Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

准备可调细胞外基质微环境,以评估施万细胞表型规范

doi: 10.3791/61496 Published: June 2, 2020

Summary

这种方法旨在说明细胞外基质线索(如基板刚度、蛋白质成分和细胞形态)调节Schwann细胞(SC)表型的机制。

Abstract

创伤性外周神经系统 (PNS) 损伤目前缺乏适当的治疗方法,无法恢复完全功能恢复。施万细胞(SCs)作为PNS的主要胶质细胞,在损伤后分化成再生细胞表型,在促进PNS再生方面发挥着至关重要的作用。但是,SC 的去分化状态很难在再生所需的时间段内保持,并且受到周围细胞外基质 (ECM) 变化的影响。因此,确定SC和不同 ECM 之间的复杂相互作用,以提供 SC 再生潜力的线索至关重要。为了解决这个问题,制定了一种策略,将不同的ECM蛋白吸附到可调调的聚二甲基硅氧烷(PDMS)基材上,为可调节刚度和蛋白质成分提供了一个平台。SC被播种到可调基材上,测量了代表SC表型动力学的关键细胞功能。为了说明SC蛋白表达与细胞形态之间的相互作用,利用除单个微联系印刷细胞模式外,其他SC的种子密度,并具有免疫荧光染色和西印的特点。结果表明,传播面积较小、细胞伸长程度较高的细胞可促进SC再生表型标记的较高水平。该方法不仅开始解开SC的ECM和细胞功能之间的显著关系,而且为未来在外周神经修复中优化生物材料提供了指导。

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

外周神经系统(PNS)损伤仍然是医疗保健领域的主要临床挑战,它损害了患者的生活质量,并通过多种社会经济因素1、2,产生了重大影响。施万细胞(SC)作为PNS中的主要胶质细胞,提供必要的分子和物理线索,以诱导PNS再生,并在短间隙损伤中帮助功能恢复。这是因为SC的非凡能力,从骨髓或雷马克表型3"修复"细胞表型去分化成"修复"细胞表型。修复SC是一个独特的细胞表型在几个方面。受伤后,SCs 通过重新进入细胞周期并开始表达多种转录因子来增加增殖率,从而促进再神经化。这些因素,如c-Jun和p75NTR,被向上调节,而骨髓SC标记物,如骨髓基本蛋白(MBP),被向下调节4,4,5。此外,SCs 改变形态,变得拉长,并相互对齐,形成邦格纳带跨伤害场6。这为轴子扩展到正确的近元目标7提供了物理指导机制。然而,尽管SCs有能力促进短间隙损伤的神经再生,但功能恢复的结果在严重伤害中仍然很差。部分原因是细胞外基质 (ECM) 制导提示的丢失,以及 SCs 无法长时间保持再生表型8

神经再生和恢复过程与受伤后基底层层的状态密切相关。基底层层是围绕神经的 ECM 层,可促进制导,并在受伤后保持完好无损的情况下为轴角和 SCs 提供 ECM 绑定提示。ECM 的状态及其向细胞提供矩阵绑定提示的能力至关重要,并且以前在各种不同上下文中探索过 10、11、12、13、14。10,11,12,13,14例如,已经证明,ECM的刚度可以引导细胞功能,如增殖和分化11,15,16。11,15,16ECM的组成还可以导致明显的细胞反应,并通过细胞内信号通路17,18调节细胞行为,迁移和分化。此外,细胞形态,包括扩散面积和细胞伸长,在调节功能方面起着主要作用,可以由ECM绑定的均格19,20,控制。许多以前的研究都集中在干细胞区分成定义的血统,但SC拥有类似的能力,改变表型从一个势动,成人SC在健康的神经,修复SC能够分泌蛋白质和生长因子,同时重塑ECM后神经损伤,5,21。因此,特别关键的是确定先天SC再生能力和ECM边界线索之间的关系基础,以便洞察最终利用这种能力进行神经再生。

为了解决这个问题,我们开发了一个详细的方法,以产生一个细胞培养基板,其中机械刚度和配体类型可以很容易地调整在生理相关的范围。与聚丙烯酰胺凝胶相比,聚二甲基硅氧烷(PDMS)之所以被选为基材,是因为其高度可调力学,而聚丙烯酰胺凝胶的最大杨氏模量约为12千帕,而PDMS的模量约为1000千帕22、23、24。,23,24这对手头的工作是有益的,因为最近的研究表明,杨的兔子坐骨神经的模量在发育过程中可以超过50千帕,从而表明PNS内神经的刚度范围比之前检查的范围要宽。不同的蛋白质能够吸附到PDMS基材上,以分析SC行为力学和配体组合调控。这允许研究PNS再生过程中存在的多个微环境线索,并比较高度可调性的工作只侧重于基板的刚度25。此外,这些工程细胞培养基质与多种定量分析方法(如免疫基础化学、西印迹和定量聚合酶链反应(q-PCR))兼容。

此工程细胞培养平台非常适用于分析机械通路,因为每个 ECM 绑定信号具有高水平的单独可调性。此外,在基材上可以实现细胞微模式的流行方法,包括微触觉打印,以便控制细胞粘附,以分析与其他 ECM 绑定图24相关的细胞形状。这一点至关重要,因为线型基板促进细胞群的伸长,为在神经再生期间模仿和研究Büngner带内的拉长和再生SC提供了工具。此外,细胞形态是多细胞功能的有力调节器,如果不控制26,27,可能会,引入混淆的实验结果。目前,ECM提示28、29、30,29对SC再生表型的调控机制给予高度关注。这对于深入了解生物材料的设计至关重要,这些生物材料可作为神经引导导管,用于帮助 PNS 神经再生。这些详细的协议最终可以作为潜在工具应用,以破译由 ECM 绑定提示调节的 SC 和其他单元类型函数的机制。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. 可调细胞培养基质制备和表征

