Summary
Dieses Protokoll beschreibt den Aufbau eines kostengünstigen Mikroinjektionssystems, seine stereotaktische Implantation in Tiefehirnstrukturen und das Verfahren zur zeitgesteuerten Mikroinjektion von Tetrodotoxin bei wachen und hemmungslosen Ratten. Ziel ist es, die Beteiligung hypothalamischer Strukturen an der Regulation des Eisprungs durch Hemmung ihrer neuronalen Aktivität aufzudecken.
Abstract
Viele experimentelle Ansätze wurden verwendet, um die Rolle des Gehirns bei der Regulation des Eisprungs zu untersuchen. Beispiele sind die Läsion und Taubferentation neuronaler Gruppen, beides invasive Methoden, die die Integrität des Zielbereichs dauerhaft beeinträchtigen. Diese Methoden gehen mit Kollateraleffekten einher, die die Analyse akuter und zeitlicher Regulationsmechanismen beeinflussen können. Die stereotaxische Implantation von Leitkanülen, die auf bestimmte Gehirnregionen abzielen, gefolgt von einer Erholungsphase, ermöglicht es den Forschern, verschiedene Medikamente nach dem Verschwinden der unerwünschten Auswirkungen der Operation zu mikroinjektieren. Tetrodotoxin wurde verwendet, um die Rolle mehrerer Hirnareale in verschiedenen physiologischen Prozessen zu bestimmen, da es vorübergehend die natriumabhängigen Aktionspotentiale hemmt und so alle neuronalen Aktivitäten in der Zielregion blockiert. Dieses Protokoll kombiniert diese Methode mit Strategien zur Beurteilung des Östrogenzyklus und des Eisprungs, um die Rolle diskreter Hirnregionen bei der Regulation des Eisprungs zu bestimmten Zeiten eines bestimmten Stadiums des Östrogenzyklus aufzudecken. Wache und hemmungslose Ratten (Rattus norvegicus) wurden verwendet, um die blockierenden Wirkungen zu vermeiden, die Anästhetika und Stresshormone auf den Eisprung ausüben. Dieses Protokoll kann leicht an andere Spezies, Gehirnziele und pharmakologische Wirkstoffe angepasst werden, um verschiedene physiologische Prozesse zu untersuchen. Zukünftige Verbesserungen dieser Methode umfassen das Design eines Mikroinjektionssystems, das Glaskapillaren mit kleinem Durchmesser anstelle von Führungskanülen verwendet. Dies reduziert die Menge an Gewebe, die während der Implantation beschädigt wird, und verringert die Ausbreitung der infundierten Medikamente außerhalb des Zielbereichs.
Introduction
Der Eisprung ist der Prozess, bei dem eine oder mehrere reife Eizellen einmal in jedem Estral- / Menstruationszyklus aus den Eierstöcken freigesetzt werden. Da alle Säugetierarten auf die Produktion von Gameten angewiesen sind, um sich zu vermehren, hat das Verständnis der Mechanismen, die den Eisprung regulieren, einen großen Einfluss auf Bereiche von der Biomedizin über die Viehwirtschaft bis hin zur Erhaltung gefährdeter Arten. Der Eisprung wird durch die Hypothalamus-Hypophysen-Ovarial-Achse reguliert, die mehrere hypothalamische und extrahypophthalamische Bereiche, die Gonadotrope in der vorderen Hypophyse und die Theka- und Granulosazellen umfasst, die zusammen mit den Eizellen die Eierstockfollikel in den Eierstöcken bilden1.
Eierstockfollikel wachsen, entwickeln und ovulieren schließlich als Reaktion auf die tonische und phasische Sekretion des follikelstimulierenden Hormons und des luteinisierenden Hormons, der beiden Gonadotropine, die von den Gonadotropen abgesondert werden. Das Muster der Gonadotropinsekretion ist entscheidend für die richtige Follikelentwicklung und den Eisprung und wird durch das Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH)1,2reguliert. Dieses Neuropeptid wird von Neuronen synthetisiert, die im gesamten basalen Zwischenhirn verstreut sind, und dann an das Portalgefäß abgesondert, das den Hypothalamus und die vordere Hypophyse verbindet. Die sekretorische Aktivität der GnRH-Neuronen wird wiederum durch synaptischen Input aus verschiedenen Gehirnstrukturen moduliert. Diese Strukturen vermitteln Informationen über den Zustand der äußeren und inneren Umgebung des Organismus, einschließlich der Verfügbarkeit von Nahrung, der Länge der Photoperiode und der Konzentration von Hormonen im Blut. In diesem Sinne prägen sie das Fortpflanzungsmuster jeder Art und die spezifischen Rollen solcher Strukturen müssen bestimmt werden, um die Mechanismen des Eisprungs richtig zu verstehen. Als Beispiel wurde gezeigt, dass die Schwankung des Östradiolspiegels während des Östrogenzyklus die Sekretion von GnRH reguliert; GnRH-Neuronen exprimiert jedoch nicht die Estradiolrezeptor-Isoform, die zum Nachweis solcher Veränderungen erforderlich ist. Zwei Populationen von Neuronen, die diese Rezeptoren exprimieren, befinden sich in der rostralen periventrikulären Region des dritten Ventrikels bzw. im Arkuatkern und stellen Synapsen mit GnRH-Neuronen her. Es gibt Hinweise darauf, dass diese Neuronen die Konzentration von Östradiol interpretieren und dann die Aktivität von GnRH-Neuronen stimulieren, indem sie Kisspeptin, einen starken Induktor der GnRH-Sekretion3,freisetzen.
Experimente mit thermischen oder chemischen Läsionen sowie mechanischer Taubferentation ermöglichten es den Forschern, die Beteiligung mehrerer Gehirnstrukturen an der Regulation des Eisprungs zu bestimmen4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Diese Experimente haben jedoch den Nachteil, dass sie invasiv und traumatisch sind und mehrere Tage der Genesung erfordern, bevor die Auswirkungen der Behandlung bewertet werden, was die Analyse der akuten Auswirkungen der Behandlung behindert. Zudem beeinflussen sie dauerhaft die Zielbereiche und stören langfristig andere physiologische Prozesse. Aufgrund dieser Probleme werden die Ergebnisse dieser Experimente in der Regel durch die homöostatischen Kompensationsmechanismen im Körper des Tieres verdeckt und es ist ziemlich schwierig, genaue Informationen über die zeitliche Regulationsdynamik zu extrahieren, an der der Bereich beteiligt ist.
Die Mikroinjektion von Medikamenten, die die Aktivität von Neuronen durch Leitkanülen vorübergehend stören, ist eine geeignete Alternative, die die oben genannten Nachteile übertrifft. Die Kanülen können durch eine stereotaxische Operation in jeder Gehirnregion platziert werden, so dass der Forscher die medikamentöse Behandlung beginnen kann, nachdem die verwirrenden Auswirkungen der Operation verschwunden sind. Die zeitgesteuerte Mikroinjektion der Medikamente ermöglicht es den Forschern, Hypothesen über den Beitrag der Region zu einem bestimmten Schritt des Prozesses zu testen und kann bei wachen, zurückhaltenden oder sich frei bewegenden Tieren durchgeführt werden. Eine Vielzahl von Medikamenten, darunter Lokalanästhetika, Agonisten, Antagonisten, inverse Agonisten und biologische Toxine wie Tetrodotoxin (TTX), können zu bestimmten Zeiten in die Region des Interesses mikroinjektiert werden.
TTX ist ein biologisches Toxin, das von Bakterien synthetisiert wird, die im Körper des Kugelfisches sowie anderer Wirbeltiere und Wirbellose leben. TTX stillt die neuronale Aktivität durch die selektive und transiente Blockade von Natriumkanälen, was zur Hemmung natriumabhängiger Aktionspotentiale führt. In Gegenwart von TTX erfahren Zellen eine Veränderung in der Depolarisationsphase und sind somit nicht erregbar, sondern bleiben am Leben. Die blockierende Wirkung von TTX erklärt sich durch seine molekulare Zusammensetzung: Eine Guanidiniumgruppe ist in der Lage, den extrazellulären Aspekt des Natriumkanals zu passieren, aber der Rest des Moleküls kann aufgrund seiner Größe nicht passieren, so dass es feststeckt und den Kanal13,14,15,16,17 blockiert . Der Wirkmechanismus des TTX ermöglichte seine Verwendung als Werkzeug zur Untersuchung des Nervensystems sowohl in vitro als auch in vivo. Die intrazerebrale Injektion dieses Toxins wurde verwendet, um die Rolle diskreter Hirnareale in verschiedenen Prozessen wie Gedächtnisretention18, Schlaf und Erregung19, Ortserkennung20, räumliche Navigation21,Drogenmissbrauch 22, Thermoregulation23, Entwicklung von Schizophrenie24, Sexualverhalten25 und Regulierung des Eisprungs26 zu untersuchen unter anderem. In diesem Protokoll beschreiben wir die Auswirkungen der vorübergehenden Inaktivierung von Hypothalamuskernen durch TTX-Mikroinjektion bei wachen und hemmungslosen Ratten auf den Eisprung.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Verfahren mit Tieren wurden von der Ethikkommission der Facultad de Estudios Superiores Zaragoza, UNAM, genehmigt. Diese Institution arbeitet in strikter Übereinstimmung mit den mexikanischen Regeln für den Umgang mit Tieren, offizielle Norm: NOM-062-ZOO-1999, die mit internationalen Richtlinien übereinstimmt.
1. Bau von bilateralen Kanülen
- Ziehen Sie den Edelstahlschaft mit einer Druckpinzette aus der Nabe von zwei 23 G Hypodermienadeln und entfernen Sie dann den verbleibenden Kleber mit einer Skalpellklinge.
- Zeichnen Sie eine Linie 15 mm vom stumpfen Ende der Wellen mit einem feinen Permanentmarker. Verwenden Sie eine Schneidpinzette, um die abgeschrägenen Enden zu entfernen.
- Halten Sie die 15 mm Segmente mit feinen Hämostaten und drücken Sie sie senkrecht mit einer Abschaltscheibe, die an einem Rotationswerkzeug befestigt ist, bis 14 mm Rohrsegmente erhalten sind. Dieser Schritt wird durchgeführt, um den verdeckten Teil der Wellen zu beseitigen und offene und stumpfe Enden zu erzeugen. Führen Sie abschließend eine 30-G-Nadel durch die Segmente ein, um interne Hindernisse zu beseitigen.
- Bestimmen Sie den Abstand zwischen den interessierenden Strukturen in der linken und rechten Hemisphäre des Gehirns mit Hilfe eines Hirnatlas27. Verwenden Sie Formton, um die beiden 14-mm-Segmente an einem Objektträger zu befestigen und sicherzustellen, dass sich beide auf der gleichen horizontalen Ebene befinden. Beobachten Sie durch ein Augenmikrometer (10x) und stellen Sie die Segmente mit einer feinen Pinzette ein, bis der gewünschte Abstand erreicht ist.
- Lötpaste mit 10% Salzsäure im Verhältnis 2:1 mischen und einen Tropfen der Mischung 2 mm unter das stumpfe Ende der Segmente geben. Löten Sie beide Segmente mit einem einzigen Punkt mit einem Lötkolben und einem Lötdraht mit einem Durchmesser von 0,5 mm. Stellen Sie sicher, dass das Lot das Lumen der Segmente nicht behindert.
- Erstellen Sie eine Stütze, um die Kanüle an der stereotaxischen Halterung zu befestigen, indem Sie ein 10-mm-Segment aus elastischem 0,3-mm-Edelstahldraht schneiden. Verwenden Sie Formmasse, um 2 mm des Drahtes in Kontakt mit dem vorherigen Lötpunkt zu legen und den Rest über dem stumpfen Ende der Kanülen zu legen. Löten Sie den Draht an die Kanülen.
- Reinigen Sie die Oberfläche der Kanülen mit 70% Ethanol, um den Überschuss der Lotpaste zu entfernen. Spülen Sie das Innere der Kanülen mit sterilem Wasser, um metallische Partikel zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis bei einer 10-fachen Vergrößerung keine Partikel mehr unter dem Mikroskop nachgewiesen werden können.
2. Bau von Obturatoren und Kappen
- Zum Bau der Obturatoren schneiden sie zwei 16 mm Segmente aus rundem Edelstahl-Weichdraht (0,35 mm Durchmesser). Halten Sie eine beidseitige Kanüle mit Hämostaten senkrecht zu einer Laborbank und führen Sie eines dieser Segmente in jede Kanüle ein, bis sie die Bank erreichen. Biegen Sie den Rest in einem Winkel von 90°.
- Für die Kappen zwei 2 mm Segmente Silikonschläuche (Innendurchmesser =0,76 mm) schneiden und an einem der Enden jedes Segments einen Tropfen Silikonkleber auftragen. Lassen Sie den Kleber nicht in den Schlauch eindringen. Mindestens 24 Stunden trocknen lassen.
3. Bau von Mikroinjektoren
- Wiederholen Sie Schritt 1.1 und verwenden Sie stattdessen 30 G Hypodermienadeln, um die Schäfte zu erzeugen.
- Zeichnen Sie eine Linie 18,5 mm vom stumpfen Ende der Wellen und entfernen Sie den Rest der abgeschrägen Enden mit einer Schneidpinzette.
- Wiederholen Sie Schritt 1.1 mit einer einzigen 23-G-Nadel, um Adapter zu bauen, indem Sie zwei 6 mm lange Segmente ab dem stumpfen Ende schneiden.
- Entfernen Sie die verdeckten Teile der 6-mm-Segmente, indem Sie sie senkrecht gegen die Abschaltscheibe drücken, bis zwei 4-mm-Adapter erhalten sind. Beseitigen Sie interne Hindernisse.
- Setzen Sie das abgeschrämte Ende der 30 G-Segmente in die Adapter ein. Schauen Sie durch ein Stereomikroskop, um sicherzustellen, dass das Ende von Segmenten und Adaptern auf dem gleichen Niveau ist. Cyanacrylatkleber mit einem Wattestäbchen auf das distale Gelenk auftragen und 15 Minuten trocknen lassen.
- Zwei Teflonschlauchanschlüsse 5 Minuten lang in 70% Ethanol einweichen und dann über die Adapter an den Mikroinjektoren befestigen. Warten Sie, bis der Durchmesser der Steckverbinder mindestens 24 Stunden schrumpft, und sterilisieren Sie dann den Mikroinjektor mit einer Niedertemperaturmethode, um eine Beschädigung der Steckverbinder zu vermeiden (Ethylenoxidsterilisation wird empfohlen).
4. Tierpflege und Vaginalabstriche
- Verwenden Sie zyklische erwachsene weibliche Kapuzenratten(Rattus norvegicus,CIIZ-V-Stamm) mit einem Gewicht zwischen 230 und 260 Gramm. Beherbergen Sie die Ratten in Vierergruppen in Standard-Polypropylenkäfigen in einem Raum mit einer Hell-Dunkel-Fotoperiode von 14:10. Stellen Sie die Temperatur und Luftfeuchtigkeit auf 22 ± 2 °C bzw. auf 40% ein. Stellen Sie Nahrung und Wasser ad libitum zurVerfügung.
- Nehmen Sie vaginale Abstriche jeden Tag zwischen 10:00 und 12:00 Uhr.
- Sterilisieren Sie eine modifizierte bakteriologische Schleife mit einem Innendurchmesser von 1 mm mit einer Alkohollampe und kühlen Sie sie mit sterilem Wasser ab. Halten Sie die Ratte mit einem sicheren Griff und führen Sie 5 mm der bakteriologischen Schleife in die Vagina ein und berühren Sie ihre Innenwände. Entfernen Sie die bakteriologische Schleife. Bei Erfolg wird an der Spitze ein bewölkter Tropfen zu sehen sein. Legen Sie diesen Tropfen auf einen Objektträger.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Ratte, die den Kreislauf zwischen jedem Tier sterilisiert und kühlt.
- Nachdem die Tropfen abgetrocknet sind, mit Hämatoxylin-Eosin abfärben und die Proben unter einem Mikroskop bei 10x beobachten.
- Bestimmen Sie den Anteil von Leukozyten, epithelialen Kernzellen und verhornten Zellen auf jedem Abstrich und klassifizieren Sie ihn nach den Kriterien der Östrogenzyklusstadien, die in Abbildung 1beschrieben sind, die mit der vorherigen Literatur28,29übereinstimmt .
5. Stereotaxische Implantation der Kanülen
HINWEIS: Führen Sie die Implantation der Kanülen nach einer regelmäßigen aseptischen stereotaktischen Operation und unter Einhaltung der institutionellen Normen durch.
- Vor der Operation
- Sterilisieren Sie chirurgische Instrumente, Kanülen, chirurgische Schrauben, Obturatoren, Gaze und hölzerne Wattestäbchen 24 Stunden vor der Operation mit einem Dampfautoklaven. Sterilisieren Sie die Spitzen metallischer Instrumente zwischen aufeinanderfolgenden Operationen, indem Sie sie mit 10% Wasserstoffperoxid, gefolgt von Wasser, reinigen und dann in einen heißen Perlensterilisator legen.
- Bereiten Sie die Arbeitsbereiche und das stereotaktische Instrument vor, bevor Sie das Tier aus dem Heimzimmer entfernen. Bereiten Sie das Tier auf die Operation in einem Bereich vor, der sich so weit wie möglich vom Operationstisch entfernt befindet, um eine Kontamination während des Eingriffs zu vermeiden.
- Reinigen Sie die Vorbereitungs- und Operationsbereiche mit 70% Ethanol, gefolgt von einer Anwendung einer 10% igen Chloridlösung für zehn Minuten. Reinigen Sie die Basis, den Rahmen und die Manipulatoren des stereotaktischen Instruments mit 70% Ethanol und sterilisieren Sie die Spitzen der Ohrbügel mit einem heißen Perlensterilisator und kühlen Sie sie vor der Operation luftgekühlt.
- Führen Sie die Operation mit einem speziellen Laborkittel, einer Gesichtsmaske, einer Kopfhaube, chirurgischen Ärmeln, Schuhüberzügen und chirurgischen Handschuhen durch. Bitten Sie den Assistenten, die Tiere auf die Operation vorzubereiten und ihren allgemeinen Zustand während des Eingriffs zu überprüfen.
- Befestigen Sie die Kanüle am stereotaxischen Halter. Bitten Sie den Assistenten, das erste zu bedienende Tier in den Raum zu bringen. Wählen Sie Ratten in Diestrus für die Operation aus, da Beobachtungen aus unserem Labor darauf hindeuten, dass diese Tiere die richtigen Östrogenzyklen schneller wiederherstellen als Ratten, die in anderen Stadien operiert werden, wahrscheinlich weil sich die Reaktion auf Stress zusammen mit dem Östrogenzyklus ändert.
- Wiegen Sie das Tier und induzieren Sie die Anästhesie mit 4% Isofluran in 100% Sauerstoff in einer Induktionskammer für Ratten, die an einen Isofluran-Vaporizer angeschlossen sind. Um eine Belastung der Tiere zu vermeiden, füllen Sie die Kammer nicht vor. Bestätigen Sie eine chirurgische Anästhesieebene, indem Sie die Pupillenerweiterung und den Schmerzverlust überprüfen, gemessen durch die Schwanz- und Ohrquetschtests, nachdem Sie den Verlust des Aufreinheitsreflexes beobachtet haben.
- Betäubung der Ratte durch eine intraperitoneale Injektion einer Mischung aus Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg), wenn kein Isofluran-Vaporizer verfügbar ist.
- Entfernen Sie die Ratte aus der Induktionskammer und verwenden Sie einen Nasenkegel in der Vorbereitungstabelle, um die Wirkung der Anästhesie mit 2,5% Isofluran in 100% Sauerstoff aufrechtzuerhalten. Schneiden Sie die Haare der Kopfhaut mit Clippern und entfernen Sie lose Haare mit einer Fusselrolle. Injizieren Sie eine präoperative subkutane Dosis von 2 mg/kg Meloxicam bzw. 5 mg/kg Enrofloxacin als nichtsteroidales entzündungshemmendes/analgetisches und antibiotisches Antibiotikum.
- Tragen Sie künstliche Hypromellose-Tränen auf jedes Auge auf, um Austrocknung während der Operation zu vermeiden.
- Montieren Sie das Tier im stereotaktischen Instrument über einem Wärmepad mit reißenden Ohrbügeln und einer Anästhesiemaske. Stellen Sie die Nasenklemme ein, um sicherzustellen, dass der Kopf des Tieres flach ist. Führen Sie ein chirurgisches Peeling im rasierten Bereich durch, abwechselnd zwischen Povidon-Jod mit Seife und 70% Ethanol einmal und dann mit Povidon-Jod und 70% Ethanol zweimal. Setzen Sie ein Rektalthermometer ein, um die Temperatur des Tieres während des Eingriffs aufzuzeichnen, und bedecken Sie es dann mit einem sterilen Operationsfeld.
- Während der Operation
- Verwenden Sie ein Skalpell, um einen 2 cm großen Schnitt in der Haut und den Muskeln in der Mitte des rasierten Bereichs zu machen. Entfernen Sie das Periost aus dem Schädel mit einem Wattestäbchen, das mit 2% Wasserstoffperoxid beschichtet ist, um Bregma oder Lambda zu enthüllen, die Landmarken, die zur Berechnung der Zielkoordinaten verwendet werden. Trocknen Sie den Schädel mit Luft, um das Wahrzeichen besser zu visualisieren.
- Verwenden Sie die Manipulatoren des stereotaxischen Instruments, um die Kanüle in eine Position direkt über dem Wahrzeichen der Wahl zu bewegen. Registrieren Sie die vorderen-hinteren und die medial-lateralen Koordinaten aus dem stereotaxischen Instrument und berechnen Sie daraus die Koordinaten des Zielbereichs nach dem Hirnatlas27.
- Legen Sie die berechneten Koordinaten im stereotaktischen Instrument fest und platzieren Sie die Spitze der Kanüle auf der Schädeloberfläche. Registrieren Sie die dorsal-ventrale Koordinate und berechnen Sie daraus die Tiefe zum Zielbereich.
- Entfernen Sie den Arm des Manipulators, indem Sie ihn vom Rahmen abknählen. Verwenden Sie einen Zahngrat, der mit einer Geschwindigkeit von 15.000 U / min an einem Rotatorwerkzeug befestigt ist, um an der Stelle, an der die Kraniotomie durchgeführt wird, eine Markierung zu hinterlassen. Verwenden Sie dann den Grat, um drei Löcher zu machen und ein gleichseitiges Dreieck um die Markierung zu bilden. Diese Löcher dürfen den Schädel nicht durchbohren. Setzen Sie die chirurgischen Schrauben in die Löcher ein und stellen Sie sicher, dass sie fest platziert sind.
- Machen Sie die Kraniotomie breit genug, um den Abstand zwischen den Zielbereichen in jeder Hemisphäre zu berücksichtigen. Es sollte so klein wie möglich sein, aber groß genug, um das Absenken der Kanüle zu ermöglichen, ohne die Grenzen des Schädels zu berühren, da dies die Flugbahn verändern wird. Führen Sie die Kraniotomie schrittweise durch und wenden Sie den geringstmöglichen Druck an. Der Nagetierschädel ist nur wenige Millimeter dick und es ist entscheidend, die Integrität des darunter stehenden Gewebes zu erhalten.
- Sobald die Dura mater sichtbar ist, verwenden Sie eine sterile 21 G-Nadel mit der Spitze in einem 90 ° -Winkel gekrümmt, um Knochensplitter zu entfernen und einen vorderen hinteren Schnitt in den Meningen vorzunehmen. Verwenden Sie die Wirtshafter und Kollegen30 Technik, um Schäden am oberen sagittalen Sinus zu vermeiden, wenn sich der Zielbereich in der Nähe der Mittellinie befindet.
- Setzen Sie den Halter mit der Kanüle in den Rahmen und verwenden Sie den dorsal-ventralen Manipulator, um die ventrale Koordinate zu erreichen. Überprüfen Sie, ob die Nadel beim Absteigen die Ränder nicht berührt und erhöhen Sie bei Bedarf den Durchmesser der Kraniotomie.
HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Spitze der Leitkanülen auf eine Region abzielt, die zwischen 0,5 und 2,0 mm über der interessierenden Region liegt. Dies ist auf die Entzündungsreaktion des Gehirns als Reaktion auf die Einführung von Fremdkörpern und auf die Zerstörung des Gewebes zurückzuführen. Dies ist besonders kritisch, wenn die interessierende Region klein ist und der Arbeitsabstand im Vorfeld empirisch berechnet werden muss.
- Setzen Sie den Halter mit der Kanüle in den Rahmen und verwenden Sie den dorsal-ventralen Manipulator, um die ventrale Koordinate zu erreichen. Überprüfen Sie, ob die Nadel beim Absteigen die Ränder nicht berührt und erhöhen Sie bei Bedarf den Durchmesser der Kraniotomie.
- Tragen Sie Zahnzement auf, um die Kanüle am Schädel zu befestigen und trocknen zu lassen. Stellen Sie sicher, dass der Zahnzement das stumpfe Ende der Kanüle nicht bedeckt, da dies sie irreversibel behindert. Warten Sie, bis der Zement vollständig erstarrt ist.
- Setzen Sie die Obturatoren ein, um weitere Hindernisse zu vermeiden und die Durchgängigkeit während der Studie zu gewährleisten. Setzen Sie die Silikonkappe auf, um eine Kontamination zu vermeiden.
- Nach der Operation
- Ersetzen Sie verlorene Flüssigkeiten durch eine intraperitoneale Injektion von 1,0 ml steriler Kochsalzlösung bei physiologischer Temperatur. Legen Sie das Tier in einen Erholungskäfig mit thermischer Unterstützung, bis es sich von der Anästhesie erholt. Überprüfen Sie regelmäßig die Temperatur und die Herd-/Atemfrequenz des Tieres. Isofluran-Effekte dauern einige Minuten nach Unterbrechung des Gasflusses an, während Ketamin / Xylazin-Effekte 40-50 min anhalten.
- Stellen Sie postoperative Injektionen der Antibiotika, Analgetika und entzündungshemmenden Medikamente (in den gleichen Dosen und Wegen wie zuvor angegeben) für 48-72 h zur Verfügung und untersuchen Sie die Tiere täglich für den Rest des Experiments genau. Melden Sie alle Anzeichen von Schmerzen, Stress oder Gewichtsverlust an Tierarztdienste oder an ein geschultes Mitglied des Labors. Führen Sie während dieser Zeit keine weiteren Manipulationen an den Ratten durch.
- Beginnen Sie mit der Einnahme von Vaginalabstrichen nach der postoperativen Behandlung und fahren Sie fort, bis das Tier drei aufeinanderfolgende Östrogenzyklen von vier Tagen zeigt.
HINWEIS: Chronische Jugularkatheter können chirurgisch implantiert werden, so dass der Forscher serielle Blutproben entnehmen kann, um die Sekretion von Hormonen wie Östradiol, Progesteron, Testosteron, luteinisierendem Hormon, follikelstimulierendem Hormon und Corticosteron zu analysieren. Wir empfehlen, einen solchen Katheter zu platzieren, sobald sich das Tier von der Gehirnoperation erholt hat, da dies die Überlebensrate verbessert und gleichzeitig eine Verstopfung des Katheters vermeidet, die sich aus einer längeren Erholungszeit ergeben kann.
6. Tetrodotoxin Handhabung und Herstellung von Lösungen
ACHTUNG: TTX ist eine der giftigsten bekannten Substanzen. Es wirkt auf Skelettmuskeln und Nervengewebe. Eine Intoxikation durch Kontakt ist unwahrscheinlich, aber jede offene Wunde ist ein potenzieller Weg für die Impfung in den Körper. Die Hauptanliegen bei der Arbeit mit TTX sind die Punktion der Haut mit scharfen Instrumenten, die mit dem Toxin in Kontakt gekommen sind, und die Erzeugung von Aerosolen, die Mund, Augen und Schleimhäute erreichen können. Abhängig von der Dosis kann TTX tödlich sein, wenn es von der Haut eingeatmet, verschluckt oder geimpft wird. Es wird starke Reizung der Augen verursachen. Der LD50 wurde an Mäusen durch orale und intravenöse Verabreichung getestet und beträgt 334 μg/kg bzw. 7,3 μg/kg. Derzeit ist kein Antitoxin verfügbar.
HINWEIS: Inaktivierende Substanz ist eine 1,0% ige NaOCl mit oder ohne 0,25 N NaOH oder eine 10% ige Bleichlösung. Die vollständige Inaktivierung erfolgt nach 30 Minuten Exposition. TTX kann nicht vollständig durch ein Chloridderivat in einer Konzentration unter 10%, durch Autoklavieren oder durch Trockenexterilisation bei einer Temperatur unter 500 ° F inaktiviert werden. Alle Verfahren mit TTX müssen von zwei sachkundigen Personen durchgeführt werden, die innere und äußere Paar Nitrilhandschuhe, einen speziellen Laborkittel, eine Schutzbrille, eine Einweg-Gesichtsmaske, geschlossene Schuhe und eine Hose in voller Länge tragen.
- Vorbereitung der Lagerlösung
- Legen Sie ein Pad, das mit der inaktivierenden Substanz getränkt ist, in den Abzug, um eine Kontamination im Falle eines Verschüttens zu verhindern. Stellen Sie sicher, dass der Abzug ordnungsgemäß funktioniert, bevor Sie beginnen. Bereiten Sie einen Behälter mit der inaktivierenden Lösung vor, um die Pipettenspitzen zu entsorgen.
- Steriles TTX-Citrat-lyophilisiertes Pulver gemäß Herstelleranweisungen durch eine äußerst sorgfältige und langsame Titration mit steriler künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit wiedergeben und dabei die Wände der Durchstechflasche abspülen. Vermeiden Sie die Bildung von Schaum und Aerosol. Befolgen Sie eine aseptische Technik, um eine Kontamination der TTX-Lösung zu vermeiden, da sie in das Gehirn lebender Tiere injiziert wird. Verwenden Sie eine Spritze mit einer Nadel anstelle einer Mikropipette, wenn Ihre TTX-Fläschchen eine äußere Membran haben, um die Aerosolbildung zu verhindern.
- Aliquot die Stammlösung in sterile Mikroröhrchen. Machen Sie Aliquoten so klein wie möglich, da Gefrier- / Auftauzyklen die Stabilität der Moleküle verändern können. Füllen Sie nicht mehr als die Hälfte der Röhrchen, da das Wasser im gefrorenen Fall an Volumen zunimmt, was zum Öffnen des Deckels und zur Kontamination des Röhrchens und anderer im Behälter gelagerter Proben führen kann.
- Dekontaminieren Sie die Außenseite der Röhren und die Oberflächen, auf denen TTX verwendet wurde, mit der inaktivierenden Substanz. Lagern Sie die Röhrchen bei -20 °C in einer Durchstechflaschenbox in einem Sekundärbehälter.
- Verdünnen der Stammlösung auf eine Arbeitskonzentration
- Bereiten Sie frisch verdünnte Lösungen an dem Tag vor, an dem sie verwendet werden, da verdünnte Lösungen weniger stabil sind. Legen Sie ein Pad, das mit der inaktivierenden Substanz getränkt ist, in den Abzug und ein Mikrorohrgestell darauf. Bereiten Sie einen Behälter mit der inaktivierenden Lösung vor, um die Pipettenspitzen zu entsorgen.
- Pipettieren Sie die Stammlösung am Boden eines sterilen Mikroröhrchens und fügen Sie dann die berechnete Menge an künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit hinzu, um eine Konzentration von 10 ng / μL zu erreichen. Wie für das erneute Suspendieren des TTX-Pulvers beschrieben, führen Sie eine äußerst vorsichtige und langsame Titration durch, spülen Sie die Wände der Durchstechflasche ab und vermeiden Sie die Bildung von Schaum und Aerosol.
- Wenn Proben, die sich auf dem Gefrierschrank befinden, für die Mikroinjektion verwendet werden, müssen sie vor dem Experiment mindestens eine Stunde lang bei Raumtemperatur ausgeglichen werden.
7. Mikroinjektion von TTX- oder Fahrzeuglösungen in frei bewegliche Ratten
- Konfigurieren Sie die Mikroinjektionspumpe mit der Infusionsrate und der Gesamtzeit der Injektion gemäß dem Experiment. Berechnen Sie diese Parameter im Voraus unter Berücksichtigung des von der Zielstruktur belegten Volumens und der Menge der zu injizierenden Lösung. Für dieses Experiment injizieren Sie 200 nL Lösung mit einer Rate von 50 nL pro Minute für eine Gesamtinfusionszeit von 4 Minuten.
- Füllen Sie zwei 10 μL Hamilton-Spritzen mit sterilem destilliertem Wasser, führen Sie ein Stück sterilen Teflonschlauch in den Schlauchanschluss jedes Mikroinjektors ein, um sicherzustellen, dass die Länge des Schlauchs die Bewegung der Ratte nicht einschränkt (Schläuche können mit Ethylenoxid sterilisiert werden).
- Legen Sie ein Pad, das mit der inaktivierenden Substanz getränkt ist, und ein 2 cm x 2 cm großes Quadrat Paraffinfilm darüber. Pipetten Sie eine ausreichende Menge TTX, um die Nadel des Injektors und 1 cm des Schlauchs über der Folie zu füllen. Absorbieren Sie den TTX-Tropfen, indem Sie den Kolben vorsichtig einfahren. Montieren Sie die Spritzen in der Mikroinjektionspumpe und verwenden Sie ihre Steuerung, um den Kolben zu manipulieren, bis ein Tropfen TTX an der Spitze jedes Mikroinjektors zu sehen ist. Entsorgen Sie die Tropfen in das mit inaktivierender Substanz getränkte Pad.
- Wählen Sie die Ratten aus, die mikroinjektiert werden sollen. Verwenden Sie nur Ratten, die nach der Operation mindestens drei aufeinanderfolgende Zyklen zeigten. Betrachten Sie ihr Stadium des Zyklus und die Tageszeit. Sowohl die Zeit als auch das Stadium hängen von der spezifischen Hypothese ab, die Sie testen werden, für dieses Experiment 14:00 Stunden Proestrus ausgewählt, da die nervösen präovulatorischen Signale, die die phasische GnRH-Sekretion steuern, in diesem Moment auftreten. Transportieren Sie sie in den Raum, in dem die Injektion in ihren eigenen Gehäusekäfigen stattfindet, um Stress zu vermeiden.
- Halten Sie die Ratte mit einem festen Griff, entfernen Sie die Kappe und die Obturatoren von den Kanülen, führen Sie die Mikroinjektoren in die Führungskanülen ein und bringen Sie das Tier in den Käfig zurück.
- Schalten Sie die Pumpe ein und warten Sie, bis die Mikroinjektion abgeschlossen ist. Beobachten Sie das Tier während dieser Zeit, um eine mögliche Ablösung der Mikroinjektoren zu erkennen und das Verdrehen der Teflonröhren zu vermeiden.
- Lassen Sie die Mikroinjektoren für zwei weitere Minuten an Ort und Stelle, um einen Rückfluss der Lösung zu vermeiden. Entfernen Sie sie, reinigen Sie die Oberfläche des Implantats mit Jodpovidon antiseptischer Lösung und vermeiden Sie den Fluss in den Führungskanülen. Setzen Sie sterile Obturatoren ein, setzen Sie die Kappe auf und bringen Sie das Tier in den Kolonieraum zurück. Beobachten Sie das Tier regelmäßig, um mögliche Nebenwirkungen des Arzneimittels zu erkennen.
- Schalten Sie die Pumpe mit den gleichen Parametern wie bei der Mikroinjektion ein und überprüfen Sie, ob ein korrekter Durchfluss vorn ist, um sicherzustellen, dass die Durchgängigkeit des Systems während des Verfahrens erhalten bleibt.
- Drücken Sie den Kolben, um den TTX/das Fahrzeug aus dem Mikroinjektor auszustoßen, bis die Luftblase die Nadelspitze erreicht. Erinnern Sie sich an den TTX in seinem Mikroröhrchen. Füllen Sie die Spritze mit destilliertem Wasser und reinigen Sie damit das Innere der Röhrchen. Entsorgen Sie das Wasser in der inaktivierenden Substanz und wiederholen Sie diesen Vorgang mindestens dreimal. Reinigen Sie die Außenseite von Spritzen, Röhrchen und Mikroinjektoren mit einem Tuch, das mit der inaktivierenden Substanz getränkt ist.
8. Euthanasie und Gewebeverarbeitung
- Am Tag des vorhergesagten oder vaginal bestätigten Östrus injizieren Sie der Ratte eine intraperitoneale Überdosis Natriumpentobarbital (75 mg/ kg). Überprüfen Sie auf Bewusstlosigkeit und injizieren Sie 200 nL einer 0,5% igen Methylenblaulösung durch die Leitkanülen, wie in den Schritten 7.1 bis 7.9 beschrieben. Überprüfen Sie die Ratte mit dem Zehen- oder Schwanzquetschtest auf Schmerzzeichen und enthaupten Sie die Ratte mit einer Nagetierguillotine, wenn keine entdeckt werden.
- Verwenden Sie eine Schere, um die Bauchhöhle zu öffnen und die Eierstöcke zu finden. Verwenden Sie eine feine Irisschere, um jeden Eierstock zu sezieren, und schneiden Sie mit Hilfe einer Lupe an der utero-tubealen Verbindung. Vermeiden Sie es, den Eileiter zu beschädigen, da dies zum Verlust von Eizellen führt.
- Legen Sie die Eierstöcke unter ein Stereomikroskop und verwenden Sie eine Rasierklinge, um das gesamte Fettgewebe zu entfernen, ohne das Organ zu beschädigen. Entfernen Sie den Eileiter von jedem Eierstock, indem Sie mit der Rasierklinge so weit wie möglich aus der Ampullenregion schneiden. Montieren Sie jeden Eileiter auf einer anderen Rutsche und bedecken Sie sie mit einem Tropfen Wasser. Lagern Sie die Eierstöcke in einer Durchstechflasche mit Bouins Lösung.
- Trocknen Sie die Eileiter vorsichtig mit einem saugfähigen Papiertuch ab und suchen Sie unter dem Stereomikroskop nach der Ampulle. Halten Sie mit der nicht dominanten Hand den Eileiter an Ort und Stelle, indem Sie mit einer 23-G-Nadel weit von der Ampulle entfernt kneifen, und verwenden Sie dann eine weitere 23 G-Nadel in der dominanten Hand, um einen 1-mm-Schnitt im mittleren Bereich der Ampulle zu machen. Die Kumulus-Eizell-Komplexe ragen als Tropfen viskoser Flüssigkeit aus dem Schnitt heraus (Abbildung 2D). Verwenden Sie die Nadel in der dominanten Hand, um den Tropfen sanft und langsam weit vom Eileiter zu ziehen. Drücken Sie den Rest der Ampulle, um sicherzustellen, dass keine Eizellen im Inneren verbleiben. Extrahieren Sie die Eizellen so schnell wie möglich aus den Eileitern, da die Austrocknung des Eileiters die Eizellen im Inneren irreversibel einfängt.
- Entfernen Sie den Eileiter vom Objektträger und warten Sie, bis der Flüssigkeitstropfen, der die Eizellen enthält, trocknet. Färben Sie die Probe mit Hämatoxylin-Eosin. Verwenden Sie das Montagemedium zum Abdecken. Beobachten Sie unter dem Mikroskop (10x), um die Anzahl der Eizellen zu bestimmen, die von jedem Eierstock abgeworfen werden.
HINWEIS: Opfer durch Herzperfusion werden in diesem Protokoll nicht durchgeführt, da die Eizellen in den Eileitern eingeschlossen wären und daher histologische Methoden zur Beurteilung des Eisprungs erforderlich wären. Wenn der Benutzer durchlässig sein muss, um andere Gewebe zu analysieren, können zuerst die Eierstöcke entfernt und die absteigenden Arterien mit dicken Hämostaten unter der Leber eingeklemmt werden, um das Austreten von Fixiermitteln zu vermeiden. - Entfernen Sie die Haut des Kopfes und tauchen Sie den Schädel in einen Glasbehälter mit einer 10% igen Formalinlösung. Lassen Sie die Fixierung des Kopfes für mindestens zehn Tage vor dem Entfernen der Kanüle zu, um eine Verzerrung des Gewebes zu vermeiden. Um die Kanüle zu entfernen, verwenden Sie eine Schere, um alle Muskeln in der Region des Schädels, die sie umgibt, zu lösen. Schneiden Sie zwischen den Nasen- und Frontalknochen mit Knochentrimmern und entfernen Sie dann den Okzipitalknochen. Setzen Sie die Spitze der Trimmer in das Foramen magnum ein und schneiden Sie durch die sagittalen Kämme, die den Rest des Nasenbeins erreichen.
- Die isolierte Region der Schädelspitze muss die Frontal- und Parietalknochen enthalten. Entfernen Sie die implantierte Kanüle, die an der Oberseite des Schädels befestigt ist, indem Sie sie langsam senkrecht zum Kopf nach oben ziehen. Schneiden Sie jeden angebrachten Teil der Hirnhäute mit einer feinen Irisschere ab, um eine Verformung des Gehirns zu vermeiden.
- Machen Sie einen vorderen-hinteren Schnitt an den Hirnhäuten und legen Sie sie beiseite, um das Gehirn von der Schädelbasis zu entfernen. Setzen Sie eine stumpfe Pinzette unter die Riechkolben ein und ziehen Sie das Gehirn vorsichtig nach oben, bis die Sehnerven sichtbar sind. Schneiden Sie die Nerven mit einer feinen Irisschere ab und ziehen Sie das Gehirn heraus. Bewahren Sie das Gehirn in fixierender Lösung.
- Erhalten Sie 50 μm dicke Abschnitte des Gehirns mit einem Vibratom, montieren Sie sie in poly-L-Lysin-beschichteten Objektträgern (0,1% in destilliertem Wasser) und färben Sie sie mit der Nissl-Technik. Beobachten Sie die Objektträger unter dem Mikroskop (10x), um die Endposition der Kanülen (Abbildung 2A-2C) und die Ausbreitung des Farbstoffs mit Hilfe eines Rattenhirnatlas27zu bestimmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Das oben beschriebene Protokoll wurde getestet, indem die Wirkungen eines einzelnen TTX oder Vehikels (künstliche Zerebrospinalflüssigkeit; ACSF) Mikroinjektion in einen von zwei verschiedenen Kernen, von denen bekannt ist, dass sie an der Regulation des Eisprungs bei der Ratte beteiligt sind: dem suprachiasmatischen und dem arkuaten Kern. Der suprachiasmatische Kern wurde gewählt, da er den zentralen circadianen Herzschrittmacher bei Säugetieren enthält. Es ist an der Regulierung zyklischer Ereignisse als Sekretion von Gonadotropinen beteiligt. Der Arkuatkern wurde ausgewählt, weil er eine Population von Neuronen enthält, die Östradiolrezeptoren exprimieren, die die GnRH-Sekretion während des größten Teils des Östrogenzyklus stimulieren. Die Mikroinjektion wurde um 14:00 Uhr des Proestrusstadiums durchgeführt, einer Periode, die als "kritisches Fenster" bekannt ist, da viele der zentralen Mechanismen auftreten, die die präovulatorische Freisetzung von Gonadotropinen regulieren. Nach der Behandlung wurden jeden Tag vaginale Abstriche genommen und die Ratten wurden um 09:00 Uhr des vorhergesagten Östrustages eingeschläfert, was mit einem für Östrus charakteristischen Vaginalabstrich zusammenfiel. Als zusätzliche Kontrollgruppe wurden fünf intakte Ratten verwendet, die im Stadium des Östrus eingeschläfert wurden. Der Anteil der Radsporttiere nach der Operation und der Anteil der ovulierenden Ratten jeder Gruppe (ovulierende Ratten/n) wurden mit Fishers exaktem Wahrscheinlichkeitstest berechnet und analysiert. Die Anzahl der eizellen, die von beiden Eierstöcken abgestoßen wurden, wurde durch den Kruskal-Wallis-Test analysiert, gefolgt von Dunns Test. Es wurden geeignete statistische Tests durchgeführt, um sicherzustellen, dass der Stichprobenumfang angemessen war.
Insgesamt wurden 30 weibliche Ratten mit Leitkanülen implantiert, die auf eines der beiden Zielgebiete zielten. Wie in Abbildung 3gezeigt, waren alle Tiere vor der Operation zyklisch, aber nur sieben von ihnen zeigten keine Veränderungen des Östrogenzyklus nach dem Kannulationsverfahren. Dreiundzwanzig Tiere zeigten vorübergehende Veränderungen ihrer Zyklen, die durch eine Zunahme der Anzahl der Tage mit leukozytärem Abstrich gekennzeichnet waren. Solche Veränderungen sind wahrscheinlich auf den durch die Operation induzierten Stress zurückzuführen und allmählich abgenommen. Im fünften Zyklus wurden achtundzwanzig Ratten als zyklisch betrachtet und die restlichen zwei wurden aus dem Experiment verworfen. Dieses Ergebnis zeigt, dass nach einer Erholungszeit von vier Östrous-Zyklen (16 Tage) die meisten der kanwellierten Tiere für weitere Experimente geeignet sind.
Abbildung 4A und Abbildung 4B zeigen den Prozentsatz der ovulierenden Tiere bzw. die Anzahl der Eizellen, die von intakten Tieren bzw. von den mit ACSF oder TTX behandelten Gruppen in den suprachiasmatischen Kern abgeworfen werden. Alle intakten Ratten ovulierten und dasselbe galt für die ACSF-Gruppe. Keines der mit TTX mikroinjektierten Tiere hatte jedoch einen Eisprung. Die Einspritzung des Fahrzeugs hat die Anzahl der ausgeschiedenen Eizellen nicht geändert. Es wäre jedoch interessant, die Lebensfähigkeit und Qualität der freigesetzten Eizellen zu beurteilen. Ähnliche Ergebnisse können in Abbildung 4C und Abbildung 4D für Ratten beobachtet werden, die in den Arkuatkern mikroinjektiert wurden. In beiden Fällen bewies diese Methode die Beteiligung einer diskreten Hirnregion an der Regulation des Eisprungs am kritischen Fenster des Proestrusstadiums, was zunächst aus Läsionsstudien abgeleitet, aber nicht bestätigt wurde. Die Auswirkungen der TTX-Mikroinjektion scheinen eher vorübergehend als dauerhaft zu sein, da ein früheres Experiment zeigte, dass Ratten, die in den suprachiasmatischen Kern außerhalb des "kritischen Fensters" injiziert wurden, am erwarteten Tag des Östrus26ovulierten. Die Einbeziehung von Kontrollgruppen, in denen die Tiere mit einer 24-Stunden-Zeit oder bis ein klarer vaginaler Östrusabstrich erreicht ist, geopfert werden, wird jedoch ebenfalls empfohlen, um dieses Problem anzugehen.
Die Ergebnisse in Abbildung 5A-B stellen das ovulatorische Ergebnis von Tieren dar, die mit ACSF oder TTX behandelt wurden. Wie jedoch nach histologischer Bestätigung festgestellt wurde, befanden sich ihre Kanülen außerhalb der beabsichtigten Region. Die meisten dieser Kanülen wurden in der vorderen Kommissur oder im retrochiasmatischen Bereich platziert, zwei Bereiche, die nicht zur Regulierung des Eisprungs beitragen. Beide Strukturen zusammen mit dem suprachiasmatischen und dem arkuaten Kern sind sehr nah am dritten Ventrikel, wenn man bedenkt, dass eine Blockade des Eisprungs bei allen Tieren zu erwarten wäre, wenn das Medikament in den Ventrikel austritt. Die Tatsache, dass die TTX-Mikroinjektion außerhalb der Ziele den Eisprung nicht blockieren konnte, deutet darauf hin, dass das Volumen des mit der gewählten Rate infundierten TTX nicht in den Ventrikel austrat, was die regionsspezifischen Effekte von TTX offenbart. Zur Unterstützung dieser Idee zeigte die histologische Analyse der Gehirnschnitte nur gefärbte Neuronen in der Nähe der Spitze der Leitkanülen. Wir müssen jedoch klarstellen, dass keine direkte Bewertung der Ausbreitung des Arzneimittels durchgeführt wurde und daher diese Schlussfolgerung weiter behandelt werden sollte.
Abbildung 1: Vaginalabstriche, die für jedes Stadium des Rattenösenzyklus repräsentativ sind. Östrus (A) ist gekennzeichnet für das Vorhandensein von epithelialen verhornten Zellen ohne Kern, die entweder allein gefunden werden können, um kumulös als Folge der epithelialen Abschämung zu bilden. Bei Metestrus (B) können einige dieser verhornten Zellen noch vorhanden sein, sind aber von Leukozyten, die auch bei Diestrus (C) der vorherrschende Zelltyp sind, in der Unterzahl. Proestrusproben (D) zeichnen sich durch ihre viskose Konsistenz und die Vorherrschaft von epithelialen Kernzellen aus. Die Maßstabsleiste in jedem Panel stellt 10 μm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Histologische Untersuchung von Proben nach Euthanasie. Hirnkoronale Schnitte im Bereich des Arkuatkerns (ARC) und der medianen Eminenz (EM) einer intakten Ratte (A), einer bilateral kanülierten Ratte (B) und einer Ratte mit einer verlegten Kanüle (C). Die Sternchen zeigen auf den Bereich, in dem sich die Spitze der Führungskanülen befand, in B die Spitzen am Basalrand des ventromedialen Kerns (VMH), so dass die hervorstehenden Injektoren den oberen Rand des ARC erreichen konnten. In C befand sich eine Kanüle im dritten Ventrikel (3V), was zu einer nicht lokalisierten ventrikulären Mikroinjektion führte. Dies ist ein häufiger Fehler, wenn sich das Ziel in der Nähe der Mittellinie befindet und Daten von diesen Tieren verworfen werden müssen. Bei richtiger Durchführung sollte die Extraktion von Eizellen zu einem einzigen Tropfen viskoser Flüssigkeit führen, der alle Eizellen aus dem untersuchten Eileiter enthält, wie in Panel (D) zu sehen ist. Die Maßstabsleiste in jedem Panel stellt 500 μm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Kumulativer Prozentsatz der Radsporttiere vor und nach der Implantation der Kanüle (***p≤0,0001; **p=0,0003 vs. Zyklus vor der Operation, Fishers exakter Wahrscheinlichkeitstest). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Prozentsatz der ovulierenden Tiere und Median mit Interquartilsbereich (Fehlerbalken) der Anzahl der Eizellen, die von Tieren mit Mikroinjekt in die Zielstruktur #1 (suprachiasmatischer Kern, A-B) oder #2 (Arkuatkern, C-D) mit künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) oder Tetrodotoxin (TTX) um 14:00 Uhr des Proestrusstadiums eingeschöpft wurden. Die intakte Gruppe wurde zu Vergleichszwecken zu jedem Diagramm hinzugefügt und die Zahl innerhalb der Balken stellt den Anteil der ovulierenden Weibchen dar (***p≤0,01 vs. Intact- und ACSF-Gruppen, Fishers exakter Wahrscheinlichkeitstest bzw. Kruskal-Wallis-Test). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Prozentsatz der ovulierenden Tiere (A) und Median mit Interquartilsbereich (Fehlerbalken) der Anzahl der eiabgeworfenen Eizellen (B) von Tieren, deren Kanülen außerhalb der Zielgebiete bestimmt wurden. Diese Tiere wurden um 14:00 Uhr des Proestrus mit künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) oder Tetrodotoxin (TTX) mikroinjektiert. Die intakte Gruppe wurde zu Vergleichszwecken zu jedem Diagramm hinzugefügt und die Zahl innerhalb der Balken stellt den Anteil der ovulierenden Weibchen dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dieser Artikel beschreibt eine Methode, um eine diskrete Region im Gehirn von wachen und hemmungslosen Ratten zu einem bestimmten Zeitpunkt vorübergehend zu inaktivieren. Eine einfache Methode, um ihren Östrogenzyklus zu verfolgen und den Eisprung zu beurteilen, wird ebenfalls angeboten. Dieses Protokoll ermöglicht eine einfache Analyse des Beitrags bestimmter Gehirnregionen zu den Mechanismen, die den Eisprung antreiben, indem das Eisprungergebnis von TTX-behandelten Tieren mit dem von fahrzeugbehandelten Tieren verglichen wird. Mit Ausnahme des stereotaktischen Instruments und der Mikroinjektionspumpe, die in neurowissenschaftlichen Labors üblich sind, benötigt diese Methode keine teuren Materialien. Kommerzielle Kanülen und Mikroinjektoren sind die übliche Wahl für diese Art von Experiment, aber das hier beschriebene einfach zu bauende System senkt die Kosten und die Ergebnisse sind nicht zu unterscheiden. Durch die Verwendung dieses Protokolls und der in der Tabelle aufgeführten Materialien, die diesem Artikel beiliegen, können zehnmal mehr Kanülen hergestellt werden, indem der gleiche Geldbetrag ausgegeben wird, den ein kommerzielles Kit für zehn Tiere kosten würde. Der Bau von zehn beidseitigen Kanülen, unabhängig von der für die Studie erforderlichen Anpassung, kann in wenigen Stunden durchgeführt werden. Darüber hinaus sind alle Komponenten wiederverwendbar, was die Wirtschaftlichkeit erhöht.
Zusammen mit dem Nutzen-Kosten-Verhältnis ist dieses Protokoll für jede Laborumgebung geeignet, da es von jedem Personal, einschließlich Studenten, mit Kenntnissen der Nagetiermanipulation, der stereotaxischen Chirurgie und des Umgangs mit biologischen Toxinen und verwandten Abfällen durchgeführt werden kann. Darüber hinaus kann es angepasst werden, um bei jeder Art von Nagetieren und anderen kleinen Säugetieren wie Kaninchen, Frettchen, Weißbüschelaffen und sogar bei Nicht-Säugetierarten wie Vögeln und Reptilien verwendet zu werden. Neben den oben genannten Merkmalen besteht der Hauptvorteil dieses Protokolls darin, dass es leicht für die Untersuchung anderer Prozesse unter der Regulierung des Gehirns wie die Aktivität peripherer Organe, die homöostatische Reaktion auf Umweltherausforderungen und verschiedene Verhaltensweisen angepasst werden kann.
Es gibt mehrere kritische Schritte, die vor Beginn des Experiments durchgeführt werden müssen, um die gewünschten Ergebnisse zu erzielen. Zunächst müssen die Koordinaten der Zielstruktur empirisch berechnet werden, da die in Hirnatlanten berichteten Koordinaten aufgrund ihrer Belastung, ihres Geschlechts oder ihres Alters nicht unbedingt mit den für die Studie vorgesehenen Tieren übereinstimmen. Mehrere Studien haben gezeigt, dass implantierte Elektroden und Infusionssonden die Funktion der verletzten Zone nicht nur durch die Zerstörung von Nervenkörpern und Fasern, sondern auch durch die Aktivierung von Gliazellen verändern. Die Entzündungsreaktion, die unmittelbar nach der Implantation beginnt, verursacht typischerweise eine Verkapselung des Fremdkörpers durch Gliazellen. Diese Zellen bilden eine enge Hülle, die den Fluss von Neurotransmittern behindert und Neuronen verdrängt, was einen Prozess der Neurodegenerationeinleitet 31. Die schädlichen Auswirkungen des Implantationsverfahrens können nicht vermieden werden und es sollte darauf geachtet werden, dass solche Effekte so weit wie möglich von der interessierenden Hirnregion entfernt auftreten. Koordinaten sollten berechnet werden, um die Leitkanülen nur dann in den Zielbereich zu platzieren, wenn sie groß genug sind, um sicherzustellen, dass nicht mehr als 10% der Fläche durch die Kanüle beschädigt werden. Dieser Ansatz ist beispielsweise nützlich, wenn große Bereiche des Kortex untersucht werden. Auch in diesem Fall muss eine detaillierte Analyse der Kontrollgruppe durchgeführt werden, um die Auswirkungen des Implantats auf den interessierenden Prozess zu berücksichtigen. Für kleine Strukturen wie diskrete hypothalamische Kerne empfehlen wir Forschern, die Koordinaten zu berechnen, um die Leitkanülen in einem Abstand von 0,5 bis 2 mm von der oberen Grenze der Zielstruktur im mittleren Bereich in der vorderen-hinteren und medial-lateralen Ebene gemäß dem Hirnatlas zu platzieren (Abbildung 2B). Für diesen Ansatz müssen die Injektoren so ausgelegt sein, dass sie so weit herausragen, dass sie die Grenze des Ziels erreichen. Wir haben dies für die beiden in diesem Protokoll beschriebenen Kerne getestet und festgestellt, dass diese Ratten ihren Östrogenzyklus und die Fähigkeit, schneller zu ovulieren, wiedererlangten als die Tiere mit Kanülen, die in die Ziele implantiert wurden.
Die Löslichkeit der zu injizierenden pharmakologischen Wirkstoffe sollte berücksichtigt werden, damit die Vehikellösung der der Zerebrospinalflüssigkeit so ähnlich wie möglich ist. TTX kann als lyophilisiertes Pulver gekauft werden, entweder allein oder mit Citrat. Der erste hat eine geringe Löslichkeit in Wasser und ein saurer Puffer mit einem pH-Wert um 5,0 wird empfohlen, um ihn zu rekonstituieren, aber dies kann die Möglichkeit einer Schädigung des Gewebes durch Injektionen des Fahrzeugs allein mit sich bringen. Auf der anderen Seite kann TTX-Citrat in Wasser oder 0,9% iger Kochsalzlösung gelöst werden, die beide häufig als Vehikel verwendet werden. Wir empfehlen, diese beiden Fahrzeuge nicht zu verwenden, und empfehlen stattdessen die Verwendung von künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit oder Ringers Laktatlösung. Eine frühere Studie zeigte, dass Kochsalzlösung, die mikroinjektiert in den suprachiasmatischen Kern geschleudert wird, schädliche Auswirkungen auf den Eisprung hat, wenn sie an Östrus oder Diestrus durchgeführt wird26. Mehrere Artikel haben berichtet, dass die Durchblutung von Nervengewebe mit Lösungen, die nicht den physikalischen und chemischen Eigenschaften der Zerebrospinalflüssigkeit entsprechen, die Anatomie und Physiologie von Neuronen verändert und Entzündungsreaktionen und Zelltod fördert32,33,34,35. In Anbetracht dieser Ergebnisse wird die Verwendung von künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit als Vehikel in allen Experimenten mit Mikroinjektion von Medikamenten in das Gehirn dringend empfohlen.
Vor Beginn der Experimente sollten die Forscher empirisch das optimale Volumen der zu injizierenden Lösung bestimmen, da sowohl das Auslaufen in benachbarte Strukturen als auch die unzureichende Abdeckung die Interpretation der Ergebnisse verwirren könnten. Dies kann erreicht werden, indem ein wasserlöslicher Farbstoff in klare Agar- oder Gelatinewürfel mikroinjektiert wird. Die Dispersion des Farbstoffs kann dann abschätzen und mit der erwarteten Größe des Ziels verglichen werden, wie im Hirnatlas berichtet. Dennoch beeinflussen Eigenschaften der interessierenden Gehirnregion wie ihre Zelldichte und das Vorhandensein von Faserbahnen oder ventrikulären Grenzen die Diffusionsdynamik, und die Ergebnisse können von denen in Agar und Gelatine abweichen. Dementsprechend muss der Forscher dann die in vitro erhaltenen Parameter im Zielgebiet einiger weniger Tiere testen. Mehrere Farbstoffe wurden erfolgreich für intrazerebrale Mikroinjektionen bei Ratten eingesetzt, um die Diffusion eines bestimmten Lösungsvolumens abzugrenzen. Die häufigsten Beispiele sind Kresylviolett, Thioninblau, Methylenblau, Evan-Blau, schnelles Grün und Indische Tinte. Diese Farbstoffe werden in destilliertem Wasser in einer Konzentration von 0,5% oder weniger gelöst. Evans Blau hat den Vorteil, dass es in einem Fluoreszenzmikroskop nachweisbar ist (Anregung bei 620 nm und Emission bei 680 nm), was eine quantitativere Analyse der Ausbreitung ermöglicht. Auch Latex-Mikroperlen können für diesen Ansatz geeignet sein. Es ist wichtig zu erwähnen, dass Volumina größer als 2,0 μL mit dieser Technik nicht in das Gehirn verabreicht werden sollten, da mechanische Schäden und Gewebeverschiebung auftreten36.
Die Durchflussrate der Lösung ist auch ein wichtiger Faktor, da die Mikroinjektion hoher Volumina bei hoher Geschwindigkeit Gewebeverschiebung und mechanische Läsionen verursacht40. Darüber hinaus erhöht eine hohe Infusionsrate auch die Ausbreitung des Arzneimittels, was zur Inaktivierung benachbarter Strukturen führt. Eine Verdreifachung der von einer Lösung abgedeckten Fläche kann durch Änderung der Infusionsrate von 100 nL/5 Minuten auf 100 nL/1 Minute36verursacht werden. Histologische Beobachtungen von Rattengehirnen, denen Methylenblau injiziert wurde, deuten darauf hin, dass eine Infusionsrate von 50 nL / Minute das Gewebe nicht verdrängt, während das Medikament in den Zielbereich eingeengen wird (persönliche Beobachtungen). Dies wurde nur mit Volumina von mindestens 200 nL getestet, und daher müssen die Forscher Pilotexperimente durchführen, wenn größere Volumina verwendet werden.
Sobald das Arbeitsvolumen bestimmt wurde, wird auch empfohlen, die Ausbreitung auf jedes Tier zu beurteilen. Dies kann entweder durch die gleichzeitige Injektion eines Farbstoffs mit den Medikamenten oder durch Injektion einige Minuten vor der Euthanasie erfolgen, wie in diesem Protokoll beschrieben. Das erste Modell ermöglicht es dem Farbstoff, sich zusammen mit dem Toxin zu verbreiten und so eine genauere Beurteilung des betroffenen Bereichs zu ermöglichen. Ein Nachteil dieser Methode ist, dass der Farbstoff die Aktivität des Arzneimittels stören und auch zytotoxisch sein kann. Schließlich kann es zu einer Clearance aus dem Nervengewebe kommen, wenn das Tier mehrere Tage nach dem Injektionsverfahren überleben muss, was sich auf die Schätzung der Ausbreitung auswirken würde. Wenn dieser Ansatz verwendet wird, müssen die Auswirkungen des Farbstoffs auf den untersuchten Prozess durch einen Vergleich des Ergebnisses der Fahrzeug-Farbstoff-Gruppe mit dem von intakten Tieren untersucht werden. Wenn die Injektion des Farbstoffs vor der Euthanasie erfolgt, wird empfohlen, dies nach den gleichen Parametern wie während der Mikroinjektion (Infusionsrate und Volumen) zu tun. Dies sollte mindestens 10 Minuten vor der Euthanasie durchgeführt werden, um die Ausbreitung der Lösung zu ermöglichen. Bei dieser Methode wurde festgestellt, dass 200 nL einer TTX/Methylenblau-Lösung eine Kugel mit einem Durchmesser von 0,6 mm bedeckt und sich die Dispersion nicht signifikant ändert, wenn die Mikroinjektion 1 Stunde vor dem Opfer auftritt (persönliche Beobachtung). Dies stimmt mit der Studie von Freund und Kollegen37sowie der von Zhuravin und Bures38überein, die beide ergaben, dass sich 1 μL TTX-Lösung in einem kugelförmigen Volumen mit einem Durchmesser von etwa 3 mm ausbreitet. Im Allgemeinen wurde gezeigt, dass die Dispersion des Arzneimittels von seinem Molekulargewicht und dem injizierten Volumenabhängt, 39 und die oben genannten Ergebnisse stimmen mit der Diffusion von Farbstoffen mit einem Molekulargewicht überein, das dem des TTX ähnelt. Wenn eine genauere Kontrolle der Dispersion erforderlich ist, kann die Injektion von radioaktiv markiertem TTX oder die Implementierung der Immunhistochemie gegen reguläres TTX mit kommerziell erhältlichen Antikörpern durchgeführt werden37. Neben einer besseren Abgrenzung des vom Medikament abgedeckten Bereichs werden diese beiden Ansätze durch die Clearance des TTX aus dem Gewebe begrenzt, was berücksichtigt werden muss, wenn das Tier mehrere Tage nach der Mikroinjektion überleben sollte, auf der anderen Seite wird die Arbeit und Entsorgung von radioaktivem Material neue Schritte und Sicherheitsfragen einführen, die nicht mit allen Labors und Protokollen kompatibel sein könnten.
Die Einbeziehung einer Kontrollgruppe, die aus Tieren besteht, die in einen Gehirnbereich injiziert werden, der keine Rolle bei der Regulierung des untersuchten Prozesses spielt, wird empfohlen. Diese Gruppe wird dem Forscher helfen, die Spezifität des Zielbereichs bei der Regulierung dieses Prozesses zu bestimmen und die Möglichkeit zu verwerfen, dass die Medikamente, die in irgendeiner Struktur injiziert werden, ein Blockierensignal auslösen könnten, das auf einem weiter verbreiteten Mechanismus wie der Aktivierung der Stress- oder Immunachse basiert. Da selbst die experimentiertesten stereotaktischen Chirurgen nicht in der Lage sind, eine 100% ige Erfolgsrate zu erzielen, wenn kleine Strukturen anvisiert werden, werden diese Experimente in der Regel von Kanülen begleitet, die außerhalb der gewünschten Struktur platziert werden, und daher wird diese Kontrollgruppe unbeabsichtigt erreicht. Die Ergebnisse der Tiere, bei denen die Kanüle verlegt wurde, sind wertvoll und sollten nicht weggeworfen werden; Stattdessen muss eine umfassende Analyse unter Berücksichtigung der injizierten Fläche und der Dispersion des Arzneimittels durchgeführt werden. Von besonderem Interesse sind die Ergebnisse, die eine andere Wirkung (oder keine) bei Tieren zeigen, die in Regionen in der Nähe der Ziele injiziert werden.
Dieses Protokoll hat Einschränkungen, die der chronischen Platzierung von Kanülen innewohnen. Es ist nicht möglich, die dauerhafte Zerstörung von Durchgangsfasern und neuronalen Körpern in der Flugbahn der Kanüle zu vermeiden. Die Verwendung von Glaskapillaren mit einem Spitzendurchmesser von wenigen Mikrometern ist die Methode der Wahl, um Medikamente mit minimaler Schädigung des Gewebes in das Gehirn zu bringen41. Diese Methodik wurde jedoch hauptsächlich in Versuchen verwendet, in denen das Tier betäubt und/ oder der Kopf an der stereotaxischen Vorrichtung oder anderen Haltervorrichtungen befestigt wird. Dies liegt vor allem an der Zerbrechlichkeit der Kapillare selbst, die es schwierig macht, sie an einem wachen und hemmungslosen Tier zu befestigen. Ein System, das Glaskapillaren verwendet, die anstelle von Leitkanülen mit osmotischen Pumpen verbunden sind, hat eine erhebliche Verbesserung der Menge des geschädigten Hirngewebes und der Gliareaktion auf die Verletzung gezeigt42. In diesem System ist die Infusion der Medikamente jedoch eher chronisch als zeitgesteuert und daher in Experimenten, in denen die Injektionszeit genau kontrolliert werden muss, nicht sinnvoll. Ein Mikroinjektionssystem, das auf einer Glaskapillare basiert, die durch eine zuvor implantierte Führungskanüle in den Zielbereich eingeführt wird, wurde von Akinori und Kollegenbeschrieben 43. Dieses System ermöglicht die Injektion eines wachen Tieres zum gewünschten Zeitpunkt, ist jedoch nicht sehr robust und das Tier muss während des Eingriffs eingeschränkt werden, was zu einer Aktivierung der Stressreaktion führen kann. In diesem Protokoll können die Auswirkungen einer Schädigung des Nervengewebes in der Flugbahn der Leitkanüle durch den Vergleich der intakten und der Fahrzeuggruppe kontrolliert werden. Hier wurde ein ähnliches ovulatorisches Ergebnis für beide Gruppen gezeigt, und es wurde der Schluss gezogen, dass das betroffene Gewebe sowie die Injektion des Fahrzeugs den Eisprung nicht störten. Die Forscher müssen Pilotstudien durchführen, um festzustellen, ob die Strukturen, die sich dorsal zu ihrem Zielgebiet befinden und von der Kanüle zerstört würden, an der Regulierung des untersuchten Prozesses beteiligt sind. Eine vielversprechende zukünftige Richtung für diese Arbeit ist jedoch die Entwicklung eines Abgabesystems, das die Stärken sowohl der Führungskanülen als auch der Glaskapillaren nutzt.
Eine weitere wichtige Überlegung für Forscher ist der Zeitpunkt der Wirkung von TTX. Zhuravin und Bures38 haben gezeigt, dass TTX einige Minuten braucht, um eine maximale Blockade der neuronalen Übertragung zu erreichen, die etwa eineinhalb Stunden dauert und über mehrere Stunden allmählich abnimmt. Dies macht TTX zum Medikament der Wahl, wenn eine lang anhaltende Inaktivierung erforderlich ist. Wenn das Experiment eine schnellere Inaktivierung erfordert, können Lokalanästhetika wie Lidocain verwendet werden, da es nur wenige Sekunden dauert, bis eine maximale Blockade erreicht ist. Die Wirkung dieses Medikaments dauert weniger als 20 Minuten und bietet eine feinere zeitliche Auflösung als TTX. Die oben genannten Eigenschaften machen TTX zu einem guten Werkzeug für explorative Experimente, die das Vorhandensein von neuronalen Signalen untersuchen, die in weniger genau definierten zeitlichen Fenstern erzeugt werden. Lidocain hingegen ist nützlich, um dieses Fenster44 abzugrenzen. Ein Nachteil beider Medikamente ist, dass sie die Übertragung von Aktionspotentialen in Durchgangsfasern blockieren und Artefakte in die Interpretation der Daten einführen, da das Signal möglicherweise von einer anderen Struktur stammen könnte, die axonale Projektionen an den injizierten Bereich sendet. In diesem Fall ist eine sorgfältige Analyse der Injektionen, die außerhalb des Zielbereichs liegen, sehr wichtig. Zum Beispiel wurde in diesem Artikel gezeigt, dass die TTX-Infusion in den Bereich, der nur vor dem suprachiasmatischen Kern liegt, und in den Bereich zwischen ihm und dem Arkuatkern den Eisprung nicht blockierte. Solche Ergebnisse zeigten, dass die Fasern und Zellen in diesen Regionen nicht an der Regulation des Eisprungs beteiligt sind, was aufgrund des Vorhandenseins eines reziproken Netzes von Fasern, das den suprachiasmatischen Kern sowohl mit dem Arkuatkern als auch mit den vorderen Regionen, die GnRH-Neuronen enthalten, verbindet, unerwartet war.
Eine Alternative, die die Übertragung entlang der Durchgangsfasern im injizierten Bereich nicht blockiert, ist die Verwendung von zweiwertigen Kationen wie Kobalt und Magnesium, die beide die Freisetzung von Neurotransmittern durch präsynaptische Terminals hemmen. Das Problem bei diesem Ansatz ist jedoch die sehr kurze Zeit der inaktivierenden Wirkung und die hoheToxizität 44. Andere Möglichkeiten, eine Blockade von Fasern zu vermeiden, sind die optogenetischen und chemogenetischen Ansätze, die beide Strategien zur Manipulation der Aktivität bestimmter neuronaler Populationen sind. Selektivität wird durch transfizieren von Neuronen mit viralen Vektoren erreicht, die entwickelt wurden, um Sequenzen einzufügen, die entweder für Opsine kodifizieren, die an Ionenkanäle gebunden sind, oder modifizierte Rezeptoren, die unter bestimmten Promotoren exprimiert werden. Die Mikroinjektion des Vektors wird bei betäubten Tieren mit Glaskapillaren durchgeführt, wodurch das umgebende Gewebe wenig gestört wird. Die Implantation von optischen Fasern oder die systemische Injektion synthetischer Drogen ermöglicht eine sehr präzise Manipulation der Zielpopulation45. Diese Techniken erwiesen sich in einer Studie als nützlich, entweder allein oder in Verbindung mit Techniken wie der TTX-Mikroinjektion, die in diesem Protokoll vorgestellt werden46. Dennoch müssen mehrere Aspekte dieser Methoden berücksichtigt werden, um erfolgreiche Experimente zu entwerfen, einschließlich der Validierung der Spezifität der Expression, der Kontrolle der Anzahl der transfizierten Zellen, der Bewertung der Toxizität und der Bewertung der Nebenwirkungen von Licht und chemischer Stimulation.
Zu den kritischen Komponenten dieses Protokolls gehörte die ordnungsgemäße Bestimmung des Stadiums des Östrogenzyklus für jedes Tier. Um dieses Verfahren erfolgreich durchzuführen, sind die Gewinnung von Qualitätsproben des Vaginalepithels und die korrekte Interpretation der Ergebnisse entscheidend (wir empfehlen, Abbildung 1 zu folgen). Darüber hinaus müssen die Forscher das Injektionssystem sorgfältig füllen, um den Einbau von Luftblasen zu verhindern, die zur Injektion ungenauer Mengen von Medikamenten führen könnten. Es ist auch wichtig, die Tiere während der Mikroinjektion zu überwachen, um zu verhindern, dass sie in den Schlauch beißen oder das System anderweitig stören. Schließlich sollten Forscher, die blind für experimentelle Bedingungen sind, das Ergebnis des Eisprungs, die endgültige Position der Kanüle und die Verteilung der Lösung in den Zielbereich analysieren, um sicherzustellen, dass die Interpretation der Ergebnisse unvoreingenommen ist.
Hier wurde eine zuverlässige, kostengünstige und unkomplizierte Methode beschrieben, um den Beitrag einzelner Hirnareals zur Regulation des Eisprungs zu analysieren. Dieses Verfahren wird bei wachen und hemmungslosen Ratten durchgeführt und übertrifft die schädlichen Auswirkungen der Blockade der Neurotransmission und auch die hemmenden Wirkungen, die Stresshormone wie Cortisol und Corticosteron auf die GnRH-Sekretion ausüben. Diese Methode ist vollständig anpassbar und kann verwendet werden, um jedes Medikament in jede Struktur des Gehirns zu liefern. Darüber hinaus kann es leicht für häufige Nagetier- und Nicht-Nagetierarten angepasst werden, die im Labor verwendet werden. Schließlich kann dieses Protokoll in Verbindung mit Methoden zur Quantifizierung von Substanzen wie Hormonen und Metaboliten im Blut, zur Beurteilung der Genexpression in Zellen und Geweben, zur Aufzeichnung der neuronalen Aktivität und auch zur Leistung wacher Tiere in Verhaltenstests verwendet werden, um die Rolle bestimmter Hirnareale in verschiedenen Verhaltens- und physiologischen Prozessen zu bestimmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben in Bezug auf diesen Artikel nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Raymond Sanchez von der University of Washington für seine wertvolle Hilfe bei der Manuskriptbearbeitung und M.Sc. Georgina Cortés und M.Sc. Cintia Javier für ihre technische Unterstützung bei der Standardisierung dieser Technik. Wir danken auch den Mitgliedern der Veterinärdienste der Facultad de Estudios Superiores Zaragoza: MVZ. Adriana Altamirano, MVZ. Roman Hernández und MVZ. Dolores-Elizabeth Guzmán für die hervorragende Pflege und Pflege von Versuchstieren. Die in diesem Protokoll beschriebenen Experimente wurden durch die DGAPA-PAPIIT-Zuschussnummer: IN216015 und durch die CONACyT-Zuschussnummer: 236908 an Roberto Domínguez unterstützt. Carlos-Camilo Silva ist Doktorand der Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) und wird vom Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Förderkennzeichen: 294555) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 μL Hamilton syringes | Hamilton | 80314 | |
| 21 G x 1" stainless steel hypdermic needle | BD | 305165 | |
| 23 G x 1" stainless steel hypdermic needle | BD | 305145 | |
| 30 G x 1/2" stainless steel hypdermic needle | BD | 305106 | |
| Artificial cerebrospinal fluid | BASi | MD-2400 | |
| Bone trimer | Fine Science Tools | 16152-12 | |
| Burr for micro drill | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Clipper | Wahl | ||
| Cut-off disc | Dremel | SM5010 | |
| Cutting tweezers | Truper | 17367 | |
| Cyanocrylate glue | Kola loka | K-1 | |
| Dental cement | Nic Tone | ||
| Enrofloxasin | Senosiain | ||
| Eosin | Sigma | E4009 | |
| Estereoscope | Zeiss | ||
| Extra fine Bonn scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Face mask | Lanceta HG | 60036 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Hematoxilin | Sigma | H3136 | |
| Hemostats | Fine Science Tools | 13008-12 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | 320331 | |
| Hypromelose artificial tears | Sophia Labs | 8950015 | |
| Isoflurane | Pisa Agropecuaria | ||
| Meloxicam | Aranda | 1183 | |
| Microinjection pump | KD Scientific | 788380 | |
| Monomer | Nic Tone | ||
| Mototool | Dremel | 3000 | |
| Nitrile gloves | Lanceta HG | 69028 | |
| Non-Rupture Ear Bars | David Kopf Instruments | 855 | |
| Poly-L lysine | Sigma | P4707 | |
| Povidone-iodine | Dermo Dine | ||
| Povidone-iodine with soap | Germisin espuma | ||
| Pressure tweezers | Truper | 17371 | |
| Rat anesthesia mask | David Kopf Instruments | Model 906 | |
| Saline solution | PISA | ||
| Scalpel | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Scalpel blade | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Sodium pentobarbital | Pisa Agropecuaria | ||
| Standard electrode holder | David Kopf Instruments | 1770 | |
| Stainless steel wire | American Orthodontic | 856-612 | |
| Stereotaxic apparatus | David Kopf Instruments | Model 900LS | |
| Surgical Sissors | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| Teflon connectors | Basi | MD-1510 | |
| Teflon tubing | Basi | MF-5164 | |
| Tetrodotoxin | Alomone labs | T-500 | |
| Vaporizer | Kent scientific | VetFlo |
References
- Herbison, A. E. Control of puberty onset and fertility by gonadotropin-releasing hormone neurons. Nature Reviews Endocrinology. 12 (8), 452-466 (2016).
- Fink, G. Neuroendocrine Regulation of Pituitary Function. Neuroendocrinology in Physiology and Medicine. Conn, M., Freeman, E. , Springer Science Business Media. New York. 107-133 (2000).
- Herbison, A. E. The Gonadotropin-Releasing Hormone Pulse Generator. Endocrinology. 159 (11), 3723-3736 (2018).
- Morello, H., Taleisnik, S. Changes of the release of luteinizing hormone (LH) on the day of proestrus after lesions or stimulation of the raphe nuclei in rats. Brain Research. 360 (1-2), 311-317 (1985).
- Slusher, M. A., Critchlow, V. Effect of Midbrain Lesions on Ovulation and Adrenal Response to Stress in Female Rats. Experimental Biology and Medicine. 101 (3), 497-499 (1959).
- Sawyer, C. H., Haun, C. K., Hilliard, J., Radford, H. M., Kanematsu, S. Further Evidence for the Identity of Hypothalamic Areas Controlling Ovulation and Lactation in the Rabbit. Endocrinology. 73 (3), 338-344 (1963).
- Schiavi, R., Jutisz, M., Sakiz, E., Guillemin, R. Stimulation of Ovulation by Purified LH-Releasing Factor (LRF) in Animals Rendered Anovulatory by Hypothalamic Lesion. Experimental Biology and Medicine. 114 (2), 426-429 (1963).
- Bagga, N., Chhina, G. S., Mohan Kumar, V., Singh, B. Cholinergic activation of medial preoptic area by amygdala for ovulation in rat. Physiology & Behavior. 32 (1), 45-48 (1984).
- Barraclough, C. A., Yrarrazaval, S., Hatton, R. A Possible Hypothalamic Site of Action of Progesterone in the Facilitation of Ovulation in the Rat. Endocrinology. 75 (6), 838-845 (1964).
- Critchlow, V. Blockade of ovulation in the rat by mesencephalic lesions 1, 2. Endocrinology. 63 (5), 596-610 (1958).
- Terasawa, E., Wiegand, S. J. Effects of Hypothalamic Deafferentation on Ovulation and Estrous Cyclicity in the Female Guinea Pig. Neuroendocrinology. 26 (4), 229-248 (1978).
- Halász, B., Köves, K., Molnár, J. Neural control of ovulation. Human Reproduction. 3 (1), 33-37 (1988).
- Narahashi, T. Pharmacology of tetrodotoxin. Journal of Toxicology: Toxin Reviews. 20 (1), 67-84 (2001).
- Narahashi, T., Moore, J. W., Scott, W. Tetrodotoxin blockage of sodium conductance increase in lobster giant axons. The Journal of General Physiology. 47 (5), 965-974 (1964).
- Narahashi, T., Deguchi, T., Urakawa, N., Ohkubo, Y. Stabilization and rectification of muscle fiber membrane by tetrodotoxin. American Journal of Physiology-Legacy Content. 198 (5), 934-938 (1960).
- Narahashi, T. Chemicals as tools in the study of excitable membranes. Physiological Reviews. 54 (4), 813-889 (1974).
- Ritchie, J. M., Rogart, R. B. The binding of saxitoxin and tetrodotoxin to excitable tissue. Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology. 79 (1), 1-50 (1977).
- Bermudez-Rattoni, F., Introini-Collison, I. B., McGaugh, J. L. Reversible inactivation of the insular cortex by tetrodotoxin produces retrograde and anterograde amnesia for inhibitory avoidance and spatial learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (12), 5379-5382 (1991).
- Tang, X., Yang, L., Liu, X., Sanford, L. D. Influence of Tetrodotoxin Inactivation of the Central Nucleus of the Amygdala on Sleep and Arousal. Sleep. 28 (8), 923-930 (2005).
- Klement, D., Pašt’alková, E., Fenton, A. A. Tetrodotoxin infusions into the dorsal hippocampus block non-locomotor place recognition. Hippocampus. 15 (4), 460-471 (2005).
- Conejo, N. M., Cimadevilla, J. M., González-Pardo, H., Méndez-Couz, M., Arias, J. L. Hippocampal Inactivation with TTX Impairs Long-Term Spatial Memory Retrieval and Modifies Brain Metabolic Activity. PLoS ONE. 8 (5), 64749 (2013).
- Grimm, J., Ronald, E. Dissociation of Primary and Secondary Reward-Relevant Limbic Nuclei in an Animal Model of Relapse. Neuropsychopharmacology. 22 (5), 473-479 (2000).
- Hasegawa, H., et al. Inhibition of the preoptic area and anterior hypothalamus by tetrodotoxin alters thermoregulatory functions in exercising rats. Journal of Applied Physiology. 98 (4), 1458-1462 (2005).
- Meyer, F., Louilot, A. Early Prefrontal Functional Blockade in Rats Results in Schizophrenia-Related Anomalies in Behavior and Dopamine. Neuropsychopharmacology. 37 (10), 2233-2243 (2012).
- Rothfeld, J. M., Harlan, R. E., Shivers, B. D. Reversible disruption of lordosis via midbrain infusions of procaine and tetrodotoxin. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 25 (4), 857-863 (1986).
- Silva, C., Cortés, G. D., Javier, C. Y., Flores, A., Domínguez, R. A neural circadian signal essential for ovulation is generated in the suprachiasmatic nucleus during each stage of the estrous cycle. Experimental Physiology. , (2019).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (7th Ed). , Academic Press. California. (2014).
- Cora, M. C., Kooistra, L., Travlos, G. Vaginal Cytology of the Laboratory Rat and Mouse. Toxicologic Pathology. 43 (6), 776-793 (2015).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse Estrous Cycle Identification Tool and Images. PLoS ONE. 7 (4), 35538 (2012).
- Wirtshafter, D., Asin, K., Kent, E. W. Simple technique for midline stereotaxic surgery in the rat. Physiology & Behavior. 23 (1), 409-410 (1979).
- Kozai, T. D., Jaquins-Gerstl, A. S., Vazquez, A. L., Michael, A. C., Cui, X. T. Brain tissue responses to neural implants impact signal sensitivity and intervention strategies. ACS Chemical Neuroscience. 6 (1), 48-67 (2015).
- Kazim, S. F., Enam, S. A., Shamim, M. S. Possible detrimental effects of neurosurgical irrigation fluids on neural tissue: An evidence based analysis of various irrigants used in contemporary neurosurgical practice. International Journal of Surgery. 8 (8), 586-590 (2010).
- Miyajima, M., et al. Role of cerebrospinal fluid as perfusate in neuroendoscopic surgery: A basic investigation. Acta Neurochirurgica. 113, 103-107 (2012).
- Mori, K., et al. Potential risk of artificial cerebrospinal fluid solution without magnesium ion for cerebral irrigation and perfusion in neurosurgical practice. Neurologia Medico-Chirurgica. 53 (9), 596-600 (2013).
- Oka, K., Yamamoto, M., Nonaka, T., Tomonaga, M. The significance of artificial cerebrospinal fluid as perfusate and endoneurosurgery. Neurosurgery. 38 (4), (1996).
- James, T. A., Starr, M. S. Effects of the rate and volume of injection on the pharmacological response elicited by intraingral microapplication of drugs in the rat. Journal of Pharmacological Methods. 1 (3), 197-202 (1978).
- Freund, N., Manns, M., Rose, J. A method for the evaluation of intracranial tetrodotoxin injections. Journal of Neuroscience Methods. 186 (1), 25-28 (2010).
- Zhuravin, I. A., Bures, J. Extent of the tetrodotoxin induced blockade examined by pupillary paralysis elicited by intracerebral injection of the drug. Experimental Brain Research. 83 (3), 687-690 (1991).
- Myers, R. Injection of solutions into cerebral tissue: relation between volume and diffusion. Physiology and Behavior. 1 (2), 171-174 (1966).
- Gonzalez-Perez, O., Guerrero-Cazares, H., Quiñones-Hinojosa, A. Targeting of deep brain structures with microinjections for delivery of drugs, viral vectors, or cell transplants. Journal of Visualized Experiments. (46), e2082 (2010).
- McCluskey, L., Campbell, S., Anthony, D., Allan, S. M. Inflammatory responses in the rat brain in response to different methods of intra-cerebral administration. J Neuroimmunol. 194 (1-2), 27-33 (2008).
- Cunningham, M. G., O'Connor, R. P., Wong, S. E. Construction and implantation of a microinfusion system for sustained delivery of neuroactive agents. Journal of VisualizedExperiments. (13), e716 (2008).
- Akinori, A., Masamichi, S., Hiroshi, T. A new device for microinjection of drugs into the lower brain stem of conscious rats: Studies on site of action of morphine. Journal of Pharmacological Methods. 2 (4), 371-378 (1979).
- Malpeli, J. G. Reversible inactivation of subcortical sites by drug injection. Journal of Neuroscience Methods. 86 (2), 119-128 (1999).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- de Sousa, A. F., et al. Optogenetic reactivation of memory ensembles in the retrosplenial cortex induces systems consolidation. Proceedings of the Natural Academy of Sciences. 116 (17), 8576-8581 (2019).
- Beppu, K., et al. Optogenetic countering of glial acidosis suppresses glial glutamate release and ischemic brain damage. Neuron. 81 (2), 314-320 (2014).
