Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Forberedelse af tunable ekstracellulære Matrix mikromiljøer til at evaluere Schwann Cell Fænotype Specifikation

Published: June 2, 2020 doi: 10.3791/61496
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3
1Department of Chemical and Environmental Engineering, University of Cincinnati, 2Department of Biomedical Engineering, University of Cincinnati, 3Neuroscience Graduate Program, University of Cincinnati College of Medicine

Summary

Denne metode har til formål at illustrere de mekanismer, som ekstracellulære matrix signaler såsom substrat stivhed, protein sammensætning og celle morfologi regulere Schwann celle (SC) fænotype.

Abstract

Traumatisk perifert nervesystem (PNS) skader i øjeblikket mangler egnede behandlinger for at genvinde fuld funktionel opsving. Schwann celler (SCs), som de vigtigste gliaceller i PNS, spiller en afgørende rolle i at fremme PNS regenerering ved at dedifferentiating i en regenerativ celle fænotype efter skade. Den dedfferentierede tilstand af SC'er er imidlertid en udfordring at opretholde gennem den periode, der er nødvendig for regenerering, og påvirkes af ændringer i den omgivende ekstracellulære matrix (ECM). Det er derfor vigtigt at fastlægge det komplekse samspil mellem de økonomiske og sociale råd og forskellige ECM'er for at give tegn på, at de er et regenerativt potentiale i de største sikringsselskaber. For at løse dette problem blev der skabt en strategi, hvor forskellige ECM-proteiner blev adsorberet på et afstemmeligt polydimethylsiloxan (PDMS) substrat, som gav en platform, hvor stivhed og proteinsammensætning kan moduleres. SCs blev seedet på tunable substrater og kritiske cellulære funktioner, der repræsenterer dynamikken i SC fænotype blev målt. For at illustrere samspillet mellem SC protein udtryk og cellulære morfologi, forskellige såning tætheder af SCs ud over de enkelte mikrokontakt trykte cellulære mønstre blev udnyttet og karakteriseret ved immunfluorescens farvning og vestlige blot. Resultaterne viste, at celler med et mindre spredningsområde og en højere grad af cellulær forlængelse fremmede højere niveauer af SC-regenerative fænotypiske markører. Denne metode begynder ikke blot at optrævle det betydelige forhold mellem ECM og den cellulære funktion af SCs, men giver også retningslinjer for den fremtidige optimering af biomaterialer i perifernervereparation.

Introduction

Skader i det perifere nervesystem (PNS) er fortsat en stor klinisk udfordring i sundhedssektoren ved at bringe patienternes livskvalitet i livs og skabe en betydelig indvirkning gennem en lang rækkesocioøkonomiske faktorer 1,2. Schwann celler (SC), som de vigtigste gliaceller i PNS, giver de nødvendige molekylære og fysiske signaler til at fremkalde PNS regenerering og støtte i funktionelle inddrivelser i korte hul skader. Dette skyldes den bemærkelsesværdige evne til SCs at dedifferentiate i en "reparation" celle fænotype fra en myelinating eller Remak fænotype3. Reparationen SC er en karakteristisk celle fænotype på flere måder. Efter skade øger SCs deres spredningshastighed ved at genindtræde i cellecyklussen og begynde at udtrykke flere transskriptionelle faktorer for at lette reinnervation. Disse faktorer, såsom c-Jun og p75 NTR, er upregulated mens myelinating SC markører, såsom myelin grundlæggende protein (MBP), er downregulated4,5. Desuden ændrer SCs morfologi til at blive aflange og tilpasset hinanden til at danne Büngner bands på tværs af skade site6. Dette giver en fysisk vejledningsmekanisme for axoner, der kan nå det korrekte distale mål7. Men på trods af den evne, som SCs besidder til at fremme nerve regenerering i korte hul skader, resultatet af funktionelle opsving er fortsat dårlig i alvorlige skader. Dette skyldes til dels et tab af ekstracellulære matrix (ECM) vejledning stikord, samt den manglende evne til SCs at opretholde den regenerative fænotype over lange perioder8.

Nerve regenerering og nyttiggørelse proces er tæt forbundet med tilstanden af basal lamina efter skade. Den basal lamina er et lag af ECM omkring nerven, der letter vejledning og giver ECM-bundet signaler for axoner og SCS i tilfælde, hvor det forbliver intakt efter skade9. ECM's tilstand og dens evne til at levere matrixbundne signaler til celler er af afgørende betydning og er tidligere blevet undersøgt i en række forskellige sammenhænge10,11,12,13,14. F.eks. har det vist sig , at ECM's stivhed kan styre cellefunktioner som spredning og differentiering11,15,16. EcM's sammensætning kan også føre til en særskilt cellulær respons og regulere celleadfærd såsom migration og differentiering gennem intracellulære signalveje17,18. Desuden spiller cellemorfologi, herunder spredningsområde og cellulær forlængelse, en vigtig rolle i reguleringen af funktionen og kan styres af ECM-bundne signaler19,20. Mange tidligere undersøgelser har fokuseret på stamceller differentiere i definerede slægter, men SCs besidder en lignende evne til at ændre fænotype fra en homeostatisk, voksen SC inden for en sund nerve, til en reparation SC stand til at udskille proteiner og vækstfaktorer, mens remodeling ECM efter nerveskade5,21. Derfor er det især afgørende at identificere mekanismer, der ligger til grund for forholdet mellem den medfødte SC-regenerative kapacitet og ECM-bundne signaler for indsigten i i sidste ende at udnytte denne kapacitet til nerveregenerering.

For at løse dette problem har vi udviklet en detaljeret metode til at producere et cellekultursubstrat, hvor mekanisk stivhed og ligandtype let kan indstilles i fysiologisk relevante intervaller. Polydimethyl siloxane (PDMS) blev valgt som substrat på grund af dets meget afstemmelige mekanik sammenlignet med polyacrylamidge, hvor den maksimale Youngs modulus er omkring 12 kPa i modsætning til PDMS på omkring 1000 kPa22,23,24. Dette er til gavn for det arbejde ved hånden, som de seneste undersøgelser har vist Young's modulus af en kanin iskiasnerven kan overstige 50 kPa under udvikling, hvilket tyder på, at rækken af stivhed af nerver i PNS er bredere end tidligere undersøgt. Forskellige proteiner er i stand til adsorption på PDMS substrater til at analysere kombinatoriske regulering af mekanik og ligander på SC adfærd. Dette gør det muligt at undersøge flere mikromiljøsignaler i PNS-regenereringsprocessen og sammenligne en høj grad af tunabilitet i forhold til det arbejde, der udelukkende fokuserer på substratetsstivhed 25. Endvidere er disse konstruerede cellekultursubstrater kompatible med en lang række kvantitative analysemetoder såsom immunhistokemi, western blot og kvantitativ polymerasekædereaktion (q-PCR).