  1. 基底制备
    1. 使用移液器尖端以 10:1 和 60:1 的比例大力混合 PDMS 基质弹性体和固化剂,直到气泡在混合物中均匀分散。使用真空干燥去除气泡,直到气泡消散。
      注:在PDMS聚合过程中,固化剂与基弹性体交联,提供最终聚合物所需的机械性能。可以调整交联比率以改变 PDMS 刚度。
    2. 将一滴干燥 PDMS 混合物放在方形或圆形盖玻片上(例如 22 mm x 22 mm),以 2500 rpm 转速旋转旋转盖玻片 30 秒。
    3. 在60°C的烤箱中孵育盖玻片1-2小时或室温过夜,使PDMS凝固。
    4. 使用 UV-Ozone 清洁剂处理盖玻片 7 分钟(UV 波长:185 nm 和 254 nm),以提高表面亲水性。放入消毒的 6 孔板中。
    5. 在用于细胞培养之前,在70%乙醇中孵育基质至少30分钟。
      注意:紫外线臭氧清洁剂会产生对人类有害的臭氧。在化学烟气罩中工作或进行某种形式的通风。
    6. 在37°C的无菌培养箱中浸入蛋白质溶液(10μg/mL胶原蛋白 I、纤维素或层压素)中,60分钟。
      注:经过紫外线臭氧处理后,PDMS 表面可能仍具有疏水性。旋转井板,确保每个盖玻片都覆盖在蛋白质溶液中。
    7. 吸气蛋白溶液,用磷酸盐缓冲盐水(PBS)3倍清洗盖玻片。
    8. 使用市售的 EDTA 溶液 (1 倍) 重新悬挂 RT4-D6P2T Schwann 细胞系 (SCs),使用 2.5% 的尝试素,并使用血细胞计计数细胞。可调 PDMS 表面上的种子 SC,其密度为所需的细胞密度。SC 种子密度可能因不同的应用而异。
    9. 在实验时间长度中保持细胞在所需的细胞培养参数(90%湿度、5%CO 2、37°C等)。2使用Dulbecco的修改鹰培养基(DMEM)辅以10%的胎儿牛血清(FBS)和1%青霉素链霉素作为细胞培养基。
  2. 微层基板制备
    1. 使用计算机辅助设计 (CAD) 软件绘制所需的几何形状和细胞粘合区域(900 μm 2、1600 μm2和 2,500 μm2)。2根据商业供应商的这些图案创建镀铬光掩贴。
    2. 在洁净的房间或无尘环境中,使用标准光刻技术制造硅晶片(协议详见其他地方31)。此特定应用的关键参数如下:光印论:SU-8 2010;旋转轮廓以分散光圈:500 rpm 为 10 s,加速度为 100 rpm/s,3500 rpm 为 30 s,加速度为 300 rpm/s;紫外线的暴露能量:130 mJ/cm2.
      注:硅晶片上的图案高度约为 10 μm,遵循这些参数。在步骤 1.2.2 之后,使用光学显微镜可以看到矩形或三角形图案外边缘周围的潜在裂纹。在 190°C 下烘烤硅片 30 分钟有助于消除裂纹。
    3. 将带图案的硅片放在圆形 150 mm 直径 x 15 mm 高度 Petri 盘内,然后将步骤 1.1.1 中准备的脱气 PDMS(混合比 10:1)倒注到硅晶圆上。
      注:确保 PDMS 的厚度至少为 5 mm,便于在微联系打印步骤中操作。
    4. 在 60°C 的烤箱中将 PDMS 凝固在 60 °C 的烤箱中。允许 PDMS 冷却至室温。使用手术手术刀精确切割 30 mm x 30 mm 正方形的邮票,其中包含硅片的正确图案。不要损坏硅片。
      注:此时硅晶片可以重复使用多次,在用异丙醇清洁后产生更多的邮票。
    5. 将 PDMS 邮票和可调谐盖玻片(在步骤 1.1.1 至 1.1.3 中准备)消毒,将它们浸入 70% 乙醇中 30 分钟。
    6. 为了确认微接触打印后 PDMS 邮票的微图案的有效性,使用过滤的空气流和移液器 50 μg/mL BSA(德州红结合)溶液干燥 PDMS 邮票的表面,以覆盖 PDMS 邮票的整个图案侧。
    7. 在室温下用 BSA 溶液孵育 PDMS 邮票 1 小时,允许蛋白质吸附。
    8. 使用过滤的空气流干燥可调表层滑面,提高表面亲水性,如步骤 1.1.5 所述。
    9. 空气干燥 PDMS 图章以去除剩余的 BSA 溶液。
      注意:请注意 BSA 解决方案从图章中完全删除,因为任何剩余的解决方案都会导致在微联系打印期间在盖玻片上滑动。
    10. 将冲压的图案侧面与可调式盖玻片进行一致接触,使盖玻片表面的 BSA 吸附。轻轻按压盖玻片 5 分钟。
      注:不要对图章施加过大的力,因为它会弯曲并导致邮票和盖玻片之间的非特定接触。在邮票上施加的适当力量对于成功的微联系打印至关重要。
    11. 使用氟化显微镜使用 FITC(氟化物异异氰酸酯)过滤器检查显微模式。
    12. 要打印细胞粘合区域而不是荧光图案,请用层压素代替 BSA 蛋白,然后重复步骤 1.2.5 到 1.2.10。
    13. 从盖玻片上取下邮票,将盖玻片转移到消毒的 6 孔板中。将 2 mL 的 0.2% w/v Pluronic F-127 溶液添加到每个井中,以覆盖盖玻片的表面,并在室温下孵育 1 小时。
      注:普兰尼克F-127可吸附到PDMS表面,增加PDMS表面的疏水性,以阻止细胞的粘附。
