col.

2. Kılcal elektrot hazırlama

  1. 1,5 mm'lik cam kılcal damarları seramik karo(Malzeme Tablosu)kullanarak ikiye bölün ve camın fiziksel karşı güç sağlamak ve camını stabilize etmek için bir masa kullanarak temiz bir şekilde kırın.
    NOT: Blunt kesme gerektiği gibi biter.
  2. Bir Bunsen brülör kullanarak(Malzeme Tablosu)Forceps ile alev üzerinde tutarken ısı kılcal küçük bir viraj yapmak için izin verir.

3. Kapiller elektrotların doldurulması

  1. Vakum kurutucuyu laboratuvar vakum hattına bir satır içi filtre(Malzeme Tablosu)ile bağlayın.
  2. Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi'nden (HBSS) (Malzeme Tablosu) 30 mL'lik kısmını açık 50 mL konik bir boruya dökün ve vakum odasına (kapak çıkarılmış şekilde) yerleştirin.
  3. Bilgisayarı ve kayıt ekipmanını açarken vakumu açın ve HBSS'yi gazdan arındırın.
  4. 5\u201210 dk sonra vakum kapatın ve eklenmiş bir 25 G iğne ile 12 mL şırınga doldurmak için gazsız HBSS kullanın. Kabarcıklar tanıtmak için ekstra önlem alarak elektrot sahiplerinin tabanları doldurmak için kullanın.
    1. Bunu yapmak için, dişli vida kapağını çıkarın ve şırınga iğnesini silikon kauçuk contanın içinden geçirerek tutucunun arka duvarına (gümüş/gümüş klorür peleti) ulaşın.
      NOT: Gümüş/gümüş klorür peletleri, daha fazla yüzey alanı sağladığından gümüş tel kullanan tutuculara göre avantajlıdır ve bu da düşük gürültülü sabit bir taban çizgisi sağlar. Ancak, gümüş / gümüş klorür pelet iyi bir bağlantı elde etmek için hava kabarcıkları ücretsiz bir sıvı arayüzü gerektirir. Bu nedenle, bu işlem sırasında hava kabarcıkları tanıtmak için büyük özen.
    2. Şırınga iğnesini yavaşça geri çekerken tüm mikroelektrotı doldurmak için HBSS'yi yavaş yavaş enjekte edin. Dişli kapağı yeniden takın, ancak sıkmayın. HbSS ile kap içindeki boş alanı doldurmak için şırınga iğnesini yeniden yerleştirin. Daha sonra çözeltinin diğer ucundan kaçmasını önlemek için yatay tutarken cam kılcal damarı doldurun.
    3. Bükülmüş ucundan cam kılcal tutun ve yavaş yavaş gevşetilmiş kapak üzerinden ters ucunu takın ve sonra yerine vida kapağı sıkın.
      NOT: HBSS ile dolu cam elektrotlar farenin gözünün yağlamasını korur ve standart altın döngü elektrotlarının kullanımı ile oluşacak kornea dehidratasyonunu önler.
  5. Kabarcıkların dışarı akmasını sağlamak için elektrot tutucuları yukarı doğru eğilmiş kılcal elektrotlarla yerleştirin. Degas için 5\u201210 dk için vakum çalıştırın. Cam ve plastik yüzeylerden kaçan gaz HBSS'yi elektrot tutucularından dışarı itecektir.
  6. Durun ve sonra yavaşça vakum bırakın. Elektrot tutucuları ve cam kılcal damarları daha önce açıklandığı gibi yeniden doldurun.
    NOT: Kabarcıklar silikon kauçuk conta üzerinde veya yakınında toplamak eğilimindedir ve aynı zamanda dişli kapağın oluklar gizleyebilirsiniz, bu nedenle özel dikkat bu alanlarda kabarcıksız tutmak için ödenmelidir.
  7. Mikroelektrot tutucuyu özel yapım T-klips/Manyetik bilyalı eklem standına(Şekil 1A, inset) takın ve sabitleştirin. Mikroelektrot tutucu için özel stand yapmak için, bir tarafta siyah poliasettal klipsleri kaldırarak bir T-klips (5/16"-11/32" OD Tüp) #8(Malzeme Tablosu)değiştirin. Manyetik top eklemlerinin silindir tabanının yüksekliği ayarlamak için yarıya indirilmiş olmasını sağlar(Malzeme Tablosu). Modifiye Edilmiş T klipslerini M3 boyutlu somunlarla manyetik top montaj vidalarına sabitle.
  8. Mikroelektrot tutucuyu modifiye edilmiş T-klipsin içine yerleştirin ve pamuk uçlu bir temizleme çubuğunun(Malzeme Tablosu)kırılmasından yapılmış yaklaşık 1 inçkonik ahşap sapı bir açıyla kaydırarak sıkıca yerinde tutun. Özelleştirilmiş elektrot tutucu standını 180° eksende 360° döndürme sağlayan sahnenin metal plakasına güvenli bir şekilde konumlandırmak için nadir toprak mıknatıslı silindir tabanını kullanın.

4. Test elektrotları

  1. HBSS'yi küçük bir kap içine dökün (örn. 50 mL konik tüpün kapağı).
  2. Elektrotları önceden dengelemek ve iğne toprak elektrotunu (kuyruk/arka bacak) ve Ag/AgCl sinterlenmiş pelet referans elektrotunu (ağız) devreyi tamamlamak için aynı HBSS'ye yerleştirmek için HBSS içeren kapağın içine hbss dolgulu kılcal mikroelektrotları yavaşça indirin(Şekil 1A).
    NOT: Loş kırmızı ışık altında sonraki tüm adımları gerçekleştirin. Fareyi ve kılcal elektrotları konumlandırmak için kırmızı ışıklı el feneri kullanın. Kayıt başlamadan önce tüm ışık kaynaklarını tamamen kapatmayı unutmayın.
  3. Test edilecek fareyi tanımlamak için uygun bir tanımlayıcı (aile adı) seçin ve aşağıdaki sıraya göre kaydı tamamlayarak gerçekleştirilecek DC-ERG protokolünü seçin.
    1. Protokoller'etıklayın. DC-ERG'yiseçin. Çalıştır'atıklayın. Bir iletişim kutusu açılır: "Mevcut hasta XXX [DOB: XX /XX/XX) Bu test yapılması için doğru mu?" Evet'etıklayın. Daha sonra "Adım 1/6"ya geçin.
  4. Faraday kafesinin kapılarını kapatın.
  5. Empedans'a tıklayarak empedans modunu görüntüleyin ve ağız referansı, kuyruk zemini ve kayıt elektrotlarının değerlerinin kabul edilebilir olduğunu doğrulayın (Bkz. Şekil 1B).
  6. Adım 4/6 "Uzun Flaş No Light" seçmek için Adım (ileri ok) tıklayarak taban çizgisi kararlılığını (gürültü ve sürüklenme) test edin.
    NOT: Elektrotlar HBSS banyosuna yerleştirildiğinde gözlenen sürüklenme miktarı, stabilize edildikten sonra 80 s'de genellikle 500 μV'den daha azdır ve elektrotlar fareye bağlandığında gözlenen sürüklenmeye eşdeğerdir. Bu nedenle HBSS banyosundaki elektrotların elektriksel olarak okunması elektrotların durumunun önemli bir göstergesidir. Tepeden tırnama olarak ölçülen gürültü genellikle ~ 10\u201215% HBSS banyo daha fare daha büyüktür. Bu muhtemelen nefes hareket eserlerinin eklenmesi nedeniyle.
  7. Önizleme'yetıklayarak izlemeleri görüntülemeye başlayın. İzler, tepeden tırnağa genlik <200 μV ile düşük gürültülü olmalıdır. Yavaş yavaş taban çizgisine doğru solan hafif bir sürüklenme (<500 μV/80 s) kabul edilebilir (Şekil 1C).

5. Fare ve elektrot konumlandırma

  1. Fareleri karanlık adaptasyon için iyi havalandırılmış, ışık geçirmez bir kutuda bir gecede saklayın.
  2. Ketamin intraperitoneal enjeksiyon (80 mg /kg) ve ksilazin (8 mg/kg) ile hayvanları anestezik.
  3. Korneayı anestezik etmek için %0.5 proparacaine HCl damlası, gözbebeklerini dilate etmek için %2.5 fenilefrin HCl ve %0.5 tropikamid uygulayın.
  4. Kayıt sırasında cam kılcal elektrik elektrotları rahatsız önlemek için yanlışlıkla seğirme önlemek için makasla fare bıyıkları kırpın.
    NOT: ERG sistemi içindeki DC-ERG uyarıcı protokolü, Step (ileri ok) veya Step (geri ok) tıklayarak seçilebilecek birkaç yerleşik uyarıcı yordamı vardır. DC-ERG kaydını hazırlamak ve gerçekleştirmek için yazılımdaki yalnızca 1, 4 ve 5 adımları gereklidir.
  5. ERG sistem yazılımında doğru hastanın seçildiğini doğrulayın. Yeşil Protokoller düğmesine tıklayın. Protokol Açıklaması altında DC-ERG'yi seçin. Ardından Çalıştır'atıklayın. Evet'etıklayarak bunun doğru test olduğunu doğrulayın.
  6. Empedanstaki değişiklikleri gözlemlerken fareve elektrotları konumlandırmaya yardımcı olmak için kubbenin içindeki kırmızı ışığı açmak için Adım 1/6 belirlenmiş Kırmızı Işık uyarıcısını kullanın.
  7. Fareyi ısıtmalı bir kayıt masasına yerleştirin ve forceps kullanarak arka bacağın derisini dikkatlice çadırkurun. İğne elektrodu bir elinizle sıkıca tutun ve yerine sabitlemek için arka baceğe deri altına yerleştirin.
  8. Referans Ag/AgCl elektrotunu(Malzeme Tablosu)ağzın içine yerleştirin, böylece sinterlenmiş pelet arka yanak boyunca durun ve dişlerin arkasında yerinde tutulur.
    NOT: Altın tel elektrotlar ağız referans elektrodu olarak kullanılmamalıdır, çünkü farklı empedans özelliklerine sahiptirler ve tepeden tepeye gürültüyü arttırırlar.
  9. Farenin gözüne kılcal elektrotlar yerleştirmeden önce, cam kılcal damarlar dikey elektrot tutucu tutun, tanıtıldı olabilir herhangi bir kabarcıklar kaldırmak için işaret parmağı ile elektrot tutucu flick. Ucunu şırıngaya bağlı 25 G iğne kullanarak HBSS ile doldurun ve ucunda sıkışmış hava kabarcığı olmadığından emin olun. Elektrot tutucu duruşunu, HBSS dolgulu kılcal damarların açık ucunukorayla hassas bir şekilde temas edebilecek şekilde yerleştirin.
  10. Yağlayıcı göz jeli dağıtıcısını ters tutarak hava kabarcıklarının ortaya konmasını önlemek için özel önlem alın ve ilk damlaları atın. İletkenliği korumak ve kayıt sırasında kurutmayı önlemek için her göze bir damla yağlayıcı göz jeli yerleştirin.