Denne udviklede cellekulturplatform er særdeles velegnet til at analysere mekanistiske veje på grund af det høje niveau af individuel tunabilitet af hvert ECM-bundet signal. Desuden kan populære metoder til celle mikropatterning, herunder microcontact udskrivning, opnås på substraterne for at give mulighed for kontrolleret cellulære vedhæftning til at analysere celleform i forhold til andre ECM bundet signaler24. Dette er kritisk, fordi linjemønstrede substrater, som fremmer forlængelse i cellepopulationer, giver et værktøj til at efterligne og studere aflange og regenerative SCs i Büngner bands under nerve regenerering. Endvidere, cellulære morfologi er en potent regulator af flere celle funktioner og kan potentielt indføre confounding eksperimentelleresultater,hvis ikkekontrolleret 26,27. Der lægges nu stor vægt på de mekanismer , der styrer VK-fenæntypen , som er reguleret af ECM-stikord28,29,30. Dette er vigtigt at give indsigt i udformningen af biomaterialer, der kan anvendes som nerve vejledning ledninger til støtte i PNS nerve regenerering. Disse detaljerede protokoller kan i sidste ende anvendes som et potentielt redskab til at dechifrere mekanismerne i SC og andre celletype funktion som reguleret af ECM bundet stikord.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Tunable cellekultur substrat forberedelse og karakterisering

  1. Forberedelse af substrat
    1. PDMS-basiselastomer- og hærdningsmidlerne blandes kraftigt ved hjælp af en pipettespids i et forhold mellem 10:1 og 60:1, indtil boblerne er homogent spredt i blandingen. Fjern bobler ved hjælp af vakuumtørring, indtil boblerne spredes.
      BEMÆRK: Under PDMS polymerisering, hærdning agent crosslinks med basen elastomer til at give endelige polymer ønskede mekaniske egenskaber. Crosslink-forhold kan justeres for at ændre PDMS stivhed.
    2. En dråbe (~0,2 ml) af udtørret PDMS-blanding på en kvadratisk eller cirkulær dækslæk (f.eks. 22 mm x 22 mm) og drej dækslerne på en spincoater ved 2500 omdrejninger i 30 s.
    3. Dækslen inkuberes i enten en ovn ved 60 °C i 1-2 timer eller rumtemperatur natten over, for at PDMS kan størkne.
    4. Behandl coverslipsen ved hjælp af UV-ozonrenser i 7 min (UV-bølgelængde: 185 nm og 254 nm) for at øge overfladehydroficiteten. Placer det i en steriliseret 6-brønds plade.
    5. Før du bruger til cellekultur, inkuberer substrater i 70% ethanol i mindst 30 min.
      FORSIGTIG: UV-Ozon renere kan generere ozon, der er skadeligt for mennesker. Arbejde i en kemisk røghætte eller med en form for ventilation.
    6. Oversænk overslagslip i proteinopløsningen (10 μg/ml kollagen I, fibronectin eller laminin) i 60 min i en steril inkubator ved 37 °C.
      BEMÆRK: Efter behandling med UV-ozon kan PDMS-overfladen stadig være hydrofobisk. Drej brøndpladen for at sikre, at hver overtræksklip er dækket med proteinopløsningen.
    7. Proteinopløsningen aspirerer og vaskes med fosfatbufferet saltvand (PBS) 3x.
    8. Ophæng RT4-D6P2T Schwann-cellelinjen (SCs) fra passagingskålen ved hjælp af kommercielt tilgængelig EDTA-opløsning (1x) med 2,5 % trypsin og tæl celler med hæmocytometer. Seed-SCs på den afstemmelige PDMS-overflade ved den ønskede celletæthed. SC-seedningstætheden kan variere for hver enkelt anvendelse.
    9. Cellerne skal holdes i de ønskede cellekulturparametre (90 % fugtighed, 5 % CO2,37 °C osv.) i forsøgets længde. Brug Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt kvæg serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin som cellekultur medium.
  2. Mikromønstret substratforberedelse
    1. Tegn den ønskede geometri og celleklæbende områder (900 μm2, 1.600μm 2 og 2.500 μm2)ved hjælp af cad-software (computer-aided design). Opret en krom fotomaske baseret på disse mønstre fra en kommerciel leverandør.
    2. I et rent rum eller støvfrit miljø skal du bruge standardfotolitografiteknikker til at fremstille siliciumwafere (protokollerne er beskrevet andetsteds31). Kritiske parametre for denne særlige anvendelse er som følger: Photoresist: SU-8 2010; Spin profil til at sprede fotoresist: 500 rpm for 10 s med en acceleration på 100 rpm / s, derefter 3500 rpm for 30 s med en acceleration på 300 rpm / s; Eksponeringsenergi af UV-lys: 130 mJ/cm2.
      BEMÆRK: Mønstrehøjden på siliciumwafers er ca. 10 μm efter disse parametre. Potentielle revner omkring kanten uden for de rektangulære eller trekantede mønstre kan ses ved hjælp af et let mikroskop efter trin 1.2.2. Bagning af silicium wafer ved 190 °C i 30 min hjælper med at fjerne revner.
    3. Den mønstrede siliciumwafer placeres i en cirkulær diameter på 150 mm x 15 mm lang petriskål, og de-gasset PDMS (blandingsforhold 10:1) som fremstillet i trin 1.1.1 på siliciumwaferen.
      BEMÆRK: Sørg for, at tykkelsen af PDMS er mindst 5 mm for at gøre det nemmere at håndtere under udskrivningstrin til mikrokontakter.
    4. Størkne PDMS på silicium wafer i en ovn ved 60 °C natten over. Lad PDMS køle af til stuetemperatur. Præcist afskårne stempler på 30 mm x 30 mm kvadrater, der indeholder de korrekte mønstre fra siliciumwaferen ved hjælp af en kirurgisk skalpel. Siliciumwaferen må ikke beskadiges.
      BEMÆRK: Siliciumwafere kan genbruges mange gange på dette tidspunkt for at producere flere frimærker efter rengøring med isopropanol.
    5. Steriliser PDMS frimærker og de afstemmelige overslagslips (udarbejdet i trin 1.1.1 til 1.1.3) ved nedsænkning dem i 70% ethanol i 30 min.
    6. For at bekræfte effekten af mikromønstret ved pdms-stempler efter mikrokontaktudskrivning skal overfladen af PDMS-frimærker tørres ved hjælp af en filtreret luftstrøm og pipette 50 μg/ml BSA (Texas Red konjugeret) opløsning til at dække hele den mønstrede side af PDMS-stemplet.
    7. Inkubere PDMS frimærker med BSA-opløsning i 1 time ved stuetemperatur for at give mulighed for protein adsorption.
    8. Tør overfladen af aflastningslips, der kan afstemmes, ved hjælp af en filtreret luftstrøm, og øg overfladehydricialiteten som beskrevet i trin 1.1.5.
    9. Lufttørrer PDMS-stemplerne for at fjerne den resterende BSA-opløsning.
      BEMÆRK: Pas på, at BSA-opløsningen er helt fjernet fra stemplet, da eventuelle resterende opløsninger vil få stempelmærker til at glide på dækslet under mikrokontaktudskrivning.
    10. Den mønstrede side af stemplet bringes i overensstemmelse med den afstemmelige overtrækslip for BSA adsorption på dækslet. Tryk forsigtigt stemplet mod overslagslippen i 5 min.
      BEMÆRK: Påfør ikke overdreven kraft på stemplet, da det vil bøje og forårsage ikke-specifik kontakt mellem stempel og overslagslip. Den passende mængde kraft, der anvendes på stemplet, er afgørende for en vellykket mikrokontakttryk.
    11. Micropatternet undersøges ved hjælp af fluorescensmikroskop med et FITC-filter (Fluorescein isothiocyanat).
    12. Hvis du vil udskrive celleklæbende områder i stedet for fluorescerende mønstre, skal du erstatte laminin med BSA-protein og gentage trin 1.2.5 til 1.2.10.
    13. Fjern frimærker fra overslagslip, overføre overslagslips i en steriliseret 6-brønds plade. Der tilsættes 2 ml 0,2% w/v Pluronic F-127 opløsning i hver brønd for at dække overfladen af coverslip og inkubere i 1 time ved stuetemperatur.
      BEMÆRK: Pluronic F-127 kan adsorberes til PDMS overflade øge hydrofobitet af PDMS overflade til at blokere celler fra vedhæftning.
    14. Opsug Pluronic F-127 opløsning og vask 5x med PBS og 1x med cellekulturmediet før såningsceller. En typisk såningstæthed for SCs er 1.000 celler/cm2.
    15. 45 min efter cellesåning skal du fjerne cellekulturmediet og vaske dækslips med PBS 2x for at forhindre flere SCS i at overholde det samme mønster. Vedligehold celler i ønsket cellekulturmiljø i 48 timer før kvantificering.
    16. Hvis du vil oprette linjemønstrede cellekultursubstrater for at undersøge justerede celler, skal du følge trin 1.2.1 til 1.2.4 for at oprette frimærker til mikrokontaktudskrivning.
      BEMÆRK: Rillen/højderyggen for de forede mønstre på frimærket er 50 μm x 50 μm for de skitserede celler. Stemplets samlede mål er 10 mm x 10 mm.
    17. Skær stempler i dimensioner, der kun indeholder ønskede linjemønstre.
      BEMÆRK: Når der oprettes frimærker i CAD, svarer det umønstrede område af stemplet omkring linjemønstrene til celleklæbende område efter mikrokontaktudskrivning. Derfor er det nødvendigt at fjerne umønstrede områder, når du skærer stemplet ud for at sikre, at alle SC seedet på overfladen følger mønstrene.
    18. Følg trin 1.1.1 til 1.1.3 for at forberede afstemmelig PDMS overfladebehandling to petriskåle.
      BEMÆRK: Dette vil være PDMS, der dækker selve petriskålens overflade og ikke på en overtræksseddel.
    19. Følg trin 1.2.5 til 1.2.10 for at udføre mikrokontaktudskrivning for at udskrive linjemønstrede celleklæbende områder på en af de PDMS-belagte petriskåle.
      BEMÆRK: Arealet på en 60 mm x 15 mm petriskål kan indeholde linjemønstrede områder fra 6 PDMS-frimærker.
    20. Afskredler og påfyld petriskålen med 4 ml 0,2% w/v Pluronic F-127 opløsning og inkuber i 1 time.
    21. Efter mikrokontakt trykning, skyl hver side af PDMS frimærker med 70% ethanol 3x og tør med luft. Roter PDMS-stempler, og følg trin 1.2.5 til 1.2.10 for at udskrive det ikke-mønstrede celleklæbende område ved hjælp af den ikke-mønstrede side af stemplet på den anden petriskål. Gentag trin 1.2.13.
    22. Aspirate F-127 opløsning fra fade, vask 3x med PBS efterfulgt med 1x vask ved hjælp af frisk celle kultur medium. Seed SCs på retter.
      BEMÆRK: Såningstætheden for en linjemønstret skål er 5.000 celler/cm2, og for en unpatterned skål er 10.000 celler/cm2.
    23. Vedligehold SCs ved de ønskede betingelser i 48 timer, og følg protokollerne for at forberede SC-lysater32.
      BEMÆRK: Cellesåningstætheden for ikke-mønstrede retter er 2x højere end for linjemønstrede retter, da den linjemønstrede skål kun har halvdelen af celleklæbende område af den ikke-mønstrede skål.
      1. For at klargøre lysater overføres tilstrækkelig radioimmunopræcipationsanalyse (RIPA) buffer til et 10 ml konisk centrifugerør. Protease- og fosfatasehæmmer (100x) fortyndes i et forhold på 1:100 i RIPA-buffer, blandes godt ved pipettering.
      2. Cellerne vaskes med iskold PBS (1x) i 2 min. og tilsættes 80 μL af opløsningen fremstillet fra trin 1.2.23.1 på hvert celleklæbende område (det område, der blev kontaktet med PDMS-stempler og adsorberet protein) i petriskåle. Cellerne inkuberes med opløsningen på en isblok i 15 min.
        BEMÆRK: Opløsningen vil kun blive på celleklæbende område på grund af den hydrofobitet pluronic F-127 adsorption andetsteds. Denne funktion muliggør en vellykket og tilstrækkelig proteinekstraktion til linjemønstrede SCs.
      3. Skrab SCS med en celle skraber i 5 min. Opsaml lysate i en mærket 1,5 ml mikrocentrifuge rør.
      4. Mikrocentrifugelyat ved 12,000 x g i 15 min ved 4°C. Supernatanten opsamles med en 1.000 μL pipette, og overfør den til et rent mikrocentrifugerør. Celllysatet opbevares ved -20 °C.
  3. Karakterisering af substrat
    BEMÆRK: For at karakterisere polymerens mekanik på overtrækslippen anvendes der generelt flere metoder, herunder bulkkompressionstest11,,33 eller atomkraftmikroskopitest34. Denne protokol beskriver massekomprimeringstest.
    1. DÆms PDMS-forløberen for det ønskede blandingsforhold (trin 1.1) i en 30 mm petriskål, sørg for, at tykkelsen af PDMS-laget i petriskålen er mindst 20 mm.
    2. Petriskålen fjernes med størknet PDMS fra 60 °C ovnen efter 1 time, og den afkøles ved stuetemperatur. Skær polymeren i 10 mm x 10 mm firkanter. Mål tykkelsen af PDMS ved hjælp af calipre.
    3. Placer PDMS på scenen af kompressionskraftmålemaskinen. Tilslut kompressionskraftsensor (model: 112C) til sensorporten, og fastgør sensoren til testmaskinens akse.
    4. Juster sensorens højde til ca. 0,5 cm over PDMS-stemplet ved hjælp af "jog"-styring på instrumentets frontpanel.
    5. Åbn den tilknyttede software ved hjælp af vinduet "Testinstallation " , vælg "Servoprofil", og åbn vinduet "Segment". I vinduet "Segment" ønskede input "Kontrolhastighed" og "Slutbeløb" for testen.
      BEMÆRK: Kontrolhastigheden bestemmer hastigheden, hvormed sensoren bevæger sig ned mod PDMS. Slutbeløbet bestemmer den samlede afstand, som sensoren bevæger sig.
    6. Brug knappen "Z" på softwarens kontrolpanel til at nulstille alle målinger på dette tidspunkt.
    7. Flyt sensoren ned for at kontakte PDMS let, indtil 1-2 newton (N) er indlæst. Indlæsningen og den afstand, som sensoren bevæger sig, vises i softwaren.
    8. Efter at have udnyttet "Z"-knappen, kør målingen ved hjælp af "Afspil", og gem filoptagelseskraften og -afstanden.
    9. Trin 1.3.3 til 1.3.8 gentages for hver eksperimentel tilstand af PDMS.
    10. Åbn filen, og brug følgende formel til at beregne Youngs modulus (E) pdms for hvert forhold. (F = kompressionskraft, A = område af PDMS-stempel, ∆L = rejseafstand af sensor, og L0 = den oprindelige tykkelse af PDMS-stemplet).
      Equation 1

2. Kvantificering af cellulære egenskaber på afstemmelige substrater

  1. Analyse af spredning
    1. Seed SCs på substrater fremstillet fra trin 1.1.9 med en masse på 5.000 celler/ cm2 i en 6-brønds plade. Lad SCs inkubere i 48 timer i standardcellekulturforhold (37 °C og 5% CO2).
    2. 12 μL af 10 mM Bromodeoxyuridin (BrdU) stamopløsning fortyndes til 12 ml 37 °C cellekulturmedium, blandes godt med pipetten for at gøre 10 μM BrdU-mærkningsopløsning.
    3. Fjern cellekulturmediet, og vask SCs 2x med PBS.
    4. Der tilsættes 2 ml BrdU-mærkningsopløsning i hver brønd, og SCS inkuberes i 2 timer.
      BEMÆRK: Inkubationstiden for BrdU-mærkningsopløsningen afhænger af den specifikke cellepredningshastighed. RT4-D6P2T SC-linjen har en høj spredningshastighed, så der blev anvendt 2 timer inkubationstid.
    5. Fjern BrdU-mærkningsopløsningen, og vask SCs 3x med PBS. Der tilsættes 1 ml 3,7% formaldehyd i PBS til hver brønd og inkuber ved stuetemperatur i 15 minutter til cellefiksering.
      FORSIGTIG: Formaldehyd er kræftfremkaldende for mennesker; Udfør derfor alt arbejde inde i en kemisk røghætte med passende beskyttelse.
      BEMÆRK: Ved vask med PBS er der ingen cellekulturmedie i brønden, og dermed kan PDMS-overfladen være hydrofobisk. Tag forholdsregler for ikke helt at tørre overfladen af substratet for at forhindre celleskader.
    6. Indsug formaldehydopløsning og vask 3x med PBS (3 min hver). Fjern PBS og tilsæt 1 ml 0,2% Triton X-100 i PBS til hver brønd for at gennemtrænge cellemembranen. Inkuberics med Triton X-100 løsning i 20 min ved stuetemperatur.
    7. Fjern Triton X-100 opløsning og vask SCs 3x med PBS (3 min hver).
    8. Tilsæt 1 ml 1 N HCl i hver brønd og inkuber på is i 10 min. Fjern 1 N HCl og tilsæt 1 ml 2 N HCl i hver brønd og inkuber ved stuetemperatur i 10 min. HCl-behandling er til DNA-hydrolyse.
    9. 182 ml 0,2 mM Na2HPO4 og 18 ml 0,1 mM citronsyre blandes for at producere en fosfat/citronsyrebuffer til antigenudtagning. Fjern 2 N HCl og tilsæt 1 ml fosfat/citronsyre buffer i hver brønd og inkuber ved stuetemperatur i 10 min.
    10. Vask SCs 3x med 0,2% Triton X-100 i PBS. Der tilsættes 2 ml 3% bovin serumalbumin (BSA) i PBS i hver brønd og inkuberes i 30 min ved stuetemperatur til ur ikke-specifik binding af antistoffet.
    11. Fortyndet BrdU primære antistof konjugeret med Alexa Fluor 488 i 3% BSA opløsning i et forhold på 1:300 for BrdU farvning opløsning. Inkuberes SCs med farvning løsning natten over ved stuetemperatur, mens pladen er dækket af aluminiumsfolie.
    12. At kvantificere spredning, billede SCs ved hjælp af FITC og DAPI kanal af en fluorescerende mikroskop til at opdage BrdU og kerner, henholdsvis. Gem billeder som "nd.2" filer.
    13. Åbn "nd.2"-filer for hvert billede, der er taget på identiske rumlige positioner.
    14. Åbn billedanalysesoftwaren. Højreklik på baggrunden for at åbne vinduet "Automatiserede måleresultater" og "Automatiseretmåling " i afsnittet "Analysekontrol".
    15. Vælg " Count " i menuen "Tæl &Taksonomi". På FITC-billedet skal du klikke på hver kerne, der viser grøn fluorescens (BrdU positiv), og højreklikke på billedet.
      BEMÆRK: Antallet af BrdU-positive celler vises i vinduet med "Automatiseringer og målinger".
    16. For DAPI-billeder skal du gentage trin 2.1.14 for at tælle antallet af samlede kerner. Beregn procentdelen af BrdU-positive celler for dette billede.
    17. Trin 2.1.13 til 2.1.16 gentages for andre billeder til statistiske formål, og den gennemsnitlige procentdel af BrdU-positive celler beregnes for hver substrattilstand.
  2. Kvantificering af c-jun-udtryk gennem immunofluorescent billedanalyse
    1. Celler, der er fremstillet i 6-brøndsplader fra trin 1.1.9 og 1.2.23, er faste og gennemtrængede med de procedurer, der tidligere er beskrevet (trin 2.1.5-2.1.7).
      BEMÆRK: For at udføre nøjagtige sammenligninger af fluorescerende intensitet på tværs af celler med forskellige ECM-betingelser skal du anvende kameraindstillingerne ens på tværs af alle prøver, hvor alle prøver har de samme parametre.
    2. Gem billeder som ".nd2" filer.
    3. Åbn billedanalysesoftwaren. Højreklik på baggrunden for at åbne vinduet "Automatiserede måleresultater" og "Automatiseretmåling " i afsnittet "Analysekontrol".
    4. Vælg "Objektdata"i "Automatiserede måleresultater". Aktivér knappen" Fortsæt opdateringsmålingen".
    5. I toppen af softwaren skal du vælge "Mål" efterfulgt af "Objektfunktioner". Føj "Mean Intensity" til afsnittet " Valgttil måling".
    6. Åbn og flet to ".nd2" billedfiler, der indeholder billeder af c-jun og kerner.
    7. Vælg " ROI " i toppanelet,og vælg "Tegn rektangulær roi". Tegn et rektangulært område, der indeholder det nukleare område af en enkelt celle.
      BEMÆRK: c-jun-udtrykket er koncentreret i kerner35.
    8. I øverste panel af software, vælg "Binary" og "DefinerTærskel ", et nyt vindue vises for præcist at definere c-jun fluorescerende område.
    9. I det nye vindue skal du klikke på "Full Image/Use ROI" for at skifte program fra fuld billedmodel til ROI-modellen. Brug "Intensitet" til at justere opslagstabellen i venstre side af vinduet til justering af størrelse/form af det fremhævede område inden for det rektangulære investeringsafkast.
      BEMÆRK: Sørg for, at størrelsen/formen på det fremhævede område er identisk med kernen.
    10. Klik på knappen "OK" for at få den gennemsnitlige FITC-intensitet i vinduet "Automatiserede måleresultater" og klik derefter på "Store Data".
    11. I vinduet "Automatiseret måling "Slet objekt "forat fjerne det røde fremhævede område. Brug"Pegeværktøjet " i panelet til venstre for at vælge det rektangulære investeringsafkast og slette.
    12. Trin 2.2.6 til 2.2.11 gentages for at måle den gennemsnitlige FITC-intensitet for hver ekstra celle.
    13. I vinduesområdet "Automatiserede måleresultater" skal du vælge "Lagret", hvor alle lagrede data vil blive præsenteret. Brug funktionen "Eksportér" og vælg "Data til Excel" for at gemme det eksporterede regneark og udføre yderligere beregninger.
  3. Kvantificering af nuklear forlængelse
    1. Fix og permeabilize SCs udarbejdet fra trin 1.2.22 følgende trin 2.1.5-2.1.7. Udfør nuklear farvning ved hjælp af monteringsmedium med DAPI.
    2. Brug af DAPI kanal og en 40x objektiv, erhverve billeder af prøven og gemme som ".nd2" filer.
    3. Følg trin 2.2.3 og 2.2.4 for at åbne vinduet "Automatiserede måleresultater" og "Automatiseret måling" i billedanalysesoftwaren.
    4. I "Automatiserede måleresultater" skal du bruge funktionen "Option" efterfulgt af "Vælg objektfunktion". Ikolonnen " Funktion" skal duvælge " Forlængelse" og føje tilkolonnen " Valgt til målinger". Brug "Fortsæt opdateringsmåling" til at aktivere denne funktion.
    5. Åbn den "nd.2"-billedfil, der indeholder de nukleare billeder. Vælg funktionen " Automatisk registrering"i vinduet "Automatiseretmåling ", og vælg en kerne. Højreklik på billedet og det målte nukleare højde-bredde-forhold vil blive vist i "Automatiserede måleresultater".
    6. Trin 2.3.5 gentages for at kvantificere de nukleare højde-bredde-forhold for andre kerner i billedet. Vælg "Gem data" i vinduet "Automatiske måleresultater".
    7. Gentag 2.3.5 til 2.3.6 for yderligere billeder. Eksporter dataene til en regnearksfil som tidligere udført i 2.2.13 til analyse.
  4. Western blot at kvantificere protein udtryk
    1. Følg standardprotokollerne for western blot-analyse, der er beskrevet andetsteds32. Fortyndingerne af de antistoffer, der anvendes i undersøgelsen, er vist nedenfor: Kanin anti c-Jun 1:2,000; Mus anti β-actin 1:1.000; Kanin anti p75NTR 1:1.000; Kanin anti myelin grundlæggende protein 1:1,000; Anti-mus/kanin IgG, HRP-forbundet antistof 1:10.000.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at analysere og kvantificere samspillet mellem substratstivhed og proteinsammensætning på SC-fænotype blev der udviklet et afstemmeligt PDMS-cellekultursubstrat (figur 1A). Kompressionstest af polymeren ved forskellig base: hærdende middelforhold blev anvendt til at kvantificere Youngs modulus (E) af substratet (Figur 1B). Det resulterende interval af modulværdier repræsenterer fysiologisk relevante substratbetingelser. Efter fremstilling af substrater blev SCs dyrket og cellulære egenskaber analyseret på det afstemmelige mikromiljø. Spredningsrater af SCs på substrater med forskellig proteinsammensætning blev først analyseret. Laminin-belagte substrater resulterede i en højere spredningshastighed sammenlignet med kollagen I og fibronectin adsorption alle ved 10 μg/ml (Figur 2A, B). SCs på substrater med laminin belægning og forskellige moduli viste, at relativt blødere substrater (E = 3.85kPa) mindske celle spredning satser på tværs af alle betingelser (Figur 2C, D). Forskellene mellem stive substrater (E=1119kPa) og relativt bløde substrater (E=8.67kPa) var imidlertid ubetydelige (figur 2D).

SCs blev også analyseret for protein udtryk gennem immunhistokemi og vestlige blot. Niveauer af transskriptionel faktor c-jun blev analyseret ved immunfluorescerende mikroskopi (Figur 3A) og repræsenteret ved den gennemsnitlige pixel fluorescerende intensitet (Figur 3B-D). c-Jun udtryk viste sig at være upregulated som substrater blev blødere (E = 1119 kPa til E = 8,67 kPa), men på de blødeste substrater (E = 3,85 kPa), c-jun udtryk blev betydeligt downregulated. På stive substrater (E = 1119 kPa), kollagen jeg belagt substrater resulterede i den højeste c-jun udtryk, men som substrater blev blødere (E = 8,67 kPa og 3,85 kPa), laminin viste de højeste niveauer af c-jun (Figur 3E). Western blot blev også brugt til at analysere både c-jun og myelin grundlæggende protein (MBP) med c-jun niveauer upregulated og MBP downregulated på blødere substrater (Figur 3F). Yderligere, SCs seedet på laminin belagte substrater resulterede i den højeste c-jun udtryk i forhold til kollagen I og fibronectin.

Celler med forskellige såningstætheder blev derefter dyrket og plettet med rhodamin-falloidin for at udforske den rolle, som cellespredning og område i c-jun udtryk (Figur 4A, B). For at kontrollere den nukleare forlængelse af celler blev en fælles mikropatterteknik (mikrokontakttryk36)anvendt til at skabe celleklæbende linjer på cellekultursubstraterne. Det nukleare højde-bredde-forhold mellem celler, der er seedet på et linjemønstret substrat, viste sig at være betydeligt højere end celler, der er seedet på ikke-mønstrede substrater (figur 4C, D). Det blev konstateret, at ekspression af både c-jun og en anden markør signifikant i SC regenerative fænotyper, p75 neurotrophin receptor (p75 NTR), blev upregulated i tætte celler med et mindre spredningsområde (Figur 4E). Line-mønstrede celler resulterede også i et højere udtryk for både c-jun og p75 NTR sammenlignet med ikke-mønstrede celler (Figur 4F). Derfor blev der skabt mikrokontakt med trykte celleklæbende geometrier for præcist at styre cellespredningsområdet og forlængelsen, samtidig med at cellecelleinteraktioner elimineres (Figur 5A). Dimensionerne af de samlede celleklæbende områder var 900μm 2,1.600 μm2og 2.500 μm2 med et højde-bredde-forhold på enten 1 eller 4 (cellelængde: cellebredde). Fluorescerende kvæg serum albumin (fBSA, Texas rød) farvning blev brugt til at afsløre status for mikromønstrer på cellekultur substrat efter microcontact udskrivning (Figur 5B). Det nukleare højde-bredde-forhold for SC'er for hvert celleområde blev målt, og det blev påvist, at ved at øge det nukleare højde-bredde-forhold stiger den cellulære forlængelse (figur 5C). I forbindelse med øget SC-højde-bredde-ratio blev c-Jun desuden opreguleret (figur 5D). Interessant, men det blev konstateret, at som celle spredning område stiger c-jun udtryk er downregulated (Figur 5E). Immunofluorescensfarvning for både kerner og actin bekræftet cellespredningsområde og forlængelse var stærkt kontrolleret ved hjælp af denne mikropattermetode (figur 5F).

Figure 1
Figur 1: Cellekultur substrater med tunable stivhed og protein sammensætning. (A) Skematisk viser udviklingen af PDMS cellekultur substrater. (B) Den oprindelige PDMS blanding forholdet mellem base: hærdning agent bestemmer Youngs modulus. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: SC-spredningsrater reguleret af substratstivhed og proteinsammensætning. (A) Repræsentative billeder, der viser BrdU farvning, når de dyrkes på substrater af samme modulus. (B) Histogram, der viser procentdelen af BrdU-positive celler for hver proteinbelægning. (C) Repræsentative billeder, der viser BrdU-inkorporering i SC'er, der er seedet på substrater af samme proteinbelægning. (D) Histogram, der viser procentdelen af BrdU-positive celler for hver unges modulværdi. Skalastænger = 50 μm. Data præsenteres som middel ± SEM. *p < .05, **p < .005, ***p < .0005. Dele af figuren er blevet ændret fra ref.24. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Substratstivhed og proteinreguleret SC-proteinekspression. (A) Repræsentative billeder viser c-Jun immunofluorescens farvning for SCs seedet på substrater af forskellig stivhed og protein sammensætning. Gennemsnitlig pixel fluorescerende intensitet af c-juni blev målt for SCs seedet på (B) kollagen I (C) fibronectin og (D) laminin belagt substrater af forskellig stivhed. (E) c-Jun fluorescens niveau af SCs grupperet af Young's modulus af substrat. (F) Western blot viser c-jun og myelin grundlæggende protein (MBP) af SCs seedet på substrater. Glyceraldehyd 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) blev anvendt som lastekontrol. Vægtbar = 50 μm. Data præsenteres som middel ± SEM. *p < .05, **p < .005, ***p < .0005. Dele af figuren er blevet ændret fra ref.24. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Cellulære spredning område påvirker protein udtryk for SCs. (A) Cellespredningsområde med forskellige såningstætheder blev visualiseret gennem rhodamin-falloidin (rød) og kerner farvning (blå). B)Histogram, der viser det gennemsnitlige spredningsområde for SC'er i hver tilstand. (C) Kerner af SCs seedet på unpatterned eller line-mønstrede substrater blev plettet med DAPI (blå) for at vise morfologi. D)Histogram, der viser kvantificering af det nukleare højde-bredde-forhold på mønstrede og ikke-mønstrede substrater. (E) Western blot viser udtryk for c-jun og p75NTR af celler med forskellige spredning område. (F) Western blot viser proteinekspression af SCs på unpatterned og line-mønstrede substrater. Vægtbar = 50 μm. Data præsenteres som middel ± SEM. *p < .05, **p < .005, ***p < .0005. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: SC morfologi og forlængelse virkning c-juni udtryk for SCs. (A) Skematisk, der viser cellemikropatterning for figurer med forskelligt højde-bredde-forhold. (B) fBSA farvning (rød) viser formen af mikromønstrer efter mikrokontakt trykning. Skalabar = 10 μm. (C) Histogram, der viser det nukleare højde-bredde-forhold for mikropatternerede SCs. (D, E) histogram, der viser den gennemsnitlige pixel fluorescerende intensitet af c-jun for hver af de geometriske forhold. (F) Rhodamine-falloidin (rød), kerner (blå) og c-Jun (grøn) blev farves på de forskellige mikromønstre. Skalabar = 10 μm. Data præsenteres som middel ± SEM. *p < .05, **p < .005, ***p < .0005. Dele af figuren er blevet ændret fra ref.24. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

SCs kan fremme nerve regenerering på grund af deres fænotypiske transformation og regenerativt potentiale efter nerveskade. Men, hvordan ECM signaler regulere denne regenerative kapacitet forbliver for det meste uklart, potentielt hindrer ikke kun udviklingen af biomaterialer, der har til formål at fremme nerve regenerering, men også forståelsen af de mekanismer, der er involveret i nerve regenerering. For at begynde at undersøge dette samspil, cellekultur substrater blev skabt, hvor ECM signaler såsom stivhed, protein belægning, og selvklæbende topografi kan kontrolleres. Evnen til at mikromønstre klæbende topografi er et centralt element i protokollen, ved hjælp af den fælles metode til microcontact udskrivning. Dette substrat er imidlertid forskelligt fra glasset, fordi den kompressionskraft, der påføres PDMS-stemplerne, skal være på et passende niveau for at opnå den ønskede form af celleklæbende områder på cellekultursubstrater. Ved hjælp af fluorescerende kvæg serum albumin (fBSA) som en model protein til at visualisere celle klæbende områder og justere kompression kræfter på PDMS frimærker kan i sidste ende afbøde dette problem. En anden vigtig forskel fra glas er fjernelsen af overskydende Pluronic F-127, der bruges til at gøre resten af substratet ikke-klæbende. Efter denne behandling er cellekultursubstrater meget hydrofobiske, hvilket gør det udfordrende at opretholde vådcellekultursubstrater i hele vaskene, hvilket er vigtigt for mikromønstretproteins strukturelle integritet 37. Derfor anbefales det at bruge flere pipetter til at aspirere og injicere opløsninger næsten samtidigt for at forhindre substrater i helt at dehydrere.

Selv om mikropatterning præcist kan styre celleformen og ikke kræver komplicerede syntetiske procedurer ved hjælp af celleblokerende polymerer såsom OEGMA, er de metoder, der anvendes til at kvantificere mikromønstrede cellers proteinekspression, undertidenbegrænsede 38. For eksempel er prøver, der er tilgængelige fra mikropatterning, generelt begrænset til nogle få hundrede celler pr. coverslip, hvilket er utilstrækkeligt til at forberede cellelysater, der skal bruges til western blots eller qPCR. I betragtning af dette, immunofluorescens farvning alene blev brugt til at kvantificere protein udtryk for mikromønstrede celler, begrænse de forskellige proteiner, der kan kvantificeres. For at løse dette, vi udnyttede linje mønstre til at fremme celle forlængelse for større cellepopulationer og med succes forberedt celle lysater, der blev analyseret af vestlige blot. Andre metoder såsom anvendte elektriske felter eller justerede elektrospunfibre kan også anvendes til at kontrollere forlængelsen af cellepopulationer39,40. Elektriske felter passer dog muligvis ikke ind i alle anvendelser for NGC'er, da ledningsevnen af almindeligt anvendte biomaterialer såsom kollagenbaseret polymer og silke er meget lav28,41,42. I modsætning hertil er justeret elektrospun nanofibers med succes blevet implanteret i NGCs at fremme SC tilpasning, forlængelse og migration samt neuriteudvækst 43,44. Det kan også vise sig overbevisende at sammenligne SC adfærd på linje-mønstrede substrater mod dem på substrater med justeret nanofibers, da foret mønstre og justeret nanofibers er to af de mest almindelige vejledning mekanismer indarbejdet i NGCs45.

Den detaljerede mikropatteringsprotokol anvender PDMS-belagte covers som cellekultursubstrater med en maksimal overflade Youngs modulus på 1119 kPa. En sådan stivhed efterligner mange væv, men det kan ikke være muligt at modellere osteogenese af mesenkymale stamceller, som generelt kræver overfladen Youngs modulus at overstige 1 Gpa46. For sådanne situationer, glas er en alternativ kandidat, men adsorption af Pluronic F-127 kræver relativt høj overflade hydrofobicitet, som glas ikke besidder. For at øge hydrofobiteten kan glas behandles med dimethyl dichlorosilane i dichlorobenzen. Efter dette, UV-Ozon behandling kan bruges til at øge hydrofilicitet for microcontact udskrivning47.

I sidste ende blev der udviklet en cellekulturplatform, hvor ECM stimuli kan indstilles individuelt med proteinekspression kvantificeret. Vi har fastslået, at SC regenerative kapacitet fremmes af visse mekaniske og kemiske ECM stikord, som efterfølgende kan give inspiration i den fremtidige udformning af biomateriale applikationer såsom NGC og celletransplantation processer, hvor ECM funktioner kan være nødvendigt atoptimeres 24. Ikke desto mindre kan det være en udfordrende opgave at justere disse ECM-signaler, især in vivo. Fremadrettet kan denne platform anvendes til at analysere nøglemekanismer, der er involveret i den fænotypiske overgang af SC'er som reguleret af ECM. Ved at opnå dette kan manipulation af intracellulære signaler være muligt at fremme SC-regenerativ kapacitet uden behov for dedikerede platforme in vitro48,49. Dette har potentiale til banebrydende arbejde i udviklingen af teknologier til nerve reparation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen potentiel interessekonflikt blev rapporteret af forfatterne.

Acknowledgments

Forfatterne taknemmeligt anerkende finansiering støtte fra University of Cincinnati. Forfatterne også takke Ron Flenniken fra University of Cincinnati Advanced Materials Karakterisering laboratorium for støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Albumin from Bovine Serum (BSA), Texas Red conjugate Thermo Fisher Scientific A23017 BSA staining to show micropatterns
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7076S Antibody used for western blot analysis
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074S Antibody used for western blot analysis
BrdU Thermo Fisher Scientific B23151 Reagent used to measure cell proliferation
BrdU primary antibody conjugated with Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific B35130 Used to visualize BrdU in cell proliferation assays
Collagen I Thermo Fisher Scientific A10483-01 Protein used to coat coverslips
Compression force test machine TestResources Instrument to quantify mechanical properties of polymers
Dulbecco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher Scientific 11965092 Cell culture medium
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 16000044 Cell culture medium supplemental
Fibronectin Thermo Fisher Scientific 33010-018 Protein used to coat coverslips
Fluorescence microscope Nikon Eclipse Ti2 Fluorescence microscope
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) Thermo Fisher Scientific 78440 Protease and Phosphatase Inhibitor
Laminin Thermo Fisher Scientific 23017015 Protein used to coat coverslips
Mounting medium with DAPI Thermo Fisher Scientific P36971 Coverslip mountant and nuclei staining
Mouse c-Jun primary antibody Thermo Fisher Scientific 711202 Primary antibody to visualize c-Jun protein
Mouse β-Actin primary antibody Cell Signaling Technology 3700S Loading control for western blot experiments
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 Cell culture medium supplemental
Photoresist SU 2010 KAYAKU SU8-2010 Photoresist
Pluronic F-127 Sigma Aldrich P-2443 Block non-specific protein binding
Rabbit c-Jun primary antibody Cell Signaling Technology 9165S Primary antibody for visualization of c-Jun protein
Rabbit myelin basic protein primary antibody Abcam ab40390 Primary antibody for visualization of MBP
Rabbit p75NTR primary antibody Cell Signaling Technology 8238S Primary antibody for visualization of p75NTR
Rhodamine phalloidin Thermo Fisher Scientific R415 Visualization of cell cytoskeleton
RIPA buffer Abcam ab156034 Cell lysis buffer
RT4-D6P2T Schwann cell line ATCC CRL-2768 Cell line used in experiments
SYLGARD 184 PDMS base and curing agent Sigma Aldrich 761036 Tunable polymer used to coat coverslips
Trypsin Thermo Fisher Scientific 15090-046 Cell dissociation reagent
UV-Ozone cleaner Novascan Increase hydrophicility of PDMS
Versene (1x) Thermo Fisher Scientific 15040066 Cell dissociation reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Taylor, C. A., Braza, D., Rice, J. B., Dillingham, T. The Incidence of Peripheral Nerve Injury in Extremity Trauma. American Journal of Physical Medicine & Rehabilitation. 87, 381-385 (2008).
  2. Noble, J., Munro, C. A., Prasad, V. S. S. V., Midha, R. Analysis of Upper and Lower Extremity Peripheral Nerve Injuries in a Population of Patients with Multiple Injuries. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 45, 116-122 (1998).
  3. Jessen, K. R., Mirsky, R. The repair Schwann cell and its function in regenerating nerves. Journal of Physiology. 594, 3521-3531 (2016).
  4. Arthur-Farraj, P. J., et al. c-Jun Reprograms Schwann Cells of Injured Nerves to Generate a Repair Cell Essential for Regeneration. Neuron. 75, 633-647 (2012).
  5. Jessen, K. R., Mirsky, R. The Success and Failure of the Schwann Cell Response to Nerve Injury. Frontiers in Cell Neurosciences. 13, 33 (2019).
  6. Gomez-Sanchez, J. A., et al. After Nerve Injury, Lineage Tracing Shows That Myelin and Remak Schwann Cells Elongate Extensively and Branch to Form Repair Schwann Cells, Which Shorten Radically on Remyelination. Journal of Neuroscience. 37 (37), 9086-9099 (2017).
  7. Deumens, R., et al. Repairing injured peripheral nerves: Bridging the gap. Progress in Neurobiology. 92, 245-276 (2010).
  8. Höke, A., Gordon, T., Zochodne, D. W., Sulaiman, O. A. R. A decline in glial cell-line-derived neurotrophic factor expression is associated with impaired regeneration after long-term Schwann cell denervation. Experimental Neurology. 173, 77-85 (2002).
  9. Jones, S., Eisenberg, H. M., Jia, X. Advances and future applications of augmented peripheral nerve regeneration. International Journal of Molecular Sciences. 17, 1-17 (2016).
  10. Harris, G. M., et al. Nerve Guidance by a Decellularized Fibroblast Extracellular Matrix. Matrix Biology. 60-61, 176-189 (2017).
  11. Harris, G. M., Piroli, M. E., Jabbarzadeh, E. Deconstructing the Effects of Matrix Elasticity and Geometry in Mesenchymal Stem Cell Lineage Commitment. Advanced Function Mater. 24 (16), 2396-2403 (2014).
  12. Pryzhkova, M. V., Harris, G. M., Ma, S., Jabbarzadeh, E. Patterning pluripotent stem cells at a single cell level. Journal of Biomaterials and Tissue Engineering. 3 (4), 461-471 (2013).
  13. Engler, A. J., Sweeney, H. L., Discher, D. E., Schwarzbauer, J. E. Extracellular matrix elasticity directs stem cell differentiation. Journal of Musculoskeleton and Neuronal Interaction. 7 (4), 335 (2007).
  14. Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
  15. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  16. Pickup, M. W., Mouw, J. K., Weaver, V. M. The extracellular matrix modulates the hallmarks of cancer. EMBO Reports. 15, 1243-1253 (2014).
  17. Chernousov, M. A., Carey, D. J. Schwann cell extracellular matrix molecules and their receptors. Histology and Histopathology. 15, 593-601 (2000).
  18. Shibata, S., et al. Selective Laminin-Directed Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Distinct Ocular Lineages. Cell Reports. 25 (6), 1668-1679 (2018).
  19. Mcbeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell Shape, Cytoskeletal tenstion and RhoA regulate stem cell lineage committment. Developmental Cell. 6, 483-495 (2004).
  20. Halder, G., Dupont, S., Piccolo, S. Transduction of mechanical and cytoskeletal cues by YAP and TAZ. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13, 591-600 (2012).
  21. Jessen, K. R., Mirsky, R. The repair Schwann cell and its function in regenerating nerves. Journal of Physiology. 594 (13), 3521-3531 (2016).
  22. Lopez-Fagundo, C., Bar-Kochba, E., Livi, L. L., Hoffman-Kim, D., Franck, C. Three-dimensional traction forces of Schwann cells on compliant substrates. Journal of The Royal Society Interface. 11, 20140247 (2014).
  23. Gu, Y., et al. The influence of substrate stiffness on the behavior and functions of Schwann cells in culture. Biomaterials. 33, 6672-6681 (2012).
  24. Xu, Z. Y., Orkwis, J. A., DeVine, B. M., Harris, G. M. Extracellular matrix cues modulate Schwann cell morphology, proliferation, and protein expression. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. , (2019).
  25. Urbanski, M. M., et al. Myelinating glia differentiation is regulated by extracellular matrix elasticity. Scientific Reports. 6, 1-12 (2016).
  26. Sun, Y., et al. Tunable stiffness of graphene oxide/polyacrylamide composite scaffolds regulates cytoskeleton assembly. Chemical Sciences. 9 (31), 6516-6522 (2018).
  27. Hwang, J. H., et al. Extracellular matrix stiffness regulates osteogenic differentiation through MAPK activation. PLoS One. 10, 1-16 (2015).
  28. Ryan, A. J., et al. A Physicochemically Optimized and Neuroconductive Biphasic Nerve Guidance Conduit for Peripheral Nerve Repair. Advanced Healthcare Materials. 6, 1-13 (2017).
  29. Du, J., et al. Prompt peripheral nerve regeneration induced by a hierarchically aligned fibrin nanofiber hydrogel. Acta Biomaterialia. 55, 296-309 (2017).
  30. Huang, L., et al. A compound scaffold with uniform longitudinally oriented guidance cues and a porous sheath promotes peripheral nerve regeneration in vivo. Acta Biomaterialia. 68, 223-236 (2018).
  31. Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices. Jouranl of Visualized Experiments. (119), e55276 (2017).
  32. Gupta, R., et al. Shear stress alters the expression of myelin-associated glycoprotein (MAG) and myelin basic protein (MBP) in Schwann cells. Journal of Orthopaedic Research : Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 23, 1232-1239 (2005).
  33. Harris, G. M., Shazly, T., Jabbarzadeh, E. Deciphering the combinatorial roles of geometric, mechanical, and adhesion cues in regulation of cell spreading. PLoS One. 8 (11), (2013).
  34. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  35. Schreck, I., et al. C-Jun localizes to the nucleus independent of its phosphorylation by and interaction with JNK and vice versa promotes nuclear accumulation of JNK. Biochemical and Biophysical Research Communications. 407, 735-740 (2011).
  36. Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact printing of proteins for cell biology. Journal Visualized Experiments. (22), e1065 (2008).
  37. Treter, J., et al. Washing-resistant surfactant coated surface is able to inhibit pathogenic bacteria adhesion. Applied Surface Science. 303, 147-154 (2014).
  38. Lutz, J. F. Polymerization of oligo(ethylene glycol) (meth)acrylates: Toward new generations of smart biocompatible materials. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 46 (11), 3459-3470 (2008).
  39. Marcus, M., et al. Interactions of Neurons with Physical Environments. Advanced Healthcare Materials. 6, (2017).
  40. Pu, J. Golgi polarization in a strong electric field. Journal of Cell Science. 118, 1117-1128 (2005).
  41. Blaker, J. J., et al. Bioactive Silk-Based Nerve Guidance Conduits for Augmenting Peripheral Nerve Repair. Advanced Healthcare Materials. 7, 1800308 (2018).
  42. Daly, W., Yao, L., Zeugolis, D., Windebank, A., Pandit, A. A biomaterials approach to peripheral nerve regeneration : bridging the peripheral nerve gap and enhancing functional recovery. Journal of the Royal Society of Interface. 9 (67), 202-221 (2012).
  43. Xia, H., et al. Directed neurite growth of rat dorsal root ganglion neurons and increased colocalization with Schwann cells on aligned poly(methyl methacrylate) electrospun nanofibers. Brain Research. 1565, 18-27 (2014).
  44. Wang, H. B., Mullins, M. E., Cregg, J. M., McCarthy, C. W., Gilbert, R. J. Varying the diameter of aligned electrospun fibers alters neurite outgrowth and Schwann cell migration. Acta Biomaterialia. 6, 2970-2978 (2010).
  45. Carvalho, C. R., Oliveira, J. M., Reis, R. L. Modern Trends for Peripheral Nerve Repair and Regeneration: Beyond the Hollow Nerve Guidance Conduit. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 337 (2019).
  46. Yang, Y., Wang, K., Gu, X., Leong, K. W. Biophysical Regulation of Cell Behavior - Cross Talk between Substrate Stiffness and Nanotopography. Engineering. 3, 36-54 (2017).
  47. Tan, J. L., Liu, W., Nelson, C. M., Raghavan, S., Chen, C. S. Simple Approach to Micropattern Cells on Common Culture Substrates by Tuning Substrate Wettability. Tissue Engineering. 10, 865-872 (2004).
  48. Grove, M., et al. YAP/TAZ initiate and maintain schwann cell myelination. Elife. 6, 1-27 (2017).
  49. Poitelon, Y., et al. YAP and TAZ control peripheral myelination and the expression of laminin receptors in Schwann cells. Nature Neuroscience. 19, 879-887 (2016).

Tags

Denne måned i JoVE Schwann celler perifer nerve matrix stivhed ekstracellulære matrix mikropatterning celle fænotype plasticitet celleform
Forberedelse af tunable ekstracellulære Matrix mikromiljøer til at evaluere Schwann Cell Fænotype Specifikation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xu, Z., Orkwis, J. A., Harris, G. M. … More

Xu, Z., Orkwis, J. A., Harris, G. M. Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification. J. Vis. Exp. (160), e61496, doi:10.3791/61496 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter