Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Beredning av Tunable Extracellular Matrix Microenvironments att utvärdera Schwann Cell Fenotyp Specifikation

Published: June 2, 2020 doi: 10.3791/61496
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3
1Department of Chemical and Environmental Engineering, University of Cincinnati, 2Department of Biomedical Engineering, University of Cincinnati, 3Neuroscience Graduate Program, University of Cincinnati College of Medicine

Summary

Denna metod syftar till att illustrera de mekanismer genom vilka extracellulära matris ledtrådar såsom substrat stelhet, protein sammansättning och cell morfologi reglera Schwann cell (SC) fenotyp.

Abstract

Traumatiska perifera nervsystemet (PNS) skador saknar för närvarande lämpliga behandlingar för att återfå full funktionell återhämtning. Schwann celler (SCs), som de viktigaste gliacellerna i PNS, spelar en viktig roll för att främja PNS förnyelse genom att dedifferentiating till en regenerativ cell fenotyp efter skada. Dedifferentierade tillståndet för betydande betydande betydande information är dock en utmaning att upprätthålla genom den tidsperiod som krävs för regenerering och påverkas av förändringar i den omgivande extracellulära matrisen (ECM). Därför är det viktigt att fastställa det komplexa samspelet mellan de rådgivande centralföretag och olika ECM för att tillhandahålla signaler om regenerativ potential hos de centralföretagare som är avgörande. För att ta itu med detta skapades en strategi där olika ECM-proteiner adsorbelades på ett avstämt polydimetylsiloxansubstrat (PDMS) som gav en plattform där styvhet och proteinsammansättning kan moduleras. SCs seeds på den oförstämda substrat och kritiska cellulära funktioner som representerar dynamiken i SC fenotyp mättes. För att illustrera samspelet mellan SC protein uttryck och cellulära morfologi, olika sådd tätheter av SCs utöver enskilda microcontact tryckta cellulära mönster utnyttjades och kännetecknas av immunofluorescens färgning och västra blot. Resultaten visade att celler med en mindre spridning område och högre utsträckning av cellulära töjning främjas högre nivåer av SC regenerativ fenotypiska markörer. Denna metod börjar inte bara att reda ut det betydande förhållandet mellan ECM och cellulära funktion avCS, men ger också riktlinjer för framtida optimering av biomaterial i perifera nerv reparation.

Introduction

Skador på perifera nervsystemet (PNS) är fortfarande en stor klinisk utmaning inom hälso- och sjukvården genom att äventyra livskvaliteten för patienterna och skapa en betydande inverkan genom en mängd socioekonomiska faktorer1,2. Schwann celler (SC), som de viktigaste gliaceller i PNS, ge nödvändiga molekylära och fysiska ledtrådar för att inducera PNS förnyelse och stöd i funktionella återvinningar i korta gap skador. Detta beror på den anmärkningsvärda förmågan hos SCs att dedifferentiera till en "reparation" cell fenotyp från en myelinating eller Remak fenotyp3. Reparationen SC är en distinkt cell fenotyp på flera sätt. Efter skada, SCs öka sin spridning genom att åter komma in i cellcykeln och börja uttryck för flera transkriptionella faktorer för att underlätta reinnervation. Dessa faktorer, såsom c-Jun och p75 NTR, är uppreglerade medan myelinating SC markörer, såsom myelin grundläggande protein (MBP), är downregulated4,5. Dessutom ändrar SCs morfologi för att bli långsträckt och i linje med varandra för att bilda Büngner band över skadeområdet6. Detta ger en fysisk vägledningsmekanism för axoner att utvidgas till rätt distala mål7. Men trots förmågan att SCs har att främja nerv regenerering i korta gap skador, resultatet av funktionell återhämtning är fortfarande dålig i svåra skador. Detta beror delvis på en förlust av extracellulär matris (ECM) vägledning ledtrådar, liksom oförmågacs att upprätthålla regenerativ fenotyp under långa tidsperioder8.

Nervregenerering och återhämtningsprocessen är intimt knutna till tillståndet i den basala lamina efter skada. Den basala lamina är ett lager av ECM runt nerven som underlättar vägledning och ger ECM-bundna ledtrådar för axoner och SCs i de fall där det förblir intakt efter skada9. Tillståndet för ECM och dess förmåga att leverera matris bundna ledtrådar till celler är mycket viktigt och har tidigare undersökts i en mängd olika sammanhang10,11,12,13,14. Det har till exempel visats att styvheten i ECM kan styra cellfunktioner som spridning och differentiering11,15,16. Sammansättningen av ECM kan också leda till ett distinkt cellulärt svar och reglera cellbeteenden som migration och differentiering genom intracellulära signalvägar17,18. Dessutom spelar cellmorfologi, inklusive spridningsområde och cellulär töjning, en viktig roll i regleringen av funktionen och kan styras av ECM-bundna signaler19,20. Många tidigare studier har fokuserat på stamceller som skiljer sig till definierade härstamningar, men SCs har en liknande förmåga att ändra fenotyp från en homeostatisk, vuxen SC inom en frisk nerv, till en reparation SC kan utsöndra proteiner och tillväxtfaktorer medan remodeling ECM efter nervskada5,21. Därför är det särskilt viktigt att identifiera mekanismer som ligger till grund för förhållandet mellan den medfödda SC regenerativ kapacitet och ECM bundna ledtrådar för insikten att i slutändan utnyttja denna kapacitet för nervregenerering.

För att åtgärda detta har vi utvecklat en detaljerad metod för att ta fram ett cellodlingssubstrat där mekanisk styvhet och ligandtyp enkelt kan justeras i fysiologiskt relevanta områden. Polydi metylsiloxan (PDMS) valdes som substrat på grund av dess mycket avstämbara mekanik jämfört med polyakrylamidgel, där den maximala Youngs modul är cirka 12 kPa kontrasterad till PDMS på omkring 1000 kPa22,23,24. Detta är fördelaktigt för det arbete som finns, eftersom nyligen genomförda studier har visat att Youngs modulus av en kanin ischiasnerven kan överstiga 50 kPa under utveckling, vilket tyder på att utbudet av stelhet av nerver inom PNS är bredare än tidigare undersökts. Olika proteiner kan adsorption på PDMS substrat för att analysera kombinatorisk reglering av mekanik och ligander på SC beteende. Detta gör det möjligt för undersökning av flera mikromiljö signaler som finns i PNS regenereringsprocessen och jämförelse av en hög grad av tunability till arbetet fokuserar enbart på styvhet av substratet25. Vidare är dessa konstruerade cellodlingssubstrat kompatibla med en mängd kvantitativa analysmetoder som immunohistokemi, västra blot och kvantitativ polymeraskedjereaktion (q-PCR).

Denna konstruerade cellodlingsplattform är mycket lämplig för att analysera mekanistiska vägar på grund av den höga individuella tunabilityen hos varje ECM-bunden signal. Dessutom kan populära metoder för cellmikromönster, inklusive mikrokontakter, uppnås på substraten för att möjliggöra kontrollerad cellvidhäftning för att analysera cellform i förhållande till andra ECM bundna signaler24. Detta är avgörande eftersom linjemönstrade substrat, som främjar töjning i cellpopulationer, ger ett verktyg för att efterlikna och studera långsträckta och regenerativa SCs inom Büngner band under nervregenerering. Vidare, cellulär morfologi är en potent regulator av flera cellfunktioner och kan potentiellt införa förvirrande experimentella resultat om inte kontrolleras26,27. Betydande uppmärksamhet ägnas nu åt de mekanismer som styr SC regenerativ fenotyp som regleras av ECM cues28,29,30. Detta är viktigt för att ge insikt i utformningen av biomaterial som kan tillämpas som nerv vägledning ledningar för stöd i PNS nerv regenerering. Dessa detaljerade protokoll kan i slutändan tillämpas som ett potentiellt verktyg för att dechiffrera mekanismerna för SC och andra celltyp funktion som regleras av ECM bundna ledtrådar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Sunable cellodling substrat förberedelse och karakterisering

  1. Substratberedning
    1. Blanda PDMS bas elastomer och härdningsmedel med hjälp av en pipett spets kraftigt i ett förhållande mellan 10:1 och 60:1 tills bubblor är homogent spridda i blandningen. Ta bort bubblor med vakuum uttorkning tills bubblor skingras.
      OBS: Under PDMS polymerisation, härdningsmedel tvärbindningar med basen elastomer för att ge slutliga polymer önskade mekaniska egenskaper. Tvärlänksförhållanden kan justeras för att ändra PDMS styvhet.
    2. Placera en droppe (~0,2 ml) uttorkad PDMS-blandning på ett fyrkantigt eller cirkulärt täckspän (t.ex. 22 mm x 22 mm) och rotera täcket på en spindellack vid 2500 varv/min i 30 s.
    3. Inkubera täcklåset i antingen en ugn vid 60 °C i 1-2 timmar eller rumstemperatur över natten för att PDMS ska stelna.
    4. Behandla täckmedlet med UV-Ozonrengöringsmedel i 7 min (UV-våglängd: 185 nm och 254 nm) för att öka ytans hydrofilitet. Placera den i en steriliserad 6-brunnsplatta.
    5. Innan du använder för cellodling, inkubera substrat i 70% etanol i minst 30 min.
      VARNING: UV-Ozonrengöringsmedel kan generera ozon som är skadligt för människor. Arbeta i en kemisk rökhuva eller med någon form av ventilation.
    6. Sänk ned täckben i proteinlösningen (10 μg/mL kollagen I, fibronectin eller laminin) i 60 minuter i en steril inkubator vid 37 °C.
      OBS: Efter UV-ozonbehandling kan PDMS-ytan fortfarande vara hydrofoba. Rotera brunnsplattan för att säkerställa att varje täckslip är täckt med proteinlösningen.
    7. Sug upp proteinlösningen och tvätta täcket med fosfatbuffertad koksaltlösning (PBS) 3x.
    8. Re-suspend RT4-D6P2T Schwann cellinje (SCs) från passering skålen med kommersiellt tillgängliga EDTA lösning (1x) med 2,5% trypsin och räkna celler med hemocytometer. Seed SCs på den avstämda PDMS ytan vid önskad celldensitet. SC seedning tätheter kan variera för varje olika ansökan.
    9. Underhåll cellerna i de önskade cellodlingsparametrarna (90 % fuktighet, 5 % CO2, 37 °C, etc.) för experimentets längd. Använd Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) kompletteras med 10% fetala nötkreatur serum (FBS) och 1% penicillin-streptomycin som cellodlingsmedium.
  2. Mikrospatternedsubstratberedning
    1. Rita de önskade geometri- och celllimområdena (900 μm2,1 600 μm2 och 2 500 μm2) med hjälp av datorstödd design (CAD) med hjälp av datorstödd design (CAD) programvara. Skapa en chrome fotomask baserat på dessa mönster från en kommersiell leverantör.
    2. I ett rent rum eller dammfri miljö, använd standard fotolitografi tekniker för att tillverka kisel rån (protokoll är detaljerade någon annanstans31). Kritiska parametrar för just denna ansökan är följande: Fotoresist: SU-8 2010; Spin profil för att skingra fotoresisten: 500 rpm för 10 s med en acceleration på 100 rpm / s, sedan 3500 rpm för 30 s med en acceleration på 300 rpm / s; Exponeringsenergi av UV-ljus: 130 mJ/cm2.
      OBS: Höjden på mönstren på kiselplattorna är ungefär 10 μm efter dessa parametrar. Potentiella sprickor runt kanten utanför de rektangulära eller triangulära mönstren kan ses med hjälp av ett ljusmikroskop efter steg 1.2.2. Bakning av kiselrån vid 190 °C i 30 min hjälper till att eliminera sprickorna.
    3. Placera det mönstrade kiselrån inuti en cirkulär 150 mm diameter x 15 mm hög petriskål och häll avgasade PDMS (blandningsförhållande 10:1) enligt beredd i steg 1.1.1 på kiselrån.
      OBS: Se till att handtjockleken är minst 5 mm för enkel hantering under mikrokontaktsutskriftssteg.
    4. Stelna PDMS på kiselrån i en ugn vid 60 °C över natten. Låt PDMS svalna till rumstemperatur. Exakt skurna stämplar på 30 mm x 30 mm fyrkanter som innehåller rätt mönster från kiselrån med hjälp av en kirurgisk skalpell. Skada inte kiselrån.
      OBS: Kiselplattor kan återanvändas många gånger vid denna tidpunkt för att producera fler frimärken efter rengöring med isopropanol.
    5. Sterilisera PDMS-stämplar och de avstämbara täcken (beredda i steg 1.1.1 till 1.1.3) genom att doppa dem i 70 % etanol i 30 min.
    6. För att bekräfta effekten av mikromönster genom PDMS-stämplar efter mikrokontaktstryck, torka ytan av PDMS-stämplar med hjälp av en filtrerad luftström och pipett 50 μg/mL BSA (Texas Red konjugerad) lösning för att täcka hela den mönstrade sidan av PDMS-stämpeln.
    7. Inkubera PDMS-stämplar med BSA-lösning för 1 h vid rumstemperatur för att möjliggöra proteinansorption.
    8. Torka ytan av avstämda täckslipar med hjälp av en filtrerad luftström, öka ythydrofiliteten enligt beskrivningen i steg 1.1.5.
    9. Lufttorka PDMS-stämplarna för att avlägsna den återstående BSA-lösningen.
      OBS: Se till att BSA-lösningen tas bort helt från stämpeln eftersom alla återstående lösningar kommer att orsaka att stämplar glider på täcket under mikrokontaktstryck.
    10. Ta stämpelns mönstrade sida i konformkontakt med det avstämda täcket för BSA-adsorption på täckglasets yta. Tryck försiktigt stämpeln mot täcket i 5 min.
      OBS: Använd inte överdriven kraft på stämpeln eftersom den böjer sig och orsakar ospecifik kontakt mellan stämpel och täckslip. Den enorma mängd kraft som används på stämpeln är nödvändig för lyckad mikrokontakt.
    11. Undersök mikropattern med fluorescensmikroskop med ett FITC-filter (Fluorescein isothiocyanaate).
    12. Om du vill skriva ut celllima områden i stället för fluorescerande mönster, ersätta laminin för BSA-protein och upprepa steg 1.2.5 till 1.2.10.
    13. Ta bort stämplar från täcken, överför täcken till en steriliserad 6-brunnsplatta. Tillsätt 2 ml 0,2 % w/v Pluronic F-127-lösning i varje brunn för att täcka täckglasets yta och inkubera i 1 h vid rumstemperatur.
      OBS: Pluronic F-127 kan adsorberas till PDMS yta ökar hydrofobiska PDMS yta för att blockera celler från vidhäftning.
    14. Sug pluronic F-127 lösning och tvätta 5x med PBS och 1x med cellodlingsmediet före såddceller. En typisk sådddensitet för SCs är 1 000 celler/cm2.
    15. 45 min efter cellsådd, ta bort cellodlingsmediet och tvätta täcken med PBS 2x för att förhindra att flera SCs fastnar i samma mönster. Underhåll cellerna i önskad cellodlingsmiljö i 48 timmar före kvantifiering.
    16. Om du vill skapa linjemöntrade cellodlingssubstrat för att undersöka justerade celler följer du steg 1.2.1 till 1.2.4 för att skapa stämplar för mikrokontaktutskrift.
      OBS: Måtten på spår/ås av de fodrade mönster på stämpel är 50 μm x 50 μm för de celler som beskrivs. Stämpelns totala mått är 10 mm x 10 mm.
    17. Skär frimärken i dimensioner som endast innehåller önskade linjemönster.
      OBS: När frimärken skapas i CAD kommer frimärkets oskyddade område runt linjemönstren att motsvara celllimområdet efter mikrokontaktstryck. Således är det nödvändigt att eliminera otaldområden när du klipper ut stämpeln för att säkerställa att varje SC sådd på ytan följer mönstren.
    18. Följ steg 1.1.1 till 1.1.3 för att förbereda avstämd PDMS ytbeläggning två petriskålar.
      OBS: Detta kommer att VARA PDMS som täcker petriskålen ytan själv och inte på ett täckslip.
    19. Följ steg 1.2.5 till 1.2.10 för att utföra mikrokontakt utskrift för att skriva ut linjemönstrade celllimområden på en av PDMS-belagda petriskålar.
      OBS: Ytan på en 60 mm x 15 mm petriskål kan innehålla linjemönstrade områden från 6 PDMS-stämplar.
    20. Ta bort frimärken och fyll petriskålen med 4 ml 0,2% w/v Pluronic F-127-lösning och inkubera i 1 h.
    21. Efter mikrokontaktstryck, skölj varje sida av PDMS-stämplarna med 70% etanol 3x och torka med luft. Rotera PDMS-stämplar och följ steg 1.2.5 till 1.2.10 för att skriva ut det oskalade celllimområdet med den oskrivna sidan av stämpeln på den andra petriskålen. Upprepa steg 1.2.13.
    22. Sug upp F-127 lösning från disk, tvätta 3x med PBS följt med 1x tvätt med färsk cellodlingsmedium. Seed SCs på rätter.
      OBS: Sådensiteten för en linjemönstrade skålen är 5 000 celler/cm2 och för en osmättad rätt är 10 000 celler/cm2.
    23. Underhåll SCs vid önskade förhållanden för 48 h och följ protokoll för att förbereda SC lysates32.
      OBS: Cellen sådensitet för oskyddade rätter är 2x högre än för linjemönstrade rätter, eftersom den linjemönstrade skålen har bara hälften av celllimområdet i den oskyddade skålen.
      1. För att förbereda lysates, överför lämplig radioimmunoprecipitation analys (RIPA) buffert till en 10 ml konisk centrifugrör. Späd proteas och fosfatashämmare (100x) vid ett förhållande av 1:100 i RIPA buffert, blanda väl genom pipettering.
      2. Tvätta celler med iskall PBS (1x) i 2 min, tillsätt 80 μl av lösningen som framställts från steg 1.2.23.1 på varje celllimområde (det område som kontaktades med PDMS-frimärken och adsorbest protein) inom petriskålar. Inkubera celler med lösningen på ett isblock i 15 min.
        OBS: Lösningen kommer endast att stanna på celllimområdet på grund av hydrofobaiteten hos Pluronic F-127 adsorption någon annanstans. Den här funktionen möjliggör en framgångsrik och tillräcklig proteinutvinning för linjemönstrade SCs.
      3. Skrapa SCs med en cellskrapa i 5 min. Samla lysate i ett märkt 1,5 ml mikrocentrifugrör.
      4. Microcentrifug lysate vid 12, 000 x g i 15 min vid 4°C. Samla supernatant med en 1 000 μL pipett och överför till ett rent mikrocentrifugrör. Lagra cell lysate vid -20 °C.
  3. Karakterisering av substrat
    OBS: För att karakterisera polymerens mekanik på täcket används i allmänhet flera metoder, inklusive masskompressionstestning11,,33 eller atomkraftmikroskopitestning34. Det här protokollet beskriver masskomprimeringstestning.
    1. Häll PDMS-föregångaren för önskat blandningsförhållande (steg 1.1) i en 30 mm petriskål, se till att pdms-skiktets tjocklek i petriskålen är minst 20 mm.
    2. Ta bort petriskålen med stelnad PDMS från 60 °C ugn efter 1 h och låt svalna i rumstemperatur. Skär polymeren i 10 mm x 10 mm fyrkanter. Mät tjockleken på PDMS med hjälp av bromsok.
    3. Placera PDMS på scenen av kompressionskraftmätmaskinen. Koppla in komprimeringskraftsensorn (modell: 112C) till sensorporten och fäst sensorn på testmaskinens axel.
    4. Justera sensorns höjd till cirka 0,5 cm ovanför PDMS-stämpeln med hjälp av "jogga" kontroll på instrumentets frampanel.
    5. Öppna den tillhörande programvaran med fönstret" Test setup", välj "Servoprofil" och öppna fönstret "Segment". I fönstret "Segment" matas in önskad "kontrollhastighet" och "Slutbelopp" för testet.
      Obs: Kontrollhastigheten bestämmer den hastighet med vilken sensorn färdas ner mot PDMS. Slutmängden bestämmer den totala sträcka sensorn färdas.
    6. Använd knappen"Z"som finns på programvarans kontrollpanel för att återställa alla mätningar just nu.
    7. Flytta sensorn nedåt för att lätt kontakta PDMS tills 1-2 newton (N) är laddade. Lastningen och avståndet som sensorn färdas kommer att visas i programvaran.
    8. När du har använt "Z" -knappen kör du mätningen med "Spela upp" och spara filinspelningskraften och avståndet.
    9. Upprepa steg 1.3.3 till 1.3.8 för varje experimentellt tillstånd av PDMS.
    10. Öppna filen och använd följande formel för att beräkna Youngs modulus (E) av PDMS för varje förhållande. (F = kompressionskraft, A = område för PDMS-stämpel, ∆L = sensorns ressträcka och L0 = PDMS-stämpelns ursprungliga tjocklek).
      Equation 1

2. Kvantifiering av cellulära egenskaper på avstämbara substrat

  1. Spridningsanalys
    1. Seed SCs på substrat beredd från steg 1.1.9 vid en densitet av 5000 celler / cm2 i en 6-brunnsplatta. Låt SCs inkubera i 48 timmar under standardcellodlingsförhållanden (37 °C och 5 % CO2).
    2. Späd 12 μL 10 mM Bromodeoxyuridin (BrdU) stamlösning i 12 ml 37 °C cellodlingsmedium, blanda väl med pipett för att göra 10 μM BrdU-märkningslösning.
    3. Ta bort cellodlingsmediet och tvätta SCs 2x med PBS.
    4. Tillsätt 2 ml BrdU-märkningslösning i varje brunn och inkubera SCs för 2 h.
      OBS: Inkubationstiden för BrdU-märkningslösning beror på den specifika cellspridningshastigheten. RT4-D6P2T SC-linjen har en hög spridningshastighet så 2 h inkubationstid användes.
    5. Ta bort BrdU-märkningslösning och tvätta SCs 3x med PBS. Tillsätt 1 ml 3,7% formaldehyd i PBS till varje brunn och inkubera vid rumstemperatur i 15 min för cellfixering.
      VARNING: Formaldehyd är cancerframkallande hos människa. utför därför allt arbete inuti en kemisk rökhuva med lämpligt skydd.
      OBS: Vid tvättning med PBS finns det inget cellodlingsmedium i brunnen, och därmed kan PDMS-ytan vara hydrofoba. Vidta försiktighetsåtgärder för att inte helt torka ytan av substratet för att förhindra cellskador.
    6. Sug formaldehyd lösning och tvätta 3x med PBS (3 min vardera). Ta bort PBS och tillsätt 1 ml 0,2% Triton X-100 i PBS till varje brunn för att permeabilisera cellmembranet. Inkubera SCs med Triton X-100 lösning i 20 min vid rumstemperatur.
    7. Ta bort Triton X-100-lösningen och tvätta SCs 3x med PBS (3 min vardera).
    8. Tillsätt 1 ml 1 N HCl i varje brunn och inkubera på is i 10 min. Ta bort 1 N HCl och tillsätt 1 ml 2 N HCl i varje brunn och inkubera i rumstemperatur i 10 min. HCl-behandling är för DNA-hydrolys.
    9. Blanda 182 ml 0,2 mM Na2HPO4 och 18 ml 0,1 m MM citronsyra för att producera en fosfat/citronsyrabuffert för antigenhämtning. Ta bort 2 N HCl och tillsätt 1 ml fosfat/citronsyrabuffert i varje brunn och inkubera i rumstemperatur i 10 min.
    10. Tvätta SCs 3x med 0,2% Triton X-100 i PBS. Tillsätt 2 ml 3 % bovint serumalbumin (BSA) i PBS i varje brunn och inkubera i 30 min vid rumstemperatur för att stämpla nonspecific bindning av antikroppen.
    11. Späd BrdU primär antikropp konjugerad med Alexa Fluor 488 i 3% BSA lösning vid ett förhållande av 1:300 för BrdU färgning lösning. Inkubera SCs med färgningslösning över natten vid rumstemperatur medan plattan är täckt av aluminiumfolie.
    12. För att kvantifiera spridning, bild-cs med HJÄLP av FITC- och DAPI-kanalen i ett fluorescerande mikroskop för att upptäcka BrdU respektive kärnor. Spara bilder som "nd.2"-filer.
    13. Öppna "nd.2" filer för varje bild som tas på identiska rumsliga positioner.
    14. Öppna bildanalysprogramvaran. Högerklicka på bakgrunden för att öppna fönstret "Automatiserade mätresultat" och "Automatiserad mätning" i avsnittet "Analysis Control".
    15. I menyn "Antal och taxonomi" väljer du "Count". På FITC bild, klicka på varje kärna som visar grön fluorescens (BrdU positiv) och högerklicka på bilden.
      OBS: Antalet BrdU-positiva celler visas i fönstret för "Automations och mätningar".
    16. För DAPI-bilder upprepar du steg 2.1.14 för att räkna antalet totala kärnor. Beräkna procentandelen BrdU-positiva celler för den här bilden.
    17. Upprepa steg 2.1.13 till 2.1.16 för andra bilder för statistiska ändamål och beräkna medelprocenten av BrdU-positiva celler för varje substrattillstånd.
  2. Kvantifiering av c-jun-uttryck genom immunofluorescent bildanalys
    1. Celler som är beredda inuti 6-brunnsplattor från steg 1.1.9 och 1.2.23 är fixerade och permeabiliserade med de förfaranden som tidigare beskrivits (steg 2.1.5-2.1.7).
      OBS: För att utföra korrekta jämförelser av fluorescerande intensitet mellan celler med olika ECM-villkor, tillämpa kamerainställningarna på samma sätt i alla prover med alla prover med samma parametrar.
    2. Spara bilder som ".nd2"-filer.
    3. Öppna bildanalysprogramvaran. Högerklicka på bakgrunden för att öppna fönstret "Automatiserade mätresultat" och "Automatiserad mätning" i avsnittet "Analysis Control".
    4. I "Automatiserade mätresultat", välj "Objektdata". Aktivera knappen "Fortsätt uppdatera mätning".
    5. På den övre panelen i programvaran väljer du "Mått" följt av "Objektfunktioner". Lägg till "Medelintensitet" i avsnittet "Selected for Measurement".
    6. Öppna och slå samman två ".nd2" bildfiler som innehåller bilder av c-jun och kärnor.
    7. På den övre panelen väljer du "ROI" och väljer "Rita rektangulär AVKASTNING". Rita ett rektangulärt område som innehåller det kärnområde i en enda cell.
      OBS: c-jun-uttrycket är koncentrerat till atomkärnor35.
    8. I den övre panelen av programvara väljer du "Binary" och "Define Threshold", ett nytt fönster kommer att se ut att exakt definiera c-jun fluorescerande område.
    9. I det nya fönstret klickar du på "Full Image/Use ROI" för att växla program från full bildmodell till ROI-modellen. Använd "Intensitet" för att justera uppslagstabellen som finns till vänster i fönstret för justering av storlek/form för det markerade området inom den rektangulära avkastningen.
      OBS: Var noga med att se till att storleken/formen på det markerade området är identisk med kärnan.
    10. Klicka på knappen "OK" för att få medelvärdet för FITC-intensitet i fönstret "Automatiserade mätresultat" och klicka sedan på "Lagra data".
    11. I fönstret "Automatiserad mätning", "Ta bort objekt" för att ta bort rött markerat område. På den vänstra sidopanelen använder du "Pekverktyg" för att markera den rektangulära avkastningen och ta bort.
    12. Upprepa steg 2.2.6 till 2.2.11 för att mäta medelvärdet för FITC-intensitet för varje ytterligare cell.
    13. I fönsterområdet "Automatiserade mätresultat" väljer du "Lagrad" och alla lagrade data kommer att presenteras. Använd funktionenExporteraoch välj "Data till Excel" för att spara det exporterade kalkylbladet och utföra ytterligare beräkningar.
  3. Kvantifiering av kärn- töjning
    1. Åtgärda och permeabilisera SCs som utarbetats från steg 1.2.22 enligt steg 2.1.5-2.1.7. Utför kärnfärgning med monteringsmedium med DAPI.
    2. Använda DAPI-kanalen och en 40x objektiv, hämta bilder av provet och spara som ".nd2" filer.
    3. Följ fönstret "Automatiserade mätresultat" och "Automatiserad mätning" i bildanalysprogrammet.
    4. I "Automatiserade mätresultat" använder du funktionen "Alternativ" följt av "Select Object Feature". I kolumnen "Feature" väljer du "Förlängning" och lägger till i kolumnen "Selected for Measurements". Använd "Keep Updating Measurement" för att aktivera den här funktionen.
    5. Öppna bildfilen "nd.2" som innehåller kärnbilderna. I fönstretAutomatiserad mätningväljer du "Automatisk identifiering" funktion och väljer en kärna. Högerklicka på bilden och det uppmätta kärnproportionertalet visas i "Automatiserade mätresultat".
    6. Upprepa steg 2.3.5 för att kvantifiera kärnproportioner för andra kärnor i bilden. Välj "Lagra data" i fönstret "Automatiserade mätresultat".
    7. Upprepa 2.3.5 till 2.3.6 för ytterligare bilder. Exportera data till en kalkylbladsfil som tidigare gjorts i 2.2.13 för analys.
  4. Western blot att kvantifiera protein uttryck
    1. Följ standardprotokoll för western blot-analys detaljerad någon annanstans32. Utspädningarna av antikroppar som används i studien visas nedan: Kanin anti c-Jun 1:2000; Mus anti β-aktin 1:1,000; Kanin anti p75NTR 1:1,000; Kanin anti myelin grundläggande protein 1:1,000; Anti-mus/kanin IgG, HRP-kopplad antikropp 1:10 000.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att analysera och kvantifiera samspelet mellan substratstyvhet och proteinsammansättning på SC-fenotyp utvecklades ett avstämt PDMS-cellodlingssubstrat (figur 1A). Kompressionstestning av polymeren vid olika bas: härdningsmedelsförhållanden användes för att kvantifiera Youngs modulus (E) av substratet (figur 1B). Det resulterande intervallet av modulvärden representerar fysiologiskt relevanta substratförhållanden. Efter beredning av substrat, var SCs odlade och cellulära egenskaper analyseras på den avstämd mikromiljön. Spridningshastigheter av SCs på substrat av olika proteinsammansättning analyserades först. Lamininbelagda substrat resulterade i en högre spridningshastighet jämfört med kollagen I och fibronectin adsorption alla på 10 μg/mL (figur 2A,B). SCs på substrat med lamininbeläggning och olika moduli visade att relativt mjukare substrat (E=3.85kPa) minskar cellspridningshastigheten under alla förhållanden(figur 2C,D). Skillnaderna mellan stela substrat (E=1119kPa) och relativt mjuka substrat (E=8,67kPa) var dock obetydliga (figur 2D).

SCs analyserades också för protein uttryck genom immunohistochemistry och västra blot. Nivåer av transkriptionsfaktor c-Jun analyserades med immunfluorescerande mikroskopi (figur 3A) och representeras av den genomsnittliga pixellysrörsintensiteten (figur 3B-D). c-Jun uttryck visade sig vara upregulated som substrat blev mjukare (E = 1119 kPa till E = 8,67 kPa), men på mjukaste substrat (E = 3,85 kPa), c-juni uttryck var betydligt nedreglerad. På styva substrat (E= 1119 kPa), kollagen jag belagda substrat resulterade i den högsta c-juni uttryck, men som substrat blev mjukare (E = 8,67 kPa och 3,85 kPa), laminin visade de högsta nivåerna av c-juni (Figur 3E). Western blot användes också för att analysera både c-Jun och myelin grundläggande protein (MBP) med c-Jun nivåer uppreglerade och MBP nedreglerad på mjukare substrat (Figur 3F). Vidare resulterade SCs seedade på lamininbelagda substrat i det högsta c-jun-uttrycket jämfört med kollagen I och fibronectin.

Celler av olika såddtäthet odlades och färgades sedan med rhodamin-falloidin för att utforska cellspridningens och områdets roll i c-jun-uttryck (figur 4A,B). För att kontrollera kärnutfärdning av celler användes en gemensam mikromönsterteknik (microcontact printing36) för att skapa celllima linjer på cellodlingssubstraten. Kärnproportionerna för celler som såtts på ett linjemönstrade substrat visade sig vara betydligt högre än celler som sås på osärtnade substrat (figur 4C,D). Det konstaterades att uttryck för både c-jun och en annan markör betydande i SC regenerativ fenotyper, p75 neurotrofenin receptor (p75 NTR), var uppreglerade i täta celler med en mindre spridning område (Figur 4E). Linjemönstrade celler resulterade också i ett högre uttryck för både c-Jun och p75 NTR jämfört med icke-utstämda celler (figur 4F). Därför skapades mikrokontakttryckda celllimgeometrier för att exakt kontrollera cellspridningsområdet och töjning samtidigt som cellcellinteraktioner elimineras (figur 5A). Måtten på de totala celllimeområdena var 900 μm2,1 600 μm2och 2 500 μm2 med ett bildförhållande på antingen 1 eller 4 (celllängd: cellbredd). Fluorescerande bovin serum albumin (fBSA, Texas röd) färgning användes för att avslöja status för mikromönster på cellodlingssubstrat efter mikrokontakt utskrift (Figur 5B). Kärnproportionen för sc för varje cellområde mättes och det visades att genom att öka kärnproportionen ökar den cellulära töjningen (figur 5C). I takt med att sc-proportionerna ökade var c-jun dessutom uppreglerad (figur 5D). Intressant nog konstaterades det dock att när cellspridningsområdet ökar c-jun-uttrycket är nedreglerat (figur 5E). Immunofluorescensfärgning för både kärnor och aktin bekräftade cellspridningsområde och töjning kontrollerades mycket genom denna mikromönstermetod (figur 5F).

Figure 1
Figur 1: Cellodlingssubstrat med avstämd styvhet och proteinsammansättning. (A) Schematisk som visar utvecklingen av PDMS cellkultur substrat. (B)Det ursprungliga PDMS blandningsförhållandet för basen: härdningsmedel bestämmer Youngs modulus. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Spridningshastigheter för snapp regleras av substratstyvhet och proteinsammansättning. (A)Representativa bilder som visar BrdU-färgning när de odlas på substrat av samma modul. B)Histogram som visar andelen BrdU-positiva celler för varje proteinbeläggning. (C)Representativa bilder som visar BrdU-inkorporering i SCs sådd på substrat av samma proteinbeläggning. (D)Histogram som visar procentandelen brdU-positiva celler för varje youngs modulusvärde. Skalstänger = 50 μm. Data presenteras som medelvärde ± SEM. *p < .05, **p < .005, ***p < .0005. Delar av figuren har ändrats från ref.24. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Substratstyvhet och proteinreglerat SC-proteinuttryck. (A)Representativa bilder visar c-jun immunofluorescensfärgning för SCs sådd på substrat av olika styvhet och proteinsammansättning. Genomsnittlig pixel fluorescerande intensitet av c-Jun mättes för SCs sådd på(B) kollagen I (C) fibronectin och (D) lamininbelagda substrat av olika styvhet. E)c-jun fluorescensnivå av SCs grupperade efter Youngs modul av substrat. (F)Western blot visar c-jun och myelin grundläggande protein (MBP) av SCs sådd på substrat. Glyceraldehyd 3-fosfat dehydrogenas (GAPDH) användes som lastning kontroll. Skalbar = 50 μm. Data presenteras som medelvärde ± SEM. *p < .05, **p < .005, ***p < .0005. Delar av figuren har ändrats från ref.24. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Cellulärt spridningsområde påverkar proteinuttryck av SCs. (A)Cell spridning område av olika sådd densitet visualiserades genom rhodamin-falloidin (röd) och atomkärnor färgning (blå). b)Histogram som visar det genomsnittliga spridningsområdet för SCs i varje tillstånd. C)Kärnorna av SCs som såddes på oskalade eller linjemönstrade substrat färgades med DAPI (blå) för att visa morfologi. DDHistogram som visar kvantifiering av kärnproportioner på mönstrade och oförsändelser. (E)Western blot visar uttryck för c-juni och p75NTR av celler med olika spridningsområde. F)Western blot som visar proteinuttryck av SCs på ostämda och linjemönstrade substrat. Skalbar = 50 μm. Data presenteras som medelvärde ± SEM. *p < .05, **p < .005, ***p < .0005. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: SC morfologi och förlängning inverkan c-juni uttryck för SCs. (A) Schematisk som visar cellmikromönster för former med olika proportioner. B)fBSA-färgning (röd) som visar mikromönsters form efter mikrokontakt. Skalbar = 10 μm. CHistogram som visar kärnproportionering av mikromönsterSC.(D, E)Histogram som visar den genomsnittliga pixellyssningsintensiteten hos c-jun för vart och ett av de geometriska förhållandena. (F)Rhodamine-falloidin (röd), kärnor (blå) och c-Juni (grön) var färgade på de olika micropatterns. Skalbar = 10 μm. Data presenteras som medelvärde ± SEM. *p < .05, **p < .005, ***p < .0005. Delar av figuren har ändrats från ref.24. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

SCs kan främja nerv regenerering på grund av deras fenotypiska omvandling och regenerativ potential efter nerv skada. Men hur ECM signaler reglerar denna regenerativa kapacitet är fortfarande mestadels oklart, potentiellt hindrar inte bara utvecklingen av biomaterial som syftar till att främja nervregenerering men också förståelsen av de mekanismer som är involverade i nervregenerering. För att börja undersöka detta samspel, cellkultur substrat skapades där ECM ledtrådar såsom styvhet, protein beläggning, och självhäftande topografi kan kontrolleras. Förmågan att micropattern självhäftande topografi är en viktig funktion i protokollet, med hjälp av den gemensamma metoden för mikrokontakt utskrift. Detta substrat skiljer sig dock från glaset genom att den kompressionskraft som tillämpas på PDMS-stämplarna måste vara på en lämplig nivå för att uppnå önskad form av cellhäftande områden på cellodlingssubstrat. Använda fluorescerande bovin serum albumin (fBSA) som en modell protein för att visualisera cell lim områden och justera kompressionskrafter på PDMS frimärken kan i slutändan mildra denna fråga. En annan viktig skillnad från glas är avlägsnandet av överskott Pluronic F-127 som används för att göra resten av substratet icke-lim. Efter denna behandling, cellkultur substrat är mycket hydrofoba, vilket gör det utmanande att upprätthålla våtcellsodling substrat hela tvättar, vilket är viktigt för den strukturella integriteten hos mikromönster protein37. Därför rekommenderas att använda flera pipetter för att aspirera och injicera lösningar nästan samtidigt för att förhindra substrat från helt uttorkande.

Även om mikromönster exakt kan kontrollera cellens form och inte kräver komplicerade syntetiska procedurer med hjälp av cellblockerande polymerer som OEGMA, är de metoder som används för att kvantifiera proteinuttryck av mikromönsterceller ibland begränsade38. Exempelvis är prover som är tillgängliga från mikromönster i allmänhet begränsade till några hundra celler per täckslip, vilket är otillräckligt för att förbereda celllystetter som ska användas för västerländska blots eller qPCR. Med tanke på detta, immunofluorescens färgning ensam användes för att kvantifiera protein uttryck för mikromönster celler, begränsa olika proteiner som kan kvantifieras. För att ta itu med detta använde vi linjemönster för att främja cell töjning för större cell populationer och framgångsrikt beredda cell lysates som analyserades av västra blot. Andra metoder såsom tillämpade elektriska fält eller justerade elektrospunfibrer kan också användas för att kontrollera töjningen av cellpopulationer39,40. Elektriska fält får dock inte passa in i alla tillämpningar för NNGC eftersom konduktiviteten hos vanliga biomaterial som kollagenbaserad polymer och silke är mycket låg28,41,42. Däremot har justerade elektrospun nanofibrer framgångsrikt implanterats i NNGC för att främja SC anpassning, töjning och migration samt neurite utväxt43,44. Det kan också visa sig övertygande att jämföra SC beteende på linjemönstrade substrat mot dem på substrat med justerade nanofibrer, eftersom fodrade mönster och anpassade nanofibrer är två av de vanligaste vägledningsmekanismer som ingår i NGCs45.

Den mikromönster protokoll detaljerad använder PDMS belagda coverslips som cellkultur substrat, med en maximal yta Youngs modulus av 1119 kPa. Sådan stelhet härmar många vävnader, men det kanske inte är möjligt att modellera osteogenes av mesenkymala stamceller, som i allmänhet kräver ytan Youngs modul att överstiga 1 Gpa46. För sådana situationer är glas en alternativ kandidat, men adsorption av Pluronic F-127 kräver relativt hög yta hydrofobalysitet som glas inte har. För att öka hydrofobaiteten kan glas behandlas med dimetyldiklorosilan i diklosbens. Därefter kan UV-ozonbehandling användas för att öka hydrofiliteten för mikrokontaktstryck47.

I slutändan utvecklades en cellodlingsplattform där ECM-stimuli kan justeras individuellt med proteinuttryck kvantifierat. Vi har fastställt att SC regenerativ kapacitet främjas av vissa mekaniska och kemiska ECM ledtrådar, som senare kan ge inspiration i den framtida utformningen av biomaterial applikationer såsom NGCs och cell transplantation processer där ECM funktioner kan behöva optimeras24. Att trimma dessa ECM-signaler kan dock vara ett utmanande åtagande, särskilt in vivo. Framåt kan denna plattform användas för att tolka viktiga mekanismer som är involverade i den fenotypiska övergången av SCs som regleras av ECM. Genom att uppnå detta kan manipulering av intracellulära signaler vara möjligt att främja SC regenerativ kapacitet utan behov av särskilda plattformar in vitro48,49. Detta har potential för banbrytande arbete i utvecklingen av teknik för nervreparation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen potentiell intressekonflikt rapporterades av författarna.

Acknowledgments

Författarna erkänner tacksamt finansiering stöd från universitetet i Cincinnati. Författarna tackar också Ron Flenniken vid University of Cincinnati Advanced Materials Characterization laboratory för stöd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Albumin from Bovine Serum (BSA), Texas Red conjugate Thermo Fisher Scientific A23017 BSA staining to show micropatterns
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7076S Antibody used for western blot analysis
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074S Antibody used for western blot analysis
BrdU Thermo Fisher Scientific B23151 Reagent used to measure cell proliferation
BrdU primary antibody conjugated with Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific B35130 Used to visualize BrdU in cell proliferation assays
Collagen I Thermo Fisher Scientific A10483-01 Protein used to coat coverslips
Compression force test machine TestResources Instrument to quantify mechanical properties of polymers
Dulbecco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher Scientific 11965092 Cell culture medium
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 16000044 Cell culture medium supplemental
Fibronectin Thermo Fisher Scientific 33010-018 Protein used to coat coverslips
Fluorescence microscope Nikon Eclipse Ti2 Fluorescence microscope
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) Thermo Fisher Scientific 78440 Protease and Phosphatase Inhibitor
Laminin Thermo Fisher Scientific 23017015 Protein used to coat coverslips
Mounting medium with DAPI Thermo Fisher Scientific P36971 Coverslip mountant and nuclei staining
Mouse c-Jun primary antibody Thermo Fisher Scientific 711202 Primary antibody to visualize c-Jun protein
Mouse β-Actin primary antibody Cell Signaling Technology 3700S Loading control for western blot experiments
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 Cell culture medium supplemental
Photoresist SU 2010 KAYAKU SU8-2010 Photoresist
Pluronic F-127 Sigma Aldrich P-2443 Block non-specific protein binding
Rabbit c-Jun primary antibody Cell Signaling Technology 9165S Primary antibody for visualization of c-Jun protein
Rabbit myelin basic protein primary antibody Abcam ab40390 Primary antibody for visualization of MBP
Rabbit p75NTR primary antibody Cell Signaling Technology 8238S Primary antibody for visualization of p75NTR
Rhodamine phalloidin Thermo Fisher Scientific R415 Visualization of cell cytoskeleton
RIPA buffer Abcam ab156034 Cell lysis buffer
RT4-D6P2T Schwann cell line ATCC CRL-2768 Cell line used in experiments
SYLGARD 184 PDMS base and curing agent Sigma Aldrich 761036 Tunable polymer used to coat coverslips
Trypsin Thermo Fisher Scientific 15090-046 Cell dissociation reagent
UV-Ozone cleaner Novascan Increase hydrophicility of PDMS
Versene (1x) Thermo Fisher Scientific 15040066 Cell dissociation reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Taylor, C. A., Braza, D., Rice, J. B., Dillingham, T. The Incidence of Peripheral Nerve Injury in Extremity Trauma. American Journal of Physical Medicine & Rehabilitation. 87, 381-385 (2008).
  2. Noble, J., Munro, C. A., Prasad, V. S. S. V., Midha, R. Analysis of Upper and Lower Extremity Peripheral Nerve Injuries in a Population of Patients with Multiple Injuries. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 45, 116-122 (1998).
  3. Jessen, K. R., Mirsky, R. The repair Schwann cell and its function in regenerating nerves. Journal of Physiology. 594, 3521-3531 (2016).
  4. Arthur-Farraj, P. J., et al. c-Jun Reprograms Schwann Cells of Injured Nerves to Generate a Repair Cell Essential for Regeneration. Neuron. 75, 633-647 (2012).
  5. Jessen, K. R., Mirsky, R. The Success and Failure of the Schwann Cell Response to Nerve Injury. Frontiers in Cell Neurosciences. 13, 33 (2019).
  6. Gomez-Sanchez, J. A., et al. After Nerve Injury, Lineage Tracing Shows That Myelin and Remak Schwann Cells Elongate Extensively and Branch to Form Repair Schwann Cells, Which Shorten Radically on Remyelination. Journal of Neuroscience. 37 (37), 9086-9099 (2017).
  7. Deumens, R., et al. Repairing injured peripheral nerves: Bridging the gap. Progress in Neurobiology. 92, 245-276 (2010).
  8. Höke, A., Gordon, T., Zochodne, D. W., Sulaiman, O. A. R. A decline in glial cell-line-derived neurotrophic factor expression is associated with impaired regeneration after long-term Schwann cell denervation. Experimental Neurology. 173, 77-85 (2002).
  9. Jones, S., Eisenberg, H. M., Jia, X. Advances and future applications of augmented peripheral nerve regeneration. International Journal of Molecular Sciences. 17, 1-17 (2016).
  10. Harris, G. M., et al. Nerve Guidance by a Decellularized Fibroblast Extracellular Matrix. Matrix Biology. 60-61, 176-189 (2017).
  11. Harris, G. M., Piroli, M. E., Jabbarzadeh, E. Deconstructing the Effects of Matrix Elasticity and Geometry in Mesenchymal Stem Cell Lineage Commitment. Advanced Function Mater. 24 (16), 2396-2403 (2014).
  12. Pryzhkova, M. V., Harris, G. M., Ma, S., Jabbarzadeh, E. Patterning pluripotent stem cells at a single cell level. Journal of Biomaterials and Tissue Engineering. 3 (4), 461-471 (2013).
  13. Engler, A. J., Sweeney, H. L., Discher, D. E., Schwarzbauer, J. E. Extracellular matrix elasticity directs stem cell differentiation. Journal of Musculoskeleton and Neuronal Interaction. 7 (4), 335 (2007).
  14. Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
  15. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  16. Pickup, M. W., Mouw, J. K., Weaver, V. M. The extracellular matrix modulates the hallmarks of cancer. EMBO Reports. 15, 1243-1253 (2014).
  17. Chernousov, M. A., Carey, D. J. Schwann cell extracellular matrix molecules and their receptors. Histology and Histopathology. 15, 593-601 (2000).
  18. Shibata, S., et al. Selective Laminin-Directed Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Distinct Ocular Lineages. Cell Reports. 25 (6), 1668-1679 (2018).
  19. Mcbeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell Shape, Cytoskeletal tenstion and RhoA regulate stem cell lineage committment. Developmental Cell. 6, 483-495 (2004).
  20. Halder, G., Dupont, S., Piccolo, S. Transduction of mechanical and cytoskeletal cues by YAP and TAZ. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13, 591-600 (2012).
  21. Jessen, K. R., Mirsky, R. The repair Schwann cell and its function in regenerating nerves. Journal of Physiology. 594 (13), 3521-3531 (2016).
  22. Lopez-Fagundo, C., Bar-Kochba, E., Livi, L. L., Hoffman-Kim, D., Franck, C. Three-dimensional traction forces of Schwann cells on compliant substrates. Journal of The Royal Society Interface. 11, 20140247 (2014).
  23. Gu, Y., et al. The influence of substrate stiffness on the behavior and functions of Schwann cells in culture. Biomaterials. 33, 6672-6681 (2012).
  24. Xu, Z. Y., Orkwis, J. A., DeVine, B. M., Harris, G. M. Extracellular matrix cues modulate Schwann cell morphology, proliferation, and protein expression. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. , (2019).
  25. Urbanski, M. M., et al. Myelinating glia differentiation is regulated by extracellular matrix elasticity. Scientific Reports. 6, 1-12 (2016).
  26. Sun, Y., et al. Tunable stiffness of graphene oxide/polyacrylamide composite scaffolds regulates cytoskeleton assembly. Chemical Sciences. 9 (31), 6516-6522 (2018).
  27. Hwang, J. H., et al. Extracellular matrix stiffness regulates osteogenic differentiation through MAPK activation. PLoS One. 10, 1-16 (2015).
  28. Ryan, A. J., et al. A Physicochemically Optimized and Neuroconductive Biphasic Nerve Guidance Conduit for Peripheral Nerve Repair. Advanced Healthcare Materials. 6, 1-13 (2017).
  29. Du, J., et al. Prompt peripheral nerve regeneration induced by a hierarchically aligned fibrin nanofiber hydrogel. Acta Biomaterialia. 55, 296-309 (2017).
  30. Huang, L., et al. A compound scaffold with uniform longitudinally oriented guidance cues and a porous sheath promotes peripheral nerve regeneration in vivo. Acta Biomaterialia. 68, 223-236 (2018).
  31. Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices. Jouranl of Visualized Experiments. (119), e55276 (2017).
  32. Gupta, R., et al. Shear stress alters the expression of myelin-associated glycoprotein (MAG) and myelin basic protein (MBP) in Schwann cells. Journal of Orthopaedic Research : Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 23, 1232-1239 (2005).
  33. Harris, G. M., Shazly, T., Jabbarzadeh, E. Deciphering the combinatorial roles of geometric, mechanical, and adhesion cues in regulation of cell spreading. PLoS One. 8 (11), (2013).
  34. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  35. Schreck, I., et al. C-Jun localizes to the nucleus independent of its phosphorylation by and interaction with JNK and vice versa promotes nuclear accumulation of JNK. Biochemical and Biophysical Research Communications. 407, 735-740 (2011).
  36. Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact printing of proteins for cell biology. Journal Visualized Experiments. (22), e1065 (2008).
  37. Treter, J., et al. Washing-resistant surfactant coated surface is able to inhibit pathogenic bacteria adhesion. Applied Surface Science. 303, 147-154 (2014).
  38. Lutz, J. F. Polymerization of oligo(ethylene glycol) (meth)acrylates: Toward new generations of smart biocompatible materials. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 46 (11), 3459-3470 (2008).
  39. Marcus, M., et al. Interactions of Neurons with Physical Environments. Advanced Healthcare Materials. 6, (2017).
  40. Pu, J. Golgi polarization in a strong electric field. Journal of Cell Science. 118, 1117-1128 (2005).
  41. Blaker, J. J., et al. Bioactive Silk-Based Nerve Guidance Conduits for Augmenting Peripheral Nerve Repair. Advanced Healthcare Materials. 7, 1800308 (2018).
  42. Daly, W., Yao, L., Zeugolis, D., Windebank, A., Pandit, A. A biomaterials approach to peripheral nerve regeneration : bridging the peripheral nerve gap and enhancing functional recovery. Journal of the Royal Society of Interface. 9 (67), 202-221 (2012).
  43. Xia, H., et al. Directed neurite growth of rat dorsal root ganglion neurons and increased colocalization with Schwann cells on aligned poly(methyl methacrylate) electrospun nanofibers. Brain Research. 1565, 18-27 (2014).
  44. Wang, H. B., Mullins, M. E., Cregg, J. M., McCarthy, C. W., Gilbert, R. J. Varying the diameter of aligned electrospun fibers alters neurite outgrowth and Schwann cell migration. Acta Biomaterialia. 6, 2970-2978 (2010).
  45. Carvalho, C. R., Oliveira, J. M., Reis, R. L. Modern Trends for Peripheral Nerve Repair and Regeneration: Beyond the Hollow Nerve Guidance Conduit. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 337 (2019).
  46. Yang, Y., Wang, K., Gu, X., Leong, K. W. Biophysical Regulation of Cell Behavior - Cross Talk between Substrate Stiffness and Nanotopography. Engineering. 3, 36-54 (2017).
  47. Tan, J. L., Liu, W., Nelson, C. M., Raghavan, S., Chen, C. S. Simple Approach to Micropattern Cells on Common Culture Substrates by Tuning Substrate Wettability. Tissue Engineering. 10, 865-872 (2004).
  48. Grove, M., et al. YAP/TAZ initiate and maintain schwann cell myelination. Elife. 6, 1-27 (2017).
  49. Poitelon, Y., et al. YAP and TAZ control peripheral myelination and the expression of laminin receptors in Schwann cells. Nature Neuroscience. 19, 879-887 (2016).

Tags

Denna månad i JoVE Schwann celler perifer nerv matris stelhet extracellulär matris mikromönster cell fenotyp plasticitet cellform
Beredning av Tunable Extracellular Matrix Microenvironments att utvärdera Schwann Cell Fenotyp Specifikation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xu, Z., Orkwis, J. A., Harris, G. M. … More

Xu, Z., Orkwis, J. A., Harris, G. M. Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification. J. Vis. Exp. (160), e61496, doi:10.3791/61496 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter