Summary
Este protocolo descreve a construção de um sistema de microinjeção de baixo custo, sua implantação estereotaxa em estruturas cerebrais profundas e o procedimento para microinjeções cronometradas de tetrodotoxina em ratos acordados e desenfreados. O objetivo é revelar a participação de estruturas hipotalâmicas na regulação da ovulação inibindo sua atividade neural.
Abstract
Muitas abordagens experimentais têm sido usadas para estudar o papel do cérebro na regulação da ovulação. Exemplos incluem a lesão e a desafeção de grupos neuronais, que são métodos invasivos que prejudicam permanentemente a integridade da área alvo. Esses métodos são acompanhados de efeitos colaterais que podem afetar a análise de mecanismos regulatórios agudos e temporais. A implantação estereotipada de cânulas-guia destinadas a regiões cerebrais específicas, seguidas de um período de recuperação, permite aos pesquisadores microinjetar diferentes drogas após o desaparecimento dos efeitos indesejados da cirurgia. A tetrodotoxina tem sido usada para determinar os papéis de várias áreas cerebrais em diversos processos fisiológicos, pois inibe transitoriamente os potenciais de ação dependentes de sódio, bloqueando assim toda a atividade neural na região alvo. Este protocolo combina este método com estratégias para a avaliação do ciclo estrous e da ovulação para revelar o papel de regiões cerebrais discretas na regulação da ovulação em determinados momentos de qualquer estágio do ciclo estrous. Ratos acordados e desenfreados(Rattus norvegicus) foram usados para evitar os efeitos de bloqueio que os anestésicos e os hormônios do estresse exercem sobre a ovulação. Este protocolo pode ser facilmente adaptado a outras espécies, alvos cerebrais e agentes farmacológicos para estudar diferentes processos fisiológicos. Melhorias futuras neste método incluem o projeto de um sistema de microinjeção usando capilares de vidro de pequeno diâmetro em vez de cânulas-guia. Isso reduzirá a quantidade de tecido danificado durante a implantação e diminuirá a disseminação das drogas infundidas fora da área alvo.
Introduction
A ovulação é o processo pelo qual um ou mais oócitos maduros são liberados dos ovários uma vez que cada ciclo estral/menstrual. Como todas as espécies de mamíferos dependem da produção de gametas para procriar, a compreensão dos mecanismos que regulam a ovulação tem um enorme impacto em áreas que vão da biomedicina, da pecuária e da manutenção de espécies ameaçadas de extinção. A ovulação é regulada pelo eixo hipotalâmico-pituitário-ovariano, que envolve várias áreas hipotalâmicas e extra-hipotalâmicas, os gonadotropes na hipófise anterior e as células trómia e granulosa que, juntamente com os oócitos, formam os folículos ovarianos dentro dos ovários1.
Os folículos ovarianos crescem, desenvolvem-se e eventualmente ovulam em resposta à secreção tônica e afásica do hormônio estimulante do folículo e do hormônio luteinizador, os dois gonadotropinas secretados pelos gonadotropos. O padrão de secreção de gonadotropina é fundamental para o desenvolvimento folicular adequado e a ovulação e é regulado pelo hormônio liberador de gonadotropina (GnRH)1,2. Este neuropeptídeo é sintetizado por neurônios espalhados pelo diencephalon basal e, em seguida, secretado para a vasculatura portal que liga o hipotálamo e a hipófise anterior. A atividade secreta dos neurônios GnRH é, por sua vez, modulada pela entrada sináptica decorrente de diversas estruturas cerebrais. Essas estruturas transmitem informações sobre o estado do ambiente externo e interno do organismo, incluindo a disponibilidade de alimentos, o comprimento do fotoperíodo e a concentração de hormônios no sangue. Nesse sentido, eles moldam o padrão reprodutivo de cada espécie e os papéis específicos dessas estruturas devem ser determinados para compreender adequadamente os mecanismos que regem a ovulação. Como exemplo, foi demonstrado que a flutuação nos níveis de estradiol durante o ciclo estrous regula a secreção do GnRH; no entanto, os neurônios GnRH não expressam a isoforme do receptor estradiol necessário para detectar tais alterações. Duas populações de neurônios expressando esses receptores estão localizadas na região periventricular rostral do terceiro ventrículo e no núcleo arcuato, respectivamente, e sinapses stablish com neurônios GnRH. Há evidências que sugerem que esses neurônios interpretam a concentração de estradiol e, em seguida, estimulam a atividade de neurônios GnRH liberando kisspepíntina, um potente indutor da secreção GnRH3.
Experimentos envolvendo lesões hemicas ou químicas, bem como a desafetração mecânica, permitiram aos pesquisadores determinar o envolvimento de várias estruturas cerebrais na regulação da ovulação4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Esses experimentos, no entanto, têm a desvantagem de serem invasivos e traumáticos, exigindo vários dias de recuperação antes de avaliar os efeitos do tratamento, impedindo a análise dos efeitos agudos do tratamento. Além disso, afetam permanentemente as áreas alvo e interrompem outros processos fisiológicos a longo prazo. Devido a esses problemas, os resultados desses experimentos são geralmente obscurecidos pelos mecanismos compensatórios homeostáticos no corpo do animal e extrair informações precisas sobre a dinâmica regulatória temporal em que a área está envolvida é bastante difícil.
A microinjeção de drogas que interrompem transitóriamente a atividade dos neurônios através de cânulas guia é uma alternativa adequada que supera as desvantagens mencionadas acima. As cânulas podem ser colocadas em qualquer região cerebral por uma cirurgia estereotaxa, permitindo que o pesquisador inicie o tratamento medicamentoso após os efeitos confusos da cirurgia desaparecerem. A microinjeção cronometrada dos medicamentos permite que os pesquisadores testem hipóteses sobre a contribuição da região para uma determinada etapa do processo e podem ser realizadas em animais acordados ou em movimento livre. Uma variedade de drogas, incluindo anestésicos locais, agonistas, antagonistas, agonistas inversos e toxinas biológicas como a tetrodotoxina (TTX) podem ser microinjetadas na região de interesse em momentos específicos.
TTX é uma toxina biológica sintetizada por bactérias que vivem no corpo do baiacu, bem como outros vertebrados e invertebrados. O TTX silencia a atividade neural através do bloqueio seletivo e transitório dos canais de sódio, o que resulta na inibição dos potenciais de ação dependentes do sódio. Na presença do TTX, as células experimentam uma alteração na fase de despolarização e, portanto, não são excitáveis, mas permanecem vivas. O efeito de bloqueio do TTX é explicado por sua composição molecular: um grupo de guanidinium é capaz de passar pelo aspecto extracelular do canal de sódio, mas o resto da molécula não pode passar devido ao seu tamanho, por isso fica preso e bloqueia o canal13,14,15,16,17 . O mecanismo de ação do TTX permitiu seu uso como ferramenta para estudar o sistema nervoso tanto in vitro quanto in vivo. A injeção intracerebral dessa toxina tem sido usada para estudar o papel de áreas cerebrais discretas em diversos processos como retenção de memória18, sono e excitação19,reconhecimento do local20,navegação espacial21,abuso de drogas22,termoregulação23,desenvolvimento da esquizofrenia24, comportamento sexual25 e regulação da ovulação26 entre outros. Neste protocolo descrevemos os efeitos na ovulação da inativação transitória de núcleos hipotalâmicos por microinjeção TTX em ratos acordados e desenfreados.
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Protocol
Os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê de Ética da Lei de Estudios Superiores Zaragoza, unam. Esta instituição opera em estrita conformidade com as regras mexicanas para o manejo de animais, Norma Oficial: NOM-062-ZOO-1999, que concorda com as diretrizes internacionais.
1. Construção de cânulas bilaterais
- Extrair o eixo de aço inoxidável do cubo de duas agulhas hipodérmicas de 23 G usando pinças de pressão e, em seguida, remover qualquer cola restante usando uma lâmina de bisturi.
- Desenhe uma linha de 15 mm além da extremidade cega dos eixos com um marcador permanente fino. Use pinças de corte para remover as extremidades chanfradas.
- Segure os segmentos de 15 mm com hemostatas finos e pressione-os perpendicularmente com um disco de corte anexado a uma ferramenta rotatória até que sejam obtidos segmentos de tubos de 14 mm. Esta etapa é feita para eliminar a porção ocluída dos eixos, criando extremidades abertas e contundentes. Por fim, insira uma agulha de 30 G através dos segmentos para eliminar qualquer obstrução interna.
- Determine a distância entre as estruturas de interesse nos hemisférios esquerdo e direito do cérebro com o auxílio de um atlas cerebral27. Use argila de molde para fixar os dois segmentos de 14 mm a um slide de microscópio e garantir que ambos estejam no mesmo nível horizontal. Observe através de um micrômetro ocular (10x) e ajuste os segmentos com pinças finas até que a distância desejada seja obtida.
- Misture a pasta de solda com 10% de ácido clorídrico em uma proporção de 2:1 e adicione uma gota da mistura 2 mm abaixo da extremidade contundente dos segmentos. Soldar ambos os segmentos com um único ponto usando um ferro de solda e fio de solda de 0,5 mm de diâmetro. Certifique-se de que a solda não obstrua o lúmen dos segmentos.
- Crie um suporte para anexar a cânula ao suporte estereotaxic cortando um segmento de aço inoxidável resiliente de 0,3 mm. Use argila de molde para colocar 2 mm do fio em contato com o ponto de solda anterior e o resto deitado acima da extremidade cega das cânulas. Solde o fio para as cânulas.
- Limpe a superfície das cânulas com 70% de etanol para remover o excesso da pasta de solda. Lave o interior das cânulas com água estéril para remover partículas metálicas. Repita este processo até que nenhuma partícula possa ser detectada sob o microscópio a uma ampliação de 10x.
2. Construção de obturadores e tampas
- Para construir os obturadores corte dois segmentos de 16 mm de fio macio de aço inoxidável redondo (0,35 mm de diâmetro). Segure uma cânula bilateral com hemostats, perpendicular a um banco de laboratório, e insira um desses segmentos em cada cânula até chegar ao banco. Dobre o remanescente em um ângulo de 90°.
- Para as tampas corte dois segmentos de 2 mm de tubos de silicone (diâmetro interno=0,76 mm) e aplique uma gota de cola de silício em uma das extremidades de cada segmento. Não deixe a cola entrar na tubulação. Deixe secar por pelo menos 24 horas.
3. Construção de microinjetores
- Repita o passo 1.1, usando agulhas hipodérmicas de 30 G para criar os eixos.
- Desenhe uma linha de 18,5 mm além da extremidade cega dos eixos e remova o remanescente das extremidades chanfradas com pinças de corte.
- Repita o passo 1.1 com uma única agulha de 23 G para construir adaptadores cortando dois segmentos de 6 mm de comprimento a partir da extremidade contundente.
- Elimine as porções ocluídas dos segmentos de 6 mm pressionando-as perpendicularmente contra o disco de corte até que dois adaptadores de 4 mm sejam obtidos. Elimine qualquer obstrução interna.
- Insira a extremidade chanfrada dos segmentos de 30 G nos adaptadores. Olhe através de um estereómico para garantir que o fim de ambos, segmentos e adaptadores, estejam no mesmo nível. Aplique cola de cianoacrilato na articulação distal usando um cotonete e deixe secar por 15 minutos.
- Mergulhe dois conectores de tubos de Teflon em 70% de etanol por 5 minutos e, em seguida, conecte-os aos microinjetores através dos adaptadores. Aguarde até que o diâmetro dos conectores diminua por pelo menos 24 horas e, em seguida, esterilize o microinjetor com um método de baixa temperatura para evitar danos aos conectores (recomenda-se a esterilização de óxido de etileno).
4. Manutenção animal e manchas vaginais
- Use ratos cíclicos adultos encapuzados(Rattus norvegicus, CEPA CIIZ-V) pesando entre 230 e 260 gramas. Abriga os ratos em grupos de quatro em gaiolas padrão de polipropileno em uma sala com um fotoperíodo claro-escuro 14:10. A temperatura e a umidade em 22 ± 2 °C e em 40%, respectivamente. Fornecer comida e água ad libitum.
- Faça manchas vaginais todos os dias entre 10:00 e 12:00 h.
- Esterilize um laço bacteriológico modificado com um diâmetro interno de 1 mm usando uma lâmpada de álcool e esfrie-a com água estéril. Segure o rato com uma aderência segura e introduza 5 mm do laço bacteriológico na vagina, tocando suas paredes internas. Remova o laço bacteriológico. Se for bem sucedida, uma queda nebulosa será vista na ponta. Coloque essa gota em um slide de microscópio.
- Repita este processo para cada rato esterilizando e resfriando o laço entre cada animal.
- Após as gotas secar, manche com hematoxilina-eosina e observe as amostras sob um microscópio em 10x.
- Determinar a proporção de leucócitos, células nucleadas epiteliais e células queratinizadas em cada mancha e classificá-la de acordo com os critérios dos estágios de ciclo estrous relatados na Figura 1, que concorda com a literatura anterior28,29.
5. Implantação estereotíxica das cânulas
NOTA: Realizar a implantação das cânulas após uma cirurgia estereotaxa asséptica regular e cumprindo normas institucionais.
- Antes da cirurgia
- Esterilizar instrumentos cirúrgicos, cânulas, parafusos cirúrgicos, obturadores, gaze e cotonetes de algodão de madeira 24 horas antes da cirurgia usando uma autoclave a vapor. Esterilize as pontas dos instrumentos metálicos entre cirurgias consecutivas limpando-as com peróxido de hidrogênio de 10%, seguido de água e, em seguida, coloque-os em um esterilizador de contas quentes.
- Prepare as áreas de trabalho e o instrumento estereotaxico antes de retirar o animal da sala de aula. Prepare o animal para cirurgia em uma área que está localizada o mais longe possível da mesa de cirurgia para evitar contaminação durante o procedimento.
- Limpe as áreas de preparação e cirurgia com 70% de etanol seguido de aplicação de uma solução de cloreto de 10% por dez minutos. Limpe a base, a armação e os manipuladores do instrumento estereotax com 70% de etanol e esterilize as pontas das barras de ouvido usando um esterilizador de contas quentes e esfrie-as antes da cirurgia.
- Realizar a cirurgia usando um jaleco dedicado, máscara facial, capô da cabeça, mangas cirúrgicas, capas de sapato e luvas cirúrgicas. Peça ao assistente para preparar os animais para a cirurgia e verificar seu estado geral durante o procedimento.
- Coloque a cânula no suporte estereotaxista. Peça ao assistente para trazer o primeiro animal a ser operado para a sala. Selecione ratos em diestrus para cirurgia, uma vez que observações do nosso laboratório indicam que esses animais recuperam ciclos estrous adequados mais rápido do que ratos operados em outros estágios, provavelmente porque a resposta ao estresse muda junto com o ciclo estrous.
- Pesar o animal, e induzir anestesia com 4% de isoflurane em 100% oxigênio dentro de uma câmara de indução para ratos ligados a um vaporizador de isoflurane. Para evitar estressar os animais, não preenchia a câmara. Confirme um plano cirúrgico de anestesia verificando a dilatação da pupila e a perda de dor medida pelos testes de pinça da cauda e ouvido após observar a perda do reflexo de direito.
- Anestesiar o rato por uma injeção intraperitoneal de uma mistura de cetamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) se um vaporizador de isoflurano não estiver disponível.
- Retire o rato da câmara de indução e use um cone de nariz na mesa de preparação para manter os efeitos da anestesia com 2,5% de isoflurano em 100% de oxigênio. Corte o cabelo do couro cabeludo com cortadores e remova os cabelos soltos com um rolo de fiapos. Injete uma dose subcutânea pré-operatória de 2 mg/kg de Meloxicam e 5 mg/kg de Enrofloxacina como anti-inflamatório/analgésico não esteroide e antibiótico, respectivamente.
- Aplique lágrimas artificiais de hispromellose em cada olho para evitar a proficação durante a cirurgia.
- Monte o animal no instrumento estereotaxico acima de uma almofada de aquecimento usando barras de ouvido não-ruptura e uma máscara de anestesia. Ajuste o grampo do nariz para garantir que a cabeça do animal esteja plana. Realize um esfoliante cirúrgico na área raspada alternando entre povidone-iodo com sabão e 70% de etanol uma vez e, em seguida, usando povidone-iodo e 70% etanol duas vezes. Insira um termômetro retal para registrar a temperatura do animal durante o procedimento e, em seguida, cubra-o com um campo cirúrgico estéril.
- Durante a cirurgia
- Use um bisturi para fazer uma incisão de 2 cm na pele e no músculo no meio da área raspada. Remova o periosteum do crânio usando um cotonete revestido com peróxido de hidrogênio de 2% para revelar bregma ou lambda, os marcos que serão usados para calcular as coordenadas alvo. Seque o crânio com ar para uma melhor visualização do marco.
- Use os manipuladores do instrumento estereotaxic para mover a cânula para uma posição diretamente acima do marco de escolha. Registre as coordenadas anterior-posterior e medial-lateral do instrumento estereotaxic e use-as para calcular as coordenadas da área alvo de acordo com o atlas cerebral27.
- Coloque as coordenadas calculadas no instrumento estereotaxista e coloque a ponta da cânula na superfície do crânio. Registre a coordenada dorsal-ventral e use-a para calcular a profundidade da área alvo.
- Remova o braço do manipulador desparafusando-o da armação. Use uma rebarba dentária presa a uma ferramenta rotativa a uma velocidade de 15.000 rpm para deixar uma marca no local onde será realizada a craniotomia. Em seguida, use a rebarba para fazer três buracos, formando um triângulo equilátero ao redor da marca. Estes buracos não devem perfurar o crânio. Insira os parafusos cirúrgicos nos orifícios, garantindo que estejam bem colocados.
- Faça a craniotomia larga o suficiente para acomodar a distância entre as áreas alvo em cada hemisfério. Deve ser o menor de diâmetro possível, mas grande o suficiente para permitir o abaixamento da cânula sem tocar nas bordas do crânio, uma vez que isso modificará a trajetória. Realize a craniotomia gradualmente, aplicando a menor pressão possível. O crânio do roedor tem apenas alguns milímetros de espessura e é fundamental preservar a integridade dos tecidos abaixo.
- Uma vez visível a dura-mater, use uma agulha estéril de 21 G com a ponta curvada em um ângulo de 90° para remover lascas de osso e fazer um corte anterior-posterior nas meninges. Use Wirtshafter e colegas30 técnica para evitar danos ao seio sagital superior se a área alvo estiver localizada perto da linha média.
- Coloque o suporte com a cânula na moldura e use o manipulador dorsal-ventral para alcançar a coordenada ventral. Verifique se a agulha não toca nas bordas enquanto desce e aumenta o diâmetro da craniotomia, se necessário.
NOTA: É importante que a ponta das cânulas-guia tenha como alvo uma região que varia de 0,5 a 2,0 mm acima da região de interesse. Isso se deve à reação inflamatória do cérebro em resposta à introdução de corpos estranhos e à destruição do tecido. Isso é especialmente crítico se a região de interesse for pequena e a distância de trabalho deve ser calculada empiricamente com antecedência.
- Coloque o suporte com a cânula na moldura e use o manipulador dorsal-ventral para alcançar a coordenada ventral. Verifique se a agulha não toca nas bordas enquanto desce e aumenta o diâmetro da craniotomia, se necessário.
- Aplique cimento dentário para prender a cânula ao crânio e deixe secar. Certifique-se de que o cimento dental não cubra a extremidade contundente da cânula, pois isso irá obstruí-lo irreversivelmente. Espere até o cimento se solidificar completamente.
- Insira os obturadores para evitar maiores obstruções e para garantir a patência durante o estudo. Coloque a tampa de silicone para evitar contaminação.
- Após a cirurgia
- Substitua os fluidos perdidos por uma injeção intraperitoneal de 1,0 mL de solução salina estéril a uma temperatura fisiológica. Coloque o animal em uma gaiola de recuperação com suporte térmico até que ele se recupere da anestesia. Verifique a temperatura e a frequência cardíaca/respiratória do animal periodicamente. Os efeitos isoflurane duram alguns minutos após a interrupção do fluxo de gás, enquanto os efeitos cetamina/xilazina duram 40-50 min.
- Fornecer injeções pós-operatórias dos antibióticos, analgésicos e anti-inflamatórios (nas mesmas doses e rotas indicadas antes) por 48-72 h e inspecionar os animais diariamente para o resto do experimento. Denuncie qualquer sinal de dor, estresse ou perda de peso para os serviços veterinários ou para um membro treinado do laboratório. Não realize qualquer outra manipulação para os ratos durante este período.
- Comece a tomar manchas vaginais após o tratamento pós-operatório e continue fazendo isso até que o animal mostre três ciclos estrous consecutivos de quatro dias.
NOTA: Cateteres de jugular crônicos podem ser implantados cirurgicamente, permitindo que o pesquisador pegue amostras de sangue em série para analisar a secreção de hormônios como estradiol, progesterona, testosterona, hormônio luteinizador, hormônio estimulante do folículo e corticosterona. Recomendamos colocar esse cateter assim que o animal se recuperar da cirurgia cerebral, uma vez que isso melhorará a taxa de sobrevivência, evitando também entupimento do cateter que pode resultar de um longo tempo de recuperação.
6. Manuseio de tetrodotoxinas e preparação de soluções
ATENÇÃO: O TTX é uma das substâncias mais tóxicas conhecidas. Atua em músculos esqueléticos e tecido nervoso. Intoxicação por contato é improvável, mas qualquer ferida aberta é um caminho potencial para a inoculação no corpo. As principais preocupações ao trabalhar com TTX são a punção da pele com instrumentos afiados que estiveram em contato com a toxina e a geração de aerossóis que podem atingir a boca, olhos e membranas mucosas. Dependendo da dose, o TTX pode ser letal se inalado, engolido ou inoculado pela pele. Causará forte irritação dos olhos. O LD50 foi testado em camundongos por administração oral e intravenosa e é de 334 μg/kg e 7,3 μg/kg, respectivamente. Não há antitoxina disponível no momento.
NOTA: A substância inativante é um NaOCl de 1,0% com ou sem 0,25 N NaOH, ou uma solução de alvejante de 10%. A inativação completa ocorre após 30 min de exposição. O TTX não pode ser completamente inativado por qualquer derivado de cloreto em uma concentração abaixo de 10%, por autoclaving nem por esterilização de calor seco a uma temperatura inferior a 500 °F. Todos os procedimentos envolvendo TTX devem ser realizados por dois indivíduos experientes usando pares internos e externos de luvas de nitrito, jaleco dedicado, óculos de segurança, máscara facial descartável, sapatos fechados e calças de comprimento integral.
- Preparação da solução de estoque
- Coloque uma almofada encharcada com a substância inativante no capô da fumaça para evitar contaminação em caso de derramamento. Certifique-se de que o capô da fumaça está funcionando corretamente antes de começar. Prepare um recipiente com a solução de inativação para descartar pontas de pipeta.
- Resuspend TTX citrate lyophilized em pó de acordo com as instruções do fabricante por uma titulação extremamente cuidadosa e lenta com fluido cerebrospinal artificial estéril, enxaguando as paredes do frasco no processo. Evite a formação de espuma e aerossol. Siga uma técnica asséptica para evitar a contaminação da solução TTX, pois ela será injetada no cérebro de animais vivos. Use uma seringa com uma agulha em vez de uma micropipette se seus frascos TTX tiverem uma membrana externa para evitar a formação de aerossol.
- Alíquotar a solução de estoque em micro tubos estéreis. Faça alíquotas o mais pequenas possível, uma vez que ciclos de congelamento/descongelamento podem alterar a estabilidade das moléculas. Não encha mais da metade dos tubos porque a água aumenta em volume quando congelado, o que pode levar à abertura da tampa e contaminação do tubo e outras amostras armazenadas no recipiente.
- Descontaminar o exterior dos tubos e as superfícies onde o TTX foi usado com a substância inativante. Armazene os tubos a -20 °C em uma caixa de frasco dentro de um recipiente secundário.
- Diluir a solução de estoque para uma concentração de trabalho
- Prepare soluções recém-diluídas no dia em que serão usadas, uma vez que as soluções diluídas são menos estáveis. Coloque uma almofada encharcada com a substância inativante no capô da fumaça e um micro tubo-rack em cima dele. Prepare um recipiente com a solução de inativação para descartar pontas de pipeta.
- Pipetar a solução de estoque na parte inferior de um microtubo estéril e, em seguida, adicionar a quantidade calculada de fluido cerebrospinal artificial para alcançar uma concentração de 10 ng/μL. Como descrito para a re-suspensão do pó TTX, realize uma titulação extremamente cuidadosa e lenta, enxaguando as paredes do frasco e evitando a formação de espuma e aerossol.
- Se as amostras que estiveram no congelador serão usadas para microinjeção, devem ser permitidas a equilíbrio à temperatura ambiente por pelo menos uma hora antes do experimento.
7. Microinjeção de soluções TTX ou veículos em ratos em movimento livre
- Configure a bomba de microinjeção com a taxa de infusão e tempo total de injeção de acordo com o experimento. Calcule esses parâmetros com antecedência considerando o volume ocupado pela estrutura alvo e a quantidade de solução a ser injetada. Para este experimento, injete 200 nL de solução a uma taxa de 50 nL por minuto por um tempo total de infusão de 4 minutos.
- Encha duas seringas Hamilton de 10 μL com água destilada estéril, insira um pedaço de tubo estéril de Teflon no conector de tubo de cada microinjetor, garantindo que o comprimento da tubulação não restrinja o movimento do rato (a tubulação pode ser esterilizada usando óxido de etileno).
- Coloque uma almofada encharcada com a substância inativante e um filme de 2 cm x 2 cm quadrados de parafina acima dele. Pipeta uma quantidade suficiente de TTX para encher a agulha do injetor e 1 cm da tubulação acima do filme. Absorva a gota TTX retraindo suavemente o êmbolo. Monte as seringas na bomba de microinjeção e use seus controles para manipular o êmbolo até que uma gota de TTX possa ser vista na ponta de cada microinjetor. Descarte as gotas na almofada encharcada com substância inativante.
- Selecione os ratos que serão microinjetados. Use apenas ratos que apresentaram pelo menos três ciclos consecutivos após a cirurgia. Considere seu estágio do ciclo e a hora do dia. Tanto o tempo quanto o estágio dependem da hipótese específica que você vai testar, para este experimento 14:00 horas de proestrus selecionado, uma vez que os sinais pré-iovulatórios nervosos que regem a secreção gnrh phasic ocorrem neste momento. Transporte-os para a sala onde a injeção ocorrerá dentro de suas próprias gaiolas de habitação para evitar problemas.
- Segure o rato com uma aderência firme, remova a tampa e os obturadores das cânulas, insira os microinjetores nas cânulas guia e devolva o animal para a gaiola.
- Ligue a bomba e espere até que a microinjeição termine. Observe o animal durante esse período, a fim de detectar um possível descolamento dos microinjetores e evitar a torção dos tubos de Teflon.
- Deixe os microinjetores no lugar por dois minutos adicionais para evitar o refluxo da solução. Remova-os, limpe a superfície do implante com solução antisséptica de iodopovidona, evitando seu fluxo dentro das cânulas-guia. Insira obturadores estéreis, coloque a tampa e devolva o animal para a sala da colônia. Observe o animal periodicamente para detectar quaisquer possíveis efeitos colaterais da droga.
- Ligue a bomba com os mesmos parâmetros da microinjeção e verifique se há um fluxo correto para garantir que a patência do sistema seja retida durante o procedimento.
- Pressione o êmbolo para expulsar o TTX/veículo do microinjetor até que a bolha de ar atinja a ponta da agulha. Lembre-se do TTX em seu microtubo. Encha a seringa com água destilada e use-a para limpar o interior dos tubos. Descarte a água na substância inativante e repita esse processo pelo menos três vezes. Limpe o exterior das seringas, tubos e microinjetores com um pano encharcado na substância inativante.
8. Eutanásia e processamento de tecidos
- No dia das estrus previstas ou vaginalmente confirmadas, injete no rato uma overdose intraperitoneal de pentobarbital de sódio (75 mg/kg). Verifique se há perda de consciência e injete 200 nL de uma solução azul de metileno de 0,5% através das cânulas guia, conforme descrito nas etapas 7,1 a 7,9. Verifique se há sinais de dor usando o teste de beliscão do dedo do pé ou da cauda e, se nenhum for detectado, decapite o rato usando uma guilhotina de roedor.
- Use uma tesoura para abrir a cavidade abdominal e encontrar os ovários. Use uma tesoura de íris fina para dissecar cada ovário, cortando na junção utero-tubal com o auxílio de uma lupa. Evite danificar o oviduto porque isso resultará na perda de oócitos.
- Coloque os ovários sob um estereómico e use uma lâmina de barbear para remover todo o tecido adiposo sem danificar o órgão. Remova o oviduto de cada ovário cortando com o lâmina de barbear o mais longe possível da região da ampola. Monte cada oviduto em um slide diferente e cubra com uma gota de água. Armazene os ovários em um frasco contendo a solução de Bouin.
- Seque suavemente os ovidutos com uma toalha de papel absorvente e procure a ampola sob o estereóscópio. Com a mão não dominante, segure o oviduto no lugar, beliscando longe da ampola com uma agulha de 23 G, em seguida, use outra agulha de 23 G na mão dominante para fazer uma incisão de 1 mm na região média da ampola. Os complexos cumulus-oócitos se projetarão da incisão como uma gota de fluido viscoso(Figura 2D). Use a agulha na mão dominante para puxar suavemente e lentamente a gota longe do oviduto. Pressione o remanescente da ampola para garantir que não restem oócitos dentro. Extrair os oócitos dos ovidutos o mais rápido possível, pois a dessecação do oviduto irá prender irreversivelmente os oócitos dentro.
- Remova o oviduto do slide e espere até que a gota de fluido contendo os oócitos secar. Manche a amostra com hematoxilina-eosina. Use meio de montagem para cobrir o deslizamento. Observe sob o microscópio (10x) para determinar o número de oócitos derramados por cada ovário.
NOTA: O sacrifício por perfusão cardíaca não é realizado neste protocolo, uma vez que os oócitos ficariam presos nos ovidutos e, portanto, métodos histológicos seriam necessários para avaliar a ovulação. Se o usuário tiver que perfundir para analisar outros tecidos, os ovários podem ser removidos primeiro e as artérias descendentes presas com hemostatas grossas abaixo do fígado para evitar o vazamento de fixação. - Remova a pele da cabeça e submerse o crânio em um recipiente de vidro com uma solução de 10% de formalina. Permita a fixação da cabeça por pelo menos dez dias antes de remover a cânula para evitar distorções do tecido. Para remover a cânula, use uma tesoura para desprender todos os músculos da região do crânio que a circunda. Corte entre os ossos nasais e frontais com aparadores ósseos e, em seguida, remova o osso occipital. Insira a ponta dos aparadores no foie magnum e comece a cortar através das cristas sagidas atingindo o remanescente do osso nasal.
- A região isolada da parte superior do crânio deve conter os ossos frontal e parietal. Remova a cânula implantada presa ao topo do crânio puxando-a lentamente para cima perpendicularmente para a cabeça. Corte qualquer porção anexada das meninges com uma tesoura de íris fina para evitar a deformação do cérebro.
- Faça um corte anterior-posterior nas meninges e coloque-as de lado para remover o cérebro da base do crânio. Insira pinças sem corte abaixo das lâmpadas olfativas e puxe suavemente o cérebro até que os nervos ópticos estejam visíveis. Corte os nervos com uma tesoura de íris fina e puxe o cérebro. Preserve o cérebro em solução fixa.
- Obtenha seções de 50 μm de espessura do cérebro usando um vibratome, monte-as em lâminas revestidas de poli-L-lysina (0,1% em água destilada) e manche com a técnica nissl. Observe os slides sob o microscópio (10x) para determinar a posição final das cânulas (Figura 2A-2C) e a propagação do corante com o auxílio de um atlas cerebral de rato27.
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Representative Results
O protocolo descrito acima foi testado avaliando os efeitos de um único TTX ou veículo (fluido cerebrospinal artificial; ACSF) microinjeção em um dos dois núcleos diferentes conhecidos por estarem envolvidos na regulação da ovulação no rato: o supraciasmático e o núcleo arcuato. O núcleo supraciasmático foi escolhido por conter o marca-passo circadiano central em mamíferos. Está envolvida na regulação de eventos cíclicos como secreção de gonadotropinas. O núcleo arcuato foi escolhido porque contém uma população de neurônios que expressam receptores estradiol, o que estimula a secreção do GnRH durante a maior parte do ciclo estrous. A microinjeção foi realizada às 14:00 horas do estágio proestrus, período conhecido como "janela crítica" devido à ocorrência de muitos dos mecanismos centrais que regulam a liberação pré-ovulatória de gonadotropinas. Após o tratamento, as manchas vaginais eram tomadas todos os dias e os ratos eram eutanizados às 09:00 horas do dia previsto de estrus, que coincidiu com uma mancha vaginal característica de estrus. Como um grupo de controle adicional, foram utilizados cinco ratos intactos eutanizados na fase de estrus. A fração de animais ciclistas após a cirurgia e a fração de ratos ovulantes de cada grupo (ratos ovulando/n) foram calculadas e analisadas utilizando-se o teste exato de probabilidade de Fisher. O número de ovais derramados por ambos os ovários foi analisado pelo teste de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de Dunn. Foram realizados testes estatísticos adequados para garantir que o tamanho da amostra fosse adequado.
Um total de 30 ratos fêmeas foram implantados com cânulas-guia visando uma das duas áreas alvo. Como mostrado na Figura 3,todos os animais eram cíclicos antes da cirurgia, mas apenas sete deles não apresentaram alterações do ciclo estrous após o procedimento de cannulação. Vinte e três animais apresentaram alterações transitórias de seus ciclos, caracterizadas pelo aumento do número de dias com manchas leucócíticas. Tais alterações provavelmente se devem ao estresse induzido pela cirurgia e gradualmente diminuíram. No quinto ciclo, 28 ratos foram considerados cíclicos e os outros dois foram descartados do experimento. Este resultado mostra que, após um tempo de recuperação de quatro ciclos estrous (16 dias), a maioria dos animais canulados são adequados para novas experimentações.
A Figura 4A e a Figura 4B retratam a porcentagem de animais ovulando e o número de ovas derramados, respectivamente, por animais intactos e pelos grupos tratados com ACSF ou TTX no núcleo supraciasmático. Todos os ratos intactos ovularam e o mesmo aconteceu com o grupo ACSF. No entanto, nenhum dos animais microinjetados com TTX ovulado. A injeção do veículo não modificou o número de barras de ovário. No entanto, seria interessante avaliar a viabilidade e qualidade dos oócitos liberados. Resultados semelhantes podem ser observados na Figura 4C e Figura 4D para ratos microinjetados no núcleo arcuato. Em ambos os casos, este método comprovou a participação de uma região cerebral discreta na regulação da ovulação na janela crítica do estágio proestrus, que foi inferida pela primeira vez a partir de estudos de lesão, mas não confirmada. Os efeitos da microinjeção TTX parecem ser transitórios e não permanentes, uma vez que um experimento anterior mostrou que ratos injetados no núcleo supraciasmático fora da "janela crítica" ovularam no dia esperado do estrus26. No entanto, recomenda-se também a inclusão de grupos de controle nos quais os animais são sacrificados com uma ou até que uma mancha vaginal clara de estrus seja alcançada para abordar essa questão.
Os resultados na Figura 5A-B representam o desfecho ovulatório dos animais tratados com ACSF ou TTX. No entanto, conforme determinado após a confirmação histológica, suas cânulas foram localizadas fora da região pretendida. A maioria dessas cânulas foi colocada na comissura anterior ou na área retroquismática, duas áreas que não contribuem para a regulação da ovulação. Ambas as estruturas, juntamente com a supraciasmática e o núcleo arcuato estão muito próximas do terceiro ventrículo, considerando isso, seria esperado um bloqueio de ovulação em todos os animais se a droga vazasse para o ventrículo. O fato de a microinjeção TTX fora dos alvos não ter bloqueado a ovulação sugere que o volume de TTX infundido na taxa selecionada não vazou no ventrículo, revelando assim os efeitos específicos da região do TTX. Em apoio a essa ideia, a análise histológica das fatias cerebrais só mostrou neurônios manchados perto da ponta das cânulas-guia. No entanto, é preciso esclarecer que não foi realizada uma avaliação direta da disseminação da droga e, portanto, essa conclusão deve ser mais aprofundada.
Figura 1: Manchas vaginais representativas de cada etapa do ciclo estrous de ratos. Estrus (A) é caracterizado pela presença de células cornificadas epiteliais sem um núcleo que pode ser encontrado sozinho de formação cumulosa como resultado da desquamação epitelial. No metestrus(B)algumas dessas células cornificadas ainda podem estar presentes, mas estão em menor número por leucócitos, que também são o tipo de célula predominante em Diestrus(C). As amostras de proestrus(D)são caracterizadas pela consistência viscosa e pela predominância das células nucleadas epiteliais. A barra de escala em cada painel representa 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Exame histológico das amostras após a eutanásia. Seções coronais cerebrais no núcleo arcuato (ARC) e região de eminência mediana (EM) de um rato intacto(A),um rato bilateralmente canulado(B)e um rato com uma cânula extraviada(C). Os asteriscos apontam para a área onde a ponta das cânulas guia estavam localizadas, em B as pontas onde na margem basal do núcleo ventromedial (VMH) permitindo que os injetores protuberantes alcançassem a margem superior do ARC. Em C uma cânula foi localizada dentro do terceiro ventrículo (3V), resultando em uma microinjeção ventricular não localizada. Este é um erro comum quando o alvo está localizado perto da linha média e os dados desses animais devem ser descartados. Quando realizada corretamente, a extração de oócitos deve resultar em uma única gota de fluido viscoso contendo todos os oócitos do ovídeo examinado como visto no painel(D). A barra de escala em cada painel representa 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Percentual acumulado de animais ciclistas antes e depois da implantação da cânula (***p≤0,0001; **p=0,0003 vs. o ciclo antes da cirurgia, teste de probabilidade exato de Fisher). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Percentual de animais ovulantes e mediana com intervalo interquartil (barras de erro) do número de óvulos derramados por animais microinjetados na estrutura alvo #1 (núcleo supraciasmático, A-B) ou #2 (núcleo arcuate, C-D) com fluido cerebrospinal artificial (ACSF) ou tetrodotoxina (TTX) às 14:00 do prostorão. O grupo intacto foi adicionado a cada gráfico para fins de comparação e o número dentro das barras representa a fração de fêmeas ovulando (***p≤0,01 vs. Grupos intactos e ACSF, teste de probabilidade exato de Fisher e teste de Kruskal-Wallis, respectivamente). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Percentual de animais ovulantes (A) e mediana com faixa interquartil (barras de erro) do número de galpões de ova (B) por animais cujas cânulas foram determinadas para estar fora das áreas alvo. Estes animais foram microinjetados com fluido cerebrospinal artificial (ACSF) ou tetrodotoxina (TTX) às 14:00 de proestrus. O grupo intacto foi adicionado a cada gráfico para fins de comparação e o número dentro das barras representa a fração de fêmeas ovulando. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este artigo descreve um método para inativar transitoriamente, a qualquer momento, uma região discreta no cérebro de ratos acordados e sem restrições. Um método simples para rastrear seu ciclo estrous e avaliar a ovulação também é fornecido. Este protocolo permite uma análise direta da contribuição de regiões cerebrais específicas aos mecanismos que impulsionam a ovulação, comparando o desfecho ovulatório de animais tratados com TTX com os tratados com veículos. Com exceção do instrumento estereotaxista e da bomba de microinjeção, que são comuns em laboratórios de neurociência, este método não requer materiais caros. Cânulas comerciais e microinjetores são a escolha usual para este tipo de experimento, mas o sistema fácil de construir aqui descrito reduz os custos e os resultados são indistinguíveis. Usando este protocolo e os materiais listados na tabela que acompanham este artigo, dez vezes mais cânulas podem ser fabricadas gastando a mesma quantidade de dinheiro que um kit comercial para dez animais custaria. A construção de dez cânulas bilaterais, não importa a personalização necessária para o estudo, pode ser realizada em poucas horas. Além disso, todos os componentes são reutilizáveis, o que aumenta a eficácia do custo.
Juntamente com a relação custo-benefício, este protocolo é adequado para qualquer ambiente laboratorial, uma vez que pode ser realizado por qualquer pessoal, incluindo estudantes, com conhecimento de manipulação de roedores, cirurgia estereotaxic e manuseio de toxinas biológicas e resíduos relacionados. Além disso, pode ser adaptado para ser usado em qualquer espécie de roedor e outros pequenos mamíferos, incluindo coelhos, furões, saguis e até mesmo em espécies não-míamferas, como aves e répteis. Além das características acima observadas, a principal vantagem deste protocolo é que ele pode ser facilmente adaptado para o estudo de outros processos sob a regulação do cérebro, como a atividade de órgãos periféricos, a resposta homeostática aos desafios ambientais e diversos comportamentos.
Existem várias etapas críticas que devem ser realizadas antes de iniciar o experimento, a fim de alcançar os resultados desejados. Em primeiro lugar, as coordenadas da estrutura alvo devem ser calculadas empiricamente, uma vez que as relatadas em atlas cerebrais não necessariamente correspondem aos animais designados para o estudo como resultado de sua tensão, sexo ou idade. Vários estudos têm demonstrado que eletrodos implantados e sondas de infusão alteram a função da zona lesada não apenas pela destruição de corpos e fibras neurais, mas também pela ativação de células gliais. A reação inflamatória que começa imediatamente após a implantação normalmente causa encapsulamento do corpo estranho por células gliais. Essas células formam uma baia apertada que impede o fluxo de neurotransmissores e desloca neurônios, iniciando um processo de neurodegeneração31. Os efeitos deletérios do procedimento de implantação não podem ser evitados e devem ser tomados cuidados para garantir que tais efeitos ocorram o mais longe possível da região de interesse cerebral. As coordenadas devem ser calculadas para colocar as cânulas-guia na área alvo apenas se for grande o suficiente para garantir que não mais de 10% da área será danificada pela cânula. Essa abordagem é útil, por exemplo, para que grandes áreas do córtex sejam estudadas. Ainda neste caso, deve ser realizada uma análise detalhada do grupo controle para explicar os efeitos do implante no processo de interesse. Para pequenas estruturas, como núcleos hipotalâmicos discretos, aconselhamos os pesquisadores a calcular as coordenadas para colocar as cânulas-guia a uma distância que varia de 0,5 a 2 mm da borda superior da estrutura alvo na região média nos planos posteriores e medial-laterais anteriores de acordo com o atlas cerebral(Figura 2B). Para esta abordagem, os injetores devem ser projetados para se projetar o suficiente para alcançar a fronteira do alvo. Testamos isso para os dois núcleos descritos neste protocolo e descobrimos que esses ratos recuperaram seu ciclo estrous e a capacidade de ovular mais rápido do que os animais com cânulas implantadas dentro dos alvos.
A solubilidade dos agentes farmacológicos a serem injetados deve ser considerada para que a solução do veículo seja o mais semelhante possível à do fluido cefalorraquidiano. O TTX pode ser adquirido como pó liofilizado, sozinho ou com citrato. O primeiro tem baixa solubilidade na água e um tampão ácido com pH em torno de 5,0 é recomendado para reconstituí-lo, mas isso pode introduzir a possibilidade de danificar o tecido como resultado apenas de injeções do veículo. Por outro lado, o citrato TTX pode ser dissolvido em água ou solução salina de 0,9%, que são comumente usadas como veículos. Recomendamos o uso de ambos os veículos, e sugerimos o uso de fluido cerebrospinal artificial ou a solução de lactato de Ringer. Um estudo anterior mostrou que a solução salina microinjetada no núcleo supraciasmático tem efeitos deletérios sobre a ovulação quando realizada em estrus ou diestrus26. Vários artigos relataram que a perfusão do tecido nervoso com soluções que não correspondem às características físicas e químicas do fluido cefalorraquidiano altera a anatomia e fisiologia dos neurônios e promove respostas inflamatórias e morte celular32,33,34,35. Considerando esses resultados, o uso de fluido cerebrospinal artificial como o veículo é fortemente recomendado em todos os experimentos envolvendo microinjeção de drogas no cérebro.
Antes do início dos experimentos, os pesquisadores devem determinar empiricamente o volume ideal de solução a ser injetada, pois tanto o vazamento em estruturas adjacentes quanto a cobertura insuficiente poderiam confundir a interpretação dos resultados. Isso pode ser feito microinjetando um corante solúvel em ágar claro ou cubos de gelatina. A dispersão do corante pode então ser estimada e comparada com o tamanho esperado do alvo, conforme relatado no atlas cerebral. Ainda assim, propriedades da região cerebral de interesse, como sua densidade celular e a presença de tratos de fibra ou bordas ventriculares afetarão a dinâmica de difusão, e os resultados podem diferir daqueles encontrados em ágar e gelatina. Assim, o pesquisador deve então testar os parâmetros obtidos in vitro na área alvo de alguns animais. Vários corantes têm sido usados com sucesso para microinjeções intracerebrais em ratos, a fim de delinear a difusão de um determinado volume de solução. Os exemplos mais comuns são violeta cresyl, azul thionine, azul metileno, azul de Evan, verde rápido e tinta índia. Estes corantes são dissolvidos em água destilada a uma concentração de 0,5% ou menor. O azul de Evan tem a vantagem de ser detectável em um microscópio de fluorescência (excitação a 620 nm e emissão a 680 nm), permitindo uma análise mais quantitativa da propagação. Microesferas de látex também podem ser adequadas para esta abordagem. É importante mencionar que volumes superiores a 2,0 μL não devem ser administrados no cérebro com essa técnica, uma vez que danos mecânicos e deslocamento tecidual ocorrerão36.
A vazão da solução também é um fator importante a ser controle, uma vez que a microinjeção de volumes elevados em alta velocidade causa deslocamento tecidual e lesões mecânicas40. Além disso, uma alta taxa de infusão também aumenta a disseminação da droga, resultando na inativação de estruturas vizinhas. Tanto quanto um aumento triplo na área coberta por uma solução pode ser causado pela alteração da taxa de infusão de 100 nL/5 minutos para 100 nL/1 minuto36. Observações histológicas de cérebros de ratos injetados com azul de metileno indicam que uma taxa de infusão de 50 nL/minuto não desloca o tecido enquanto confina a droga na área alvo (observações pessoais). Isso só foi testado com volumes iguais ou inferiores a 200 nL e, portanto, os pesquisadores devem executar experimentos piloto se maiores volumes forem usados.
Uma vez determinado o volume de trabalho, também é recomendado avaliar a propagação em cada animal. Isso pode ser feito co-injetando um corante com as drogas ou injetando-o alguns minutos antes da eutanásia, como descrito neste protocolo. O modelo anterior permite que o corante se espalhe junto com a toxina, proporcionando assim uma avaliação mais precisa da área afetada. Uma desvantagem deste método é que o corante pode interferir com a atividade da droga, e também pode ser citotóxico. Finalmente, a liberação do tecido nervoso pode ocorrer se o animal precisar sobreviver por vários dias após o procedimento de injeção, o que afetaria a estimativa da propagação. Se essa abordagem for utilizada, os efeitos do corante no processo em estudo devem ser abordados comparando o resultado do grupo veículo+corante com o de animais intactos. Se a injeção do corante ocorrer antes da eutanásia, fazê-lo seguindo os mesmos parâmetros da microinjeção (taxa de infusão e volume) é recomendado. Isso deve ser realizado pelo menos 10 minutos antes da eutanásia para permitir a disseminação da solução. Com este método, verificou-se que 200 nL de uma solução azul TTX/metileno cobre uma esfera de 0,6 mm de diâmetro e a dispersão não muda significativamente se a microinjeção ocorrer 1 hora antes do sacrifício (observação pessoal). Isso concorda com o estudo de Freund e colegas37, bem como o de Zhuravin e Bures38,que ambos descobriram que 1 μL de solução TTX se espalha em um volume em forma de esférica com um diâmetro de cerca de 3 mm. Em geral, mostrou-se que a dispersão da droga depende de seu peso molecular e do volume injetado,39 e os resultados acima indicados correspondem à difusão de corantes com um peso molecular semelhante ao do TTX. Se for necessário um controle mais preciso da dispersão, a injeção de TTX radiolabeled ou a implementação de imunohistoquímica contra TTX regular com anticorpos disponíveis comercialmente podem ser realizadas37. Além de um melhor delineamento da área coberta pela droga, essas duas abordagens são limitadas pela liberação do TTX do tecido, que deve ser considerado se o animal deve sobreviver vários dias após a microinjeção, por outro lado, o trabalho e o descarte de material radioativo introduzirão novas etapas e questões de segurança que não poderiam ser compatíveis com todos os laboratórios e protocolos.
Recomenda-se a inclusão de um grupo controle que consiste em animais injetados em uma área cerebral que não tenha um papel na regulação do processo estudado. Esse grupo ajudará o pesquisador a determinar a especificidade da área alvo na regulação desse processo e descartará a possibilidade de que os medicamentos, injetados em qualquer estrutura, possam desencadear um sinal de bloqueio baseado em um mecanismo mais difundido, como a ativação do estresse ou do eixo imunológico. Uma vez que mesmo os cirurgiões estereóxicos mais experimentados não são capazes de obter uma taxa de sucesso de 100% quando pequenas estruturas são alvo, esses experimentos geralmente são acompanhados por cânulas colocadas fora da estrutura desejada e, portanto, esse grupo de controle é involuntariamente atingido. Os resultados dos animais em que a cânula foi extraviada são valiosos e não devem ser descartados; em vez disso, uma análise abrangente deve ser realizada considerando a área injetada e a dispersão da droga. De especial interesse são os resultados que mostram um efeito diferente (ou nenhum) em animais injetados em regiões próximas aos alvos.
Este protocolo tem limitações inerentes à colocação crônica de cânulas. Não é possível evitar a destruição permanente de fibras de passagem e corpos neuronais na trajetória da cânula. O uso de capilares de vidro com um diâmetro de ponta de alguns micrômetros é o método de escolha para entregar drogas no cérebro com danos mínimos ao tecido41. Essa metodologia, no entanto, tem sido utilizada principalmente em experimentos nos quais o animal é anestesiado e/ou a cabeça está presa ao aparelho estereotaxista ou outros dispositivos portadores. Isso se deve principalmente à fragilidade do próprio capilar, o que dificulta anexá-lo a um animal acordado e sem restrições. Um sistema que utiliza capilares de vidro conectados às bombas osmóticas, em vez de cannulas guiadas, mostrou uma melhora considerável na quantidade de tecido cerebral danificado e na resposta gliaria à lesão42. Neste sistema, no entanto, a infusão das drogas é crônica ao invés de cronometrado e, portanto, não é útil em experimentos nos quais o tempo de injeção deve ser precisamente controlado. Um sistema de microinjeção baseado em um capilar de vidro inserido na área alvo através de uma cânula guia previamente implantada foi descrito por Akinori e seus colegas43. Este sistema permite a injeção de um animal acordado no momento desejado, mas não é muito robusto e o animal deve ser restringido durante o procedimento, o que pode levar à ativação da resposta ao estresse. Neste protocolo, os efeitos dos danos ao tecido nervoso na trajetória da cânula guia podem ser controlados comparando os grupos intacto e veicular. Aqui foi mostrado um desfecho ovulatório semelhante para ambos os grupos, e concluiu-se que o tecido afetado, bem como a injeção do veículo não interferiu na ovulação. Os pesquisadores devem realizar estudos piloto para determinar se as estruturas localizadas dorsais à sua área alvo, que seriam destruídas pela cânula, estão envolvidas na regulação do processo estudado. Ainda assim, uma direção futura promissora para este trabalho é projetar um sistema de entrega que capitalize os pontos fortes tanto das cânulas guia quanto dos capilares de vidro.
Outra consideração importante para os pesquisadores é o tempo de ação do TTX. Zhuravin e Bures38 mostraram que o TTX leva alguns minutos para atingir um bloqueio máximo de transmissão neural, que dura cerca de uma hora e meia, diminuindo gradualmente ao longo de várias horas. Isso faz do TTX a droga escolhida quando a inativação de longa duração é necessária. Se o experimento requer uma inativação mais rápida, anestésicos locais como lidocaína podem ser usados, pois leva apenas alguns segundos para atingir um bloqueio máximo. Os efeitos desta droga duram menos de 20 minutos, proporcionando uma resolução temporal mais fina do que o TTX. As características acima indicadas fazem do TTX uma boa ferramenta para experimentos exploratórios que estudam a presença de sinais neurais gerados em janelas temporais menos bem definidas. Lidocaína, por outro lado, é útil para delinear esta janela44. Uma desvantagem de ambas as drogas é que eles bloqueiam a transmissão de potenciais de ação em fibras de passagem, introduzindo artefatos na interpretação dos dados, uma vez que o sinal poderia potencialmente vir de uma estrutura diferente que envia projeções axonais para a área injetada. Neste caso, análises cuidadosas das injeções determinadas para estar fora da área alvo são muito importantes. Por exemplo, neste artigo foi demonstrado que a infusão de TTX na área apenas anterior ao núcleo supraciasmático e na região entre ele e o núcleo arcuato não bloqueou a ovulação. Tais resultados revelaram que as fibras e células dessas regiões não estão envolvidas na regulação da ovulação, o que foi inesperado devido à presença de uma rede recíproca de fibras ligando o núcleo supraciasmático tanto com o núcleo arcuato quanto as regiões anteriores contendo neurônios GnRH.
Uma alternativa que não bloqueia a transmissão ao longo de fibras de passagem na área injetada é o uso de cáingos divalentos como cobalto e magnésio, que ambos inibem a liberação de neurotransmissores por terminais presinápticos. O problema com essa abordagem, no entanto, é o curto tempo de inativação da ação e alta toxicidade44. Outras opções para evitar o bloqueio de fibras são as abordagens optogenéticas e quimiéticas, ambas estratégias para a manipulação da atividade de populações neuronais específicas. A seletividade é adquirida pela transfecção de neurônios com vetores virais projetados para inserir sequências que codificam tanto para opsinas ligadas a canais de íons quanto receptores modificados expressos em promotores específicos. A microinjeção do vetor é realizada em animais anestesiados utilizando capilares de vidro, causando pouca interrupção do tecido circundante. A implantação de fibras ópticas ou a injeção sistêmica de drogas sintéticas permite uma manipulação muito precisa da população-alvo45. Essas técnicas se mostraram úteis em um estudo, isoladamente ou em conjunto com técnicas como a microinjeção TTX apresentada neste protocolo46. Ainda assim, vários aspectos desses métodos devem ser considerados para projetar experimentos bem-sucedidos, incluindo a validação da especificidade da expressão, controlando o número de células transfeminadas, avaliação da toxicidade e avaliação dos efeitos colaterais da estimulação leve e química.
Os componentes críticos deste protocolo incluíam a devida determinação do estágio do ciclo estrous para cada animal. Para realizar este procedimento com sucesso, obter amostras de qualidade do epitélio vaginal e interpretar corretamente os resultados são fundamentais (aconselhamos seguir a Figura 1). Além disso, os pesquisadores devem preencher cuidadosamente o sistema de injeção para evitar a incorporação de bolhas de ar que possam resultar na injeção de volumes imprecisos de drogas. Também é importante monitorar os animais durante a microinjeção para evitar que eles mordam a tubulação ou interfiram no sistema. Finalmente, os pesquisadores cegos a condições experimentais devem analisar o resultado da ovulação, a posição final da cânula e a dispersão da solução na área alvo para garantir que a interpretação dos resultados seja imparcial.
Aqui foi descrito um método confiável, econômico e direto para analisar a contribuição de áreas discretas do cérebro na regulação da ovulação. Este procedimento é realizado em ratos acordados e desenfreados, superando os efeitos deletérios do bloqueio da neurotransmissão e também os efeitos inibitórios que os hormônios de estresse como cortisol e corticosterona exercem sobre a secreção gnrh. Este método é totalmente personalizável e pode ser usado para entregar qualquer droga em qualquer estrutura do cérebro. Além disso, pode ser facilmente adaptado para espécies comuns de roedores e não roedores usados em laboratório. Por fim, esse protocolo pode ser utilizado em conjunto com métodos para quantificação de substâncias como hormônios e metabólitos no sangue, avaliação da expressão genética em células e tecidos, registro da atividade neuronal e também o desempenho de animais acordados em testes comportamentais para determinar o papel de áreas cerebrais específicas em diversos processos comportamentais e fisiológicos.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar em relação a este artigo.
Acknowledgments
Somos gratos a Raymond Sanchez na Universidade de Washington por sua valiosa ajuda na edição de manuscritos e à M.Sc. Georgina Cortés e M.Sc. Cintia Javier por seu apoio técnico na padronização desta técnica. Também somos gratos aos membros dos serviços veterinários da Facultad de Estudios Superiores Zaragoza: MVZ. Adriana Altamirano, MVZ. Roman Hernández e MVZ. Dolores-Elizabeth Guzmán pela excelente manutenção e cuidado de animais experimentais. Os experimentos descritos neste protocolo foram apoiados pelo número de subvenção DGAPA-PAPIIT: IN216015 e pelo número de subvenção do CONACyT: 236908 a Roberto Domínguez. Carlos-Camilo Silva é doutorando pelo Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas da Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) e é apoiado pelo Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Grant: 294555).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 μL Hamilton syringes | Hamilton | 80314 | |
| 21 G x 1" stainless steel hypdermic needle | BD | 305165 | |
| 23 G x 1" stainless steel hypdermic needle | BD | 305145 | |
| 30 G x 1/2" stainless steel hypdermic needle | BD | 305106 | |
| Artificial cerebrospinal fluid | BASi | MD-2400 | |
| Bone trimer | Fine Science Tools | 16152-12 | |
| Burr for micro drill | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Clipper | Wahl | ||
| Cut-off disc | Dremel | SM5010 | |
| Cutting tweezers | Truper | 17367 | |
| Cyanocrylate glue | Kola loka | K-1 | |
| Dental cement | Nic Tone | ||
| Enrofloxasin | Senosiain | ||
| Eosin | Sigma | E4009 | |
| Estereoscope | Zeiss | ||
| Extra fine Bonn scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Face mask | Lanceta HG | 60036 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Hematoxilin | Sigma | H3136 | |
| Hemostats | Fine Science Tools | 13008-12 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | 320331 | |
| Hypromelose artificial tears | Sophia Labs | 8950015 | |
| Isoflurane | Pisa Agropecuaria | ||
| Meloxicam | Aranda | 1183 | |
| Microinjection pump | KD Scientific | 788380 | |
| Monomer | Nic Tone | ||
| Mototool | Dremel | 3000 | |
| Nitrile gloves | Lanceta HG | 69028 | |
| Non-Rupture Ear Bars | David Kopf Instruments | 855 | |
| Poly-L lysine | Sigma | P4707 | |
| Povidone-iodine | Dermo Dine | ||
| Povidone-iodine with soap | Germisin espuma | ||
| Pressure tweezers | Truper | 17371 | |
| Rat anesthesia mask | David Kopf Instruments | Model 906 | |
| Saline solution | PISA | ||
| Scalpel | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Scalpel blade | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Sodium pentobarbital | Pisa Agropecuaria | ||
| Standard electrode holder | David Kopf Instruments | 1770 | |
| Stainless steel wire | American Orthodontic | 856-612 | |
| Stereotaxic apparatus | David Kopf Instruments | Model 900LS | |
| Surgical Sissors | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| Teflon connectors | Basi | MD-1510 | |
| Teflon tubing | Basi | MF-5164 | |
| Tetrodotoxin | Alomone labs | T-500 | |
| Vaporizer | Kent scientific | VetFlo |
References
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