6. DC-ERG kaydı

  1. Adım 4/6 "Uzun Flash No Li" seçmek için Adım (ileri ok) tıklayın.
  2. Empedancetıklayın. Sol ve sağ gözlerin dirençlerini incelemek için Empedans Kontrol ekranını kullanın. Her gözdeki kayıt elektrotlarının empedans değerlerinin benzer olması beklenmektedir (~39 kΩ). Hem zemin hem de referans elektrotlar için empedans değerlerinin 10 kΩ'den az olması beklenmektedir).
  3. Sol ve sağ gözün izlerini görüntülemek için Önizleme'yi tıklatın. Kararlı bir taban çizgisinin elde edilebisini bekleyin (<10 dk). İzleme önizlemesini çıkmak için Durdur'a tıklayın.
    NOT: Kayıttaki sürüklenme yönündean ani değişiklikler veya anormal gürültü zamanla düzelmez ve dikkat gerektiren kılcal elektrotun tanımlanmasını gerektirir. En olası nedeni elektrot ucuna tanıtılan bir kabarcık olduğunu. Ucu HBSS ile doldurun. Taban çizgisini kontrol etmek için Önizleme'yi yeniden tıklatın.
  4. Adım 5/6 "Uzun Flash 10 cd 7 dk" seçmek için Adım (ileri ok) tıklayın.
  5. Kaydı başlatmak için Çalıştır'ı tıklatın (Şekil 1D).

7. Veri ihracatı

  1. Dışa aktabilmek için fare kaydını açıklayan "Hasta" (Aile Adı) seçeneğini belirleyin.
  2. Eski Testler'etıklayın.
  3. Protokol Açıklaması altında DC-ERG'yiseçin. Daha önce edinilen verileri yüklemek için yeşil Yük düğmesini tıklatın.
  4. Adım 5/6 "Uzun Flash 10 cd 7 dk" ilerlemek için Adım (ileri ok) tıklayın.
  5. İhracat'atıklayın.
  6. Dosya adını sağlayın (örn. dosya adı.csv). Geçerli bir dosya adı bir harfle başlamalı ve ardından harfler, sayılar veya alt çizerler olmalıdır. Özel karakterler veya tireler kullanmayın. Veri analizi programı (DCERG_Analysis.exe) tablo girişlerini değişken adları gereksinimlerini karşılamasını gerektirir.
  7. Veri Tablosu'nunyanına bir onay işareti yerleştirin. Ayırıcının yanında Sekme'yiseçin. Seçeneklerin yanına onay işaretlerini yerleştirin(Başlıklar, Dikey), Tümleri (Adımlar, Chans, Sonuçlar), Veri Sütunları (İçerikler, Sonuçlar, Süpürler) ve Biçim (Dosya) içerir.
  8. Daha sonra Dışa Aktarma (Şekil 1E)üzerine tıklayın. Bu, *.csv dosyasını C:\Multifocal klasörüne kaydeder.

8. Veri analizi

  1. Uygun çalışma zamanı yükleyicisini indirin ve kurun (Malzeme Tablosu)
  2. DCERG_Analysis.exe yükleyicisini indirin ve kurun.
    NOT: Bu, DC-ERG bileşenlerinin çözümlemesi gerçekleştirecek komut dosyası yükler ve Başlat Menüsü klasöründe programı çalıştırmak için bir kısayol oluşturur.
  3. Başlat Menüsü > Programlar klasöründe oluşturulan kısayolu tıklatın.
  4. Çözümleme için dışa aktarılan veri dosyasını veya dosyalarını (*.csv) seçin. Birden fazla dosya seçmek için fareye ctrl + sol tıklayın kullanın.
    NOT: Çalıştırılabilir dosya iki tür çizim oluşturur: 1) ham veri ölçülen sürüklenme gösteren en iyi uyum satırı ile çizilir; 2) sürüklenme düzeltilmiş yanıt hareketli bir ortalama (~ 5 s bir açıklık ile) ile düzeltildikten sonra çizilir. Bu çizimden DC-ERG bileşenlerinin genlikleri ve zirveye doğru zaman ları tanımlanır: c dalgası, hızlı salınım, ışık tepe noktası ve kapalı yanıt. Veriler daha sonra her sayfanın farklı bir fare kaydına karşılık geldiği excel'e tablo biçiminde dışa aktarılır. Bu sayfaları iki özet sayfası takip eder: (i) derlenmiş DC-ERG genlikleri (mV); (ii) dc-ERG zaman-to-peaks (ışık başlangıçlı, t = 0 dk) derlenmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Şekil 2 miR-204 ko/ko cre/+ (koşullu KO) ve yabani tip (WT) farelerden alınan örnek bir veri kümesidir. MiR-204 ko/ko cre/+ retinapigment epitelinde mikroRNA 204'ün koşullu nakavtı olan farelerdir. Bu fareler floxed miR-204 fareler (NEIGEF tarafından üretilen)22 VMD2-CRE fareler23ile geçerek oluşturulur. MiR-204, sıkı kavşak bütünlüğünü koruyan epitel fonksiyon için kritik proteinlerin ekspresyonunu (örneğin, claudins), Kir 7.1 potasyum kanallarının ekspresyonu yoluyla potasyum homeostazın bakımını ve çeşitli görsel döngü genlerinin (örn.

Anormal RPE morfolojisi fare hatları25ifade birkaç RPE özgü Cre bildirilmiştir bu yana, Biz WT fenotip ile fareler ifade Cre normal RPE morfolojisi için izlendi. MiR-204 ko/ko cre+ (koşullu KO) fare retinasının yapısal ve fonksiyonel anormallikleri miR-204 null mice15'te hiper otofloresans (lipofussin benzeri mevduat) ile karakterize ve RPE apikal yüzeyine lokalize artmış mikroglia ile karakterize özelliklere benzer. Null farelerde bu değişikliklere RPE'nin ışık uyarılmış elektriksel yanıtlarında azalma eşlik etti ve fotoreseptör yanıtlarında en az değişiklik yapıldı (retinal ERG tarafından değerlendirildi). Böylece miR-204 ko/ko cre/+ farelerde miR-204 ifadesinin tedirginolmasının da RPE'nin elektriksel tepkisini değiştirmesi beklenmektedir.

Sunulan örnekte, ısıtılmış platformüzerine bir fare yerleştirilir ve elektrotlar kubbeyi indirmeden önce uygun şekilde yerleştirilir. Empedans ve drift daha önce banyo solüsyonu kullanılarak açıklandığı gibi kontrol edilir. Temsili "negatif" sonuçlar Şekil 2A'dagösterilmiştir. Şekil 2A'da (üst panel) iz, izdeki (mavi gölgeli) tepeden tepeye gürültüyü artıran elektrottaki dakika kabarcıklarından muzdariptir. Başka bir örnekte(Şekil 2A, alt panel), kabarcıklar cam yüzeyinden ayırmak ve elektrot uzunluğu boyunca hareket bu sürüklenme çıkarma ile telafi edilemez taban çizgisi sürüklenme yönünde ani değişikliklere neden olur. Şekil 2B, mikroelektrotları elektrot tutucu standlarına monte edilmeden önce vakum odası kullanılarak kabarcıkların ortadan kaldırıldığı WT ve miR-204 ko/ko cre/+ farelerin temsili "pozitif" kayıtlarını gösterir.

İlk 25 s (yeşil) için en uygun çizgi hesaplanır ve mavi gösterilir(Şekil 2B). Sürüklenme düzeltilen yanıtlar, DC-ERG bileşenlerinin genliklerinin belirlenmesiyle birlikte Şekil 2C'de yeniden çizilir. Bu protokolde tanımlanan DC-ERG tekniği kullanılarak hem WT hem de miR-204 ko/ko cre/+ suşlarından hayvanlar hızlı bir şekilde kaydedilebilir ve analiz edilebilir.

C dalgası iki bileşenden oluşur: fotoreseptör aktivitesi nedeniyle subretinal alanda potasyum azalmasına yanıt olarak artan potasyum iletkenliği ve iç retina hücreleri kaynaklanan ayrı bir katkı (yavaş P3 bileşeni – Müller hücrelerinin aktivitesini yansıtan) rpe apikal membran hiperpolarizasyon. Hızlı salınım RPE bazolateral membran hiperpolarizasyonu ile ilgili bilgi sağlar26, öncelikle kistik fibrozis transmembran iletkenlik regülatörü denilen bir Cl taşıyıcı iletkenlik değişiklikleri nedeniyle (CFTR)27. Işık tepe ikinci bir haberci sistemi ile Ca2 + bağımlı Cl kanallarının aktivitesini modüle ederek RPE'nin bazolateral membran depolarize bir fotoreseptör tahrikmadde28 konsantrasyonundaki bir değişiklik kaynaklandığı düşünülmektedir21. Son olarak, off-tepki polarite farklı ve ışık yoğunluğu18ile değişen tepkilerin karmaşık bir etkileşimdir.

Beklendiği gibi, Kir 7.1 K+ kanalların azaltılmış ekspresyonu c-dalgası29'u ve Şekil 2D'dekiortalama yanıtlarda gösterildiği gibi hızlı salınımı büyük ölçüde zayıflatır ve RPE'nin elektriksel özelliklerinde önemli bir bozulma olduğunu gösterir. DC-ERG bileşenlerindeki değişikliklerin bir özeti Şekil 2E'deverilmiştir. DC-ERG bileşenlerinin (WT'ye normalleştirilmiş) göreli genlikleri, göreceli olarak en büyük iki ışık uyarılmış a dalgası genliği (1 cd·s/m2;10 cd·s/m2)(WT'ye normalleştirilmiş) ve Şekil 2F\u2012H'degösterilmiştir. En parlak ışık yoğunluğuna a dalgası tepkisinin azalması (10cd·s/m2) (Şekil 2F\u2012H, Tamamlayıcı Şekil S1A,B) görme döngüsü bozukluğuna bağlı hassasiyetin geri kazanımında bir gecikme olduğunu göstermektedir (örneğin, miR-20424genomik nakavt sonucu azalan LRAT veya RPE65 ifadesinin azalmasısonucu).

Figure 1
Şekil 1: Diyagram, DC-ERG protokolündeki önemli adımları vurgular. (A) Tamamlanan devrenin görüntüsü, aynı banyo çözeltisi içine kayıt (cam kılcal mikroelektrotlar), referans ve zemin elektrotları düşürerek gerçekleştirilir. Bu yapılandırma, karakteristik empedans, gürültü ve sürüklenme değerlendirmek için ön testlerin (fareyi anesteziden önce) çalıştırılmasını sağlar. Özel mikroelektrot tutucu standının yan görünüm şemasını gösteren inset (sol üst). (B) Elektrot empedansları için uygun değerleri gösteren Empedans Kontrol Modu'nun temsili görüntüsü. Sol ve Sağ göz elektrotlarında empedans, birbirinden 5 KΩ içinde karşılaştırılabilir olmalıdır (örneğin, Sol göz: 38.7 KΩ vs. Sağ göz: 40.36 KΩ). Ağız referans elektrotunun empedansı 1 KΩ'den az, kuyruk elektrotunun ise 2,5 KΩ civarında olması gerekir. (C) Önizleme izlemesinin temsili görüntüsü (Adım 4/6) gösterilir. Adım 4 (Uzun Flaş No Light) bu adımın önizlemesi sırasında ışık teslim olmadığı için seçilir. İzler düşük gürültü olmalıdır ve yavaş yavaş taban çizgisi ne zaman solmaya hafif bir sürüklenme olabilir. İzler her iki kanalda da sabit bir sürüklenme elde ettikten ve nispeten düz hale geldikten sonra, gerçek kayıt başlayabilir. (D) 0,5 dk karanlığın ardından Adım 5/6 (Long Flash 10 cd 7 dk) kullanılarak, 10 cd/m2'lik hafif bir adım fareye 7 dakika boyunca teslim edilir ve ardından 1,5 dk.(E) Verileri *.csv dosyasına dönüştürmek için kullanılan ihracat parametrelerinin görüntüsü. Dc-ERG analiz yazılımını çalıştırmak için bu hassas biçim gereklidir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: DC-ERG analizinin temsili izleri ve iş akışı. Aşırı gösteren negatif dc-ERG sonucu görüntü (A, üst panel) tepe-to-peak gürültü ve (A, alt panel) sürüklenme. (B) Pozitif DC-ERG kayıt görüntüleri WT ve miR-204 ko/ko cre/+ fareden elde olur. Işık başlangıcından önce ilk 25 s (yeşil) için en iyi uyum çizgileri (mavi) gösteren ham izoluşturulur. (C) Sürüklenme çizimleri WTve miR-204 ko/ko cre/+ fareler için DC-ERG yanıtlarını düzeltti. DC-ERG bileşenlerinin genlikleri efsanede belirtilmiştir. (D) 3-8 aylık WT (n = 6) ve miR-204 ko/ko cre/+ (n = 6) farelerinin ORTALAMA DC-ERG yanıtları. DC-ERG bileşenleri WT iz üzerinde etiketlenmiş ve ışık stimülasyon parametreleri aşağıda tanımlanmıştır. (E) WT ve miR-204 ko/ko cre/+ fare kayıtlarından alınan DC-ERG bileşenlerinin özeti. Çubuk çizimler ortalamayı temsil eder, hata çubukları standart hatayı gösterir. (F) c-dalgası, (G) hızlı salınım ve (H)yanıtının göreli genlikleri göreceli iki en büyük ışık uyarılmış a dalgası genliklerine (1 cd·s/m2; 10 cd·s/m2) (WT'ye normalleştirilmiş) karşı çizilir. Önem yıldız işaretleri ile gösterilir: (Öğrencinin t-testi; * = p < 0.05, ** = p < 0.01, *** = p < 0.001). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: WT ve miR-204 ko/ko cre/+ farelerin ERG yanıtları. (A) WT (siyah) ve miR-204 ko/ko cre/+ farelerin (macenta) artan yoğunluklu 4 ms ışık yanıp söner yanıtları: 0.0001 cd·s/m2 (n = 5), 0,001 cd·· s/m2 (n = 5), 0.01 cd·s/m2 (n = 3), 0.1 cd·s/m2 (n = 3), 1 cd·s/m2 (n = 3), 10 cd·s/m2 (n = 2). (B) Flaş yoğunluğuna göre çizilen ortalama a dalgası genliği. (C) Flaş yoğunluğuna göre çizilen ortalama b-dalga genliği. (D) Flaş yoğunluğuna karşı çizilen a dalgası tepkilerinin ortalama zaman-tepe. (E) Flaş yoğunluğuna karşı çizilen b dalgası tepkilerinin ortalama zaman-to-peak. Hata çubukları gösterilen tüm çizimler için SEM. Önemi yıldız ile gösterilir: (Öğrencinin t-testi; * = p < 0.05). Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 2: Güç hattında voltaj regülatörü/güç kremi kullanımı ile azaltılabilen DC-ofset örneği. (A) Voltaj düzenleme gerilim ani yokluğunda (bitişik bir odada ekipman kullanımı ndan kaynaklanan örneğin, OCT) DC-ERG bileşenlerinin ölçümü ile müdahale edebilir dc-ofset oluşturmak, özellikle ışık tepe. Yıkıcı ofset sağda büyütülmüş. (B) Voltaj regülatörü/güç kremi etkinken ilk başak hala fark edilir ancak zararlı DC-ofset çıkarılır. Voltaj regülatörü/güç kreminin etkisi büyütülerek sağa gösterilir. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosyalar. Bu dosyaları indirmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kritik Adımlar

İyi bir DC-ERG kaydı, gaz giderme ve sıcaklık değişikliklerine karşı son derece hassas oldukları için, artefakt ve istenmeyen sürüklenme yaratan kabarcıklardan arınmış kararlı elektrotlar gerektirir. Fare kaydıyla ilerlemeden önce elektrotlar HBSS banyo çözeltisine yerleştirildiğinde kararlı bir taban çizgisine ulaşılması esastır. Küçük kabarcıklar kılcal elektrot tabanında veya silikon conta etrafında toplamak eğilimindedir ve elektrot tutucu tamamen monte edildikten sonra görmek zordur. Birkaç kabarcıklar mevcut olduğunda, hafifçe tutucu flicking kaldırma için onları özgür olacaktır. Çok fazla kabarcık varsa veya sürüklenme veya gürültü kaldırılamaz, genellikle elektrot sökmek ve işlemin her adımında kabarcıklar için dikkatlice incelerken baştan başlamak daha iyidir.

Modifikasyonlar ve Sorun Giderme

DC-ERG kayıtlarının doğrulmasını artırmak için kuruluma(Malzeme Tablosu)aşağıdaki özelleştirmeler yapılabilir. Mikro elektrot tutucular için düşük gürültülü kablolar, mevcut kabloları 32 bit amplifikatörden kayıt tablosuna genişletmek için kullanılabilir. Ek uzunluk, Ganzfeld kubbesi kapatıldıktan sonra elektrot tutucunun pozisyonunu bozmadan dikkatli bir şekilde yerleştirilmesini ve ayarlanmasını sağlar. Bir voltaj regülatörü / güç kremi hat gürültü ve ışık veya ekipman bitişik odalarda açık ve kapalı(Şekil S2)üretilen güç dalgalanmaları ortadan kaldırmak için kullanılabilir. Ayrıca, masa üstü Ganzfeld kubbe uyarıcı ve 32-bit amplifikatör herhangi bir ek elektrik gürültüsüne karşı kalkan için bina zemin çubuğuna topraklanmış bir Faraday kafes içine yerleştirilebilir.

Yöntemin Sınırlamaları

DC-ERG sadece karanlık adapte hayvanlar üzerinde sadakatle kaydedilebilir, yani ışık uyarıcı bir kez açık olduğunda istenmeyen potansiyelleri veya sürüklenme ortadan kaldırmak için yapılabilecek çok az şey var. Başka bir sınırlama DC-ERG bileşenlerinin bazı polarite (ışık tepe, off-response) kullanılan ışık yoğunluğuna tabiolmasıdır 16. Bu, WT'den en büyük sapmaların, bu protokolün kullandığı ışık yoğunluğunda doğal olarak bulunmayan yoğunluklarda meydana gelebileceği anlamına gelir (10 cd/m2). Bu noktada, DC-ERG analiz yazılımı negatif bir yanıt (bir yanıt minimum) varsayarak tasarlanmıştır. Kapalı yanıtın polaritesinin tersine dönmesiyle sonuçlanan daha parlak ışık yoğunlukları, dahil edilen analiz komut dosyası dosyasını değiştirme gereksinimini gerektirir.

Önemi

RPE retinal ortamın homeostatik bakım katılır ve çeşitli retina hastalıklarının patolojisinde kritik bir rol oynar. Bu yöntem, geleneksel ERG kayıtları ile birlikte yapıldığında dış retina ve RPE fonksiyonunun objektif bir ölçüsünü sağlayan RPE elektrik tepkisini kaydetmek için dc-ERG sisteminin nasıl kurulabildiğini ayrıntılı olarak açıklar. RPE işlevselliğinin bu ölçüleri, dejeneratif fenotipler gösteren transgenik fare çizgilerini değerlendirmek veya RPE'ye ilaç etkinliği veya ilaca bağlı sitotoksisite test etmek için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu çalışma NEI intramural fonlar tarafından desteklenmiştir. Yazarlar içtenlikle onun bilimsel rehberlik, teknik tavsiye ve RPE fizyolojisi ve hastalığı uzmanlığı için Dr Sheldon Miller kabul. Yazarlar Megan Kopera ve fare kolonileri yönetmek için hayvan bakım personeli teşekkür ve Dr Tarun Bansal, Raymond Zhou, ve Yuan Wang teknik destek için.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ag/AgCl (mouth) Electrode WPI Inc EP1 Mouth reference electrode for mouse
Ceramic Tile Sutter Instrument CTS Used to cut the glass capillary tube to an appropriate size
Cotton Tipped Cleaning Stick Puritan Medical Products 867-WC No Glue To be used as a spacer to improve the fit of the electrode holder assembly
Electroretinogram (ERG) System Diagnosys LLC E3 System Visual electrophysiology system to diagnose ophthalmic conditions in vision research and drug trials
Bunsen Burner Argos Technologies BW20002460 Or equivlaent to shape glass under flame
Glass Capillary Tube (1.5 mm) Sutter Instruments BF150-75 For filling with HBSS and making contact to the cornea
Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) Thermo Fisher Scientific Inc 14175-095 Commercially available. Maintain at RT
In-Line Filter Whatman 6722-5001 To protect vacuum pump from aerosols
Low Noise Cable for Microelectrode Holders WPI Inc 5372 Suggested for improving the length and placement of the cables and electrode holder assemblies
Magnetic Ball Joint WPI Inc 500871 For magnetically positioning the electrode holder assembly on the stage
MatLab Mathworks MatLab: For editing the analysis software
MatLab Curvefit Toolbox Mathworks Toolbox for MatLab (only required for editing the analysis software)
MatLab Compiler Mathworks Toolbox for MatLab (only required for editing and re-releasing the analysis software)
MatLab Runtime version 9.5 Mathworks R2018b (9.5) Required to run the analysis software: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html
Microelectrode Holders (45 degrees) WPI Inc MEH345-15 For holding the capillaries
Needle (25 ga) Covidien 8881250313 For filling the capillary tubes with HBSS
Needle (ground) Electrode Rhythmlink 13mm - one elctrode Subdermal needle electrode (ground) for mouse (13mm long, 0.4mm diameter needle, 1.5m leadwire)
Regulator/Power Conditioner Furman P-1800 Or equivalent to remove DC-offset from noise introduced through power line
Syringe (12 mL) Monoject 1181200777 For filling the capillary tubes with HBSS
T-clip Cole-Parmer 06852-20 For electrode holder assembly
Vacuum Desiccator Bel-Art 420120000 Clear polycarbonate bottom & cover
Pharmacological treatment
Lubricant eye gel Alcon 0078-0429-47 Helps lubricate corneal surface and maintain electrical contact with capillary electrodes
Phenylephrine Hydrochloride 2.5% Akorn 17478-201-15 Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation)
Proparacaine Hydrochloride 0.5% Akorn 17478-263-12 Local anesthetic for ophthalmic instillation
Tropicamide 0.5% Akorn 17478-101-12 Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation)
Xylazine AnaSed sc-362949Rx Analgesic and muscle relaxant
Zetamine (Ketamine HCl) VetOne 501072 Anesthetic for intramuscular injections

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Steinberg, R. H. Interactions between the retinal pigment epithelium and the neural retina. Documenta Ophthalmologica. 60, (4), 327-346 (1985).
  2. Sahu, B., Maeda, A. RPE Visual Cycle and Biochemical Phenotypes of Mutant Mouse Models. Methods in Molecular Biology. 1753, 89-102 (2018).
  3. Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture. Experimental Eye Resarch. 126, 51-60 (2014).
  4. Wimmers, S., Karl, M. O., Strauss, O. Ion channels in the RPE. Progress in Retinal Eye Research. 26, (3), 263-301 (2007).
  5. Gundersen, D., Orlowski, J., Rodriguez-Boulan, E. Apical polarity of Na,K-ATPase in retinal pigment epithelium is linked to a reversal of the ankyrin-fodrin submembrane cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 112, (5), 863-872 (1991).
  6. Fletcher, E. L., et al. Studying age-related macular degeneration using animal models. Optometry and Vision Science. 91, (8), 878-886 (2014).
  7. Gu, S. M., et al. Mutations in RPE65 cause autosomal recessive childhood-onset severe retinal dystrophy. Nature Genetics. 17, (2), 194-197 (1997).
  8. Marlhens, F., et al. Mutations in RPE65 cause Leber's congenital amaurosis. Nature Genetics. 17, (2), 139-141 (1997).
  9. Marmorstein, A. D., et al. the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97, (23), 12758-12763 (2000).
  10. Chang, B. Mouse models for studies of retinal degeneration and diseases. Methods in Molecular Biology. 935, 27-39 (2013).
  11. Collin, G. B., et al. Mouse Models of Inherited Retinal Degeneration with Photoreceptor Cell Loss. Cells. 9, (4), (2020).
  12. Shrock, E., Güell, M. CRISPR in Animals and Animal Models. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 152, 95-114 (2017).
  13. Smalley, E. CRISPR mouse model boom, rat model renaissance. Nature Biotechnology. 34, (9), 893-894 (2016).
  14. Benchorin, G., Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Vollrath, D. Assessment of Murine Retinal Function by Electroretinography. Bio Protocol. 7, (7), (2017).
  15. Zhang, C., et al. Regulation of phagolysosomal activity by miR-204 critically influences structure and function of retinal pigment epithelium/retina. Human Molecular Genetics. 28, (20), 3355-3368 (2019).
  16. Samuels, I. S., et al. Light-evoked responses of the retinal pigment epithelium: changes accompanying photoreceptor loss in the mouse. Journal of Neurophysiology. 104, (1), 391-402 (2010).
  17. Wu, J., Marmorstein, A. D., Peachey, N. S. Functional abnormalities in the retinal pigment epithelium of CFTR mutant mice. Experimental Eye Research. 83, (2), 424-428 (2006).
  18. Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Neurophysiology. 91, (3), 1134-1142 (2004).
  19. Peachey, N. S., Stanton, J. B., Marmorstein, A. D. Noninvasive recording and response characteristics of the rat dc-electroretinogram. Visual Neuroscience. 19, (6), 693-701 (2002).
  20. Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113, (4), 1085-1099 (2015).
  21. Marmorstein, L. Y., et al. The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1). Journal of General Physiology. 127, (5), 577-589 (2006).
  22. Zhang, C., et al. Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. Annual Meeting for the Association for Research in Vision and Ophthalmology. 3568 (2017).
  23. Iacovelli, J., et al. Generation of Cre transgenic mice with postnatal RPE-specific ocular expression. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52, (3), 1378-1383 (2011).
  24. Wang, F. E., et al. MicroRNA-204/211 alters epithelial physiology. FASEB Journal. 24, (5), 1552-1571 (2010).
  25. He, L., Marioutina, M., Dunaief, J. L., Marneros, A. G. Age- and gene-dosage-dependent cre-induced abnormalities in the retinal pigment epithelium. American Journal of Pathology. 184, (6), 1660-1667 (2014).
  26. Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation. Journal of Neurophysiology. 70, (4), 1669-1680 (1993).
  27. Blaug, S., Quinn, R., Quong, J., Jalickee, S., Miller, S. S. Retinal pigment epithelial function: a role for CFTR. Documenta Ophthalmologica. 106, (1), 43-50 (2003).
  28. Gallemore, R. P., Griff, E. R., Steinberg, R. H. Evidence in support of a photoreceptoral origin for the "light-peak substance". Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29, (4), 566-571 (1988).
  29. Shahi, P. K., et al. Abnormal Electroretinogram after Kir7.1 Channel Suppression Suggests Role in Retinal Electrophysiology. Science Reports. 7, (1), 10651 (2017).
  30. Li, Y., et al. Mouse model of human RPE65 P25L hypomorph resembles wild type under normal light rearing but is fully resistant to acute light damage. Human Molecular Genetics. 24, (15), 4417-4428 (2015).
Mouse Retinal Pigment Epitelinin Işık Uyarılmış Elektriksel Tepkilerini Kaydetmek için Doğrudan Birleştirilmiş Elektroretinogram (DC-ERG)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Miyagishima, K. J., Zhang, C., Malechka, V. V., Bharti, K., Li, W. Direct-Coupled Electroretinogram (DC-ERG) for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (161), e61491, doi:10.3791/61491 (2020).More

Miyagishima, K. J., Zhang, C., Malechka, V. V., Bharti, K., Li, W. Direct-Coupled Electroretinogram (DC-ERG) for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (161), e61491, doi:10.3791/61491 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter