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Bioengineering

श्वान सेल फेनोटाइप विनिर्देश का मूल्यांकन करने के लिए ट्यूनेबल एक्सपेरिुलर मैट्रिक्स माइक्रोएनवायरमेंट्स की तैयारी

Published: June 2, 2020 doi: 10.3791/61496
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3
1Department of Chemical and Environmental Engineering, University of Cincinnati, 2Department of Biomedical Engineering, University of Cincinnati, 3Neuroscience Graduate Program, University of Cincinnati College of Medicine

Summary

इस पद्धति का उद्देश्य उस तंत्र को चित्रित करना है जिसके द्वारा एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स संकेत जैसे सब्सट्रेट कठोरता, प्रोटीन संरचना और सेल आकृति विज्ञान श्वान सेल (एससी) फेनोटाइप को विनियमित करते हैं।

Abstract

दर्दनाक परिधीय तंत्रिका तंत्र (पीएनएस) चोटों वर्तमान में पूर्ण कार्यात्मक वसूली हासिल करने के लिए उपयुक्त उपचार की कमी है । श्वान कोशिकाएं (एससी), पीएनएस की प्रमुख ग्लियल कोशिकाओं के रूप में, चोट के बाद एक पुनर्योजी सेल फेनोटाइप में अलग-अलग द्वारा पीएनएस पुनर्जनन को बढ़ावा देने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। हालांकि, अनुसूचित जाति की अलग राज्य पुनर्जनन के लिए आवश्यक समय अवधि के माध्यम से बनाए रखने के लिए चुनौतीपूर्ण है और आसपास के बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) में परिवर्तन से प्रभावित है। इसलिए, अनुसूचित जाति के बीच जटिल परस्पर क्रिया का निर्धारण करना और अनुसूचित जाति की पुनर्योजी क्षमता के संकेत प्रदान करने के लिए अलग ईसीएम आवश्यक है । इसके समाधान के लिए, एक रणनीति बनाई गई थी जहां विभिन्न ईसीएम प्रोटीन को एक ट्यून करने योग्य पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) सब्सट्रेट पर सोख दिया गया था जिसने एक मंच प्रदान किया जहां कठोरता और प्रोटीन संरचना को संग्राहक किया जा सकता है। अनुसूचित जाति को ट्यूनेबल सब्सट्रेट्स पर वरीयता दी गई थी और एससी फेनोटाइप की गतिशीलता का प्रतिनिधित्व करने वाले महत्वपूर्ण सेलुलर कार्यों को मापा गया था। अनुसूचित जाति प्रोटीन अभिव्यक्ति और सेलुलर आकृति विज्ञान के बीच परस्पर क्रिया को समझाने के लिए, व्यक्तिगत माइक्रोकॉन्टैक्ट मुद्रित सेलुलर पैटर्न के अलावा अनुसूचित जाति के अलग-अलग सीडिंग घनत्व का उपयोग किया गया था और इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला और पश्चिमी दाग की विशेषता थी। परिणामों से पता चला है कि एक छोटे प्रसार क्षेत्र और सेलुलर विस्तार की उच्च सीमा के साथ कोशिकाओं अनुसूचित जाति पुनर्योजी फेनोटाइपिक मार्कर के उच्च स्तर को बढ़ावा दिया । यह पद्धति न केवल अनुसूचित जाति के ईसीएम और सेलुलर फ़ंक्शन के बीच महत्वपूर्ण संबंधों को सुलझाना शुरू करती है, बल्कि परिधीय तंत्रिका मरम्मत में बायोमैटेरियल्स के भविष्य के अनुकूलन के लिए दिशानिर्देश भी प्रदान करती है।

Introduction

परिधीय तंत्रिका तंत्र (पीएनएस) चोटों रोगियों के लिए जीवन की गुणवत्ता से समझौता और सामाजिक आर्थिक कारकों की एक भीड़ के माध्यम से एक महत्वपूर्ण प्रभाव पैदा करके स्वास्थ्य देखभाल में एक प्रमुख नैदानिक चुनौती बनी हुई है1,,2 ,2। श्वान कोशिकाएं (एससी), पीएनएस में प्रमुख ग्लियल कोशिकाओं के रूप में, पीएनएस पुनर्जनन और कम अंतर चोटों में कार्यात्मक वसूली में सहायता के लिए आवश्यक आणविक और शारीरिक संकेत प्रदान करती हैं। यह अनुसूचित जाति की उल्लेखनीय क्षमता के कारण एक myelinating या Remak फेनोटाइप3से एक "मरम्मत" सेल फेनोटाइप में विवर्तित करने के लिए है । मरम्मत अनुसूचित जाति कई मायनों में एक विशिष्ट सेल फेनोटाइप है। चोट के बाद, अनुसूचित जाति सेल चक्र में फिर से प्रवेश करके अपनी प्रसार दर में वृद्धि और पुनर्नर्वेशन की सुविधा के लिए कई प्रतिलेखन कारकों की अभिव्यक्ति शुरू करते हैं । सी-जून और पी75 एनटीआर जैसे इन कारकों को उपनियमित किया जाता है, जबकि मायलिन बेसिक प्रोटीन (एमबीपी) जैसे एससी मार्कर को डाउनरेडिनियमितकिया जाता,5है। इसके अलावा, अनुसूचित जाति के लिए लम्बी हो आकृति विज्ञान बदलने के लिए और एक दूसरे के साथ गठबंधन करने के लिए चोट साइट6भर में Büngner बैंड फार्म । यह अक्षों को सही डिस्टल लक्ष्य तक पहुंचाने के लिए एक भौतिक मार्गदर्शन तंत्र प्रदान करता है7. हालांकि, अनुसूचित जाति के पास कम अंतर चोटों में तंत्रिका उत्थान को बढ़ावा देने की क्षमता के बावजूद, कार्यात्मक वसूली का परिणाम गंभीर चोटों में खराब रहता है । यह भाग में बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) मार्गदर्शन संकेतों के नुकसान के कारण है, साथ ही8समय की लंबी अवधि में पुनर्योजी फेनोटाइप को बनाए रखने के लिए एससी की असमर्थता है।

तंत्रिका उत्थान और वसूली प्रक्रिया चोट के बाद बेसल लैमिना की स्थिति से परिचित रूप से जुड़ी हुई है। बेसल लैमिना तंत्रिका के चारों ओर ईसीएम की एक परत है जो मार्गदर्शन की सुविधा प्रदान करती है और उन मामलों में एक्सॉन और एससी के लिए ईसीएम-बाध्य संकेत प्रदान करती है जहां यह चोट के बाद बरकरार रहता है9। ईसीएम की स्थिति और कोशिकाओं को मैट्रिक्स बाध्य संकेत देने की क्षमता बेहद महत्वपूर्ण है और पहले विभिन्न संदर्भों10 , 11 , 12,13,,12,14में इसका पता लगाया गया है ।14 उदाहरण के लिए, यह दर्शाया गया है कि ईसीएम की कठोरता प्रसार और भेदभाव11 , 15,,1616जैसे सेल कार्यों का मार्गदर्शन कर सकती है । ईसीएम की संरचना से एक अलग सेलुलर प्रतिक्रिया भी हो सकती है और 17,18,18को इंट्रासेलुलर सिग्नलिंग पाथवे के माध्यम से माइग्रेशन और भेदभाव जैसे सेल व्यवहारों को विनियमित किया जा सकता है । इसके अलावा, क्षेत्र के प्रसार और सेलुलर विस्तार सहित सेल आकृति विज्ञान, समारोह को विनियमित करने में एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं और ईसीएम-बाध्य संकेतों द्वारा शासित किया जा सकता है19,,20। पिछले कई अध्ययनों ने परिभाषित वंशों में अंतर करने वाली स्टेम कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित किया है, फिर भी अनुसूचित जाति के पास एक स्वस्थ तंत्रिका के भीतर एक होमओस्टेटिक, वयस्क अनुसूचित जाति से फेनोटाइप को बदलने की समान क्षमता है, जो प्रोटीन और विकास कारकों को स्रावित करने में सक्षम है, जबकि तंत्रिका चोट5,,21के बाद ईसीएम को फिर से तैयार करना। इसलिए, यह विशेष रूप से सहज अनुसूचित जाति पुनर्योजी क्षमता और ईसीएम बाध्य संकेतों के बीच संबंधों को अंतर्निहित तंत्र की पहचान करने के लिए अंतर्दृष्टि के लिए अंततः तंत्रिका उत्थान के लिए इस क्षमता का दोहन करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

इसका समाधान करने के लिए, हमने एक सेल कल्चर सब्सट्रेट का उत्पादन करने के लिए एक विस्तृत पद्धति विकसित की है जहां यांत्रिक कठोरता और लिगांड प्रकार को शारीरिक रूप से प्रासंगिक श्रेणियों में आसानी से ट्यून किया जा सकता है। पॉलीएक्रिलामाइड जेल की तुलना में पॉलीडिमेथाइल सिलोक्सेन (पीडीएमएस) को अपने अत्यधिक ट्यूनेबल यांत्रिकी के कारण एक सब्सट्रेट के रूप में चुना गया था, जहां अधिकतम युवा का मॉड्यूलस लगभग 12 केपीए है जो लगभग 1000 केपीए22,23, 24,24पर पीडीएमएस के विपरीत है।, यह हाथ में काम करने के लिए फायदेमंद है, के रूप में हाल के अध्ययनों से पता चला है एक खरगोश sciatic तंत्रिका के युवा मॉड्यूलस विकास के दौरान ५० kPa से अधिक हो सकता है, जिससे सुझाव है कि PNS के भीतर नसों की कठोरता की सीमा पहले से व्यापक है की जांच की । विभिन्न प्रोटीन अनुसूचित जाति के व्यवहार पर यांत्रिकी और लिगामेंट्स के संयोजन विनियमन का विश्लेषण करने के लिए पीडीएमएस सब्सट्रेट्स पर सोखने में सक्षम हैं। यह पीएनएस पुनर्जनन प्रक्रिया में मौजूद कई सूक्ष्मवाण्यक संकेतों की जांच और काम के लिए उच्च स्तर की ट्यूनिबिलिटी की तुलना पूरी तरह से सब्सट्रेट25की कठोरता पर ध्यान केंद्रित करने की अनुमति देता है। इसके अलावा, ये इंजीनियर सेल कल्चर सब्सट्रेट्स इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री, वेस्टर्न ब्लॉट और क्वांटिटेटिव पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (क्यू-पीसीआर) जैसे मात्रात्मक विश्लेषण विधियों की एक भीड़ के साथ संगत हैं।

यह इंजीनियर सेल कल्चर प्लेटफॉर्म प्रत्येक ईसीएम-बाउंड सिग्नल के व्यक्तिगत ट्यूनेबिलिटी के उच्च स्तर के कारण मशीनी रास्तों का विश्लेषण करने के लिए अत्यधिक उपयुक्त है। इसके अलावा, माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग सहित सेल माइक्रोपैटर्निंग के लिए लोकप्रिय तरीकों को सब्सट्रेट्स पर हासिल किया जा सकता है ताकि नियंत्रित सेलुलर आसंजन को अन्य ईसीएम बाउंड संकेतों24के संबंध में सेल आकार का विश्लेषण करने की अनुमति दी जा सके। यह महत्वपूर्ण है क्योंकि लाइन पैटर्न वाले सबस्ट्रेट्स, जो सेल आबादी में विस्तार को बढ़ावा देते हैं, तंत्रिका उत्थान के दौरान Büngner बैंड के भीतर विस्तारित और पुनर्योजी अनुसूचित जाति की नकल और अध्ययन करने के लिए एक उपकरण प्रदान करते हैं। इसके अलावा , सेलुलर आकृति विज्ञान कई सेल कार्यों का एक शक्तिशाली नियामक है और26 , 27 को नियंत्रित,नहीं किए जाने पर संभावित रूप से जटिल प्रायोगिक परिणाम पेश करसकताहै । अब ईसीएम संकेतों 28,,29,30द्वारा28विनियमित अनुसूचित जाति पुनर्योजी फेनोटाइप को नियंत्रित करने वाले तंत्रों पर महत्वपूर्ण ध्यान दिया जा रहा है । यह बायोमैटेरियल्स के डिजाइन में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए आवश्यक है जिसे पीएनएस तंत्रिका उत्थान में सहायता के लिए तंत्रिका मार्गदर्शन नाली के रूप में लागू किया जा सकता है। इन विस्तृत प्रोटोकॉल अंततः ईसीएम बाध्य संकेतों द्वारा विनियमित अनुसूचित जाति और अन्य सेल प्रकार समारोह के तंत्र को समझने के लिए एक संभावित उपकरण के रूप में लागू किया जा सकता है।

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Protocol

1. ट्यूनेबल सेल संस्कृति सब्सट्रेट तैयारी और लक्षण वर्णन

  1. सब्सट्रेट तैयारी
    1. पीडीएमएस बेस इलास्टोमर और इलाज एजेंटों को 10:1 और 60:1 के बीच अनुपात में सख्ती से एक पिपेट टिप का उपयोग करके मिलाएं जब तक कि मिश्रण के भीतर बुलबुले सजातीय रूप से फैले न जाएं। जब तक बुलबुले नष्ट न हों तब तक वैक्यूम डिसिकेशन का उपयोग करके बुलबुले निकालें।
      नोट: पीडीएमएस बहुलीकरण के दौरान, अंतिम बहुलक वांछित यांत्रिक गुण प्रदान करने के लिए आधार इलास्टोमर के साथ एजेंट क्रॉसलिंक का इलाज करता है। क्रॉसलिंक अनुपात पीडीएमएस कठोरता को बदलने के लिए समायोजित किया जा सकता है।
    2. एक वर्ग या परिपत्र कवरलिप (जैसे, 22 मिमी x 22 मिमी) पर एक बूंद (~ 0.2 एमएल) का एक बूंद (~ 0.2 एमएल) रखें और 30 एस के लिए 2500 आरपीएम पर एक स्पिन कोटर पर कवरस्लिप को घुमाएं।
    3. पीडीएमएस को जमना करने के लिए रात भर 1-2 घंटे या कमरे के तापमान के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में कवरस्लिप को इनक्यूबेट करें।
    4. सतह हाइड्रोफिलिटी बढ़ाने के लिए 7 मिनट (यूवी वेवलेंग: 185 एनएम और 254 एनएम) के लिए यूवी-ओजोन क्लीनर का उपयोग करके कवरस्लिप का इलाज करें। इसे निष्फल 6-अच्छी प्लेट में रखें।
    5. सेल कल्चर के लिए इस्तेमाल करने से पहले, कम से कम 30 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में इनक्यूबेट सब्सट्रेट्स।
      सावधानी: यूवी-ओजोन क्लीनर ओजोन उत्पन्न कर सकता है जो मनुष्यों के लिए हानिकारक है। रासायनिक धुएं हुड में या वेंटिलेशन के कुछ रूप के साथ काम करें।
    6. प्रोटीन समाधान में कवर्लिक को विसर्जित करें (10 μg/ml कोलेजन I, फाइब्रोनेक्टिन, या लैमिनिन) 37 डिग्री सेल्सियस पर एक बाँझ इनक्यूबेटर में 60 मिनट के लिए।
      नोट: यूवी-ओजोन उपचार के बाद, पीडीएमएस सतह अभी भी हाइड्रोफोबिक हो सकती है। यह सुनिश्चित करने के लिए अच्छी तरह से प्लेट घुमाएं कि प्रत्येक कवरस्लिप प्रोटीन समाधान से ढका हुआ है।
    7. प्रोटीन समाधान को एस्पिरेट करें और कवरस्लिप को फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) 3x से धोएं।
    8. 2.5% ट्राइप्सिन के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ईडीटीए समाधान (1x) का उपयोग करके पासएजिंग डिश से RT4-D6P2T श्वार्न सेल लाइन (एससी) को फिर से निलंबित करें और हीमोसाइटोमीटर के साथ कोशिकाओं की गणना करें। वांछित कोशिका घनत्व पर ट्यूनेबल पीडीएमएस सतह पर बीज अनुसूचित जाति। अनुसूचित जाति सीडिंग घनत्व प्रत्येक अलग आवेदन के लिए भिन्न हो सकते हैं।
    9. प्रयोग की लंबाई के लिए वांछित कोशिका संस्कृति मापदंडों (90% आर्द्रता, 5% सीओ2,37 डिग्री सेल्सियस, आदि) में कोशिकाओं को बनाए रखें। सेल कल्चर मीडियम के रूप में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) का उपयोग करें।
  2. माइक्रोपैटर्न्ड सब्सट्रेट तैयारी
    1. कंप्यूटर-एडेड डिजाइन (सीएडी) सॉफ्टवेयर का उपयोग करके वांछित ज्यामिति और सेल चिपकने वाले क्षेत्रों (900माइक्रोन2, 1,600 माइक्रोन 2 और2,500माइक्रोन 2) को आकर्षित करें। एक वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ता से उन पैटर्न के आधार पर एक क्रोम फोटोमास्क बनाएं।
    2. एक साफ कमरे या धूल मुक्त वातावरण में, सिलिकॉन वेफर्स बनाने के लिए मानक फोटोलिथोग्राफी तकनीकों का उपयोग करें (प्रोटोकॉल कहीं और विस्तृत हैं31)। इस विशेष आवेदन के लिए महत्वपूर्ण पैरामीटर इस प्रकार हैं: फोटोरेसिस्ट: एसयू-8 2010; फोटोरेसिस्ट को तितर-बितर करने के लिए स्पिन प्रोफाइल: 100 आरपीएम/एस के त्वरण के साथ 10 एस के लिए 500 आरपीएम, फिर 300 आरपीएम/एस के त्वरण के साथ 30 एस के लिए 3500 आरपीएम; यूवी लाइट की एक्सपोजर एनर्जी: १३० mJ/cm2।
      नोट: सिलिकॉन वेफर्स पर पैटर्न की ऊंचाई इन मापदंडों के बाद लगभग 10 माइक्रोन है। आयताकार या त्रिकोणीय पैटर्न के बाहर किनारे के आसपास संभावित दरारें चरण 1.2.2 के बाद एक हल्के माइक्रोस्कोप का उपयोग कर देखा जा सकता है। 30 मिनट के लिए 190 डिग्री सेल्सियस पर सिलिकॉन वेफर पकाना दरारों को खत्म करने में मदद करता है।
    3. एक परिपत्र 150 मिमी व्यास x 15 मिमी ऊंचाई पेट्री डिश के अंदर पैटर्न वाले सिलिकॉन वेफर रखें और सिलिकॉन वेफर पर चरण 1.1.1 में तैयार डी-गैस्ड पीडीएमएस (मिश्रण अनुपात 10:1) डालें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग चरणों के दौरान हैंडलिंग में आसानी के लिए पीडीएमएस की मोटाई कम से कम 5 मिमी है।
    4. रात भर 60 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में सिलिकॉन वेफर पर पीडीएमएस जमना। पीडीएमएस को कमरे के तापमान में ठंडा होने दें। सर्जिकल स्केलपेल का उपयोग करके सिलिकॉन वेफर से सही पैटर्न वाले 30 मिमी x 30 मिमी वर्गों के टिकटों को ठीक से काटें। सिलिकॉन वेफर को नुकसान न पहुंचाए।
      नोट: सिलिकॉन वेफर्स को इस बिंदु पर कई बार पुन: इस् तेम का पुन: इस् तादात् ता किया जा सकता है ताकि आइसोप्रोपेनॉल के साथ सफाई के बाद अधिक टिकटों का उत्पादन किया जा सके।
    5. पीडीएमएस टिकटों और ट्यूनेबल कवर्लिप्स (चरण 1.1.1 से 1.1.3 में तैयार) उन्हें 30 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में डुबोकर स्टरलाइज करें।
    6. माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग के बाद पीडीएमएस टिकटों द्वारा माइक्रोपैटर्न की प्रभावकारिता की पुष्टि करने के लिए, पीडीएमएस स्टांप के पूरे पैटर्न वाले पक्ष को कवर करने के लिए फ़िल्टर की गई हवा स्ट्रीम और पिपेट 50 माइक्रोजी/एमएल बीएसए (टेक्सास रेड कंजुगेटेड) समाधान का उपयोग करके पीडीएमएस टिकटों की सतह को सुखा दें।
    7. प्रोटीन सोखने की अनुमति देने के लिए कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए बीएसए समाधान के साथ पीडीएमएस टिकटों को इनक्यूबेट करें।
    8. फ़िल्टर की गई हवा की धारा का उपयोग करके ट्यूनेबल कवर्लिप्स की सतह को सुखाएं, चरण 1.1.5 में वर्णित सतह हाइड्रोफिलिसिटी बढ़ाएं।
    9. शेष बीएसए समाधान निकालने के लिए पीडीएस के टिकटों को हवा सूखी।
      नोट: ध्यान रखें कि बीएसए समाधान पूरी तरह से स्टांप से हटा दिया गया है क्योंकि किसी भी शेष समाधान के कारण टिकट माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग के दौरान कवरस्लिप पर स्लाइड हो जाएंगे।
    10. स्टैंप के पैटर्न वाले पक्ष को कवरस्लिप सतह पर बीएसए सोखने के लिए ट्यूनेबल कवरस्लिप के अनुरूप संपर्क में लाएं। धीरे-धीरे 5 मिनट के लिए कवरस्लिप के खिलाफ स्टांप दबाएं।
      नोट: स्टांप पर अत्यधिक बल लागू न करें क्योंकि यह झुक जाएगा और स्टांप और कवरस्लिप के बीच गैर-विशिष्ट संपर्क का कारण बनेगा। सफल माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग के लिए स्टांप पर लागू बल की उचित मात्रा आवश्यक है।
    11. एक फिटसी (फ्लोरोसीन आइसोथियोसायनेट) फिल्टर के साथ फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके माइक्रोपैटर्न की जांच करें।
    12. फ्लोरोसेंट पैटर्न के बजाय सेल चिपकने वाले क्षेत्रों को प्रिंट करने के लिए, बीएसए प्रोटीन के लिए लेमिनिन स्थानापन्न और दोहराने के चरण 1.2.5 से 1.2.10।
    13. कवर्लिप्स से टिकटों को हटाएं, एक निष्फल 6-वेल प्लेट में कवर्लिप स्थानांतरित करें। कवरस्लिप की सतह को कवर करने और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करने के लिए प्रत्येक कुएं में 0.2% w/v Pluronic F-127 समाधान के 2 मिलीएल जोड़ें।
      नोट: Pluronic F-127 पीडीएमएस सतह के लिए अवशोषित किया जा सकता है पीडीएमएस सतह की हाइड्रोफोबसिटी बढ़ाने के लिए आसंजन से कोशिकाओं को ब्लॉक करने के लिए ।
    14. एस्पिरेट प्लूरोनिक एफ-127 समाधान और सीडिंग कोशिकाओं से पहले सेल कल्चर माध्यम के साथ पीबीएस और 1x के साथ 5x धोएं। अनुसूचित जाति के लिए एक विशिष्ट सीडिंग घनत्व 1,000 कोशिकाओं /2
    15. सेल सीडिंग के बाद 45 मिनट, सेल कल्चर मीडियम को हटाएं और एक ही पैटर्न का पालन करने से कई एससी को रोकने के लिए पीबीएस 2x के साथ कवरस्लिप धोएं। मात्राकरण से पहले 48 घंटे के लिए वांछित सेल संस्कृति वातावरण में कोशिकाओं को बनाए रखें।
    16. गठबंधन कोशिकाओं की जांच करने के लिए लाइन-पैटर्न वाली सेल संस्कृति सब्सट्रेट्स बनाने के लिए, माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग के लिए टिकट बनाने के लिए चरण 1.2.1 से 1.2.4 का पालन करें।
      नोट: नाली के आयाम/स्टांप पर लाइन में खड़ा पैटर्न के रिज ५० μm x ५० माइक्रोन कोशिकाओं के लिए उल्लिखित है । स्टांप के कुल आयाम 10 मिमी x 10 मिमी हैं।
    17. केवल वांछित लाइन पैटर्न वाले आयामों में टिकटों को काटें।
      नोट: सीएडी में टिकट बनाते समय, लाइन पैटर्न के चारों ओर स्टांप का अनपैटर्न्ड क्षेत्र माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग के बाद सेल चिपकने वाले क्षेत्र के अनुरूप होगा। इस प्रकार, सतह पर वरीयता प्राप्त प्रत्येक अनुसूचित जाति को पैटर्न का पालन करने के लिए स्टांप को काटते समय बिना पैटर्न वाले क्षेत्रों को खत्म करना आवश्यक है।
    18. दो पेट्री व्यंजनों को ट्यून करने योग्य पीडीएमएस सतह कोटिंग तैयार करने के लिए चरण 1.1.1 से 1.1.3 का पालन करें।
      नोट: यह पेट्री डिश सतह को कवर करने वाले पीडीएमएस होंगे न कि कवरस्लिप पर।
    19. पीडीएमएस लेपित पेट्री व्यंजनों में से एक पर लाइन-पैटर्न वाले सेल चिपकने वाले क्षेत्रों को प्रिंट करने के लिए माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग करने के लिए चरण 1.2.5 से 1.2.10 का पालन करें।
      नोट: 60 मिमी x 15 मिमी पेट्री डिश के सतह क्षेत्र में 6 पीडीएमएस टिकटों से लाइन-पैटर्न वाले क्षेत्र शामिल हो सकते हैं।
    20. टिकटों को हटाएं और पेट्री डिश को 0.2% w/v Pluronic F-127 समाधान और 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट के 4 एमएल के साथ भरें।
    21. माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग के बाद, पीडीएमएस टिकटों के प्रत्येक पक्ष को 70% इथेनॉल 3x और हवा के साथ सूखा के साथ कुल्ला करें। पीडीएमएस टिकटों को घुमाएं और दूसरी पेट्री डिश पर स्टांप के बिना पैटर्न वाले पक्ष का उपयोग करके बिना पैटर्न वाले सेल चिपकने वाले क्षेत्र को मुद्रित करने के लिए चरण 1.2.5 से 1.2.10 का पालन करें। दोहराएं चरण 1.2.13।
    22. व्यंजन से एफ-127 समाधान को एस्पिरेट करें, ताजा सेल कल्चर माध्यम का उपयोग करके 1x धोने के साथ पीबीएस के साथ 3x धोएं। व्यंजनों पर बीज अनुसूचित जाति।
      नोट: एक लाइन पैटर्न डिश के लिए सीडिंग घनत्व ५,००० कोशिकाओं/सेमी2 है और एक अपापस्टर्न डिश के लिए १०,००० कोशिकाओं/सेमी2है ।
    23. अनुसूचित जाति को 48 घंटे के लिए वांछित परिस्थितियों में बनाए रखें और अनुसूचित जाति को तैयार करने के लिए प्रोटोकॉल का पालन करें32.
      नोट: बिना पैटर्न वाले व्यंजनों के लिए सेल सीडिंग घनत्व लाइन-पैटर्न वाले व्यंजनों की तुलना में 2x अधिक है, क्योंकि लाइन-पैटर्न वाले पकवान में बिना पैटर्न वाले पकवान का केवल आधा सेल चिपकने वाला क्षेत्र है।
      1. lysates तैयार करने के लिए, पर्याप्त रेडियोइम्यूनोप्रिपिटेशन परख (RIPA) बफर को 10 एमएल शंकुकीय अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें। रिपा बफर में 1:100 के अनुपात में पतला प्रोटीज और फॉस्फेट अवरोधक (100x), पिपटिंग द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं।
      2. 2 मिनट के लिए बर्फ ठंड पीबीएस (1x) के साथ कोशिकाओं को धोएं, पेट्री व्यंजनों के भीतर प्रत्येक सेल चिपकने वाले क्षेत्र (पीडीएमएस टिकटों और सोजकेड प्रोटीन से संपर्क करने वाले क्षेत्र) पर चरण 1.2.23.1 से तैयार समाधान के 80 μL जोड़ें। 15 मिनट के लिए एक बर्फ ब्लॉक पर समाधान के साथ इनक्यूबेट कोशिकाओं।
        नोट: समाधान केवल कहीं और प्लूनिक एफ-१२७ सोखने की हाइड्रोफोबसिटी के कारण सेल चिपकने वाले क्षेत्र पर रहेगा । यह सुविधा लाइन पैटर्न वाले अनुसूचित जाति के लिए एक सफल और पर्याप्त प्रोटीन निष्कर्षण में सक्षम बनाती है।
      3. 5 मिनट के लिए एक सेल स्क्रैपर के साथ अनुसूचित जाति को स्क्रैप करें। 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब लेबल में lysate ले लीजिए।
      4. माइक्रोसेंट्रफ्यूज 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 12, 000 x ग्राम पर lysate। 1,000 माइक्रोल पिपेट के साथ सुपरनैट लें और एक साफ माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। स्टोर सेल -20 डिग्री सेल्सियस पर lysate।
  3. सब्सट्रेट लक्षण वर्णन
    नोट: कवरस्लिप पर बहुलक के यांत्रिकी की विशेषता के लिए, कई तरीकों को आम तौर पर थोक संपीड़न परीक्षण11,,33 या परमाणु बल माइक्रोस्कोपी परीक्षण34सहित नियोजित किया जाता है। यह प्रोटोकॉल बल्क संपीड़न परीक्षण की रूपरेखा तैयार करेगा।
    1. एक 30 मिमी पेट्री डिश में वांछित मिश्रण अनुपात (चरण 1.1) के पीडीएमएस अग्रदूत डालो, पेट्री डिश के भीतर पीडीएमएस परत की मोटाई सुनिश्चित करें कम से कम 20 मिमी है।
    2. 1 घंटे के बाद 60 डिग्री सेल्सियस ओवन से जम पीडीएमएस के साथ पेट्री डिश निकालें और कमरे के तापमान पर ठंडा करने के लिए अनुमति देते हैं। 10 मिमी x 10 मिमी वर्गों में बहुलक काटें। कैलिपर्स का उपयोग करके पीडीएमएस की मोटाई को मापें।
    3. पीडीएमएस को संपीड़न बल मापने वाली मशीन के मंच पर रखें। संपीड़न बल सेंसर में प्लग (मॉडल: 112C) सेंसर पोर्ट करने के लिए और परीक्षण मशीन की धुरी के लिए सेंसर को ठीक।
    4. उपकरण के सामने पैनल पर "सैर" नियंत्रण का उपयोग करके पीडीएमएस स्टांप के ऊपर लगभग 0.5 सेमी तक सेंसर की ऊंचाई को समायोजित करें।
    5. "टेस्टसेटअप"विंडो का उपयोग करके संबंधित सॉफ्टवेयर खोलें,"सर्वो प्रोफाइल"का चयन करें, और"सेगमेंट"विंडो खोलें। 'सेगमेंट'विंडो में, इनपुट ने परीक्षण के लिए"नियंत्रण दर"और"अंत राशि"की इच्छा जताई।
      नोट: नियंत्रण दर उस दर को निर्धारित करती है जिस पर सेंसर पीडीएमएस की ओर नीचे यात्रा करता है। अंतिम राशि सेंसर यात्रा करने वाली कुल दूरी निर्धारित करती है।
    6. इस बिंदु पर सभी मापों को रीसेट करने के लिए सॉफ्टवेयर के नियंत्रण कक्ष पर स्थित"जेड"बटन का उपयोग करें।
    7. सेंसर को हल्के से पीडीएमएस से संपर्क करने के लिए नीचे ले जाएं जब तक कि 1-2 न्यूटन (एन) लोड न हो जाएं। सेंसर जो लोडिंग और दूरी तय करेगा, उसे सॉफ्टवेयर में प्रदर्शित किया जाएगा।
    8. "जेड"बटन का उपयोग करने के बाद,"प्ले"का उपयोग करके माप चलाएं, और फ़ाइल रिकॉर्डिंग बल और दूरी को सहेजें।
    9. पीडीएमएस की प्रत्येक प्रायोगिक स्थिति के लिए 1.3.3 से 1.3.8 चरण दोहराएं।
    10. फाइल खोलें और प्रत्येक अनुपात के लिए पीडीएमएस के युवा के मॉड्यूलस (ई) की गणना करने के लिए निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करें। (एफ = संपीड़न बल, पीडीएमएस स्टांप का एक = क्षेत्र, ∆एल = सेंसर की यात्रा दूरी, और एल0 = पीडीएमएस स्टांप की मूल मोटाई)।
      Equation 1

2. ट्यूनेबल सब्सट्रेट्स पर सेलुलर गुणों का मात्राकरण

  1. प्रसार परख
    1. एक 6-अच्छी प्लेट में 5,000 कोशिकाओं/सेमी2 के घनत्व पर चरण 1.1.9 से तैयार सब्सट्रेट्स पर बीज अनुसूचित जाति। अनुसूचित जाति को मानक सेल संस्कृति स्थितियों (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2)में 48 घंटे के लिए इनक्यूबेट करने की अनुमति दें।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस सेल कल्चर मीडियम के 12 एमएल में 10 एमएम ब्रोमोडेऑक्सीयूरिडीन (BrdU) स्टॉक सॉल्यूशन के 12 माइक्रोन को पतला करें, 10 माइक्रोन एम बीआरडीयू लेबलिंग सॉल्यूशन बनाने के लिए पिपेट के साथ अच्छी तरह से मिलाएं।
    3. सेल कल्चर मीडियम निकालें और पीबीएस के साथ एससी 2x धोएं।
    4. प्रत्येक कुएं में बीआरडीयू लेबलिंग समाधान के 2 एमएल जोड़ें और 2 घंटे के लिए अनुसूचित जाति को इनक्यूबेट करें।
      नोट: BrdU लेबलिंग समाधान का इनक्यूबेशन समय विशिष्ट सेल प्रसार दर पर निर्भर करता है। RT4-D6P2T अनुसूचित जाति लाइन एक उच्च प्रसार दर है तो इनक्यूबेशन समय के 2 घंटे का इस्तेमाल किया गया था ।
    5. BrdU लेबलिंग समाधान निकालें और पीबीएस के साथ अनुसूचित जाति 3x धोएं। प्रत्येक अच्छी तरह से पीबीएस में 3.7% फॉर्मलडिहाइड का 1 मिलियन जोड़ें और सेल निर्धारण के लिए 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
      सावधानी: फॉर्मेल्डिहाइड एक मानव कैंसरकारक है; इसलिए, उचित सुरक्षा के साथ रासायनिक धुएं हुड के अंदर सभी काम करें।
      नोट: पीबीएस के साथ धोते समय, कुएं में कोई सेल संस्कृति माध्यम नहीं है, और इस प्रकार पीडीएमएस सतह हाइड्रोफोबिक हो सकती है। सेल क्षति को रोकने के लिए सब्सट्रेट की सतह को पूरी तरह से सूखने के लिए सावधानी बरतें।
    6. फॉर्मेरेट फॉर्मलडिहाइड समाधान और पीबीएस (प्रत्येक 3 मिनट) के साथ 3x धोएं। पीबीएस को हटाएं और कोशिका झिल्ली को पार करने के लिए प्रत्येक कुएं में पीबीएस में 0.2% ट्राइटन एक्स-100 का 1 मिलियन मिलियन जोड़ें। कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए ट्राइटन एक्स-100 समाधान के साथ इनक्यूबेट एससी।
    7. ट्राइटन एक्स-100 समाधान निकालें और पीबीएस (प्रत्येक 3 मिनट) के साथ अनुसूचित जाति 3x धोएं।
    8. प्रत्येक कुएं में 1 एन एचसीएल का 1 एमएल जोड़ें और 10 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें। 1 एन एचसीएल को हटाएं और प्रत्येक कुएं में 2 एन एचसीएल का 1 एमएल जोड़ें और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। एचसीएल उपचार डीएनए हाइड्रोलिसिस के लिए है।
    9. एंटीजन रिट्रीवल के लिए फॉस्फेट/साइट्रिक एसिड बफर का उत्पादन करने के लिए 0.2 एमएम एनए2एचपीओ4 और 18 एमएल ऑफ 0.1 एमएम साइट्रिक एसिड का 182 एमएल मिलाएं। 2 एन एचसीएल निकालें और प्रत्येक कुएं में 1 एमएल फॉस्फेट/साइट्रिक एसिड बफर जोड़ें और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें ।
    10. पीबीएस में 0.2% ट्राइटन एक्स-100 के साथ अनुसूचित जाति 3x धोएं। पीबीएस में 3% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) के 2 एमसीएल को प्रत्येक कुएं में जोड़ें और एंटीबॉडी के गैर-विशिष्ट बाध्यकारी घड़ी के लिए कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    11. तनु BrdU प्राथमिक एंटीबॉडी BrdU धुंधला समाधान के लिए 1:300 के अनुपात में 3% बीएसए समाधान में एलेक्सा फ्लोर 488 के साथ संयुक्त। कमरे के तापमान पर रात भर धुंधला समाधान के साथ इनक्यूबेट अनुसूचित जाति जबकि थाली एल्यूमीनियम पन्नी में कवर किया जाता है ।
    12. प्रसार की मात्रा निर्धारित करने के लिए, छवि अनुसूचित जाति अनुसूचित जाति क्रमशः BrdU और नाभिक का पता लगाने के लिए एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के FITC और DAPI चैनल का उपयोग कर । छवियों को "nd.2" फ़ाइलों के रूप में सहेजें।
    13. समान स्थानिक पदों पर ली गई प्रत्येक छवि के लिए "nd.2" फाइलें खोलें।
    14. इमेज एनालिसिस सॉफ्टवेयर खोलें। "विश्लेषण नियंत्रण" के खंड में खिड़की"स्वचालित माप परिणाम"और"स्वचालित माप" खोलनेके लिए पृष्ठभूमि पर सही क्लिककरें।
    15. 'काउंट एंड टैकोनोमी'मेन्यू में'काउंट' चुनें। फिटसी इमेज पर, ग्रीन फ्लोरेसेंस (BrdU पॉजिटिव) और छवि पर सही क्लिक दिखाते हुए प्रत्येक नाभिक पर क्लिक करें।
      नोट: BrdU सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या"स्वचालन और माप"की खिड़की में दिखाया गया है ।
    16. DAPI छवियों के लिए, कुल नाभिक की संख्या गिनने के लिए चरण 2.1.14 दोहराएं। इस छवि के लिए BrdU सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना करें।
    17. सांख्यिकीय उद्देश्यों के लिए अन्य छवियों के लिए 2.1.16 के माध्यम से चरण 2.1.13 दोहराएं और प्रत्येक सब्सट्रेट स्थिति के लिए BrdU सकारात्मक कोशिकाओं के औसत प्रतिशत की गणना करें।
  2. इम्यूनोफ्लोर्सेंट छवि विश्लेषण के माध्यम से सी-जून अभिव्यक्ति का मात्राकरण
    1. चरण 1.1.9 और 1.2.23 से 6-अच्छी प्लेटों के अंदर तैयार कोशिकाओं को पहले वर्णित प्रक्रियाओं (चरण 2.1.5-2.1.7) के साथ तय और पार कर दिया जाता है।
      नोट: अलग ईसीएम स्थितियों की कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट तीव्रता की सटीक तुलना करने के लिए, सभी नमूनों में समान रूप से कैमरा सेटिंग्स लागू करें, जिसमें सभी नमूनों के समान पैरामीटर होते हैं।
    2. ".nd2" फ़ाइलों के रूप में छवियों को सहेजें।
    3. इमेज एनालिसिस सॉफ्टवेयर खोलें। "विश्लेषणनियंत्रण"के अनुभाग में खिड़की"स्वचालित माप परिणाम"और"स्वचालित माप"खोलने के लिए सही क्लिक पृष्ठभूमि।
    4. "स्वचालितमाप परिणाम"में,"ऑब्जेक्ट डेटा"का चयन करें। सक्रिय करें"माप अपडेट करते रहें"बटन।
    5. सॉफ्टवेयर के शीर्ष पैनल में,"उपाय"का चयन करें और उसके बाद"ऑब्जेक्ट फीचर्स"। माप केलिए चयनित'के खंड में"मीन तीव्रता"जोड़ें।
    6. सी-जून और नाभिक की छवियों वाली दो ".nd2" छवि फ़ाइलों को खोलें और मर्ज करें।
    7. शीर्ष पैनल में,"आरओआई"का चयन करें और"ड्रा आयताकार आरओआई"का चयन करें। एक आयताकार क्षेत्र जो एक एकल कोशिका के परमाणु क्षेत्र को आकर्षित करें।
      नोट: सी-जून अभिव्यक्ति नाभिक३५के भीतर केंद्रित है ।
    8. सॉफ्टवेयर के शीर्ष पैनल में,"बाइनरी"और"परिभाषित थ्रेसहोल्ड"का चयन करें, एक नई विंडो सी-जून फ्लोरोसेंट क्षेत्र को ठीक से परिभाषित करने के लिए दिखाई देगी।
    9. नई विंडो में फुल इमेज मॉडल से प्रोग्राम को स्विच करने के लिए 'फुलइमेज/यूजआरओआई' पर क्लिक करें। आयताकार आरओआई के भीतर हाइलाइट किए गए क्षेत्र के आकार/आकार के समायोजन के लिए खिड़की के बाईं ओर स्थित लुकअप टेबल को समायोजित करने के लिए"तीव्रता"का उपयोग करें।
      नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए ध्यान रखें कि हाइलाइट किए गए क्षेत्र का आकार/आकार नाभिक के समान है ।
    10. "ओके"बटन पर क्लिक करें,"स्वचालित माप परिणाम"की खिड़की में मतलब फिटसी तीव्रता प्राप्त करने के लिए और फिर"स्टोर डेटा"पर क्लिक करें।
    11. "स्वचालितमाप",लाल हाइलाइट किए गए क्षेत्र को हटाने के लिए"डिलीट ऑब्जेक्ट"की खिड़की में। बाईं ओर पैनल पर, आयताकार आरओआई का चयन करने और हटाने के लिए"पॉइंटिंग टूल"का उपयोग करें।
    12. प्रत्येक अतिरिक्त सेल के लिए मतलब फिटसी तीव्रता को मापने के लिए चरण 2.2.6 से 2.2.11 तक दोहराएं।
    13. "स्वचालित मापपरिणाम"के विंडो क्षेत्र में,"संग्रहीत"का चयन करें और सभी संग्रहीत डेटा प्रस्तुत किए जाएंगे। निर्यातस्प्रेडशीट को बचाने और अतिरिक्त गणनाकरने के लिए "निर्यात"फ़ंक्शन का उपयोग करें और "डेटा टू एक्सेल" का चयन करें।
  3. परमाणु विस्तार की मात्रा
    1. फिक्स और 1.2.22 चरण 2.1.5-2.1.7 के बाद कदम से तैयार अनुसूचित जाति को पार करें। DAPI के साथ बढ़ते माध्यम का उपयोग कर परमाणु धुंधला प्रदर्शन करते हैं।
    2. DAPI चैनल और एक 40x उद्देश्य लेंस का उपयोग करना, नमूने की छवियों को प्राप्त करने और ".nd2" फ़ाइलों के रूप में बचाने के लिए ।
    3. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में"स्वचालित माप परिणाम" और "स्वचालित माप"विंडो खोलनेAutomated Measurementके लिए चरण 2.2.3 और 2.2.4 का पालन करें।
    4. "स्वचालितमाप परिणाम"में,"विकल्प"फ़ंक्शन का उपयोग करें जिसके बाद"चुनें ऑब्जेक्ट फ़ीचर"। 'फ़ीचर'कॉलम में'विस्तार'का चयन करें और'माप के लिए चयनित'कॉलम में जोड़ें। इस फ़ंक्शन को सक्रिय करने के लिए"अपडेटिंग मेजरमेंटरखें" का उपयोग करें।
    5. "nd.2" छवि फ़ाइल है कि परमाणु छवियों में शामिल खोलें । "स्वचालितमाप"विंडो में,"ऑटो डिटेक्शन"फ़ंक्शन का चयन करें और एक नाभिक का चयन करें। छवि और मापा परमाणु पहलू अनुपात पर सही क्लिक करें"स्वचालित माप परिणाम"में दिखाया जाएगा ।
    6. छवि के भीतर अन्य नाभिक के लिए परमाणु पहलू अनुपात की मात्रा निर्धारित करने के लिए चरण 2.3.5 दोहराएं। "स्वचालितमाप परिणाम"की खिड़की में"स्टोर डेटा"का चयन करें।
    7. अतिरिक्त छवियों के लिए 2.3.5 से 2.3.6 तक दोहराएं। विश्लेषण के लिए 2.2.13 में पहले किए गए स्प्रेडशीट फ़ाइल में डेटा निर्यात करें।
  4. प्रोटीन अभिव्यक्ति की मात्रा निर्धारित करने के लिए पश्चिमी दाग
    1. कहीं और विस्तृत पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए मानक प्रोटोकॉल का पालन करें३२। अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी के कमजोर पड़ने के नीचे दिखाए गए हैं: खरगोश विरोधी सी-जून 1:2,000; माउस एंटी-ऐक्टिन 1:1,000; खरगोश विरोधी p75NTR 1:1,000; खरगोश विरोधी मायलिन बेसिक प्रोटीन 1:1,000; एंटी माउस/खरगोश आईजीजी, एचआरपी से जुड़ी एंटीबॉडी 1:10,000 ।

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Representative Results

एससी फेनोटाइप पर सब्सट्रेट कठोरता और प्रोटीन संरचना के बीच परस्पर क्रिया का विश्लेषण और मात्रा निर्धारित करने के लिए, एक ट्यूनबल पीडीएमएस सेल कल्चर सब्सट्रेट विकसित किया गया था(चित्रा 1 ए)। अलग आधार पर बहुलक के संपीड़न परीक्षण: इलाज एजेंट अनुपात सब्सट्रेट(चित्रा 1B)के युवा मॉड्यूलस (ई) की मात्रा निर्धारित करने के लिए उपयोग किया गया था । मॉड्यूलस मूल्यों की परिणामस्वरूप सीमा शारीरिक रूप से प्रासंगिक सब्सट्रेट स्थितियों का प्रतिनिधित्व करती है। सब्सट्रेट्स की तैयारी के बाद, एससी को सुसंस्कृत किया गया और सेलुलर गुणों का विश्लेषण ट्यूनेबल माइक्रोएनवायरमेंट पर किया गया। अलग प्रोटीन संरचना के सब्सट्रेट्स पर अनुसूचित जाति की प्रसार दरों का पहले विश्लेषण किया गया । लैमिनिन लेपित सब्सट्रेट्स के परिणामस्वरूप कोलेजन I और फाइब्रोनेक्टिन सोखने की तुलना में 10 μg/mL(चित्रा 2ए, बी)पर उच्च प्रसार दर हुई। लेमिनिन कोटिंग और अलग मोडुली के साथ सब्सट्रेट्स पर एससी ने दिखाया कि अपेक्षाकृत नरम सब्सट्रेट्स (ई = 3.85kPa) सभी शर्तों(चित्रा 2सी, डी)में सेल प्रसार दरों में कमी करते हैं। हालांकि, कठोर सब्सट्रेट्स (ई = 1119kPa) और अपेक्षाकृत नरम सब्सट्रेट्स (ई = 8.67kPa) के बीच मतभेद नगण्य(चित्रा 2D)थे।

इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और वेस्टर्न ब्लॉट के जरिए प्रोटीन एक्सप्रेशन के लिए एससी का भी विश्लेषण किया गया । ट्रांसक्रिप्शनल फैक्टर सी-जून के स्तर का विश्लेषण इम्यूनोफ्लोरेटेंट माइक्रोस्कोपी(चित्रा 3 ए)द्वारा किया गया था और इसका प्रतिनिधित्व मतलब पिक्सेल फ्लोरोसेंट तीव्रता(चित्र 3बी-डी)द्वारा किया गया था। सी-जून अभिव्यक्ति को उप-विनियमित दिखाया गया क्योंकि सब्सट्रेट्स नरम हो गए (ई = 1119 केपीए से ई = 8.67 केपीए), हालांकि, नरम सब्सट्रेट्स (ई = 3.85 केपीए) पर, सी-जून अभिव्यक्ति को काफी हद तक कम किया गया था। कठोर सब्सट्रेट्स (ई = 1119 केपीए) पर, कोलेजन आई कोटेड सब्सट्रेट्स के परिणामस्वरूप उच्चतम सी-जून अभिव्यक्ति हुई, फिर भी सब्सट्रेट्स नरम हो गए (ई = 8.67 केपीए और 3.85 kPa), लैमिनिन ने सी-जून(चित्रा 3E)के उच्चतम स्तर को दिखाया। पश्चिमी दाग का उपयोग सी-जून और मायलिन बेसिक प्रोटीन (एमबीपी) दोनों का विश्लेषण करने के लिए भी किया गया था, जिसमें सी-जून स्तर अपविनियमित और एमबीपी डाउनलेटेड नरम सब्सट्रेट्स(चित्रा 3F)पर था। इसके अलावा, लेमिनिन लेपित सब्सट्रेट्स पर वरीयता प्राप्त एससी के परिणामस्वरूप कोलेजन आई और फाइब्रोनेक्टिन की तुलना में सबसे अधिक सी-जून अभिव्यक्ति हुई।

अलग-अलग सीडिंग घनत्व की कोशिकाओं को तब सुसंस्कृत किया गया था और सी-जून अभिव्यक्ति(चित्रा 4ए, बी)में सेल प्रसार और क्षेत्र की भूमिका का पता लगाने के लिए रोडामाइन-फालोडिन के साथ दाग दिया गया था। कोशिकाओं के परमाणु विस्तार को नियंत्रित करने के लिए, सेल संस्कृति सब्सट्रेट्स पर सेल चिपकने वाली लाइनें बनाने के लिए एक सामान्य माइक्रोपैटर्निंग तकनीक (माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग36)का उपयोग किया गया था। एक लाइन पैटर्न वाले सब्सट्रेट पर वरीयता प्राप्त कोशिकाओं के परमाणु आस्पेक्ट अनुपात को बिना पैटर्न वाले सब्सट्रेट्स(चित्रा 4सी, डी)पर वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की तुलना में काफी अधिक दिखाया गया था। यह पाया गया कि सी-जून और एससी पुनर्योजी फेनोटाइप में एक अन्य मार्कर की अभिव्यक्ति, p75 न्यूरोट्रोफिन रिसेप्टर (p75 एनटीआर), घने कोशिकाओं में एक छोटे प्रसार क्षेत्र(चित्रा 4E)के साथ उपवित किया गया था। लाइन-पैटर्न वाली कोशिकाओं के परिणामस्वरूप गैर-पैटर्न वाली कोशिकाओं(चित्रा 4F)की तुलना में सी-जून और पी 75 एनटीआर दोनों की उच्च अभिव्यक्ति हुई। इसलिए, सेल-सेल इंटरैक्शन(चित्रा 5A)को नष्ट करते समय सेल प्रसार क्षेत्र और विस्तार को ठीक से नियंत्रित करने के लिए माइक्रोकॉन्टैक्ट मुद्रित सेल चिपकने वाली ज्यामिति बनाई गई थी। कुल सेल चिपकने वाले क्षेत्रों के आयाम 900 माइक्रोन2,1,600 माइक्रोन2,और 2,500 माइक्रोन2 थे, जो 1 या 4 (सेल लंबाई: सेल चौड़ाई) के आस्पेक्ट अनुपात के साथ थे। फ्लोरोसेंट गोजातीय सीरम एल्बुमिन (fBSA, टेक्सास लाल) धुंधला माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग(चित्रा 5B)के बाद सेल संस्कृति सब्सट्रेट पर माइक्रोपैटर्न की स्थिति को प्रकट करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । प्रत्येक कोशिका क्षेत्र के लिए अनुसूचित जाति के परमाणु आस्पेक्ट अनुपात को मापा गया था और यह दिखाया गया था कि परमाणु आस्पेक्ट रेशियो को बढ़ाकर सेलुलर विस्तार बढ़ जाताहै (चित्रा 5C)। इसके अलावा, अनुसूचित जाति के आस्पेक्ट रेशियो में वृद्धि के रूप में, सी-जून को उपनियमित(चित्रा 5D) कियागया था। दिलचस्प बात यह है कि, हालांकि, यह पाया गया कि सेल प्रसार क्षेत्र के रूप में सी-जून अभिव्यक्ति को बढ़ाता है डाउनरेडिनियमित(चित्रा 5E)। इस माइक्रोपेटर्निंग विधि(चित्रा 5F)के माध्यम से नाभिक और ऐक्टिन कन्फर्म सेल फैलने वाले क्षेत्र और विस्तार दोनों के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला अत्यधिक नियंत्रित किया गया था।

Figure 1
चित्रा 1: सेल संस्कृति ट्यूनेबल कठोरता और प्रोटीन संरचना के साथ सब्सट्रेट्स। (ए)योजनाबद्ध पीडीएमएस सेल कल्चर सब्सट्रेट्स के विकास को दिखाता है । (ख)आधार का प्रारंभिक पीडीएमएस मिश्रण अनुपात: इलाज एजेंट युवा के मॉड्यूलस निर्धारित करता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: अनुसूचित जाति प्रसार दर सब्सट्रेट कठोरता और प्रोटीन संरचना द्वारा विनियमित। (A) प्रतिनिधिछवियां एक ही मॉड्यूलस के सब्सट्रेट्स पर सुसंस्कृत होने पर BrdU धुंधला दिखा । (ख)हिस्टोग्राम प्रत्येक प्रोटीन कोटिंग के लिए बीआरडीयू पॉजिटिव कोशिकाओं का प्रतिशत दिखाता है । (ग)प्रतिनिधि छवियां एक ही प्रोटीन कोटिंग के सब्सट्रेट्स पर वरीयता प्राप्त अनुसूचित जाति में BrdU निगमन दिखा । (D)हिस्टोग्राम प्रत्येक युवा के मॉड्यूलस मूल्य के लिए BrdU सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत दिखा । स्केल बार = 50 माइक्रोन। डेटा को मतलब ± एसईएम के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। *p< .05, **p< .005, ***p<.0005. आंकड़े के कुछ हिस्सों को रेफरी24से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: सब्सट्रेट कठोरता और प्रोटीन विनियमित अनुसूचित जाति प्रोटीन अभिव्यक्ति। (A)प्रतिनिधि छवियां विभिन्न कठोरता और प्रोटीन संरचना के सब्सट्रेट्स पर वरीयता प्राप्त अनुसूचित जाति के लिए सी-जून इम्यूनोफ्लोरेसेंस को दर्शाती हैं । सी-जून के मतलब पिक्सेल फ्लोरोसेंट तीव्रता को अनुसूचित जाति(बी)कोलेजन I(सी)फाइब्रोनेक्टिन और(डी)लेमिनिन कोटेड सब्सट्रेट्स पर विभिन्न कठोरता के लिए मापा गया था । (ई)सी-जून फ्लोरेसेंस स्तर अनुसूचित जाति के युवा मॉड्यूलस द्वारा समूहित सब्सट्रेट के मॉड्यूलस । (F)सब्सट्रेट्स पर वरीयता प्राप्त एससी के सी-जुन और मायलिन बेसिक प्रोटीन (एमबीपी) को दिखाने वाला वेस्टर्न ब्लॉट। ग्लानिडाहाइड 3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज (जीडब्ल्यूडीएच) का उपयोग लोडिंग नियंत्रण के रूप में किया जाता था। स्केल बार = 50 माइक्रोन। डेटा को मतलब ± एसईएम के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। *p< .05, **p< .005, ***p<.0005. आंकड़े के कुछ हिस्सों को रेफरी24से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: सेलुलर प्रसार क्षेत्र अनुसूचित जाति की प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रभावित करता है। (A)विभिन्न सीडिंग घनत्व के सेल स्प्रेडिंग क्षेत्र की कल्पना रोडामाइन-फलोडिन (लाल) और नाभिक स्टेनिंग (नीला) के माध्यम से की गई थी । (ख)हर स्थिति में अनुसूचित जाति के औसत प्रसार क्षेत्र को दिखाते हुए हिस्टोग्राम । (ग)अविध या लाइन पैटर्न वाले सब्सट्रेट्स पर वरीयता प्राप्त अनुसूचित जाति के नाभिक को आकृति विज्ञान दिखाने के लिए डीएपीआई (नीला) से दाग दिया गया था । (घ)हिस्टोग्राम पैटर्न और बिना पैटर्न वाले सब्सट्रेट्स पर परमाणु आस्पेक्ट रेशियो का मात्राकरण दिखाता है । (ई)पश्चिमी दाग अलग-अलग प्रसार क्षेत्र के साथ कोशिकाओं के सी-जून और p75NTR की अभिव्यक्ति दिखा रहा है। (F)पश्चिमी दाग जो एससी की प्रोटीन अभिव्यक्ति को बिना पैटर्न वाले और लाइन पैटर्न वाले सब्सट्रेट्स पर दिखाता है । स्केल बार = 50 माइक्रोन। डेटा को मतलब ± एसईएम के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। *p< .05, **p< .005, ***p<.0005. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: अनुसूचित जाति आकृति विज्ञान और विस्तार प्रभाव सी-जून अनुसूचित जाति की अभिव्यक्ति । (क)विभिन्न आस्पेक्ट रेशियो के आकार के लिए सेल माइक्रोपैटर्निंग दिखाते हुए योजनाबद्ध। (ख)एफबीबीएसए स्टेनिंग (लाल) माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग के बाद माइक्रोपैटर्न के आकार को दिखाता है । स्केल बार = 10 माइक्रोन। (ग)हिस्टोग्राम माइक्रोपैटर्न्ड एससी का नाभिकीय आस्पेक्ट रेशियो दिखा रहा है।(डी, ई)हिस्टोग्राम प्रत्येक ज्यामितीय स्थितियों के लिए सी-जून की औसत पिक्सेल फ्लोरोसेंट तीव्रता दिखाता है । (F)रोडामाइन-फीलॉइडिन (लाल), नाभिक (नीला) और सी-जून (हरा) अलग-अलग माइक्रोपैटर्न पर दाग रहे थे । स्केल बार = 10 माइक्रोन। डेटा को मतलब ± एसईएम के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। *p< .05, **p< .005, ***p<.0005. आंकड़े के कुछ हिस्सों को रेफरी24से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

अनुसूचित जाति तंत्रिका चोट के बाद अपने फेनोटाइपिक परिवर्तन और पुनर्योजी क्षमता के कारण तंत्रिका उत्थान को बढ़ावा दे सकती है। हालांकि, ईसीएम संकेत इस पुनर्योजी क्षमता को कैसे विनियमित करते हैं, यह ज्यादातर अस्पष्ट रहता है, संभावित रूप से न केवल बायोमैटेरियल्स के विकास में बाधा डालता है जिसका उद्देश्य तंत्रिका उत्थान को बढ़ावा देना है, बल्कि तंत्रिका उत्थान में शामिल तंत्र की समझ भी है। इस परस्पर क्रिया की जांच शुरू करने के लिए, सेल कल्चर सब्सट्रेट्स बनाए गए जहां कठोरता, प्रोटीन कोटिंग और चिपकने वाले स्थलाकृति जैसे ईसीएम संकेतों को नियंत्रित किया जा सकता है। माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग की सामान्य विधि का उपयोग करते हुए प्रोटोकॉल के भीतर माइक्रोपैटर्न चिपकने वाली स्थलाकृति की क्षमता एक महत्वपूर्ण विशेषता है। हालांकि, यह सब्सट्रेट ग्लास से अलग है कि पीडीएमएस टिकटों पर लागू किया जा रहा संपीड़न बल सेल संस्कृति सब्सट्रेट्स पर सेल चिपकने वाले क्षेत्रों के वांछित आकार को प्राप्त करने के लिए उचित स्तर पर होना चाहिए। सेल चिपकने वाले क्षेत्रों की कल्पना करने और पीडीएमएस टिकटों पर संपीड़न बलों को समायोजित करने के लिए एक मॉडल प्रोटीन के रूप में फ्लोरोसेंट गोजातीय सीरम एल्बुमिन (fBSA) का उपयोग अंततः इस मुद्दे को कम कर सकता है। कांच से एक और महत्वपूर्ण अंतर अतिरिक्त प्लेरोनिक एफ-127 को हटाना है जिसका उपयोग शेष सब्सट्रेट गैर-चिपकने वाले को प्रदान करने के लिए किया जाता है। इस उपचार के बाद, सेल कल्चर सब्सट्रेट्स अत्यधिक हाइड्रोफोबिक होते हैं, जिससे पूरे वॉश में गीले सेल कल्चर सब्सट्रेट्स को बनाए रखना चुनौतीपूर्ण हो जाता है, जो माइक्रोपैटर्न्ड प्रोटीन37की संरचनात्मक अखंडता के लिए महत्वपूर्ण है। इसलिए, सब्सट्रेट्स को पूरी तरह से निर्जलीकरण से रोकने के लिए लगभग एक साथ समाधान को एस्पिरेट करने और इंजेक्ट करने के लिए कई पिपेट का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।

यद्यपि माइक्रोपैटर्निंग कोशिका के आकार को ठीक से नियंत्रित कर सकता है और ओजीएमए जैसे पॉलिमर को अवरुद्ध करने वाले सेल का उपयोग करके जटिल सिंथेटिक प्रक्रियाओं की आवश्यकता नहीं होती है, सूक्ष्मपैटर्न कोशिकाओं की प्रोटीन अभिव्यक्ति को निर्धारित करने के लिए उपयोग की जाने वाली विधियांकभी-कभी सीमित 38होती हैं। उदाहरण के लिए, माइक्रोपैटर्निंग से उपलब्ध नमूने आम तौर पर कुछ सौ कोशिकाओं प्रति कवरस्लिप तक सीमित होते हैं, जो पश्चिमी ब्लॉट्स या क्यूपीसीआर के लिए उपयोग किए जाने वाले सेल lysates को तैयार करने के लिए अपर्याप्त है। इस पर विचार करते हुए, अकेले इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला का उपयोग माइक्रोपैटर्न कोशिकाओं के लिए प्रोटीन अभिव्यक्ति को निर्धारित करने के लिए किया गया था, जो प्रोटीन की विविधता को सीमित करता है जिसे मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। इसका समाधान करने के लिए, हमने बड़ी सेल आबादी के लिए सेल विस्तार को बढ़ावा देने के लिए लाइन पैटर्न का उपयोग किया और पश्चिमी दाग द्वारा विश्लेषण किए गए सेल लिसेट्स को सफलतापूर्वक तैयार किया। 39,40सेल आबादी के विस्तार कोनियंत्रितकरने के लिए लागू इलेक्ट्रिक फ़ील्ड या गठबंधन इलेक्ट्रोस्पन फाइबर जैसे अन्य तरीकों को भी लागू किया जा सकता है . हालांकि, बिजली के क्षेत्र एनजीसी के लिए सभी अनुप्रयोगों में फिट नहीं हो सकते हैं क्योंकि आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले बायोमैटेरियल्स जैसे कोलेजन-आधारित बहुलक और रेशम की चालकता बहुत कम है28,,41,,42। इसके विपरीत, अनुसूचित जाति के संरेखण, विस्तार और प्रवास को बढ़ावा देने के साथ-साथ न्यूराइट आउटग्रोथ43, 44,44के लिए गठबंधन इलेक्ट्रोस्पन नैनोफाइबर को सफलतापूर्वक एनजीसी में प्रत्यारोपित किया गया है। यह गठबंधन नैनोफाइबर के साथ सब्सट्रेट्स पर उन लोगों के खिलाफ लाइन-पैटर्न वाले सब्सट्रेट्स पर एससी व्यवहार की तुलना करने के लिए भी मजबूर साबित हो सकता है, क्योंकि लाइन वाले पैटर्न और गठबंधन नैनोफाइबर एनजीसी45में शामिल सबसे आम मार्गदर्शन तंत्र में से दो हैं।

विस्तृत माइक्रोपैटरिंग प्रोटोकॉल 1119 केपीए की अधिकतम सतह युवा के मॉड्यूलस के साथ सेल कल्चर सब्सट्रेट्स के रूप में पीडीएमएस कोटेड कवरस्लिप का उपयोग करता है। इस तरह की कठोरता कई ऊतकों की नकल करती है, फिर भी मेसेंचिमल स्टेम कोशिकाओं के ऑस्टियोजेनेसिस को मॉडल करना संभव नहीं हो सकता है, जिसके लिए आम तौर पर सतह यंग के मॉड्यूलस को 1 जीपीए46से अधिक की आवश्यकता होती है। ऐसी स्थितियों के लिए, ग्लास एक वैकल्पिक उम्मीदवार है, हालांकि प्लूरोनिक एफ-127 के सोखने के लिए अपेक्षाकृत उच्च सतह हाइड्रोफोबिकिटी की आवश्यकता होती है जो ग्लास के पास नहीं है। हाइड्रोफोबिकिटी बढ़ाने के लिए, ग्लास को डाइक्लोरोबेंज़ीन में डाइमेथिल डाइक्लोरोसिलेन के साथ इलाज किया जा सकता है। इसके बाद, यूवी-ओजोन उपचार का उपयोग माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग47के लिए हाइड्रोफिलिटी बढ़ाने के लिए किया जा सकता है।

अंततः, एक सेल संस्कृति मंच विकसित किया गया था जहां ईसीएम उत्तेजनाओं को प्रोटीन अभिव्यक्ति मात्रा के साथ व्यक्तिगत रूप से ट्यून किया जा सकता है। हमने निर्धारित किया है कि अनुसूचित जाति पुनर्योजी क्षमता को कुछ यांत्रिक और रासायनिक ईसीएम संकेतों द्वारा बढ़ावा दिया जाता है, जो बाद में एनजीसी और सेल प्रत्यारोपण प्रक्रियाओं जैसे जैव सामग्री अनुप्रयोगों के भविष्य के डिजाइन में प्रेरणा प्रदान कर सकते हैं जहां ईसीएम सुविधाओं को अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है24। फिर भी, इन ECM संकेतों ट्यूनिंग एक चुनौतीपूर्ण उपक्रम हो सकता है, विशेष रूप से वीवो में । आगे बढ़ते हुए, इस मंच का उपयोग ईसीएम द्वारा विनियमित अनुसूचित जाति के फेनोटाइपिक संक्रमण में शामिल प्रमुख तंत्रों को पार्स करने के लिए किया जा सकता है। इस लक्ष्य को प्राप्त करके, इनट्रासेलुलर संकेतों में हेरफेर विट्रो48, 49,में समर्पित प्लेटफार्मों की आवश्यकता के बिना अनुसूचित जाति पुनर्योजी क्षमता को बढ़ावा देना संभव होसकताहै। यह तंत्रिका मरम्मत के लिए प्रौद्योगिकियों के विकास में अभूतपूर्व काम करने की क्षमता है।

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Disclosures

लेखकों द्वारा हितों के किसी संभावित संघर्ष की सूचना नहीं दी गई ।

Acknowledgments

लेखकों कृतज्ञता सिनसिनाटी विश्वविद्यालय से धन समर्थन स्वीकार करते हैं । लेखक भी समर्थन के लिए सिनसिनाटी उन्नत सामग्री लक्षण वर्णन प्रयोगशाला के विश्वविद्यालय के रॉन Flenniken शुक्रिया अदा करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Albumin from Bovine Serum (BSA), Texas Red conjugate Thermo Fisher Scientific A23017 BSA staining to show micropatterns
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7076S Antibody used for western blot analysis
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074S Antibody used for western blot analysis
BrdU Thermo Fisher Scientific B23151 Reagent used to measure cell proliferation
BrdU primary antibody conjugated with Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific B35130 Used to visualize BrdU in cell proliferation assays
Collagen I Thermo Fisher Scientific A10483-01 Protein used to coat coverslips
Compression force test machine TestResources Instrument to quantify mechanical properties of polymers
Dulbecco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher Scientific 11965092 Cell culture medium
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 16000044 Cell culture medium supplemental
Fibronectin Thermo Fisher Scientific 33010-018 Protein used to coat coverslips
Fluorescence microscope Nikon Eclipse Ti2 Fluorescence microscope
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) Thermo Fisher Scientific 78440 Protease and Phosphatase Inhibitor
Laminin Thermo Fisher Scientific 23017015 Protein used to coat coverslips
Mounting medium with DAPI Thermo Fisher Scientific P36971 Coverslip mountant and nuclei staining
Mouse c-Jun primary antibody Thermo Fisher Scientific 711202 Primary antibody to visualize c-Jun protein
Mouse β-Actin primary antibody Cell Signaling Technology 3700S Loading control for western blot experiments
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 Cell culture medium supplemental
Photoresist SU 2010 KAYAKU SU8-2010 Photoresist
Pluronic F-127 Sigma Aldrich P-2443 Block non-specific protein binding
Rabbit c-Jun primary antibody Cell Signaling Technology 9165S Primary antibody for visualization of c-Jun protein
Rabbit myelin basic protein primary antibody Abcam ab40390 Primary antibody for visualization of MBP
Rabbit p75NTR primary antibody Cell Signaling Technology 8238S Primary antibody for visualization of p75NTR
Rhodamine phalloidin Thermo Fisher Scientific R415 Visualization of cell cytoskeleton
RIPA buffer Abcam ab156034 Cell lysis buffer
RT4-D6P2T Schwann cell line ATCC CRL-2768 Cell line used in experiments
SYLGARD 184 PDMS base and curing agent Sigma Aldrich 761036 Tunable polymer used to coat coverslips
Trypsin Thermo Fisher Scientific 15090-046 Cell dissociation reagent
UV-Ozone cleaner Novascan Increase hydrophicility of PDMS
Versene (1x) Thermo Fisher Scientific 15040066 Cell dissociation reagent

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References

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Xu, Z., Orkwis, J. A., Harris, G. M. … More

Xu, Z., Orkwis, J. A., Harris, G. M. Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification. J. Vis. Exp. (160), e61496, doi:10.3791/61496 (2020).

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