    14. 吸气普鲁里尼奇F-127溶液,在播种细胞之前用PBS洗5倍,用细胞培养培养体洗1倍。SC 的典型播种密度是 1,000 个细胞/厘米2
    15. 细胞播种后45分钟,取出细胞培养培养培养,用PBS 2倍清洗盖玻片,防止多个SC粘附于相同的模式。在定量之前,在所需的细胞培养环境中保持细胞48小时。
    16. 要创建线型细胞培养基板来检查对齐的细胞,请按照步骤 1.2.1 到 1.2.4 创建用于微触觉打印的图章。
      注:图章上衬砌图案的凹槽/孔的尺寸为 50 μm x 50 μm,用于勾图的单元格。邮票的总尺寸为 10 mm x 10 mm。
    17. 将图章切成仅包含所需线图案的尺寸。
      注:在 CAD 中创建图章时,线型图案周围的图章的未图案区域将对应于微连接打印后细胞粘合区域。因此,在切掉图章时,必须消除未图案的区域,以确保表面上的种子都遵循图案。
    18. 按照步骤 1.1.1 到 1.1.3 准备可调谐 PDMS 表面涂层两个培养皿。
      注:这将是覆盖培养皿表面本身的 PDMS,而不是盖玻片上。
    19. 按照步骤 1.2.5 到 1.2.10 执行微连接打印,以打印 PDMS 涂层 Petri 盘上的线型细胞粘合区域。
      注:60 mm x 15 mm Petri 盘的表面面积可以包含 6 个 PDMS 图章的线型区域。
    20. 取出邮票,用 0.2% w/v 普鲁尼奇 F-127 溶液填充 Petri 盘,孵育 1 小时。
    21. 微触觉打印后,用 70% 乙醇 3 倍冲洗 PDMS 邮票的每一面,然后用空气干燥。旋转 PDMS 图章,按照步骤 1.2.5 到 1.2.10 使用第二个 Petri 盘上的邮票的未图案一侧打印未图案的细胞粘合区域。重复步骤 1.2.13。
    22. 从菜肴中吸出 F-127 溶液,用 PBS 洗 3 倍,然后使用新鲜细胞培养培养剂洗 1x 洗。菜上的种子 SCs 。
      注:线型菜的播种密度为5,000细胞/厘米2,无图案菜的播种密度为10,000细胞/厘米2。
    23. 将 SC 保持在所需条件下 48 小时,并遵循协议准备 SC lysates32
      注:未图案菜肴的细胞播种密度比线纹菜的细胞播种密度高2倍,因为线纹菜只有未图案菜的细胞粘合面积的一半。
      1. 为了准备裂解物,将足够的放射性免疫沉淀测定(RIPA)缓冲液转移到10mL锥形离心管中。在 RIPA 缓冲液中,以 1:100 的比例稀释蛋白酶和磷酸酶抑制剂 (100 倍),通过移液混合均好。
      2. 用冰冷的PBS(1倍)清洗细胞2分钟,将步骤1.2.23.1准备的80μL溶液添加到培养皿中每个细胞粘合区域(与PDMS邮票和吸附蛋白接触的区域)。用溶液在冰块上孵育细胞15分钟。
        注:由于普卢尼克F-127吸附在其他地方的疏水性,该溶液将只停留在细胞粘合剂区域。此功能为线型 SCs 成功且足够提取蛋白质。
      3. 用细胞刮刀刮 5 分钟,将酸盐收集到标有 1.5 mL 的微离心管中。
      4. 微离心在12,000 x g下,在4°C下15分钟。用 1,000 μL 移液器收集上清液,并转移到干净的微离心管中。将细胞在-20°C下进行酸化。
  3. 基质特征
    注:为了在盖玻片上描述聚合物的力学特性,通常采用多种方法,包括批量压缩测试1111、3333或原子力显微镜测试34。该协议将概述批量压缩测试。
    1. 将所需混合比的 PDMS 前体(步骤 1.1)倒入 30 mm 培养皿中,确保培养皿内 PDMS 层的厚度至少为 20 mm。
    2. 1 小时后,将用凝固 PDMS 从 60 °C 烤箱中取出培养皿,并在室温下冷却。将聚合物切割成 10 mm x 10 mm 正方形。使用卡钳测量 PDMS 的厚度。
    3. 将 PDMS 放在压缩力测量机的舞台上。将压缩力传感器(型号:112C)插入传感器端口,将传感器固定到测试机的轴上。
    4. 使用仪器前面板上的"jog"控制,将传感器的高度调整到 PDMS 图章上方约 0.5 厘米。
    5. 使用"测试设置"窗口打开相关软件,选择"伺服配置文件",然后打开"分段"窗口。在"段"窗口中,输入所需的"控制速率"和"结束量"进行测试。
      注:控制速率确定传感器向下移动 PDMS 的速率。端量确定传感器的总行驶距离。
    6. 使用软件控制面板上的"Z"按钮在此点重置所有测量值。
    7. 将传感器向下移动以轻轻接触 PDMS,直到加载 1-2 牛顿 (N)。加载和传感器行驶的距离将显示在软件中。
    8. 使用"Z"按钮后,使用"播放"运行测量,并保存文件录制力和距离。
    9. 对于 PDMS 的每个实验条件,重复步骤 1.3.3 到 1.3.8。
    10. 打开文件并使用以下公式计算每个比率的 PDMS 的 Young 模数 (E)。(F = 压缩力,A = PDMS 冲压区域,=L = 传感器的行驶距离,L0 = PDMS 冲压的原始厚度)。
      Equation 1

2. 可调基材上的细胞特性量化

  1. 扩散测定
    1. 在6井板中,以5,000个细胞/厘米2的密度从步骤1.1.9中对基板进行种子SC准备。允许在标准细胞培养条件下孵育48小时(37°C和5%CO2)。
    2. 将12μL的10 mM溴氧尿素(BrdU)库存溶液稀释成12 mL的37°C细胞培养基,与移液器很好地混合,使10μM布尔杜标签溶液。
    3. 取出细胞培养介质,用 PBS 清洗 SCs 2x。
    4. 将 2 mL 的 BrdU 标签溶液添加到每个井中,并孵育 SCs 2 小时。
      注:BrdU标签溶液的孵育时间取决于特定的细胞增殖率。RT4-D6P2T SC线具有很高的增殖率,因此使用了2小时孵育时间。
    5. 拆下 BrdU 标签溶液,用 PBS 清洗 SCs 3x。将 PBS 中 1 mL 的 3.7% 甲醛添加到每个井中,并在室温下孵育 15 分钟进行细胞固定。
      注意:甲醛是一种人类致癌物质;因此,在化学烟罩内进行所有工作,并提供适当的保护。
      注:使用PBS洗涤时,井中没有细胞培养基,因此PDMS表面可能疏水。采取预防措施,不要完全干燥基板表面,以防止细胞损坏。
    6. 吸气甲醛溶液,用PBS洗3倍(每洗3分钟)。去除PBS,将 PBS 中 0.2% Triton X-100 的 1 mL 添加到每孔中,以渗透细胞膜。在室温下用Triton X-100溶液孵育SC20分钟。
    7. 拆下Triton X-100溶液,用PBS清洗SC3倍(每片3分钟)。
    8. 在每个井中加入1 mL 1 N HCl,在冰上孵育10分钟。取出1个N HCl,将1 mL的2N HCl加入到每个井中,在室温下孵育10分钟。
    9. 混合 182 mL 的 0.2 mM Na2HPO4 和18 mL 的 0.1 mM 柠檬酸,以产生磷酸盐/柠檬酸缓冲液,用于抗原检索。取出2N HCl,将1 mL磷酸盐/柠檬酸缓冲液加入每个井,在室温下孵育10分钟。
    10. 在 PBS 中用 0.2% 的三吨 X-100 洗涤 SCs 3x。将2 mL的3%牛血清白蛋白(BSA)加入PBS中,并在室温下孵育30分钟,以检测抗体的非特异性结合。
    11. 稀释BrdU原抗体与Alexa Fluor 488在3%BSA溶液中结合,BrdU染色溶液的比例为1:300。在室温下用染色溶液孵育SC过夜,而板材则覆盖在铝箔中。
    12. 为了量化增殖,图像SC使用荧光显微镜的 FITC 和 DAPI 通道分别检测 BrdU 和核。将图像保存为"nd.2"文件。
    13. 打开在相同空间位置拍摄的每个图像的"nd.2"文件。
    14. 打开图像分析软件。右键单击背景以打开"分析控制"部分中的窗口"自动测量结果"和"自动测量"。
    15. 在 "计数和分类 " 菜单中,选择"计数".在 FITC 图像上,单击显示绿色荧光(BrdU 正数)的每个原子核,右键单击图像。
      注:BrdU阳性细胞的数量显示在"自动化和测量"窗口中
    16. 对于 DAPI 图像,重复步骤 2.1.14 以计算总核数。计算此图像的 BrdU 正单元格的百分比。
    17. 对于用于统计目的的其他图像,重复步骤 2.1.13 至 2.1.16,并计算每个基底条件 BrdU 正细胞的均值百分比。
  2. 通过免疫荧光图像分析对c-Jun表达进行量化
    1. 步骤 1.1.9 和 1.2.23 中 6 孔板内准备的细胞与前面描述的程序(步骤 2.1.5-2.1.7)一起固定和渗透。
      注:要对不同 ECM 条件的细胞进行荧光强度的准确比较,请在所有样品中应用相机设置,所有样本具有相同的参数。
    2. 将图像保存为".nd2"文件。
    3. 打开图像分析软件。右键单击背景打开窗口 [自动测量结果] 和 [自动测量] 在 [分析控制] 部分
    4. 在"自动测量结果"中,选择"对象数据"。激活"不断更新测量"按钮。
    5. 在软件的顶部面板中,选择"测量",后跟"对象功能"。将"平均强度"添加到"选定测量"部分
    6. 打开并合并两个包含 c-Jun 和核图像的".nd2"图像文件。
    7. 在顶部面板中,选择"ROI"并选择"绘制矩形 ROI"。绘制包含单个单元核区域的矩形区域。
      注:c-Jun表达集中在核35中
    8. 在软件顶部面板中,选择"二进制"和"定义阈值",将出现一个新窗口来精确定义 c-Jun 荧光区域。
    9. 在新窗口中,单击"全图像/使用 ROI"将程序从完整图像模型切换到 ROI 模型。使用"强度"调整位于窗口左侧的查找表,以调整矩形 ROI 中高亮显示区域的大小/形状。
      注意:注意确保高亮区域的大小/形状与原子核相同。
    10. 单击"确定"按钮,获取"自动测量结果"窗口中的平均 FITC强度,然后单击"存储数据"。
    11. 在"自动测量"窗口中,"删除对象"以删除红色突出显示的区域。在左侧面板上,使用"指点工具"选择矩形 ROI 并删除。
    12. 重复步骤 2.2.6 到 2.2.11 以测量每个附加单元的均值 FITC 强度。
    13. 在"自动测量结果"的窗口区域中,选择"存储",并呈现所有存储的数据。使用"导出"函数并选择"数据到Excel"保存导出的电子表格并执行其他计算。
  3. 量化核伸长
    1. 修复和渗透步骤 1.2.22 中按照步骤 2.1.5-2.1.7 准备的 SC。使用 DAPI 安装介质进行核染色。
    2. 使用 DAPI 通道和 40 倍的客观镜头,获取样本的图像并保存为".nd2"文件。
    3. 按照步骤2.2.3和2.2.4在图像分析软件中打开"自动测量结果"和"自动测量"窗口。
    4. 在 "自动测量结果" 中,使用 "选项" 函数,后跟 "选择对象要素"。在"特征"列中,选择"伸长"并添加到"选定测量"列。使用"不断更新测量"激活此功能。
    5. 打开包含核图像的"nd.2"图像文件。在"自动测量"窗口中,选择"自动检测"功能并选择一个原子核。右键单击图像,测量的核纵横比将显示在[自动测量结果]中。
    6. 重复步骤 2.3.5 以量化图像中其他核的核纵横比。在"自动测量结果"窗口中选择"存储数据"。
    7. 对于其他图像,请重复 2.3.5 到 2.3.6。将数据导出到电子表格文件中,如以前在 2.2.13 中所做的,以进行分析。
  4. 西方印迹量化蛋白质表达
    1. 遵循标准协议,为西方印迹分析详细其他地方32。研究中使用的抗体稀释如下:兔子抗c-Jun 1:2,000;小鼠抗β-行动素1:1,000;兔子防 p75NTR 1:1,000;兔抗米素基本蛋白1:1,000;抗小鼠/兔 IgG,HRP 相关抗体 1:10,000。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

为了分析和量化在SC表型上基板刚度和蛋白质成分之间的相互作用,开发了可调PDMS细胞培养基质(图1A)。不同基基聚合物的压缩测试:利用固化剂比来量化基板的杨模量(E)(图1B)。生成的模量值范围表示生理相关的基底条件。在制备基材后,在可调的微环境上对SC进行培养和细胞特性分析。首先分析了不同蛋白质成分基质上的SC增殖率。与胶原蛋白 I 和纤维素吸附相比,层宁涂层基材的增殖率更高,全部为 10 μg/mL(图 2A,B)。层压涂层和不同模态基材上的SC表明,相对柔软的基材(E=3.85kPa)可降低所有条件下的细胞增殖率(图2C,D)。然而,硬基板(E=1119kPa)和相对软基板(E=8.67kPa)之间的差异微不足道(图2D)。

还通过免疫基础化学和西方印迹对SCs的蛋白质表达进行了分析。通过免疫荧光显微镜(图3A)分析转录因子c-Jun的水平,并由平均像素荧光强度(图3B-D)表示。c-Jun表达被证明随着基板变软(E=1119 kPa 到 E=8.67 kPa)而上升,然而,在最软的基材(E=3.85 kPa)上,c-Jun 表达明显下降。在刚性基材 (E=1119 kPa) 上,胶原蛋白 I 涂层基板产生最高的 c-Jun 表达,然而随着基材变软(E=8.67 kPa 和 3.85 kPa),层压素显示 c-Jun 的最高水平(图 3E)。西方印迹还用于分析c-Jun和米林基本蛋白(MBP),c-Jun水平上升,MBP在较软的基材上向下调节(图3F)。此外,与胶原蛋白 I 和纤维素相比,在层压涂层基材上播种的 SCs 产生了最高的 c-Jun 表达。

不同播种密度的细胞随后被培养并染色于罗丹胺-法罗酮,以探索细胞扩散和在c-Jun表达中的作用(图4A,B)。为了控制细胞的核伸长,利用一种常见的微模式技术(微连接打印36)在细胞培养基材上形成细胞粘合线。在线型基材上播种的细胞的核纵横比明显高于在未表型基材上播种的细胞(图4C,D)。研究发现,在SC再生表型中,c-Jun和另一种显著标记物p75神经营养素受体(p75 NTR)的表达在扩散面积较小的致密细胞中被调高(图4E)。线型细胞与非模式细胞相比,c-Jun和p75NTR的表达也更高(图4F)。因此,微触觉印刷细胞胶粘剂几何形状被创建,以精确控制细胞的扩散面积和伸长,同时消除细胞-细胞相互作用(图5A)。总细胞粘合区域的尺寸为 900 μm 2、1,600 μm2和 2,500 μm2,纵横比为 1 或 4(细胞长度:细胞宽度)。2荧光牛血清白蛋白(fBSA,得克萨斯红)染色用于揭示微触觉打印后细胞培养基板上微模式的状态(图5B)。测量了每个细胞面积的SC的核纵横比,表明通过增加核长宽比,细胞伸长率增加(图5C)。此外,随着SC纵横比的提高,c-Jun被上调(图5D)。然而,有趣的是,发现随着细胞扩散面积的增加,c-Jun表达被降低调节(图5E)。通过这种微模式方法对核和行动素确认细胞扩散区和伸长的免疫荧光染色具有高度控制(图5F)。

Figure 1
图1:具有可调刚度和蛋白质成分的细胞培养基质。A) 显示PDMS细胞培养基质发展的示意图。(B) 基的初始PDMS混合比:固化剂决定杨的模数。请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2:由基板刚度和蛋白质成分调节的SC增殖率。A) 代表性图像显示 BrdU 染色时,培养在同一模态基质的基质。(B) 直方图显示每种蛋白质涂层的BrdU阳性细胞的百分比。(C) 代表性图像显示BrdU在SCs中结合,这些物质播种在同一蛋白涂层的基材上。(D) 直方图显示每个 Young 的模数值的 BrdU 阳性细胞百分比。比例线 = 50 μm。数据以均值 = SEM.*p <....05,**p <.005,***p <.0005。该图的部分已修改自参考文献24。请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3:基底刚度和蛋白质调节SC蛋白表达。A) 代表性图像显示,C-Jun免疫荧光染色的SC种子在不同的刚度和蛋白质成分的基材上。测量了在(B)胶原蛋白 I ( C ) 纤维素和 (D) 层压涂层基质上播种的SCs的均像素荧光强度。(E) c-Jun荧光水平的SC按杨的基质分组。(F) 西方印迹显示在基材上播种的SC的c-Jun和米林基本蛋白(MBP)。甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)被用作装载控制。比例线 = 50 μm。数据以均值 = SEM.*p <....05,**p <.005,***p <.0005。该图的部分已修改自参考文献24。请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图4:细胞扩散区影响SCS的蛋白质表达。A) 不同播种密度的细胞扩散区域通过罗丹胺-法罗酮(红色)和核染色(蓝色)进行可视化。(B) 显示每个条件下 SC 的平均扩散面积的直方图。(C) 在未表型或线型基材上播种的SC核被染色为DAPI(蓝色),以显示形态。(D) 显示图案和未模式基材上核纵横比定量的直方图。(E) 西方印迹显示不同扩散区域的细胞的c-Jun和p75NTR的表达。(F) 西方印迹,显示未图案和线型基材上SCs的蛋白质表达。比例线 = 50 μm。数据以均值 = SEM.*p <....05,**p <.005,***p <.0005。请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 5
图5:SC形态和伸长影响SC的c-Jun表达。A) 显示不同纵横比形状的细胞微模型的示意图。(B) fBSA 染色(红色),显示微触觉打印后微模式的形状。比例线 = 10 μm。(C) 显示微模式 SCs 的核纵横比的直方图(D, E) 直方图显示每个几何条件下 c-Jun 的均像素荧光强度。(F) 罗达明-法罗酮(红色)、核(蓝色)和c-Jun(绿色)被染色在不同的微模式上。比例线 = 10 μm。数据以均值 = SEM.*p <....05,**p <.005,***p <.0005。该图的部分已修改自参考文献24。请单击此处查看此图的较大版本。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

SCs 可以促进神经再生,由于其表型转化和神经损伤后再生潜力。然而,ECM提示如何调节这种再生能力仍然大多不清楚,可能不仅阻碍生物材料的发展,旨在促进神经再生,而且理解神经再生所涉及的机制。为了开始研究这种相互作用,在 ECM 线索(如刚度、蛋白质涂层和粘合剂地形)可控制时,创建了细胞培养基板。利用微触觉打印的常用方法,微模式胶粘剂地形能力是协议中的一个关键特征。但是,这种基板与玻璃不同,因为应用于 PDMS 图章的压缩力必须处于适当的水平,才能达到细胞培养基板上所需的细胞粘合区域形状。利用荧光牛血清白蛋白 (fBSA) 作为模型蛋白来可视化细胞粘合区域并调整 PDMS 邮票上的压缩力,可以最终缓解此问题。与玻璃的另一个关键区别是去除多余的普鲁尼克F-127,用于使基材的其余部分非粘合。经过这种处理,细胞培养基质具有高度疏水性,使得在整个洗涤过程中保持湿细胞培养基质具有挑战性,这对微模式蛋白37的结构完整性非常重要。因此,建议使用多个移液器几乎同时吸气和注射溶液,以防止基材完全脱水。

虽然微模式可以精确控制细胞形状,不需要复杂的合成程序使用细胞阻断聚合物,如OEGMA,用于量化蛋白质表达的微模式细胞的方法有时是有限的38。例如,从微模式获得样品通常限于每个盖玻片几百个细胞,这不足以准备用于西方印迹或 qPCR 的细胞异物。考虑到这一点,仅使用免疫荧光染色来量化微模式细胞的蛋白质表达,限制了可以量化的蛋白质种类。为了解决这个问题,我们利用线模式促进细胞伸长为更大的细胞群体,并成功地准备了细胞酸盐,由西方印迹分析。其他方法,如应用电场或对齐电喷纤维也可以用于控制细胞群39,40伸长。然而,电场可能不适合NGC的所有应用,因为常用的生物材料,如胶原蛋白基聚合物和丝绸的电导率非常低28,41,42。28,41,42相比之下,对齐的电喷纳米纤维已经成功地植入NGC,以促进SC对齐,伸长和迁移,以及神经土产生43,44。43,将线型基材上的SC行为与纳米纤维对齐的基材上的SC行为进行比较也可能很有说服力,因为衬里图案和对齐的纳米纤维是NGCs45中最常见的两种引导机制。

微模式协议详细利用PDMS涂层盖玻片作为细胞培养基板,最大表面 Young 的模量为 1119 kPa。这种刚度模仿许多组织,但可能无法模拟中层干细胞的骨质生成,这通常要求表面 Young 的模量超过 1 Gpa46。在这种情况下,玻璃是替代候选,但Pluronic F-127的吸附需要相对较高的表面疏水性,而玻璃并不具备这种疏水性。为了增加疏水性,玻璃可以在二氯苯中用二甲基二氯硅烷进行处理。在此之后,UV-Ozone 处理可用于提高微触觉打印的亲水性47

最终,开发了一个细胞培养平台,其中ECM刺激可以通过蛋白质表达进行单独调整。我们已经确定,SC再生能力是由某些机械和化学ECM提示促进的,这些线索随后可以在生物材料应用的未来设计中提供灵感,如NGC和细胞移植过程,其中ECM特性可能需要优化24。尽管如此,调整这些 ECM 提示可能是一项具有挑战性的工作,尤其是在体内。今后,该平台可用于分析 ECM 监管的 SC 表型转换中涉及的关键机制。通过实现这一点,细胞内提示的操纵可以促进SC再生能力,而无需在体外48,49,的专用平台。这在神经修复技术的发展方面具有开创性的工作潜力。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

提交人没有报告潜在的利益冲突。

Acknowledgments

作者感谢辛辛那提大学的资助支持。作者还感谢辛辛那提大学先进材料特性实验室的罗恩·弗伦尼肯的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Albumin from Bovine Serum (BSA), Texas Red conjugate Thermo Fisher Scientific A23017 BSA staining to show micropatterns
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7076S Antibody used for western blot analysis
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074S Antibody used for western blot analysis
BrdU Thermo Fisher Scientific B23151 Reagent used to measure cell proliferation
BrdU primary antibody conjugated with Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific B35130 Used to visualize BrdU in cell proliferation assays
Collagen I Thermo Fisher Scientific A10483-01 Protein used to coat coverslips
Compression force test machine TestResources Instrument to quantify mechanical properties of polymers
Dulbecco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher Scientific 11965092 Cell culture medium
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 16000044 Cell culture medium supplemental
Fibronectin Thermo Fisher Scientific 33010-018 Protein used to coat coverslips
Fluorescence microscope Nikon Eclipse Ti2 Fluorescence microscope
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) Thermo Fisher Scientific 78440 Protease and Phosphatase Inhibitor
Laminin Thermo Fisher Scientific 23017015 Protein used to coat coverslips
Mounting medium with DAPI Thermo Fisher Scientific P36971 Coverslip mountant and nuclei staining
Mouse c-Jun primary antibody Thermo Fisher Scientific 711202 Primary antibody to visualize c-Jun protein
Mouse β-Actin primary antibody Cell Signaling Technology 3700S Loading control for western blot experiments
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 Cell culture medium supplemental
Photoresist SU 2010 KAYAKU SU8-2010 Photoresist
Pluronic F-127 Sigma Aldrich P-2443 Block non-specific protein binding
Rabbit c-Jun primary antibody Cell Signaling Technology 9165S Primary antibody for visualization of c-Jun protein
Rabbit myelin basic protein primary antibody Abcam ab40390 Primary antibody for visualization of MBP
Rabbit p75NTR primary antibody Cell Signaling Technology 8238S Primary antibody for visualization of p75NTR
Rhodamine phalloidin Thermo Fisher Scientific R415 Visualization of cell cytoskeleton
RIPA buffer Abcam ab156034 Cell lysis buffer
RT4-D6P2T Schwann cell line ATCC CRL-2768 Cell line used in experiments
SYLGARD 184 PDMS base and curing agent Sigma Aldrich 761036 Tunable polymer used to coat coverslips
Trypsin Thermo Fisher Scientific 15090-046 Cell dissociation reagent
UV-Ozone cleaner Novascan Increase hydrophicility of PDMS
Versene (1x) Thermo Fisher Scientific 15040066 Cell dissociation reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Taylor, C. A., Braza, D., Rice, J. B., Dillingham, T. The Incidence of Peripheral Nerve Injury in Extremity Trauma. American Journal of Physical Medicine & Rehabilitation. 87, 381-385 (2008).
  2. Noble, J., Munro, C. A., Prasad, V. S. S. V., Midha, R. Analysis of Upper and Lower Extremity Peripheral Nerve Injuries in a Population of Patients with Multiple Injuries. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 45, 116-122 (1998).
  3. Jessen, K. R., Mirsky, R. The repair Schwann cell and its function in regenerating nerves. Journal of Physiology. 594, 3521-3531 (2016).
  4. Arthur-Farraj, P. J., et al. c-Jun Reprograms Schwann Cells of Injured Nerves to Generate a Repair Cell Essential for Regeneration. Neuron. 75, 633-647 (2012).
  5. Jessen, K. R., Mirsky, R. The Success and Failure of the Schwann Cell Response to Nerve Injury. Frontiers in Cell Neurosciences. 13, 33 (2019).
  6. Gomez-Sanchez, J. A., et al. After Nerve Injury, Lineage Tracing Shows That Myelin and Remak Schwann Cells Elongate Extensively and Branch to Form Repair Schwann Cells, Which Shorten Radically on Remyelination. Journal of Neuroscience. 37, (37), 9086-9099 (2017).
  7. Deumens, R., et al. Repairing injured peripheral nerves: Bridging the gap. Progress in Neurobiology. 92, 245-276 (2010).
  8. Höke, A., Gordon, T., Zochodne, D. W., Sulaiman, O. A. R. A decline in glial cell-line-derived neurotrophic factor expression is associated with impaired regeneration after long-term Schwann cell denervation. Experimental Neurology. 173, 77-85 (2002).
  9. Jones, S., Eisenberg, H. M., Jia, X. Advances and future applications of augmented peripheral nerve regeneration. International Journal of Molecular Sciences. 17, 1-17 (2016).
  10. Harris, G. M., et al. Nerve Guidance by a Decellularized Fibroblast Extracellular Matrix. Matrix Biology. 60-61, 176-189 (2017).
  11. Harris, G. M., Piroli, M. E., Jabbarzadeh, E. Deconstructing the Effects of Matrix Elasticity and Geometry in Mesenchymal Stem Cell Lineage Commitment. Advanced Function Mater. 24, (16), 2396-2403 (2014).
  12. Pryzhkova, M. V., Harris, G. M., Ma, S., Jabbarzadeh, E. Patterning pluripotent stem cells at a single cell level. Journal of Biomaterials and Tissue Engineering. 3, (4), 461-471 (2013).
  13. Engler, A. J., Sweeney, H. L., Discher, D. E., Schwarzbauer, J. E. Extracellular matrix elasticity directs stem cell differentiation. Journal of Musculoskeleton and Neuronal Interaction. 7, (4), 335 (2007).
  14. Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276, (5317), 1425-1428 (1997).
  15. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  16. Pickup, M. W., Mouw, J. K., Weaver, V. M. The extracellular matrix modulates the hallmarks of cancer. EMBO Reports. 15, 1243-1253 (2014).
  17. Chernousov, M. A., Carey, D. J. Schwann cell extracellular matrix molecules and their receptors. Histology and Histopathology. 15, 593-601 (2000).
  18. Shibata, S., et al. Selective Laminin-Directed Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Distinct Ocular Lineages. Cell Reports. 25, (6), 1668-1679 (2018).
  19. Mcbeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell Shape, Cytoskeletal tenstion and RhoA regulate stem cell lineage committment. Developmental Cell. 6, 483-495 (2004).
  20. Halder, G., Dupont, S., Piccolo, S. Transduction of mechanical and cytoskeletal cues by YAP and TAZ. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13, 591-600 (2012).
  21. Jessen, K. R., Mirsky, R. The repair Schwann cell and its function in regenerating nerves. Journal of Physiology. 594, (13), 3521-3531 (2016).
  22. Lopez-Fagundo, C., Bar-Kochba, E., Livi, L. L., Hoffman-Kim, D., Franck, C. Three-dimensional traction forces of Schwann cells on compliant substrates. Journal of The Royal Society Interface. 11, 20140247 (2014).
  23. Gu, Y., et al. The influence of substrate stiffness on the behavior and functions of Schwann cells in culture. Biomaterials. 33, 6672-6681 (2012).
  24. Xu, Z. Y., Orkwis, J. A., DeVine, B. M., Harris, G. M. Extracellular matrix cues modulate Schwann cell morphology, proliferation, and protein expression. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. (2019).
  25. Urbanski, M. M., et al. Myelinating glia differentiation is regulated by extracellular matrix elasticity. Scientific Reports. 6, 1-12 (2016).
  26. Sun, Y., et al. Tunable stiffness of graphene oxide/polyacrylamide composite scaffolds regulates cytoskeleton assembly. Chemical Sciences. 9, (31), 6516-6522 (2018).
  27. Hwang, J. H., et al. Extracellular matrix stiffness regulates osteogenic differentiation through MAPK activation. PLoS One. 10, 1-16 (2015).
  28. Ryan, A. J., et al. A Physicochemically Optimized and Neuroconductive Biphasic Nerve Guidance Conduit for Peripheral Nerve Repair. Advanced Healthcare Materials. 6, 1-13 (2017).
  29. Du, J., et al. Prompt peripheral nerve regeneration induced by a hierarchically aligned fibrin nanofiber hydrogel. Acta Biomaterialia. 55, 296-309 (2017).
  30. Huang, L., et al. A compound scaffold with uniform longitudinally oriented guidance cues and a porous sheath promotes peripheral nerve regeneration in vivo. Acta Biomaterialia. 68, 223-236 (2018).
  31. Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices. Jouranl of Visualized Experiments. (119), e55276 (2017).
  32. Gupta, R., et al. Shear stress alters the expression of myelin-associated glycoprotein (MAG) and myelin basic protein (MBP) in Schwann cells. Journal of Orthopaedic Research : Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 23, 1232-1239 (2005).
  33. Harris, G. M., Shazly, T., Jabbarzadeh, E. Deciphering the combinatorial roles of geometric, mechanical, and adhesion cues in regulation of cell spreading. PLoS One. 8, (11), (2013).
  34. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, (4), 677-689 (2006).
  35. Schreck, I., et al. C-Jun localizes to the nucleus independent of its phosphorylation by and interaction with JNK and vice versa promotes nuclear accumulation of JNK. Biochemical and Biophysical Research Communications. 407, 735-740 (2011).
  36. Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact printing of proteins for cell biology. Journal Visualized Experiments. (22), e1065 (2008).
  37. Treter, J., et al. Washing-resistant surfactant coated surface is able to inhibit pathogenic bacteria adhesion. Applied Surface Science. 303, 147-154 (2014).
  38. Lutz, J. F. Polymerization of oligo(ethylene glycol) (meth)acrylates: Toward new generations of smart biocompatible materials. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 46, (11), 3459-3470 (2008).
  39. Marcus, M., et al. Interactions of Neurons with Physical Environments. Advanced Healthcare Materials. 6, (2017).
  40. Pu, J. Golgi polarization in a strong electric field. Journal of Cell Science. 118, 1117-1128 (2005).
  41. Blaker, J. J., et al. Bioactive Silk-Based Nerve Guidance Conduits for Augmenting Peripheral Nerve Repair. Advanced Healthcare Materials. 7, 1800308 (2018).
  42. Daly, W., Yao, L., Zeugolis, D., Windebank, A., Pandit, A. A biomaterials approach to peripheral nerve regeneration : bridging the peripheral nerve gap and enhancing functional recovery. Journal of the Royal Society of Interface. 9, (67), 202-221 (2012).
  43. Xia, H., et al. Directed neurite growth of rat dorsal root ganglion neurons and increased colocalization with Schwann cells on aligned poly(methyl methacrylate) electrospun nanofibers. Brain Research. 1565, 18-27 (2014).
  44. Wang, H. B., Mullins, M. E., Cregg, J. M., McCarthy, C. W., Gilbert, R. J. Varying the diameter of aligned electrospun fibers alters neurite outgrowth and Schwann cell migration. Acta Biomaterialia. 6, 2970-2978 (2010).
  45. Carvalho, C. R., Oliveira, J. M., Reis, R. L. Modern Trends for Peripheral Nerve Repair and Regeneration: Beyond the Hollow Nerve Guidance Conduit. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 337 (2019).
  46. Yang, Y., Wang, K., Gu, X., Leong, K. W. Biophysical Regulation of Cell Behavior - Cross Talk between Substrate Stiffness and Nanotopography. Engineering. 3, 36-54 (2017).
  47. Tan, J. L., Liu, W., Nelson, C. M., Raghavan, S., Chen, C. S. Simple Approach to Micropattern Cells on Common Culture Substrates by Tuning Substrate Wettability. Tissue Engineering. 10, 865-872 (2004).
  48. Grove, M., et al. YAP/TAZ initiate and maintain schwann cell myelination. Elife. 6, 1-27 (2017).
  49. Poitelon, Y., et al. YAP and TAZ control peripheral myelination and the expression of laminin receptors in Schwann cells. Nature Neuroscience. 19, 879-887 (2016).
准备可调细胞外基质微环境,以评估施万细胞表型规范
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xu, Z., Orkwis, J. A., Harris, G. M. Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification. J. Vis. Exp. (160), e61496, doi:10.3791/61496 (2020).More

Xu, Z., Orkwis, J. A., Harris, G. M. Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification. J. Vis. Exp. (160), e61496, doi:10.3791/61496 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter