Summary
כאן אנו מתארים חילופי אניון חזקים כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים של [3H]-מיו-אינוזיטול תווית שתילים אשר היא שיטה רגישה מאוד כדי לזהות ולכומת פוליפוספטים אינוזיטול בצמחים.
Abstract
אסטרים פוספט של מיו-אינוזיטול, גם כנף פוספטים אינוזיטול (InsPs), הם סוג של רגולטורים סלולריים לשחק תפקידים חשובים בפיזיולוגיה של הצמח. בשל החיוב השלילי שלהם, שפע נמוך ורגישות לפעילות הידרולית, הגילוי והכימות של מולקולות אלה הוא מאתגר. זה במיוחד המקרה עבור צורות זרחן מאוד המכיל 'אנרגיה גבוהה' אג"ח diphospho, גם גם כנוזיטול pyrophosphates (PP-InsPs). בשל הרגישות הגבוהה שלה, חילופי אניון חזקים כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (SAX-HPLC) של צמחיםהמסוממיםעם [ 3 H]-מיו-אינוזיטול היא כיום השיטה של בחירה לנתח מולקולות אלה. באמצעות [ 3 H]-מיו-אינוזיטול שתילי צמח radiolabel, מיניםשוניםInsP כולל מספר isomers שאינם enantiomeric ניתן לזהות ומופלה ברגישות גבוהה. כאן מתוארת ההתקנה של מערכת SAX-HPLC מתאימה, כמו גם זרימת עבודה מלאה מטיפוח צמחים, תייול רדיו וחילוץ InsP ועד להפעלה של SAX-HPLC וניתוח נתונים עוקב. הפרוטוקול המוצג כאן מאפשר אפליה וכמות של מינים שונים של InsP, כולל מספר isomers שאינם enantiomeric של PP-InsPs, InsP7 ו InsP 8 ,ולהיותמותאם בקלות מינים אחרים של צמחים. כדוגמאות, SAX-HPLC מנתח של Arabidopsis thaliana ו לוטוס ג'פניקו שתילים מבוצעים ופרופילי InsP מלאים מוצגים ונדונים. השיטה המתוארת כאן מייצגת כלי מבטיח כדי להבין טוב יותר את התפקידים הביולוגיים של InsPs בצמחים.
Introduction
לפני כמעט ארבעה עשורים, פוספטים אינוזיטול (InsPs) הגיח כמו מולקולות איתות, לאחר Ins(1,4,5)P3 (InsP3) זוההכשליח שני המפעיל את שחרור מתווכי הקולטן של Ca2+ בתאים בעליחיים 1,,2. עד כה, אין קולטן InsP3 (IP3-R) זוהה בצמחים, אשר מטיל ספק תפקיד איתות ישיר עבור InsP3 בתאי צמח3. ללא קשר, InsP3 משמש כסימן מקדים עבור InsPs אחרים המעורבים במספר תהליכים התפתחותיים של הצמח, כולל רגולציה של מסלולי איתותספציפיים 3,4,,5,,6,7,,8. לדוגמה, InsP3 יכול להיות זרחן נוסף InsP 6 ,המכונהגם "חומצה פיטית", אשר מייצג מקור מרכזי של פוספט, מיו-אינוזיטול ו cations, והוצג לשחק תפקידי מפתח בהגנה על הצמח מפני פתוגנים, MRNA ייצוא פוספט הומסטאזיס 5 ,9,,10,11,12.9
אינוזיטול pyrophosphates (PP-InsPs) הם מחלקה של InsPs המכילים לפחות אחד אנרגיה גבוהה די-פוספו בונד, מזוהה בתחילה בתאים בעלי חיים, אמבה ושמרים, שם הם משחקים תפקידיםקריטיים בתהליכים תאיים שונים 13,14,15. למרות עבודה על PP-InsPsבצמחים 16,17,18,19,1720,,21,22,23,24,25,26, הפונקציות הביולוגיות וזהות isomer של מולקולות אלה עדיין להישאר אניגמטי במידה רבה., במפעל מודל Arabidopsis thaliana, תאי InsP8 הוצע לווסת את ההגנות נגד אוכלי עשב חרקים ופטריות necrotrophic באמצעות גילויצירוף מקרים של InsP 8 ו jasmonate פעיל על ידי קומפלקס קולטן ASK1-COI1-JAZ17. יתר על כן, תפקידים של InsP8 ו- PP-InsPs אחרים בהונואוסטזיס אנרגיה חישה תזונתית, כמו גם הומוסטאזיס פוספטהוצעו 17,23,24,25,26.
ללא קשר למערכת הביולוגית המועסקת, אחד האתגרים המתודולוגיים העיקריים בעת לימוד InsPs היה זיהוי אמין וכמת מדויק של מולקולות אלה. שיטות מבוססות ספקטרומטריה מסה שימשו לזיהוי InsPs, כולל PP-InsPs, מתמציות תאים. עם זאת, מחקרים אלה לא הצליחו להבדיל בין26 ל-26,27. גישה נוספת לניתוח InsPs משתמשת במשיכה כלפי מטה של InsPs מתאי ליסטים באמצעות TiO2 חרוזים, ואחריו אלקטרופורזה ג'ל polyacrylamide (PAGE) של InsPs האלגנטיות. לאחר מכן ניתן להכתים את ה- InsPs על-ידי טולואידין כחול או DAPI24,28,29. עם זאת, עד כה לא ניתן לזהות InsPs באופן מהימנות נמוך יותר InsP5 מתמציות צמחים באמצעות שיטה זו. לאחרונה, שיטה באמצעות [13C]-מיו-inositol עבור תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ניתוח של InsPs פורסם כחלופה חילופי אניון חזק כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (SAX-HPLC)30. טכניקה זו דווחה כדי להשיג רגישות דומה בהשוואה SAX-HPLC ולאפשר זיהוי של 5-InsP7, כמו גםאת האפליה של InsP 5 אינונטיומריםשונים מתמציות תאים. עם זאת, יישום השיטה מבוססת NMR דורש מסונתז כימית ולאזמין מבחינהמסחרית [ 13 C]-מיו-אינוזיטול. לכן, השיטה המועסקת ברוב המקרים היא תייול רדיו דגימות עם [3H]-מיו-אינוזיטול, ואחריו SAX-HPLC31,32,33. טכניקה זו מבוססת על ספיגה של מיו -אינוזיטולרדיואקטיבי לתוך הצמח והמרה שלה InsPs שונים על ידי הפעילות המשולבת של קינאזים ופוספטים תאיים ייעודיים.
ה- InsPs המסויגים בתווית[3H]מופקים בחומצה ומחולצים באמצעות SAX-HPLC. בשל החיוב השלילי שלהם, InsPs לקיים אינטראקציה חזקה עם השלב הנייח טעון חיובית של העמודה SAX-HPLC וניתן לפתוח עם מעבר צבע מאגר המכיל הגדלת ריכוזי פוספט כדי לתוחב InsPs מהעמודה. זמני ההתמהמה תלויים אפוא בהסתערות ובגיאומטריה של מיני ה-InsP שיש להפרידם. בהיעדר עמודות כיראליות, רק אנשים לא אננטיומרים יכולים לפי הם מופרדים על ידי פרוטוקול זה. עם זאת, ניתן להשתמש בתקני תיומת רדיו כדי להקצות את האופי האיתורי של פסגת InsP ספציפית. מאמצים מרובים בעבר על ידי מעבדות שונות כדי ליצור סטנדרטים מתויגים ללא תווית עם (ביו)שיטות כימיות או לטהר אותם מתאים שונים אורגניזמים עזרו הקצאת פסגות מינים מסוימים InsP, וגם לצמצם את הזהות האיתונטרית שלמינים בודדים שלInsP 5,7,21,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43. כמו כן, ההברה האחרונה של מסלולים אנזימטיים המובילים להיווצרות PP-InsPs בצמחים, כמו גם הגילוי של אפקט חיידקי סוג III עם פעילות ספציפית 1-phytase, לספק מידע על איך ליצור סטנדרטיםשימושיים עבור ניתוחים אלה 10,17,18,22,23.
ניתן למדוד את השברים המתקבלים במונה מבריק נוזלי בשל β של tritium (3H). עם הגדלת זמן תיוג, שיווי משקל איזוטופי מצב יציב הוא הגיע, לאחר מכן פרופילי InsP שהושגו צריך לייצג את מצב InsP של הצמח31. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה בהשוואה לטכניקות זמינות אחרות הוא הרגישות הגבוהה שהושגה על ידי השימוש בסימן המוקדם הישיר עבור InsPs ומדידה של אות רדיואקטיבי.
SAX-HPLC שלדגימות שחולצומ [ 3 H]-מיו-אינוזיטול-תווית צמחים או אורגניזמים אחרים משמש בדרך כלל לזיהוי וכימות של InsPs החל מינים InsP נמוך כדי PP-InsPs, המייצג כלי בעל ערך כדי להבין טוב יותר את חילוף החומרים, פונקציה ו מצבי פעולה של InsPs. עד כה, שיטה זו היא גם הבחירה המתאימה ביותר עבור חוקרים עם עניין מיוחד מינים InsP נמוך יותר. בעוד היסודות של הליך זה, שבו הפרוטוקול המתואר כאן בונה על, תוארובעבר 7,21,31,,34, פרוטוקול מפורט המותאם לניתוח של InsPs נגזר צמח ובמיוחד של PP-InsPs עדיין חסר. פרסומים קודמים דיווחו על קשיים לזהות באופן אמין את PP-InsPs בשפע נמוך,במיוחדInsP 8 , בשל אחד או יותר מהגורמים הבאים: כמויות נמוכות יחסית של חומר צמחי, [3H]-מיו-אינוזיטול עם פעילות ספציפית נמוכה (> 20 Ci/mmol), שימוש במאגרי חילוץ שלא מבוססים על חומצה perchloric או מרוכזים פחות מ 1 M, מאגרים נטרול שונים, כמו גם מעברי צבע תת אופטימליים או זיהוי של [3H] עם גלאי על הקו. בהשוואה ללימודים אלה, הפרוטוקול המוצג כאן מיועד לזיהוי אמין של PP-InsPs7,21,34.
כאן אנו מציגים זרימת עבודה מפורטת, החל מהגדרת הציוד לטיפוח ותיוג צמחים, חילוץ InsP וה-SAX-HPLC מפעילים את עצמם. למרות השיטה היה אופטימיזציה צמח מודל A. thaliana, זה יכול להיות שונה בקלות כדי ללמוד מינים אחרים של צמחים, כפי שהראה כאן עם פרופיל InsP הדיווח הראשון של המודל קטנית לוטוס japonicus. למרות שהשימוש במין צמחי אחר עשוי לדרוש אופטימיזציה מסוימת, אנו מבינים כי אלה יהיו מינוריים, מה שהופך את הפרוטוקול הזה לנקודת התחלה טובה למחקר נוסף ב-InsPs של הצמח. על מנת להקל על מיטוב אפשרי, אנו מציינים כל שלב בפרוטוקול שבו ניתן לבצע שינויים, כמו גם את כל הצעדים הקריטיים שעשויים להיות מאתגרים בעת ביסוס השיטה בפעם הראשונה. בנוסף, אנו מדווחים כיצד ניתן להשתמש בנתונים שהושגו על-ידי שיטה זו לכמת של InsPs ספציפיים וכיצד ניתן לנתח ולהשוות דגימות שונות.
Protocol
1. הגדרת מערכת HPLC
- הגדר מערכת המורכבת משתי משאבות HPLC עצמאיות (משאבה בינארית), אחת עבור כל מאגר. שתי המשאבות צריכות להיות נשלטות יחד באמצעות מחשב עם תוכנה מתאימה או על ידי משאבת אב. ליישם לשטוף את אטם בוכנה עבור שתי המשאבות, או באמצעות כוח הכבידה או באמצעות משאבת לחץ נמוך שלישית. ציין משאבה אחת עבור מאגר A (משאבה A מוגדרת) ואחד עבור מאגר B (תו לא משאבה B).
הערה: שניהם צריכים להיות מסוגלים ליצור לחצים של עד 60 בר (6 MPa) ו בקצבי זרימה של לפחות 0.5 מ"ל/דקה. - חבר את שתי המשאבות למיקסר דינמי.
- חבר את המיקסר לשסתום הזרקה עם לולאה לדוגמה של קיבולת של לפחות 1 מ"ל.
- חבר את שסתום ההזרקה לעמודה עם נמת באמצעות אביזרי הקצה המתאימים.
- חבר את העמודה למלקט השברים באמצעות נמת באורך מתאים.
הערה: תיאור זה מבוסס על מערכת HPLC שלנו (ראה טבלת החומרים),הדורשת שלבים ידניים יותר מאשר מערכות חדשות ומתוחכמות יותר. המערכת שלנו מאפשרת גישה קלה ושינוי של כל הרכיבים. משאבות Quaternary (עם השינוע הבינארי המתואר כאן) יכול לשמש גם יוביל פרופילי חומש ואיכות כוללת של ניתוחים דומים לאלה שהושגו עם משאבות בינאריות.
2. הכנת מאגרים, עמודות ומערכת HPLC
- הכן את המאגרים לחילוץ של InsPs מסיסים: מאגר חילוץ (1 M HClO4)ומאגר נטרול (1 M K2CO3). הכינו את שני המאגרים עם מים טהורים במיוחד. הם יציבים בטמפרטורת החדר במשך מספר חודשים. מיד לפני החילוץ, הוסף EDTA לשני הפתרונות לריכוז סופי של 3 מ"מ (לדוגמה, מפתרון מניות EDTA מסונן של 250 מ"מ).
התראה: HClO4 (חומצה perchloric) הוא מאוד מאכל. - הכן את המאגרים להפעלה SAX-HPLC: מאגר A (1 mM EDTA) ו מאגר B (1 mM EDTA, 1.3 M (NH4)2HPO4; pH 3.8 עם H3PO4). הכינו את שניהם באמצעות מים רהורים טהורים במיוחד ולאחר מכן סינון ואקום עם מסנני ממברנה בגודל 0.2 μm. אלה יציבים בטמפרטורת החדר במשך מספר חודשים.
הערה: יש לכלול את EDTA בכל המאגרים כדי למנוע אינטראקציות של cations עם InsPs, מה שיכול לגרום לתסביך מלח InsP שונה או אפילו לא מסיסים. - לתכנת את מעבר הצבע כדלקמן: 0\u20122 דקות, 0% מאגר B; 2\u20127 דקות, עד 10% מאגר B; 7\u201268 דקות, עד 84% מאגר B; 68\u201282 דקות, עד 100% מאגר B; 82\u2012100 דקות, 100% מאגר B, 100\u2012101 דקות, עד 0% מאגר B; 101\u2012125 דקות, 0% מאגר B. קצב הזרימה האופטימלי עבור מעבר צבע זה הוא 0.5 מ"ל/דקה.
- במהלך הריצה, לאסוף שברים בכל דקה, החל מדקה 1 עד דקה 96. 30 ה דקות הנותרות של מעבר הצבע משמשות לשטיפת העמודה והמערכת, ותאין לא לאסוף אותם לצורך ספירת נצנוץ.
- במידת האפשר, הגדר את הלחץ הניתן להזנה מקסימה לפני כיבוי החירום של משאבות HPLC ל- 80 בר (8 MPa). פעולה זו מונעת נזק קריטי לארין העמודה.
- בעת שימוש בעמודה חדשה של SAX HPLC, רחץ אותה ביסודיות (>50 מ"ל) עם מים מסוננים במיוחד לפני השימוש הראשון.
הערה: זה יבטיח הסרה של מתנול הכלול, ובכך למנוע משקעים מלח בשלבים מאוחרים יותר. במידת האפשר, השתמש במשאבת HPLC נפרדת. אם פעולה זו אינה זמינה, ודא כי HPLC שטף במים לפני שטיפת העמודה. קצב הזרימה לא יעלה על 2 מ"ל/דקה. לאחר השטיפה, העמודה מוכנה לניתוח, וכאשר מטפלים בה כראוי, ניתן להשתמש בה עבור ריצות 20\u201240. לאחר מכן, הרזולוציה תקטין ברצף. שטיפה ממושכת עם מאגר A (>1 h) וביצוע שלב 2.6 יכולים לסייע בהגדלת חיי העמודה. אם הירידה ברזולוציה נמשכת, יש להחליף את העמודה. ניתן להתאים את מעבר הצבע כדי להגדיל את ההפרדה בין מינים ספציפיים של פוליפוספט לאנוזיטול או כדי להקטין את זמן הריצה הכולל. שימוש במערכות HPLC שונות (עם נפח ריק שונה או נפח שונה של הנימים) ישפיע מאוד על זמני השמירה. כמו כן, לשינויים בעמודות יש השפעות מינוריות על זמני השמירה. - בצע "ריצה מדומה". במקום דגימה שחולצו, הזריקו מים מסוננים במיוחד במערכת HPLC והפעילו את מעבר הצבע הסטנדרטי. אין יהיה לאסוף את השברים.
הערה: שלב 2.6 הוא אופציונלי. עם זאת, יש לבצע אותו אם חל אחד מהמצבים הבאים: מותקנת עמודה חדשה; מערכת HPLC שימשה לשיטה שונה מראש; מערכת HPLC לא היה בשימוש במשך יותר מ- 3 ימים; הייתה בעיה עם הריצה הקודמת.
3. טיפוח צמחים ותיוג עם[3H]-מיו-inositol
הערה: יש לבצע את השלבים הבאים עם רכיבים סטריליים ובתנאים סטריליים, תוך לבישת כפפות להגנה על הידיים מפני זיהום באמצעות התבלין הרדיואקטיבי. אמצעי התקשורת של הצמח, במיוחד כאשר מכילים סוכרוז, נוטים לזיהום מיקרוביאלי.
- לחטא זרעי תליאנה עם 1 מ"ל של 1.2% נתרן hypochlorite במשך 3 דקות ואחריו 1 מ"ל של 70% אתנול במשך 3 דקות. לאחר מכן להוסיף 1 מ"ל של 100% אתנול, פיפטה הזרעים עם אתנול על נייר מסנן עגול ולאפשר להם להתייבש באוויר תחת הזרמת למינאר על ספסל נקי.
- בעת שימוש בזרעי L. japonicus, למקם אותם בטיח לקרצף זרעים עם נייר זכוכית לפני עיקור כדי להבטיח קצב נביטה מספיק.
- לזרוע זרעי Arabidopsis ב 1-2 שורות על צלחות פטרי מרובעמלא מדיה צמיחה מוצק המורכבת חצי כוח Murashige ו Skoog (MS) מלח פתרון, 1% סוכרוז, 0.7% מסטיק גלן במים deionized מותאם pH 5.7 עם KOH ולאפשר להם שכבה לפחות 1 יום ב 4 ° C בחושך.
- עבור זרעי לוטוס, לזרוע אותם בשורה אחת על צחלות פטרי מרובעמלא מדיה צמיחה מוצק המורכב 0.8% אגר bacteriological במים deionized ולאפשר להם שכבה לפחות 3 ימים ב 4 ° C בחושך.
- מניחים את הצלחות אנכית באינקובטור צמיחה או בתא אקלימי ומאפשרים להם לגדול במשך 10-12 ימים בתנאים של יום קצר (8 ש' אור ב-22°C, 16 כ"ס כהה ב-20°C).
- להעביר 10-20 שתילים לתוך באר אחת של 12 היטב ברור שטוח תחתית תא צלחת תרבות מלאה 2 מ"ל של תמיסת מלח MS חצי כוח בתוספת 1% סוכרוז ומותאם pH 5.7.
- להוסיף 45 μCi של [3H]-מיו-אינוזיטול (30-80 Ci /mmol, מומס ב 90% אתנול) ולערבב על ידי מערבול עדין. מכסים את הצלחת במכסה המתאים ואוטמים אותה בקלטת כירורגית מיקרופורית (לדוגמה, מיקרופור או סרט לאוקופור), ומכניסים אותה בחזרה לאינקובטור הצמיחה.
התראה:[3H] הוא מקרן בטא באנרגיה נמוכה שיכול להיות סכנת קרינה מזיקה כאשר שואפים, בליע או נספג דרך עור חשוף. לבש תמיד כפפות בעת טיפול בחומר רדיואקטיבי או בציוד שיש לו מגע ישיר או עקיף לחומר רדיואקטיבי. כמו כן, פעל בהתאם לכללים המקומיים לטיפול בטוח ברדיוכימיקלים (לדוגמה, לבישת בגדי מגן נוספים, שימוש במערך וסקרים של משטחים לזיהמים על בסיס קבוע). - לאחר 5 ימים של תיוג, להסיר שתילים מהתקשורת ולשטוף אותם לזמן קצר עם מים deionized. ייבאו אותם במגבות נייר והעבירו אותם לצינור מיקרוצנטריפוגה ב-1.5 מ"ל. אין מעל מילוי הצינור, ולמקם לא יותר מ 100 מ"ג FW / שפופרת, אשר מתאים כ 10\u201220 שתילים בני 17 יום.
הערה: עודף של חומר צמחי יהיה לדלל את החומצה במהלך תהליך החילוץ ויהיה מאוד להקטין את יעילות החילוץ.- הצמד-להקפיא את הצינור בחנקן נוזלי ולאחסן אותו ב -80 מעלות צלזיוס עד החילוץ.
הערה: ניתן לשמור דגימות ב-80 °C למשך מספר שבועות מבלי להתפשר על איכות המדגם. תנאי הצמיחה (מדיה, אור, טמפרטורה, זמן) ניתן לשנות על פי הצרכים של ניסוי מסוים או מינים צמחיים. עם זאת, יש לנקוט בטיפול בעת דילול[3H]-מיו-אינהוזיטול, על מנת להבטיח ריצות SAX-HPLC הניתנות לכימות באיכות טובה. לכן, מומלץ להתחיל עם [3H]-מיו-אינוזיטול ריכוזים כאמור כאן ולהפחית אותו צעד צעד אם תרצה. במהלך זמן תיוג, צמחים יכולים להיות מוגשים לטיפולים שונים (למשל, לחצים סביבתיים או חומרים כימיים) כדי להעריך את ההשפעה של תנאים אלה על InsPs העולמי. כדי להגיע לתיוג מצב יציב, אנו ממליצים לתייג צמחים למשך 5 ימים לפחות.
- הצמד-להקפיא את הצינור בחנקן נוזלי ולאחסן אותו ב -80 מעלות צלזיוס עד החילוץ.
4. חילוץ של InsPs מסיס
הערה: שמור דגימות ריגנטים על קרח במהלך כל תהליך החילוץ. תמיד ללבוש כפפות ומשקפיים מגן בשל הסיכון הגבוה של מגע עם חומר רדיואקטיבי, במיוחד במהלך שחיקה. כל מה שמיצור קשר עם דגימות נחשב לפסולת רדיואקטיבית ויש להיפטר ממנו בהתאם לכללים המקומיים לסילוק בטוח של חומר רדיואקטיבי.
- הכן את פתרונות העבודה עבור מאגר החילוץ והניטרול כמו בשלב 2.1. כל מדגם ידרוש 600 μL של מאגר החילוץ ו 400 μL של ניטרול מאגר. אחסן את המאגרים בקרח.
- קח את הדגימות מ -80 °C מקפיא ולשמור אותם בחנקן נוזלי עד עיבוד נוסף. טוחנים את הדגימות עם עלי צינור microcentrifuge עד שהם מתחילים להפשיר ולהוסיף 500 μL של חיץ חילוץ קר כקרח. המשך לטחון עד שהדגימה הומוגנית לחלוטין ולפתרון צבע ירוק עמוק (אם העלים נמצאים בדגימה).
- צנטריפוגה הדגימות במשך 10 דקות ב 4 ° C ב ≥ 18000 x g. מעבירים את הסופרנטנט לצינור חדש של 1.5 מ"ל. יש לזכור כי הצינורות המשמשים לחילוץ נחשבים פסולת רדיואקטיבית מוצקה ויש להיפטר בהתאם.
-
בזהירות להוסיף 300 μL של מאגר נטרול לתמצית. משקעים של חלבונים ומבעבעים יתחילו מיד. מערבבים על ידי ערבוב עם קצה פיפטה לאחר דקה ולהמתין כמה שניות לפני pipetting כמות קטנה (5 μL) על נייר pH (טווח אידיאלי של pH 6-9). ה-pH צריך להיות בין pH 7 ו 8 בסופו של דבר.
- במידת הצורך, הוסף כמויות קטנות (בדרך כלל 10-20 μL) של מאגר נטרול או מאגר החילוץ עד לתום ה-pH הרצוי. תן לדגימות לנוח על קרח לפחות שעה אחת עם מכסה פתוח.
- צנטריפוגה הדגימות במשך 10 דקות ב 4 ° C ≥ 18,000 x g. מעבירים את הסופרנטנט לצינור חדש של 1.5 מ"ל.
הערה: הדגימות יכולות לשמש ישירות בהפעלה של SAX-HPLC או לשמור על קרח (אם נעשה בה שימוש מאוחר יותר באותו יום) או קפואות בחנקן נוזלי ומאוחסנות ב-80°C למשך 2\u20124 שבועות. כדי להבטיח שכפול גבוה ויכולת השוואה, מומלץ תמיד להקפיא את הדגימות בחנקן נוזלי במשך 5 דקות, גם אם הם ישמשו ישירות לאחר מכן. אחסון לטווח ארוך יותר של דגימות שחולצו ב-80°C אפשרי כל עוד הדגימות מפשירות פעם אחת בלבד. אם נעשה שימוש בדגימות קפואות לניתוח, ודא שאין חלקיקים גלויים לאחר הפשרה. אחרת, צנטריפוגה שוב במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ב ≥ 18,000 x g ולהעביר את supernatant לתוך צינור טרי 1.5 מ"ל.
5. ביצוע הריצה של HPLC
- צייד את אספן השברים עם 96 בקבוקונים מבריקים קטנים (קיבולת של ~ 6 מ"ל) ולמלא כל בקבוקון עם 2 מ"ל של קוקטייל מבריק מתאים (למשל, Ultima-Flo AP קוקטייל מבריק נוזלי) תואם מאגרים עם pH נמוך וריכוז פוספט אמוניום גבוה (ראה טבלת חומרים).
הערה: מספר הבקבוקונים וגודל הבקבוקונים תלויים במלקט השברים ומונה ההבהיקים המשמשים. חשוב לפחות לאסוף את 90 השברים הראשונים, אם השינוע המתואר כאן משמש, כדי להשיג פרופיל פוליפוספט אינוזיטול מלא. כמו כן הקפד לתייג כראוי כל בקבוקון והמכסה שלה בהתאמה, כדי למנוע בלבול של שברים או דגימות. - הפעל את מערכת HPLC/משאבות ומוכן להפעלה. הפעל את שטיפת אטם הבוכנה ולשמור אותו מופעל במהלך כל הריצה. טען את הדגימה על-ידי הזרקה ידנית של הסופרנט שלם מ- 4.5 (כ- 750 μL) באמצעות מזרק מתאים (ראה טבלת חומרים). אם הזרקה אוטומטית אפשרית, העבר את הדגימה למבכון המדגם המתאים. סובב את השסתום מ- "load" כדי "להזריק" מיקום ולהפעיל את מעבר הצבע ואת אספן השברים.
הערה: בהתאם למערכת HPLC שבה נעשה שימוש, ההליך ההתחלתי עשוי להשתנות, במיוחד בעת השוואת מערכות ישנות יותר (כמתואר כאן) עם דגם חדש יותר הנשלט על-ידי תוכנה מלאה. חשוב מאוד להבטיח כי מעבר הצבע, הזרקת מדגם ואיסוף שברים להתחיל בו זמנית. - בעוד הפעלת HPLC נמשכת, בדוק את הלחץ באופן קבוע. הלחץ ההתחלתי צריך להיות סביב בר 18-24 (1.8-2.4 MPa) ואצריך לעלות לאט ל-50-60 בר (5-6 MPa) ברגע 100% מאגר B מגיע.
התראה: לחץ מופחת עשוי להצביע על דליפה במערכת בעוד לחץ מוגבר מצביע על חסימה. תנודות לחץ (≥ 3 בר בתוך כמה שניות) יכול להצביע על נוכחות של אוויר במערכת. זכור שכל מה שמשאיר את העמודה, כמו גם כל דליפה המתרחשת במזרק או לאחר מכן הוא רדיואקטיבי.
הערה: הלחץ תלוי גם במערכת HPLC והוא יכול להיות נמוך או גבוה יותר ממה שצוין כאן. הוא יגדל באיטיות לאחר כ-15-20 ריצות. עם זאת, זה לא בהכרח משפיע על איכות הריצות שהושגו. - לאחר הריצה, לסגור את הבקבוקונים בחוזקה ולערבב את השברים עם קוקטייל מבריק על ידי ניעור נמרץ. המשיכו ישירות עם המדידה או שמרו את הבקבוקונים במצב זקוף, באופן אידיאלי בחושך.
הערה: שברים מעורבבים עם קוקטייל מבריק יציבים במשך שבועות ותו לא ניתן למדוד מאוחר יותר. מכיוון שמחצית החיים של הריטניום היא 12.32 שנים, אובדן האות זניח. - לאחר סיום הריצה של הדגימה האחרונה של היום, הפסק את שתי משאבות HPLC.
- (אופציונלי) כדי ל כדי להגדיל את אריכות ימים של המערכת, במיוחד כאשר הוא לא בשימוש קבוע, לשטוף משאבה B ונימים על ידי הצבת הנימים ממאגר B לתוך בקבוק עם מאגר A ולתת את המשאבה לרוץ במשך 10-15 דקות. לפני השימוש הבא, זכור להחליף את הניימים במאגר B ולניתוק משאבה B מהמיקסר כדי לשטוף אותו במאגר B. לאחר המשאבה ונימים מלאים שוב עם מאגר B, לחבר אותו מחדש עם המיקסר והמערכת מוכנה לשימוש.
6. מדידת השברים
- הכנס את הבקבוקונים למדפי הנגד של ההבהיקה ומדד כל בקבוקון למשך 5 דקות במונה נוזלי.
- באופן אידיאלי, השתמש בארונות תקשורת המתאימים ישירות בקבוקונים קטנים ולהימנע מתלייה בקבוקונים גדולים יותר (למשל, 20 מ"ל) בקבוקונים כדי להפחית שגיאות ספירה. הגדרות התוכנה המשמשות בפרוטוקול זה מוצגות באות משלים 1.
הערה: בצע באופן קבוע פרוטוקול SNC (נורמליזציה עצמית וכיל) באמצעות תקנים לאמנווים[ 3 H]. זמני ספירה קצרים יותר (1-5 דקות) אפשריים כדי להפחית את זמן ההמתנה. עם זאת, כדי להבטיח שכפול ודיוק ספירה גבוהים, מומלץ להשתמש ב- 5 דקות.
7. ניתוח נתונים
- יצא את המידות ממונה ה-Scintillation כקובץ גיליון אלקטרוני או כתבנית קובץ תואמת/להמרה. הערך את הנתונים באמצעות מחשב המצויד ב- Excel או בתוכנה דומה, ותוכנת ניתוח מתאימה כמו Origin.
- הכן תרשים קו דו-ממדי שבו הספירות הנמדדות לדקות (cpm) מתווים כנגד זמן השמירה (ראה איור 1, איור 2).
- כדי להשוות דגימות זו עם זו, לנרמל את הנתונים על-ידי סיכום לחץ הדם מכל שבר מדקה 25 עד 96 עבור כל דגימה בודדת.
הערה: דקה 25 משמש כניתוק כדי לא לכלול לא מאוגדים [3H]-מיו-אינוזיטול, InsP1 ו InsP2 מהניתוח, כמו אלה נוטים תנודות חזקות ולא ניתן להפריד היטב (לפחות עם מעבר הצבע המוצע בפרוטוקול זה) ובכך לשנות בחוזקה את גורם הנורמליזציה בשל הפעילות הגבוהה שלהם. - נרמל את כל הנתונים לדגימה עם העלות הכוללת הנמוכה ביותר (בשברים 25\u201296) על-ידי חלוקת העלות הכוללת של העלות לדקה מהדגימה עם העלות הנמוכה ביותר של העלות לדקה (בשברים 25-96) לפי העלות הכוללת של העלות לדקה (בשברים 25-96) של שאר הדגימות. לאחר מכן ניתן להשתמש בגורם שנוצר כדי לנרמל את ה-cpm מכל שבר על-ידי הכפלת תוצאת ה-CPM של כל שבר עם הגורם.
הערה: בסופו של דבר, סכום ערכי ה- cpm מדקה 25 עד הסוף צריך להיות שווה לכל הדגימות בהשוואה זו לזו. יש להציג רק ריצות מנורמלות באותו גרף/איור (כאשר מוצגות כפרופילים בפועל). איור משלים 2 מציג דוגמה לאופן ביצוע שלבי חישוב אלה (באמצעות שברים 25-35 בלבד של שתי דגימות לפישוט). עם זאת, במקרים מסוימים אין צורך לנרמל נתונים. לדוגמה, כאשר פסגות מכמתות לפי שלב 7.4 ומוצגות כאחוזים מכלל ה- InsPs (כפי שמוצג באות תלת-מ). כאמור, בעת הצגת ניתוחים מרובים זה לצד זה כפרופילים, או כאשר הפעילות הנמדדת בפועל משמשת למסקנות (לדוגמה, טיפול א') מגדיל את הנורמליזציה של InsP7 על ידי x% בהשוואה לפקד, בהתייחס לערכי ה-CPM של InsP7 של שתי הדגימות ולא לאחוז הנורמליזציה הכוללת של InsPs. כדי לנתח את ההשפעה של הבדלי גנוטיפ או טיפול על יעילות תיוג, חשוב לא לנרמל, כמו זה היה לפסול הבדלים אלה. עם זאת, כימות מוחלטת בשיטה זו היא מאתגרת כי יעילות החילוץ עם פרוטוקול זה יכול להיות משתנה מסיבות שונות, הם לפעמים אפילו נצפו כאשר עותק משוכפל של אותו גנוטיפ וטיפול מנותחים. זכור שבהתאם למערכת HPLC, לעמודה ולמשפיל המשמש לניתוחים, ייתכן שיהיה צורך לשנות את הניתוח. - כדי לבצע כימות יחסיים של פסגות פוליפוספט אינוזיטול מסוימות ולאחר מכן ליצור גרפים עמודות המכילים נתונים של שכפולים לניתוחים סטטיסטיים, להמשיך את הניתוח עם תוכנה מיוחדת שיכולה לחשב אזורי שיא של כרומטוגרמות (למשל, מקור). ראה איור משלים 3.
הערה: רוב מערכות HPLC הנשלטות על-ידי תוכנה מסופקות עם תוכנה המתאימה המסוגלת למשימה זו. שיאים נקבעים כשברים עם ערכי cpm מעל הרקע (המשתנים במידה מסוימת בין ריצות) ושמני שמירה הדומים לנתונים שפורסמו בעבר. זמן השמירה של שיא מסוים נקבע בתוכנה גיליון אלקטרוני (למשל, Excel) משמש להקצאת שיאים לחישוב של אינטגרלים מוגדרים (למשל, במקור). איור משלים 3 ממחיש תהליך זה של קביעת שיא, חיסור רקע ושילוב של פסגות.
Representative Results
התוצאות המוצגות כאן שואפות להמחיש תוצאות אפשריות שהושגו על פי וריאציות ברמות טכניות וביולוגיות. הראשון מובחן על ידי ניתוחים באמצעות עמודות חדשות לעומת גיל ( איור 1 )ודוגמאות טריותלעומתמאוחסנות (איור 3), והשנייה עלידי הערכת תמציות משתי מערכות צמחיםשונות, א. תליאנה (איור 1, איור 3) ול.
הפעלת SAX-HPLC אופטימלית מתוארת על איור 1A\u2012C, אשר מראה ספקטרום פוליפוספט אינוזיטול מלא שהושג מתמציות A. thaliana לאחר ספירת מבריק. שימו לב כי הפסגות מופרדות יפה ותו לא ניתן להקצותן ל-isomers שונים (או לזוגות enantiomer) המבוססים על ניידות כרומטוגרפית המתוארתקודם לכן 5,7.
איור 2 מציג את התוצאה המייצגת של ניתוח SAX-HPLC של שתילי L. japonicus שגדלו וסויגו באותם תנאים כמו שתילי Arabidopsis. בעוד ככל הנראה כל מיני InsP ופסגות הידועים Arabidopsis ניתן לראות, ישנם הבדלים משמעותיים לגבי יחסית (למשל, יחסים בין isomers) של isomers InsP ספציפי, בעת השוואת הפרופילים של שני המינים. לדוגמה, תמציות לוטוס הראו InsPמוגברת 3c, InsP4b, InsP5b ו מופחת InsP3a, InsP4a, InsP5a ו InsP5c לעומת Arabidopsis אשר משאיר מקום לחקירות נוספות. איור 2D ממחיש את היחסים השונים בין Isomers InsP בין Arabidopsis לבין לוטוס.
איור 3 מציג שני פרופילי InsP של מדגם שפוצלו לאחר החילוץ. המחצית הראשונה נותחה מיד והמחצית השנייה יום לאחר מכן, לאחר אחסון ב-80 מעלות צלזיוס. שים לב כי רק הבדלים קלים נצפו בין הדגימות השונות (כלומר, קווים שחורים ואדומים באיור 3A\u2012C, ואיור תלת-מידי). הדבר ממחיש שמחזור הקפאה אחד אינו פוגע בדגימה וששיטה עצמה מייצרת תוצאות לשחזור.
איור 1: פרופיל InsP טיפוסי של ניתוח SAX-HPLC מוצלח שבוצע באמצעות פרוטוקול זה. (a\u2012C) פרופיל SAX-HPLC של בני 17 יום מסוג פראי (קול-0) שתילי Arabidopsis radiolalabeled עם [3H]-מיו-אינוזיטול. חילוץ InsP כללי והפעלה SAX-HPLC בוצעו באותו יום. (א)ספקטרום מלא; (B, C) מה אתה עושהכאן? הגדלת התצוגה של הפרופיל המוצג ב- A. כל הפסגות הגלויות מסומנות ומוקצות למין InsP המתאים. בהתבסס על ניידות כרומטוגרפיתשפורסמה 5,7, InsP4a מייצג ככל הנראה Ins(1,4,5,6)P4 או Ins(3,4,5,6)P4, InsP5a מייצג InsP5 [2-OH], InsP5b מייצג את InsP5 [4-OH] או את צורתו האנונטיומרית InsP5 [6-OH], ו- InsP5c מייצג את InsP5 [1-OH] או את צורתו האנונטיומרית InsP5 [3-OH]. האופי האיתורי של InsP3a-c, InsP4b, InsP7ו- InsP8 עדיין אינם ידועים. לוח (D) מציג פרופיל SAX-HPLC של צמחים שגודלו באופן זהה אך באמצעות עמודה מזדקנת (>40 פועל). הפחתה ברורה של InsP6 בהשוואה למינים אחרים InsP והיעדר PP-InsPs גלוי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: פרופיל InsP מייצג של צמחים ל. יפניקוס. פרופיל SAX-HPLC (A\u2012C) של 17 יום בן בר מסוג (גיפו) L. שתילי יפניקוס radiolabeled עם [3H]-מיו-אינוזיטול. (א)ספקטרום מלא; (B, C) מה אתה עושהכאן? הגדלת התצוגה של הפרופיל המוצג ב- A. כל הפסגות הגלויות מסומנות ומוקצות למין InsP המתאים. בהתבסס על ניידות כרומטוגרפיתשפורסמה 5,7, InsP4a מייצג ככל הנראה InsP (1,4,5,6)P4 או Ins(3,4,5,6)P4, InsP5b מייצג ככל הנראה InsP5 [4-OH] או את צורתו אננטיומרית InsP5 [6-OH], ו- InsP5c מייצג ככל הנראה את InsP5 [1-OH] או את צורתו האנונטיומרית InsP5 [3-OH]. האופי האיתורי של InsP3a-c, InsP4b, InsP7ו- InsP8 אינם ידועים. (ד)השוואה בין מיני InsP בודדים (ב% מכלל הפעילות מ- elution 25\u201296) של A. thaliana (נתונים מאיור 1A\u2012C) ו- L. japonicus (נתונים מאיור 2A-C). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: פרופילי InsP של מדגם מפוצל הממחישים את האפשרות לשחזור של ניתוחי SAX-HPLC. (a\u2012C) פרופילי SAX-HPLC של בני 17 יום (קול-0) שתילי ערבידופסיס עם[3H]-מיו-אינוזיטול. לפני הריצה, הדגימה פוצלה וחצי לרוץ מיד והשני חצי יום לאחר מכן לאחר אחסון ב -80 ° C. (A)ספקטרום מלא; (B, C) מה אתה עושהכאן? הגדלת התצוגה של הפרופיל המוצג ב- A. כל הפסגות הגלויות מסומנות ומוקצות למין InsP המתאים. בהתבסס על ניידות כרומטוגרפיתשפורסמה 5,7, InsP4a מייצג ככל הנראה Ins(1,4,5,6)P4 או Ins(3,4,5,6)P4, InsP5a מייצג InsP5 [2-OH], InsP5a מייצג את InsP5 [2-OH], InsP5b מייצג את InsP5 [4-OH] או את הטופס האנטנטיומרי שלו InsP5 [6-OH], ו- InsP5c מייצג את InsP5 [1-OH] או את צורתו האנזנטיומרית InsP5 [3-OH]. האופי האיתורי של InsP3a-c, InsP4b, InsP7ו- InsP8 עדיין אינם ידועים. לוח ד' מציג את הכימות של InsP6 ו- PP-InsPs InsP7 ו- InsP8 של שתי הריצות. הערכים מייצגים את הסכום (ב- %) של מיני InsP בהתאמה ביחס לכל InsP (פעילות כוללת מ-25-96). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור משלים 1: הגדרות תוכנה לספירת נוזלים באמצעות מונה מבריק קל. צילומי מסך המציגים את גירסת התוכנה, כמו גם הגדרות המשמשות לספירת דוגמאות של [3H] המבוצעות עם פרוטוקול זה מתוארות. אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו.
איור משלים 2: דוגמה מייצגת לנורמליזציה של נתונים. צילום מסך של גליון עבודה מציג את כל השלבים והנוסחאות המשמשים לנרמל את ריצות SAX-HPLC זו לזו. לצורך פישוט, מוצגים רק שברים 25-35 של דגימות. אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו.
איור משלים 3: קביעת שיא, חיסור רקע ואינטגרציה באמצעות תוכנת ניתוח. (א)נתונים מניתוח SAX-HPLC נטענים לתוך התוכנה (דקות 28-96) וכלי מנתח השיא נבחר. (B\u2012E) התוכנית הבסיסית מוגדרת באופן ידני על-ידי הגדרת נקודות בין שיאים בודדים והרקע חסר. (F)פסגות נקבעות באופן ידני על בסיס מראה ופורסם ניידות כרומטוגרפית5,,7. (G) טווחי שיא מוגדרים באופן ידני על-ידי ערכי cpm. (H)פסגות משולבות ומחושבות כ% מכל הפסגות. אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו.
Discussion
כאן אנו מציגים שיטה רב-תכליתית ורגישה לכמת InsPs כולל PP-InsPs בתמציות צמח ולספק עצות מעשיות על איך לקבל שיטה זו הוקמה. למרות שהפרוטוקול הוא בדרך כלל חזק, ריצות וניתוחים תת-אופטימליים יכולים להתרחש. ברוב המקרים, ריצות אלה ניתן לזהות על ידי הפחתה חזקה או אפילו אובדן מוחלט של InsPs זרחן מאוד, במיוחד המינים PP-InsP InsP7 ו InsP8. סיבות אפשריות יכולות להיות זיהום מיקרוביאלי של חומר הצמח ונעה לא מספיק של הידרולאזים PP-InsP צמח אנדוגני במהלך החילוץ בשל שחיקה מספיקה והפשרה של חומר הצמח שלא יהיה במגע מיידי עם מאגר החילוץ. סיבות נוספות כוללות התאמת pH לא מדויקת על-ידי תוספת לא מספקת או עודפת של מאגר נטרול, או פשוט חומר לדוגמה לא מספיק. האחרון יכול לעשות את זה קשה לזהות PP-InsPs, מאז אלה נמצאים לעתים קרובות בכמויות נמוכות מאוד בתאים. עודף של חומר מדגם או ייבוש לא יעיל במהלך שלב 3.5 עלול לגרום דילול של חומצה perchloric, ולכן גם מוביל השבתת אנזים מספיק ואובדן ספציפי של InsP6 ו PP-InsPs. כמות החומר הצמחי, כמו גם radiolabel בשימוש בפרוטוקול זה היו אופטימיזציה בהתבסס על עלויות וביצועים, ולכן הוא קרוב לכמות הנמוכה ביותר שעדיין מספיקה למתן תוצאות אופטימליות. בנוסף, שרפטור העמודה יאבד בהדרגה את קיבולת הרזולוציה שלו. הסימן הראשון של תהליך זה הוא (מסיבות לא לגמרי ברורות למחברים) אובדן ספציפי של מינים InsP זרחן גבוה יותר כמו PP-InsPs בספקטרום HPLC. עם הזדקנות נוספת, אפילו InsP6 לא ייפתר כראוי על ידי העמודה(איור 1D). לכן, השימוש בעמודה נאותה, כמו גם טיפול קפדני של המדגם ותחזוקה נכונה של רכיבי HPLC הוא חיוני להבטחת תוצאות מדויקות.
בעת השוואת דוגמאות וריצות, במיוחד כאשר נוצרים באמצעות ציוד שונה (לדוגמה, מערכות ועמודות של HPLC) או בימים שונים, חיוני לנרמל את הדגימות זו לזו (כמתואר בשלב 7.3) ולנתח אותן באותו אופן. רק באמצעות נורמליזציה ניתן ומדויק להציג דגימות מרובות באותו גרף (איור 3). לכמת InsPs בודדים ביחס לסך של InsPs, או למין InsP ספציפי אחר, אין צורך לנרמל, כל עוד מוצגים רק ערכים יחסיים ולא ערכים מוחלטים. באופן אידיאלי, הן פרופילי InsP והן הכימות מוצגים. עם זאת, במקרים מסוימים לא ניתן להציג כראוי שתי ריצות או יותר באותו גרף. זמני שמירה שונים או רמות שונות של פעילות רקע יכולים לקשה על השוואת פרופילי SAX-HPLC לא כירים בלבד. אותו הדבר נכון כאשר דגימות רבות צריך להיות מושווה. במקרים כאלה, יש צורך בהערכה נוספת באמצעות תוכנה נוספת (לדוגמה, Origin) לכמת שיא אישי.
המחברים מודעים לכך שניתן לייעל את הפרוטוקול המתואר כאן ויש להתאים אותו לכל שאלת מחקר פרטני. למרות להיות אופטימיזציה עבור תמציות Arabidopsis 7,17 בפרוטוקול זה, שיטה זו היא תכליתית והוא יכול לעזור בקביעת פרופילי InsP של מינים אחרים של צמחים גם כן. כאן אנו מדגים אפשרות זו על ידי הצגת בפעם הראשונה פרופיל InsP עבור L. japonicus, אשר לא דרש שינויים של תנאי התיוג, חילוץ InsP או SAX-HPLC לרוץ(איור 2). במיוחד, בעוד באופן כללי דומה, ההבדלים נצפו בין L. japonicus ו פרופילים InsP Arabidopsis. למשל, בל. japonicus InsP5 [4-OH] או הצורה enantiomeric שלה InsP5 [6-OH] הם בשפע יותר מאשר InsP5 [1-OH] או הצורה אננטיומרית שלה Insפ'-5 [3-OH] בהשוואה לערבידופסיס,שם InsP5 [1-OH] או צורתו enantiomeric InsP5 [3-OH] הם המינים הדומיננטיים InsP5. כמו כן, אנו צופים כי שינויים בהרכבהתקשורת, [3H]-מיו-ריכוז, גיל הצמח, תנאים סביבתיים (למשל, אור וטמפרטורה), תוספת של תרכובות כימיות או ניתוחים של אינטראקציות צמח מיקרוביאלי בין גורמים אחרים, ייתכן שיהיה צורך להיבדק ולהתאים.
אחד החסרונות החשובים של שיטה זו שיש לקחת בחשבון הוא כי התיוג נעשה בתרבות נוזלית (סטרילית), אשר אינה מייצגת סביבה פיזיולוגית עבור רוב צמחי הקרקע. בנוסף, בשל העלויות הגבוהות של [³H]-מיו-אינוזיטול, נפח פתרון התיוג וגודל כלי התרבות מוגבל בדרך כלל, מה שמגביל גם את גודל הצמחים שניתן להשתמש בהם. ניתן להימנע מטיפוח בתרבות הנוזלית על ידי הסתננות ישירה למשל של צמחים מגודלים בקרקע עם [³H]-מיו-אינוזיטול ולאחר מכן בעקבות הפרוטוקול המתואר כאן, כפישדווח קודם לכן 10.
ישנם מספר חסרונות של פרוטוקול זה בהשוואה לשיטות חלופיות, כגון TiO2 למשוך למטה ואחריו טכניקות מבוססות PAGE או ספקטרומטריה המונית. בשל[3H]-מיו-תיוג inositol, רק מינים InsP שמקורם ישירות מיו -inositol רדיויתגלה בסופו של דבר. השיטה המתוארת כאן היא עיוורת isomers Ins אחרים כגון scyllo-אינוזיטול ו isomers אחרים שחלקם זוהו בצמחים מסוימים44. יתר על כן, myo-InsPs נגזר ממסלולים אחרים לא ייכללו, כולל אלה מסונתז על ידי סינתזה דה נובו של מיו-אינוזיטול ומיו-אינוזיטול-3-פוספט באמצעות isomerization של גלוקוז-6-פוספט, קטאלי על ידי מיו-אינוזיטול-3-פוספט סינתאז (MIPS)חלבונים 45. למרות[32P] או [33P]- אורתופדיה -פוספט יכול לשמש תוויות חלופיות, השימוש בהם מהווה חיסרון גדול, שכן כל מולקולה המכילה פוספט, כולל נוקלאוטידים בשפע ונגזרותיה, יסויג.ortho מולקולות אלה ניתן גם לחלץ עם פרוטוקול זה ולאגד לעמודה SAX, אשר יגרום רמה גבוהה של פעילות רקע שתפריע לזיהוי של פסגות InsPבודדים 5. בנוסף, כימות של [32P]- או [33P] מתויג InsPs ו PP-InsPs יכול להיות מושפע מאוד על ידי מחזור פוספט ו pyrophosphate moiety ולא יכול לדווח על קריאה המונית עבור מינים אינוזיטול.
מצד שני,[3H]-מיו-אינוזיטול במיוחד תוויות מיו-אינוזיטול המכיל מולקולות. InsPs, שומנים המכילים אינוזיטול, כגון פוספינוסיטידים, ו galactinol הם במקרה זה מסומן. עם זאת, רק InsPs ינותחו עם פרוטוקול זה, מאז שומנים אינם מסיסים במאגר החילוץ galactinol אינו נקשר לעמודה SAX.
עד כה, ההבדלים מפרופיל InsP צמח שנוצר על ידי [3H]-מיו-אינוזיטול תיוג לעומת אחד שנקבע על ידי TiO2 נסיגה / PAGE נשאר לא ידוע, מאז השוואות כאלה לא בוצעו בצמחים. מחקר שנערך לאחרונה בתאי בעלי חיים התייחס לשאלה זו46. בעבודה זו, בריכה של InsP6 כי הוא בלתי נראה על ידי [3H]-מיו-אינוזיטול תיוג, אשר בכך צריך להיות נגזר ישירות גלוקוז-6-פוספט, זוהה על ידי השוואת פרופילי SAX-HPLC עם ג'לים דף של קווי תאים יונקים. 24 שעות של רעב פוספט הביא לעלייה של 150% של InsP6 בעת כימות ג'לים דף של InsPs מטוהרים באמצעות TiO2 נסיגה. SAX-HPLC ניתוחים של [3H]-מיו-אינוזיטול-תווית תאים שטופלו באופן זהה רק הראה עלייה של 15% של [3H]-InsP6. כפי שהוזכר קודם לכן, InsPs נמוך יותר מ- InsP5 אינם ניתנים לגילוי עם ניתוח PAGE ברוב המקרים. תייבל רדיו ואחריו SAX-HPLC נראה כשיטת הבחירה, כל עוד פרוטוקולים ספקטרומטריים מסה אינם ממוטבים כדי לזהות קבוצה זו של מולקולות טעונות שלילית מאוד.
אתגר נוסף שנותר הוא להבחין בין enantiomers בניתוחי SAX-HPLC (או בכל שיטה אחרת לניתוח InsP)10,17. אתגר זה ניתן להתמודד על ידי תוספת של בוררים כיראליים, כלומר, enantiopure תרכובות כמו L-ארגנין amide אינטראקציה עם מולקולות enantiomeric בהתאמה כדי ליצור תרכובות diastereomeric שניתןלהפריד 10. למיטב ידיעתנו, גישה זו יושמה רק כדי להפלות את Enantiomeric InsP5 isomers InsP5 [1-OH] ו- InsP5 [3-OH] על ידי NMRמנתח 10. אפליה של זוגות אננטיומריים אחרים או אפליה מוצלחת של enantiomers על ידי ניתוח SAX-HPLC כיראלי או שיטות מבוססות דף כיראלי עדיין לא דווחו ויש לפתח גם. בהתחשב בסינתזה המשומרת וברגולציה המשומרת של PP-InsPs על ידי זמינות זרחן, אנו מדמיינים כי שיטות לא רדיואקטיביות במיוחד כגון PAGE או שיטות מבוססות MS, יחד עם ניתוחים תזונתיים, יסייעו לקרקע את מאמצי האמת לכייל נתוני חישה מרחוק שנועדו לאבחן ליקויים תזונתיים בגידולים17,,18,,24,,25. עם זאת, השיטה המוצגת כאן עדיין יכול להיחשב תקן הזהב עבור ניתוחי InsP ויהיה אינסטרומנטלי לגלות פונקציות חדשות של שליחים מסקרנים אלה בצמחים.
Disclosures
לסופרים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי דויטשה Forschungsgemeinschaft (DFG, קרן המחקר הגרמנית) תחת אסטרטגיית מצוינות של גרמניה - EXC-2070 – 390732324 (PhenoRob), קבוצת הכשרת מחקר GRK2064 ומעניקי מחקר בודדים SCHA1274/4-1 ו SCHA1274/5-1 כדי G.S. אנו מודים גם ללי שלוטר ובריג'יט אוברבאך על הסיוע הטכני.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Eppendorf AG | model: 5430 R | |
| Diammonium hydrogen phosphate, ≥97 % | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0268.1 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate, ≥99 %, p.a., ACS | Carl Roth GmbH + Co. KG | 8043.2 | |
| Falcon 12-well clear flat bottom TC-treated multiwell cell culture plate, with lid, individually wrapped, sterile | Corning Inc. | 353043 | |
| Fraction collector | LAMBDA Instruments GmbH | model: OMNICOLL single channel collector | |
| Growth incubator | poly klima GmbH | model: PK 520-LED | |
| HPLC pumps | Kontron Instruments | model: 420 | |
| HPLC syringe for Rheodyne valves, 1 mL | Hamilton Company | 81365 | |
| Injector for HPLC | Supelco | model: Rheodyne 9725 | |
| Inositol, myo-[1,2-3H(N)] | American Radiolabeled Chemicals Inc. | ART 0261 | |
| Liquid nitrogen | University, Chemistry Department | ||
| Liquid scintillation counter | PerkinElmer Inc | model: TRI-CARB 2900TR | |
| Micro pestle | Carl Roth GmbH + Co. KG | CXH7.1 | |
| Mixed cellulose Eester filter, ME range (ME 24), plain, 0.2 µm pore size, 47 mm circle | GE Healthcare Life Sciences | 10401770 | |
| Mixer for HPLC | Kontron Instruments | model: M 800 | |
| Murashige & Skoog medium, salt mixture | Duchefa Biochemie | M0221 | |
| OriginPro software | OriginLab Corp. | ||
| Orthophosphoric acid, ≥85 %, p.a., ISO | Carl Roth GmbH + Co. KG | 6366.1 | |
| Partisphere 5 µm SAX cartridge column, 125 x 4.6 mm | Hichrom Limited | 4621-0505 | |
| Perchloric acid, 70 %, 99.999 % trace metals basis | Sigma-Aldrich | 311421 | |
| Petri dish, square, PS, clear, 120/120/17 mm, sterile | Greiner Bio One International GmbH | 688161 | |
| pH-indicator paper pH 5.5 - 9.0, Neutralit | Merck KGaA | 109564 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Potassium carbonate | Carl Roth GmbH + Co. KG | P743.2 | |
| Safe-Lock tubes, 1.5 mL | Eppendorf AG | 30120086 | |
| Sample loop for 9725 injectors, volume 2 mL, PEEK | Supelco | 57648 | |
| SNAPTWIST scintillation vial, 6.5 mL | Simport Scientific Inc. | S207-5 | |
| Sterile bench | LaboGene | model: ScanLaf MARS 900 | |
| Sucrose, ≥99,5 %, p.a. | Carl Roth GmbH + Co. KG | 4621.1 | |
| Ultima-Flo AP liquid scintillation cocktail | PerkinElmer Inc | 6013599 | |
| Ultra-pure deionized water | Milli-Q | ||
| Wrenchless WVS End Fitting Kit | Hichrom Limited | 4631-1001 |
References
- Berridge, M. J., Irvine, R. F. Inositol Phosphates and Cell Signaling. Nature. 341 (6239), 197-205 (1989).
- Streb, H., Irvine, R. F., Berridge, M. J., Schulz, I. Release of Ca-2+ from a Nonmitochondrial Intracellular Store in Pancreatic Acinar-Cells by Inositol-1,4,5-Trisphosphate. Nature. 306 (5938), 67-69 (1983).
- Krinke, O., Novotna, Z., Valentova, O., Martinec, J. Inositol trisphosphate receptor in higher plants: is it real. Journal of Experimental Botany. 58 (3), 361-376 (2007).
- Kuo, H. F., et al. Arabidopsis inositol pentakisphosphate 2-kinase, AtIPK1, is required for growth and modulates phosphate homeostasis at the transcriptional level. Plant Journal. 80 (3), 503-515 (2014).
- Kuo, H. F., et al. Arabidopsis inositol phosphate kinases IPK1 and ITPK1 constitute a metabolic pathway in maintaining phosphate homeostasis. Plant Journal. 95 (4), 613-630 (2018).
- Gillaspy, G. E. Lipid-mediated Protein Signaling. Capelluto, D. G. S. , Springer. Netherlands. 141-157 (2013).
- Stevenson-Paulik, J., Bastidas, R. J., Chiou, S. T., Frye, R. A., York, J. D. Generation of phytate-free seeds in Arabidopsis through disruption of inositol polyphosphate kinases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (35), 12612-12617 (2005).
- Lemtiri-Chlieh, F., MacRobbie, E. A. C., Brearley, C. A. Inositol hexakisphosphate is a physiological signal regulating the K+-inward rectifying conductance in guard cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (15), 8687-8692 (2000).
- Lee, H. S., et al. InsP6-sensitive variants of the Gle1 mRNA export factor rescue growth and fertility defects of the ipk1 low-phytic-acid mutation in Arabidopsis. Plant Cell. 27 (2), 417-431 (2015).
- Blüher, D., et al. A 1-phytase type III effector interferes with plant hormone signaling. Nature Communications. 8, (2017).
- Murphy, A. M., Otto, B., Brearley, C. A., Carr, J. P., Hanke, D. E. A role for inositol hexakisphosphate in the maintenance of basal resistance to plant pathogens. Plant Journal. 56 (4), 638-652 (2008).
- Poon, J. S. Y., Le Fevre, R. E., Carr, J. P., Hanke, D. E., Murphy, A. M. Inositol hexakisphosphate biosynthesis underpins PAMP-triggered immunity to Pseudomonas syringae pv. tomato in Arabidopsis thaliana but is dispensable for establishment of systemic acquired resistance. Molecular Plant Pathology. 21 (3), 376-387 (2020).
- Wild, R., et al. Control of eukaryotic phosphate homeostasis by inositol polyphosphate sensor domains. Science. 352 (6288), 986-990 (2016).
- Shears, S. B. Inositol pyrophosphates: Why so many phosphates. Advances in Biological Regulation. 57, 203-216 (2015).
- Shears, S. B. Intimate connections: Inositol pyrophosphates at the interface of metabolic regulation and cell signaling. Journal of Cellular Physiology. 233 (3), 1897-1912 (2018).
- Desai, M., et al. Two inositol hexakisphosphate kinases drive inositol pyrophosphate synthesis in plants. Plant Journal. 80 (4), 642-653 (2014).
- Laha, D., et al. VIH2 Regulates the Synthesis of Inositol Pyrophosphate InsP8 and Jasmonate-Dependent Defenses in Arabidopsis. Plant Cell. 27 (4), 1082-1097 (2015).
- Laha, D., et al. Arabidopsis ITPK1 and ITPK2 Have an Evolutionarily Conserved Phytic Acid Kinase Activity. Acs Chemical Biology. 14 (10), 2127-2133 (2019).
- Dorsch, J. A., et al. Seed phosphorus and inositol phosphate phenotype of barley low phytic acid genotypes. Phytochemistry. 62 (5), 691-706 (2003).
- Flores, S., Smart, C. C. Abscisic acid-induced changes in inositol metabolism in Spirodela polyrrhiza. Planta. 211 (6), 823-832 (2000).
- Brearley, C. A., Hanke, D. E. Inositol phosphates in barley (Hordeum vulgare L) aleurone tissue are stereochemically similar to the products of breakdown of InsP(6) in vitro by wheat-bran phytase. Biochemical Journal. 318, 279-286 (1996).
- Laha, N. P., et al. ITPK1-Dependent Inositol Polyphosphates Regulate Auxin Responses in Arabidopsis thaliana. bioRxiv. , (2020).
- Laha, D., et al. Inositol Polyphosphate Binding Specificity of the Jasmonate Receptor Complex. Plant Physiology. 171 (4), 2364-2370 (2016).
- Dong, J. S., et al. Inositol Pyrophosphate InsP(8) Acts as an Intracellular Phosphate Signal in Arabidopsis. Molecular Plant. 12 (11), 1463-1473 (2019).
- Zhu, J., et al. Two bifunctional inositol pyrophosphate kinases/phosphatases control plant phosphate homeostasis. Elife. 8, (2019).
- Couso, I., et al. Synergism between Inositol Polyphosphates and TOR Kinase Signaling in Nutrient Sensing, Growth Control, and Lipid Metabolism in Chlamydomonas. Plant Cell. 28 (9), 2026-2042 (2016).
- Ito, M., et al. Hydrophilic interaction liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the quantitative analysis of mammalian-derived inositol poly/pyrophosphates. Journal of Chromatography A. 1573, 87-97 (2018).
- Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Inositol Phosphates Purification Using Titanium Dioxide Beads. Bio-Protocol. 8 (15), (2018).
- Loss, O., Azevedo, C., Szijgyarto, Z., Bosch, D., Saiardi, A. Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates. Jove-Journal of Visualized Experiments. (55), e3027 (2011).
- Harmel, R. K., et al. Harnessing C-13-labeled myo-inositol to interrogate inositol phosphate messengers by NMR Electronic supplementary information (ESI) available. Chemical Science. 10 (20), 5267-5274 (2019).
- Azevedo, C., Saiardi, A. Extraction and analysis of soluble inositol polyphosphates from yeast. Nature Protocols. 1 (5), 2416-2422 (2006).
- Shears, S. B. Inositol Phosphates: Methods and Protocols. Miller, G. J. , Springer US. 1-28 (2020).
- Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Importance of Radioactive Labelling to Elucidate Inositol Polyphosphate Signalling. Topics in Current Chemistry. 375 (1), (2017).
- Stevenson-Paulik, J., et al. Inositol phosphate metabolomics: Merging genetic perturbation with modernized radiolabeling methods. Methods. 39 (2), 112-121 (2006).
- Liu, C., Riley, A. M., Yang, X., Shears, S. B., Potter, B. V. L. Synthesis and Biological Activity of d- and l-chiro-Inositol 2,3,4,5-Tetrakisphosphate: Design of a Novel and Potent Inhibitor of Ins(3,4,5,6)P4 1-Kinase/Ins(1,3,4)P3 5/6-Kinase. Journal of Medicinal Chemistry. 44 (18), 2984-2989 (2001).
- Hughes, P. J., Hughes, A. R., Putney, J. W., Shears, S. B. The regulation of the phosphorylation of inositol 1,3,4-trisphosphate in cell-free preparations and its relevance to the formation of inositol 1,3,4,6-tetrakisphosphate in agonist-stimulated rat parotid acinar cells. Journal of Biological Chemistry. 264 (33), 19871-19878 (1989).
- Shears, S. B., Kirk, C. J., Michell, R. H. The pathway of myo-inositol 1,3,4-trisphosphate dephosphorylation in liver. The Biochemical journal. 248 (3), 977-980 (1987).
- Stevenson-Paulik, J., Odom, A. R., York, J. D. Molecular and Biochemical Characterization of Two Plant Inositol Polyphosphate 6-/3-/5-Kinases. Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42711-42718 (2002).
- Stephens, L. R., Hawkins, P. T., Downes, C. P. An analysis of myo-[3H]inositol trisphosphates found in myo-[3H]inositol prelabelled avian erythrocytes. The Biochemical journal. 262 (3), 727-737 (1989).
- Saiardi, A., et al. Mammalian inositol polyphosphate multikinase synthesizes inositol 1,4,5-trisphosphate and an inositol pyrophosphate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (5), 2306 (2001).
- Azevedo, C., Burton, A., Bennett, M., Onnebo, S. M. N., Saiardi, A. Inositol Phosphates and Lipids: Methods and Protocols. Barker, C. J. , Humana Press. 73-85 (2010).
- Saiardi, A., Caffrey, J. J., Snyder, S. H., Shears, S. B. The Inositol Hexakisphosphate Kinase Family: CATALYTIC FLEXIBILITY AND FUNCTION IN YEAST VACUOLE BIOGENESIS. Journal of Biological Chemistry. 275 (32), 24686-24692 (2000).
- Brearley, C. A., Hanke, D. E. Inositol phosphates in the duckweed Spirodela polyrhiza L. Biochemical Journal. 314, 215-225 (1996).
- Pollard, J. K., Steward, F. C., Shantz, E. M. Hexitols in Coconut Milk - Their Role in Nurture of Dividing Cells. Plant Physiology. 36 (4), 492 (1961).
- Donahue, J. L., et al. The Arabidopsis thaliana Myo-inositol 1-phosphate synthase1 gene is required for Myo-inositol synthesis and suppression of cell death. Plant Cell. 22 (3), 888-903 (2010).
- Desfougeres, Y., Wilson, M. S. C., Laha, D., Miller, G. J., Saiardi, A. ITPK1 mediates the lipid-independent synthesis of inositol phosphates controlled by metabolism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (49), 24551-24561 (2019).
