Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Voorbereiding van Tunable Extracellular Matrix Microenvironments om Schwann Cell Phenotype Specification te evalueren

Published: June 2, 2020 doi: 10.3791/61496
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3
1Department of Chemical and Environmental Engineering, University of Cincinnati, 2Department of Biomedical Engineering, University of Cincinnati, 3Neuroscience Graduate Program, University of Cincinnati College of Medicine

Summary

Deze methodologie heeft tot doel de mechanismen te illustreren waarmee extracellulaire matrixsignalen zoals substraatstijfheid, eiwitsamenstelling en celmorfologie het fenotype van Schwann-cel (SC) reguleren.

Abstract

Traumatisch perifeer zenuwstelsel (PNS) verwondingen momenteel gebrek aan geschikte behandelingen om volledig functioneel herstel te herwinnen. Schwann cellen (SCs), als de belangrijkste gliacellen van de PNS, spelen een vitale rol bij het bevorderen van PNS regeneratie door dedifferentiatie in een regeneratieve cel fenotype na letsel. De gededifferentieerde toestand van SC's is echter een uitdaging om de periode die nodig is voor regeneratie te handhaven en wordt beïnvloed door veranderingen in de omringende extracellulaire matrix (ECM). Daarom is het bepalen van het complexe samenspel tussen SC's en verschillende ECM om signalen te geven van regeneratief potentieel van SC's. Om dit aan te pakken werd een strategie ontwikkeld waarbij verschillende ECM-eiwitten werden geadsorbeerd op een tunable polydimethylsiloxane (PDMS) substraat dat een platform bood waar stijfheid en eiwitsamenstelling kunnen worden gemoduleerd. SC's werden gezaaid op de tunable substraten en kritische cellulaire functies die de dynamiek van SC fenotype werden gemeten. Ter illustratie van het samenspel tussen SC eiwitexpressie en cellulaire morfologie, verschillende zaaien dichtheden van SCs in aanvulling op individuele microcontact gedrukte cellulaire patronen werden gebruikt en gekenmerkt door immunofluorescentie vlekken en westerse vlek. De resultaten toonden aan dat de cellen met een kleiner uitspreiden gebied en hogere omvang van cellulaire verlenging hogere niveaus van SC regeneratieve fenotypictellers bevorderden. Deze methodologie begint niet alleen de significante relatie tussen de ECM en de cellulaire functie van SCs te ontrafelen, maar biedt ook richtlijnen voor de toekomstige optimalisatie van biomaterialen in perifere zenuwreparatie.

Introduction

Perifere verwondingen van het zenuwstelsel (PNS) blijven een belangrijke klinische uitdaging in de gezondheidszorg door de kwaliteit van leven voor patiënten in gevaar te brengen en een significante impact te creëren door een veelheid van sociaal-economische factoren1,2. Schwann cellen (SC), als de belangrijkste gliacellen in de PNS, bieden de nodige moleculaire en fysieke signalen om PNS regeneratie te induceren en hulp bij functionele herstel in korte hiaatletsels. Dit is te wijten aan het opmerkelijke vermogen van SCs om te dedifferentiaat in een "reparatie" cel fenotype van een myelineerend of Remak fenotype3. De repair SC is een onderscheidend celfenotype op verschillende manieren. Na letsel verhogen SC's hun proliferatiesnelheid door de celcyclus opnieuw in te voeren en verschillende transcriptiefactoren uit te voeren om de reinnervatie te vergemakkelijken. Deze factoren, zoals c-Jun en p75 NTR, zijn upregulated terwijl myelinating SC markers, zoals myeline basiseiwit (MBP), zijn downregulated4,5. Bovendien veranderen SCs morfologie om langwerpig te worden en met elkaar uitgelijnd om Büngner-banden te vormen over de letselplaats6. Dit biedt een fysiek geleidingsmechanisme voor de axonen uit te breiden tot de juiste distale doelstelling7. Echter, ondanks het vermogen dat SCs bezitten om zenuwregeneratie te bevorderen in korte kloof verwondingen, het resultaat van functioneel herstel blijft slecht in ernstige verwondingen. Dit is deels te wijten aan een verlies van extracellulaire matrix (ECM) begeleidingssignalen, evenals het onvermogen van SCs om het regeneratieve fenotype gedurende langere perioden te behouden8.

De zenuwregeneratie en het herstelproces zijn nauw verbonden met de toestand van de basale lamina na letsel. De basale lamina is een laag ECM rond de zenuw die begeleiding vergemakkelijkt en biedt ECM-gebonden signalen voor axonen en SCs in gevallen waarin het intact blijft na letsel9. De toestand van de ECM en het vermogen om matrixgebonden signalen aan cellen te leveren is van vitaal belang en is eerder onderzocht in verschillende contexten10,11,12,13,14. Zo is bijvoorbeeld aangetoond dat de stijfheid van de ECM celfuncties zoals proliferatie endifferentiatie 11,15,16kan leiden . Samenstelling van de ECM kan ook leiden tot een duidelijke cellulaire respons en reguleren van celgedrag zoals migratie en differentiatie door middel van intracellulaire signalering trajecten17,18. Bovendien spelen celmorfologie, met inbegrip van verspreidingsgebied en cellulaire verlenging, een belangrijke rol bij het reguleren van de functie en kan worden beheerst door ECM-gebonden signalen19,20. Veel eerdere studies hebben zich gericht op stamcellen die zich onderscheiden in gedefinieerde afstammingen, maar SC's beschikken over een vergelijkbaar vermogen om fenotype te veranderen van een homeostatische, volwassen SC binnen een gezonde zenuw, tot een reparatie SC die eiwitten en groeifactoren kan afscheiden tijdens het verbouwen van de ECM na zenuwletsel5,21. Daarom is het vooral van cruciaal belang om mechanismen te identificeren die ten grondslag liggen aan de relatie tussen de aangeboren SC-regeneratieve capaciteit en ECM-gebonden signalen voor het inzicht om deze capaciteit uiteindelijk te benutten voor zenuwregeneratie.

Om dit aan te pakken, hebben we een gedetailleerde methodologie ontwikkeld om een celkubstraat te produceren waar mechanische stijfheid en ligand type gemakkelijk kunnen worden afgestemd in fysiologisch relevante bereiken. Polydimethyl siloxaan (PDMS) werd gekozen als substraat vanwege de zeer tunable mechanica in vergelijking met polyacrylamide gel, waar de maximale Young's modulus is ongeveer 12 kPa in tegenstelling tot PDMS op ongeveer 1000 kPa22,23,24. Dit is gunstig voor het werk bij de hand, als recente studies hebben aangetoond dat de Young modulus van een konijn heupzenuw kan meer dan 50 kPa tijdens de ontwikkeling, waardoor suggereert dat het bereik van stijfheid van de zenuwen binnen de PNS is breder dan eerder onderzocht. Verschillende eiwitten zijn in staat om te adsorpteren op PDMS substraten om de combinatorische regulatie van mechanica en liganden op SC gedrag te analyseren. Dit maakt het mogelijk om meerdere micro-milieusignalen te onderzoeken die aanwezig zijn in het PNS-regeneratieproces en een vergelijking van een hoge mate van tunability met het werk dat zich uitsluitend richt op stijfheid van het substraat25. Verder zijn deze ontworpen celkweeksubstraten compatibel met een veelheid aan kwantitatieve analysemethoden zoals immunohistochemie, westelijke vlek en kwantitatieve polymerasekettingreactie (q-PCR).

Dit ontworpen celcultuurplatform is zeer geschikt voor het analyseren van mechanistische paden vanwege het hoge niveau van individuele tunability van elk ECM-gebonden signaal. Bovendien kunnen populaire methoden voor celmicropatterning, inclusief microcontactafdrukken, worden bereikt op de substraten om gecontroleerde cellulaire hechting mogelijk te maken om de celvorm te analyseren ten opzichte van andere ECM-gebonden signalen24. Dit is van cruciaal belang omdat lijn patroon substraten, die de verlenging in celpopulaties te bevorderen, bieden een hulpmiddel om na te bootsen en te bestuderen langwerpige en regeneratieve SCs binnen Büngner bands tijdens zenuwregeneratie. Verder, cellulaire morfologie is een krachtige regulator van meerdere celfuncties en kan mogelijk leiden tot verstorende experimentele resultaten, zo niet gecontroleerd26,27. Er wordt nu veel aandacht besteed aan de mechanismen voor het regeneratieve fenotype van de SC, zoals geregeld door ECM-signalen28,29,30. Dit is essentieel om inzicht te geven in het ontwerp van biomaterialen die kunnen worden toegepast als zenuwgeleidingsleidingen voor hulp bij PNS zenuwregeneratie. Deze gedetailleerde protocollen kunnen uiteindelijk worden toegepast als een potentieel instrument om de mechanismen van SC en andere celtypefunctie te ontcijferen zoals gereguleerd door ECM-gebonden signalen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Tunable celcultuur substraat voorbereiding en karakterisering

  1. Substraatbereiding
    1. Meng het PDMS-basiselastome en uithardingsmiddel met behulp van een pipetpunt krachtig bij een verhouding tussen 10:1 en 60:1 tot bellen homogeen verspreid zijn in het mengsel. Verwijder bellen met behulp van vacuüm uitdroging totdat bellen worden afgevoerd.
      OPMERKING: Tijdens PDMS polymerisatie, uithardingsmiddel crosslinks met de basis elastomeer om de uiteindelijke polymeer gewenste mechanische eigenschappen te bieden. Crosslink ratio's kunnen worden aangepast om pdms stijfheid te veranderen.
    2. Plaats een druppel (~0,2 mL) van uitgedroogd PDMS-mengsel op een vierkante of cirkelvormige coverslip (bijvoorbeeld 22 mm x 22 mm) en draai de coverslip op een spincoater bij 2500 rpm voor 30 s.
    3. Incubeer de coverslip in een oven bij 60 °C voor 1-2 uur of kamertemperatuur 's nachts voor PDMS te stollen.
    4. Behandel de coverslip met UV-Ozon cleaner gedurende 7 minuten (UV-golflengte: 185 nm en 254 nm) om het oppervlak hydrofiele te verhogen. Plaats het in een gesteriliseerde 6-put plaat.
    5. Voor gebruik voor celkweek, incubeersubstraten in 70% ethanol gedurende ten minste 30 min.
      LET OP: UV-Ozonreiniger kan ozon genereren dat schadelijk is voor de mens. Werk in een chemische rookkap of met een of andere vorm van ventilatie.
    6. Dompel coverslips onder in de eiwitoplossing (10 μg/mL collageen I, fibronectine of laminine) gedurende 60 minuten in een steriele couveuse bij 37 °C.
      OPMERKING: Na de behandeling met UV-ozon kan het PDMS-oppervlak nog steeds hydrofoob zijn. Draai de putplaat om ervoor te zorgen dat elke coverlip bedekt is met de eiwitoplossing.
    7. Spoel de eiwitoplossing aan en was de coverslip met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) 3x.
    8. Re-suspend RT4-D6P2T Schwann cellijn (SCs) van passaging schotel met behulp van commercieel beschikbare EDTA oplossing (1x) met 2,5% trypsine en tel cellen met hemocytometer. Zaad-SC's op het tunable PDMS-oppervlak bij de gewenste celdichtheid. SC zaaien dichtheden kunnen variëren voor elke verschillende toepassing.
    9. Houd cellen in de gewenste celkweekparameters (90% vochtigheid, 5% CO2,37 °C, enz.) voor de duur van het experiment. Gebruik Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine als het celkweekmedium.
  2. Micropatroon substraatpreparaat preparaat
    1. Teken de gewenste geometrie- en celkleefgebieden (900 μm2, 1.600 μm2 en 2.500 μm2) met behulp van CAD-software (computer-aided design). Maak een chromen fotomasker op basis van die patronen van een commerciële leverancier.
    2. Gebruik in een clean room of stofvrije omgeving standaard fotolithografietechnieken om siliciumwafers te fabriceren (protocollen zijn elders gedetailleerd31). Kritische parameters voor deze specifieke toepassing zijn als volgt: Photoresist: SU-8 2010; Spin profiel om de fotoresist te verspreiden: 500 rpm voor 10 s met een versnelling van 100 rpm /s, dan 3500 rpm voor 30 s met een versnelling van 300 rpm/ s; Blootstellingsenergie van UV-licht: 130 mJ/cm2.
      OPMERKING: De hoogte van patronen op de siliciumwafers is ongeveer 10 μm volgens deze parameters. Potentiële scheuren rond de rand buiten de rechthoekige of driehoekige patronen kunnen worden gezien met behulp van een lichtmicroscoop na stap 1.2.2. Het bakken van de siliciumwafer op 190 °C gedurende 30 min helpt om de scheuren te elimineren.
    3. Plaats de patroon siliciumwafer in een cirkelvormige petrischaal met een diameter van 150 mm x 15 mm hoogte en giet de vergast PDMS (mengverhouding 10:1) zoals bereid in stap 1.1.1 op de siliciumwafer.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de dikte van PDMS ten minste 5 mm is voor gebruiksgemak tijdens microcontact afdrukstappen.
    4. Stollen PDMS op silicium wafer in een oven op 60 °C 's nachts. Laat PDMS afkoelen tot kamertemperatuur. Nauwkeurig gesneden stempels van 30 mm x 30 mm vierkanten met de juiste patronen van de silicium wafer met behulp van een chirurgische scalpel. Beschadig de siliciumwafer niet.
      OPMERKING: Siliciumwafels kunnen op dit moment vele malen worden hergebruikt om meer postzegels te produceren na reiniging met isopropanol.
    5. Steriliseer PDMS-stempels en de tunable coverslips (bereid in stap 1.1.1 tot 1.1.3) door ze gedurende 30 minuten in 70% ethanol onder te dompelen.
    6. Om de werkzaamheid van micropast door PDMS-postzegels na microcontactafdruk te bevestigen, droogt u het oppervlak van PDMS-stempels met behulp van een gefilterde luchtstroom en pipet 50 μg/mL BSA (Texas Red conjugated) oplossing om de gehele patroonzijde van de PDMS-stempel te bedekken.
    7. Incubbate PDMS-stempels met BSA-oplossing voor 1 uur bij kamertemperatuur om eiwitad adsorptie mogelijk te maken.
    8. Droog het oppervlak van tunable coverslips met behulp van een gefilterde luchtstroom, verhoog de hydrofieliteit van het oppervlak zoals beschreven in stap 1.1.5.
    9. Droog de PDMS-stempels aan de lucht om de resterende BSA-oplossing te verwijderen.
      LET OP: Zorg ervoor dat de BSA-oplossing volledig uit de stempel wordt verwijderd, omdat een resterende oplossing ervoor zorgt dat stempels op de covers glijden tijdens het afdrukken van microcontact.
    10. Breng de gedesssorimeter van de stempel in overeenstemming met de tunable coverslip voor BSA-adsorptie op het coverslipoppervlak. Druk de stempel voorzichtig 5 min op de coverlip.
      LET OP: Breng geen overmatige kracht op het stempel, omdat het zal buigen en veroorzaken niet-specifiek contact tussen stempel en coverslip. De juiste hoeveelheid kracht die op de stempel wordt uitgeoefend is essentieel voor succesvol microcontactafdrukken.
    11. Bestudeer het micropatroon met behulp van fluorescentiemicroscoop met een FITC (Fluorescein isothiocyanaat) filter.
    12. Om celkleefgebieden af te drukken in plaats van fluorescerende patronen, vervangt u laminine voor BSA-eiwit en herhaalt u stap 1.2.5 tot 1.2.10.
    13. Verwijder stempels van coverslips, breng coverslips over in een gesteriliseerde 6-well plaat. Voeg 2 mL van 0,2% w/v Pluronic F-127 oplossing in elke put om het oppervlak van de coverslip te dekken en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
      OPMERKING: Pluronic F-127 kan worden geadsorbeerd op PDMS-oppervlak waardoor de hydrofobiciteit van pdms-oppervlak toeneemt om cellen van hechting te blokkeren.
    14. Aspirate Pluronic F-127 oplossing en was 5x met PBS en 1x met de cel kweek medium voor het zaaien van cellen. Een typische zaaidichtheid voor SC's is 1.000 cellen/cm2.
    15. 45 min na celzaaien, verwijder het celkweekmedium en was coverslips met PBS 2x om te voorkomen dat meerdere SC's zich aan hetzelfde patroon houden. Houd cellen in de gewenste celkweekomgeving voor 48 uur voor kwantificering.
    16. Als u celkubstraten met lijnpatroon wilt maken om uitgelijnde cellen te onderzoeken, volgt u stap 1.2.1 tot 1.2.4 om stempels te maken voor afdrukken via microcontact.
      OPMERKING: De afmetingen van de groef/nok van de gevoerde patronen op het stempel zijn 50 μm x 50 μm voor de geschetste cellen. De totale afmetingen van de stempel zijn 10 mm x 10 mm.
    17. Snijd stempels in afmetingen die alleen gewenste lijnpatronen bevatten.
      OPMERKING: Bij het maken van stempels in CAD komt het niet-gepatterde gebied van de stempel rond de lijnpatronen overeen met het celkleefgebied na het afdrukken van microcontact. Zo is het noodzakelijk om niet-gepatterde gebieden te elimineren bij het uitsnijden van de stempel om ervoor te zorgen dat elke SC die op het oppervlak wordt gezaaid, de patronen volgt.
    18. Volg stap 1.1.1 tot 1.1.3 om het tunable PDMS-oppervlak te bereiden dat twee petrischaaltjes bedekt.
      LET OP: Dit zal PDMS zijn die het petrischaaloppervlak zelf bedekken en niet op een coverslip.
    19. Volg stap 1.2.5 tot 1.2.10 om microcontactafdrukken uit te voeren om cellijmgebieden met lijnpatroon af te drukken op een van de met PDMS gecoate petrischaaltjes.
      OPMERKING: Het oppervlak van een petrischaal van 60 mm x 15 mm kan gebieden met lijnpatroon van 6 PDMS-stempels bevatten.
    20. Verwijder stempels en vul de petrischaal met 4 mL van 0,2% w/v Pluronic F-127 oplossing en incubeer gedurende 1 uur.
    21. Na microcontact printen spoelt u elke kant van de PDMS-stempels af met 70% ethanol 3x en droog met lucht. Draai PDMS-stempels en volg stap 1.2.5 tot 1.2.10 om ongepaste celkleefgebied af te drukken met behulp van de ongepaste kant van de stempel op de tweede petrischaal. Herhaal stap 1.2.13.
    22. Aspirate F-127 oplossing uit gerechten, wassen 3x met PBS gevolgd met 1x wassen met behulp van verse cel cultuur medium. Seed SCs op gerechten.
      OPMERKING: De zaaidichtheid voor een schotel met lijnpatroon is 5.000 cellen/cm2 en voor een ongepaste schotel is 10.000 cellen/cm2.
    23. Houd SCs 48 uur onder de gewenste omstandigheden en volg protocollen om SC lysates32voor te bereiden.
      OPMERKING: De celzaaidichtheid voor niet-gepatterde gerechten is 2x hoger dan die voor gerechten met lijnpatroon, omdat de schotel met lijnpatroon slechts de helft van het celkleefgebied van het ongepaste schaal heeft.
      1. Om lysates voor te bereiden, breng voldoende radio-immuunsyxil (RIPA) buffer over naar een 10 mL conische centrifugebuis. Verdun protease en fosfataseremmer (100x) bij een verhouding van 1:100 in RIPA buffer, meng goed door pipetting.
      2. Was cellen met ijskoude PBS (1x) gedurende 2 min, voeg 80 μL van de oplossing bereid vanaf stap 1.2.23.1 op elke cel lijm gebied (het gebied dat contact opgenomen met PDMS stempels en adsorberende eiwitten) binnen petrischaaltjes. Incubbate cellen met de oplossing op een ijsblok gedurende 15 min.
        OPMERKING: De oplossing blijft alleen op celkleefgebied als gevolg van de hydrofobiciteit van Pluronic F-127 adsorptie elders. Deze functie maakt een succesvolle en voldoende eiwitextractie mogelijk voor sc's met lijnpatroon.
      3. Schraap SCs met een celschraper voor 5 min. Verzamel lysate in een gelabelde 1,5 mL microcentrifuge buis.
      4. Microcentrifuge lysaat bij 12, 000 x g gedurende 15 minuten bij 4°C. Verzamel supernatant met een pipet van 1.000 μL en breng over op een schone microcentrifugebuis. Bewaar cellysaat bij -20 °C.
  3. Substraatkarakterisering
    OPMERKING: Om de mechanica van het polymeer op de coverslip te karakteriseren, worden over het algemeen meerdere methoden gebruikt, waaronder bulkcompressietesten11,,33 of atomaire krachtmicroscopietesten34. Dit protocol schetst bulkcompressietests.
    1. Giet de PDMS-voorloper van de gewenste mengverhouding (stap 1.1) in een petrischaal van 30 mm, zorg ervoor dat de dikte van de PDMS-laag in de petrischaal ten minste 20 mm bedraagt.
    2. Verwijder de petrischaal met gestolde PDMS na 1 uur uit de oven van 60 °C en laat afkoelen bij kamertemperatuur. Snijd polymeer in 10 mm x 10 mm vierkanten. Meet de dikte van PDMS met behulp van remklauwen.
    3. Plaats PDMS op het podium van de compressiekrachtmeetmachine. Sluit de compressiekrachtsensor (model: 112C) aan op de sensorpoort en bevestig de sensor op de as van de testmachine.
    4. Stel de hoogte van de sensor aan op ongeveer 0,5 cm boven de PDMS-stempel met behulp van "jog" bediening op het voorpaneel van het instrument.
    5. Open de bijbehorende software met het venster' Installatie testen', selecteer 'Servoprofiel'en open het vensterSegment. In het vensterSegmentvoert u de gewenste "Controlesnelheid" en "Eindbedrag" in voor de test.
      OPMERKING: De controlesnelheid bepaalt de snelheid waarmee de sensor naar het PDMS reist. Eindbedrag bepaalt de totale afstand die de sensor aflegt.
    6. Gebruik de"Z"knop op het bedieningspaneel van de software om alle metingen op dit punt te resetten.
    7. Beweeg de sensor naar beneden om licht contact te maken met PDMS totdat 1-2 newton (N) zijn geladen. De belasting en de afstand die de sensor aflegt, worden weergegeven in de software.
    8. Na gebruik te hebben gemaakt van de "Z" knop, voer meting uit met "Afspelen", en sla de bestandsopnamekracht en afstand op.
    9. Herhaal stap 1.3.3 tot 1.3.8 voor elke experimentele toestand van PDMS.
    10. Open het bestand en gebruik de volgende formule om de Young's modulus (E) van PDMS voor elke verhouding te berekenen. (F = compressiekracht, A = gebied van PDMS-stempel, ∆L = reisafstand van de sensor en L0 = oorspronkelijke dikte van de PDMS-stempel).
      Equation 1

2. Kwantificering van cellulaire eigenschappen op tunable substraten

  1. Proliferatietest
    1. Zaad-SC's op substraten die vanaf stap 1.1.9 worden bereid bij een dichtheid van 5.000 cellen/cm2 in een 6-putplaat. Laat SC's 48 uur uitbroeden in standaard celkweekomstandigheden (37 °C en 5% CO2).
    2. Verdun 12 μL van 10 mM Bromodeoxyuridine (BrdU) voorraadoplossing tot 12 mL van 37 °C celkweekmedium, meng goed met pipet om 10 μ BrdU-etiketteringsoplossing te maken.
    3. Verwijder het celkweekmedium en was 2x SC's met PBS.
    4. Voeg 2 mL BrdU-labeloplossing toe aan elke put en broed 2 uur in.
      OPMERKING: De incubatietijd van de BrdU-etiketteringsoplossing is afhankelijk van de specifieke celproliferatiesnelheid. De RT4-D6P2T SC lijn heeft een hoge proliferatie snelheid, zodat 2 uur van de incubatietijd werd gebruikt.
    5. Verwijder de BrdU-etiketteringsoplossing en was 3x SC's met PBS. Voeg 1 mL van 3,7% formaldehyde in PBS toe aan elke put en broed bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten voor celfixatie.
      LET OP: Formaldehyde is een kankerverwekkende stof bij de mens; voer daarom alle werkzaamheden uit in een chemische rookkap met de juiste bescherming.
      OPMERKING: Bij het wassen met PBS is er geen celkweekmedium in de put, en dus kan het PDMS-oppervlak hydrofoob zijn. Neem voorzorgsmaatregelen om het oppervlak van het substraat niet volledig te drogen om celschade te voorkomen.
    6. Aspirate formaldehyde oplossing en was 3x met PBS (3 min per stuk). Verwijder PBS en voeg 1 mL van 0,2% Triton X-100 in PBS toe aan elke put om het celmembraan te doorgronden. Incubeer SC's met Triton X-100-oplossing voor 20 minuten bij kamertemperatuur.
    7. Verwijder triton X-100 oplossing en was SCs 3x met PBS (3 min per stuk).
    8. Voeg 1 mL van 1 N HCl in elke put en incubeer op ijs gedurende 10 min. Verwijder 1 N HCl en voeg 1 mL van 2 N HCl in elke put en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min. HCl behandeling is voor DNA hydrolyse.
    9. Meng 182 mL van 0,2 mM Na2HPO4 en 18 mL van 0,1 mM citroenzuur om een fosfaat/citroenzuurbuffer voor antigeen retrieval te produceren. Verwijder 2 N HCl en voeg 1 mL fosfaat/citroenzuurbuffer toe aan elke put en broed op kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
    10. Was SC's 3x met 0,2% Triton X-100 in PBS. Voeg 2 mL van 3% runderserum albumine (BSA) in PBS in elke put en broed gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur om niet-specifieke binding van het antilichaam te klokken.
    11. Verdun brdu primair antilichaam geconjugeerd met Alexa Fluor 488 in 3% BSA-oplossing bij een verhouding van 1:300 voor BrdU-kleuroplossing. Incubeer SCs met kleuring oplossing 's nachts bij kamertemperatuur, terwijl de plaat is bedekt met aluminiumfolie.
    12. Om proliferatie te kwantificeren, beeld-SC's met behulp van de FITC en DAPI kanaal van een fluorescerende microscoop om BrdU en kernen te detecteren, respectievelijk. Sla afbeeldingen op als "nd.2"-bestanden.
    13. Open "nd.2" bestanden voor elke afbeelding genomen op identieke ruimtelijke posities.
    14. Open de software voor beeldanalyse. Klik met de rechtermuisknop op de achtergrond om het venster "Geautomatiseerde meetresultaten" en "Geautomatiseerde meting" te openen in het gedeelte van "Analysis Control".
    15. Selecteer 'Count & Taxonomie'in het menu ' Tellen & Taxonomie ' selecteer 'Telling'. Klik op de AFBEELDING van FITC op elke kern met groene fluorescentie (BrdU-positief) en klik met de rechtermuisknop op de afbeelding.
      OPMERKING: Het aantal BrdU-positieve cellen wordt weergegeven in het venster van "Automatiseringen en metingen".
    16. Herhaal stap 2.1.14 om het aantal totale kernen te tellen voor DAPI-afbeeldingen. Bereken het percentage BrdU-positieve cellen voor deze afbeelding.
    17. Herhaal stap 2.1.13 tot en met 2.1.16 voor andere afbeeldingen voor statistische doeleinden en bereken het gemiddelde percentage BrdU-positieve cellen voor elke substraatconditie.
  2. Kwantificering van c-Jun expressie door immunofluorescente beeldanalyse
    1. Cellen die vanaf stap 1.1.9 en 1.2.23 in 6-putplaten zijn bereid, worden vastgemaakt en doordrongen van de eerder beschreven procedures (stap 2.1.5-2.1.7).
      OPMERKING: Als u nauwkeurige vergelijkingen van fluorescerende intensiteit wilt uitvoeren tussen cellen met verschillende ECM-omstandigheden, past u camera-instellingen identiek toe op alle monsters met alle monsters met dezelfde parameters.
    2. Sla afbeeldingen op als ".nd2"-bestanden.
    3. Open de software voor beeldanalyse. Klik met de rechtermuisknop op de achtergrond om het venster "Geautomatiseerde meetresultaten" en "Geautomatiseerde meting" in het gedeelte van "Analysis Control" te openen.
    4. Selecteer in "Geautomatiseerde meetresultaten"" Objectgegevens". Activeer de knop'Meten bijhouden'.
    5. Selecteer in het bovenste paneel van de software "Meet" gevolgd door "Objectfuncties". Voeg "Gemiddelde intensiteit" toe aan het gedeelte van " Geselecteerdvoor meting".
    6. Open en voeg twee ".nd2"-afbeeldingsbestanden die afbeeldingen van c-Jun en kernen bevatten.
    7. Selecteer in het bovenste paneel" ROI" en selecteer "Rechthoekige ROI tekenen". Teken een rechthoekig gebied met het nucleaire gebied van een enkele cel.
      LET OP: c-Jun expressie is geconcentreerd in kernen35.
    8. Selecteer in het bovenste paneel van software "Binair" en "Drempel definiëren", een nieuw venster om c-Jun fluorescerend gebied nauwkeurig te definiëren.
    9. Klik in een nieuw venster op "Volledige afbeelding/ROI gebruiken" om het programma over te schakelen van volledig beeldmodel naar het ROI-model. Gebruik 'Intensiteit' om de opzoektabel aan de linkerkant van het venster aan te passen voor aanpassing van de grootte/vorm van het gemarkeerde gebied binnen de rechthoekige ROI.
      LET OP: Zorg ervoor dat de grootte/vorm van het gemarkeerde gebied identiek is aan de kern.
    10. Klik op de knop" OK" om de gemiddelde FITC-intensiteit in het venster van "Geautomatiseerde meetresultaten" te krijgen en klik vervolgens op" Winkelgegevens".
    11. In het venster van "Geautomatiseerd meten", "Object verwijderen" om rood gemarkeerd gebied te verwijderen. Gebruik in het linkerzijpaneel "Het gereedschap Wijzen" om de rechthoekige ROI te selecteren en te verwijderen.
    12. Herhaal stap 2.2.6 tot 2.2.11 om de gemiddelde FITC-intensiteit voor elke extra cel te meten.
    13. Selecteer "Opgeslagen" in vensteroppervlak van "Geautomatiseerde meetresultaten" en alle opgeslagen gegevens worden gepresenteerd. Gebruik de functieExporterenen selecteer 'Gegevens naar Excel' om de geëxporteerde spreadsheet op te slaan en aanvullende berekeningen uit te voeren.
  3. Kwantificeren van nucleaire rek
    1. Fix en permeabilize SCs bereid vanaf stap 1.2.22 volgende stappen 2.1.5-2.1.7. Voer nucleaire vlekken uit met behulp van montagemedium met DAPI.
    2. Met behulp van de DAPI kanaal en een 40x objectieve lens, het verwerven van beelden van het monster en op te slaan als ".nd2" bestanden.
    3. Volg stap 2.2.3 en 2.2.4 om het venster" Automated Measurement Results" en " AutomatedMeasurement" venster in de beeldanalysesoftware te openen.
    4. Gebruik in "Geautomatiseerde meetresultaten" de functie "Optie" gevolgd door "Selecteer Object Functie". Selecteer in de kolom Functie "Functie"" Rek" en voeg toe aan de kolom Geselecteerd voormetingen. Gebruik "Meting bijhoudenhouden " om deze functie te activeren.
    5. Open het afbeeldingsbestand "nd.2" dat de nucleaire afbeeldingen bevat. Selecteer in het vensterGeautomatiseerd metende functieAutomatisch detecterenen selecteer een kern. Klik met de rechtermuisknop op de afbeelding en de gemeten nucleaire beeldverhouding wordt weergegeven in "Automated Measurement Results".
    6. Herhaal stap 2.3.5 om nucleaire beeldverhoudingen te kwantificeren voor andere kernen in het beeld. Selecteer "Winkelgegevens" in het venster van "Automatische meetresultaten".
    7. Herhaal 2.3.5 tot 2.3.6 voor extra afbeeldingen. Exporteer de gegevens naar een spreadsheetbestand zoals eerder gedaan in 2.2.13 voor analyse.
  4. Westerse vlek om eiwitexpressie te kwantificeren
    1. Volg standaardprotocollen voor westerse vlekanalyse die elders gedetailleerd is32. De verdunningen van antilichamen die in het onderzoek worden gebruikt, worden hieronder weergegeven: Konijn anti c-jun 1:2.000; Muis anti β-actin 1:1.000; Konijn anti p75NTR 1:1,000; Konijn anti myeline basiseiwit 1:1.000; Anti-muis/konijn IgG, HRP-gekoppeld antilichaam 1:10.000.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Om het samenspel tussen substraatstijfheid en eiwitsamenstelling op SC-fenotype te analyseren en te kwantificeren, werd een tunable PDMS-celkubstraat ontwikkeld(figuur 1A). Compressietesten van het polymeer op verschillende basis: de verhoudingen van het uithardingsmiddel werden gebruikt om de modulus (E) van de Young (E) van het substraat te kwantificeren (figuur 1B). Het resulterende bereik van moduluswaarden vertegenwoordigt fysiologisch relevante substraatcondities. Na de voorbereiding van substraten werden SC's gekweekt en cellulaire eigenschappen geanalyseerd op de tunable micro-omgeving. Proliferatiepercentages van SC's op substraten van verschillende eiwitsamenstelling werden eerst geanalyseerd. Laminin gecoate substraten resulteerde in een hogere proliferatie in vergelijking met collageen I en fibronectine adsorptie alle op 10 μg /mL (Figuur 2A,B). SC's op substraten met lamininecoating en verschillende moduli toonden aan dat relatief zachtere substraten (E=3.85kPa) de celproliferatiepercentages in alle omstandigheden verminderen(figuur 2C,D). De verschillen tussen stijve substraten (E=1119kPa) en relatief zachte substraten (E=8.67kPa) waren echter onbeduidend(figuur 2D).

SCs werden ook geanalyseerd voor eiwitexpressie door middel van immunohistochemie en westerse vlek. Niveaus van transcriptiefactor c-Jun werden geanalyseerd door immunofluorescente microscopie(figuur 3A) en vertegenwoordigd door de gemiddelde pixel fluorescerende intensiteit (figuur 3B-D). c-Jun expressie bleek te zijn upregulated als substraten werd zachter (E = 1119 kPa naar E = 8,67 kPa), echter, op de zachtste substraten (E = 3,85 kPa), c-Jun expressie was aanzienlijk downregulated. Op stijve substraten (E=1119 kPa), collageen ik gecoate substraten resulteerde in de hoogste c-Jun expressie, maar als substraten werd zachter (E = 8,67 kPa en 3,85 kPa), laminine toonde de hoogste niveaus van c-Jun (Figuur 3E). Western blot werd ook gebruikt om zowel c-Jun en myeline basiseiwit (MBP) te analyseren met c-Jun niveaus upregulated en MBP downregulated op zachtere substraten (Figuur 3F). Verder, SCs gezaaid op laminine gecoate substraten resulteerde in de hoogste c-Jun expressie in vergelijking met collageen I en fibronectine.

Cellen van verschillende zaaien dichtheden werden vervolgens gekweekt en gekleurd met rhodamine-phalloidin om de rol van cel verspreiding en gebied in c-Jun expressie te verkennen (Figuur 4A,B). Om de nucleaire verlenging van cellen te controleren, werd een gemeenschappelijke micropatterningtechniek (microcontact printing36)gebruikt om celkleeflijnen op de cellenkweeksubstraten te creëren. De kernverhouding van cellen die op een substraat met een lijnpatroon zijn gezaaid, bleek aanzienlijk hoger te zijn dan cellen die op niet-gepaste substraten zijn gezaaid (figuur 4C,D). Het bleek dat de expressie van zowel c-Jun en een andere marker significant in SC regeneratieve fenotypes, p75 neurotrofine receptor (p75 NTR), werden upregulated in dichte cellen met een kleiner verspreidingsgebied (Figuur 4E). Cellen met lijnpatroon resulteerden ook in een hogere expressie van zowel c-Jun als p75 NTR in vergelijking met niet-gepaterde cellen (figuur 4F). Daarom zijn microcontactprintcellijmgeometrieën gemaakt om het verspreidingsgebied en de rek nauwkeurig te controleren, terwijl celcelinteracties worden geëlimineerd(figuur 5A). Afmetingen van de totale celkleefgebieden waren 900 μm2, 1.600 μm2en 2.500 μm2 met een beeldverhouding van 1 of 4 (cellengte: celbreedte). Fluorescerende boviene serum albumine (fBSA, Texas red) kleuring werd gebruikt om de status van micropatronen op celkweek substraat onthullen na microcontact afdrukken (Figuur 5B). De nucleaire beeldverhouding van SC's voor elk celgebied werd gemeten en werd aangetoond dat door het verhogen van de nucleaire beeldverhouding de cellulaire verlenging toeneemt(figuur 5C). Bovendien, naarmate de SC-beeldverhouding toenam, werd c-Jun verhoogd(figuur 5D). Interessant is echter dat als cel verspreiden gebied verhoogt c-Jun expressie is downregulated (Figuur 5E). Immunofluorescentie kleuring voor zowel kernen als actine bevestigde cel verspreiding gebied en rek werden sterk gecontroleerd door middel van deze micropatterning methode (Figuur 5F).

Figure 1
Figuur 1: Celkweeksubstraten met tunable stijfheid en eiwitsamenstelling. (A) Schematisch met de ontwikkeling van PDMS-celkweeksubstraten. (B) De initiële PDMS mengverhouding van de basis: uithardingsmiddel bepaalt young's modulus. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: SC proliferatie tarieven geregeld door substraat stijfheid en eiwitsamenstelling. (A) Representatieve afbeeldingen waarop BrdU-vlekken worden weergegeven wanneer deze worden gekweekt op substraten van dezelfde modulus. (B) Histogram met het percentage BrdU-positieve cellen voor elke eiwitcoating. cC) representatieve afbeeldingen waarop brdu-integratie in SC's is gezaaid op substraten van dezelfde eiwitcoating. (D) Histogram met het percentage BrdU-positieve cellen voor de moduluswaarde van elke jongen. Schaalbalken = 50 μm. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. *p < .05, **p < .005, ***p < .0005. Delen van het cijfer zijn gewijzigd van ref.24. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Substraatstijfheid en eiwitgereguleerde SC-eiwitexpressie. (A) Representatieve afbeeldingen tonen c-Jun immunofluorescentie vlekken voor SK's gezaaid op substraten van verschillende stijfheid en eiwitsamenstelling. Gemiddelde pixel fluorescerende intensiteit van c-Jun werd gemeten voor SC's gezaaid op (B) collageen I (C) fibronectin en (D) laminine gecoate substraten van verschillende stijfheid. (E) c-Jun fluorescentieniveau van SK's gegroepeerd door Young's modulus van substraat. (F) Westelijke vlek met c-Jun en myeline basiseiwit (MBP) van SC's die op substraten zijn gezaaid. Glyceraldehyde 3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH) werd gebruikt als ladingscontrole. Schaalbalk = 50 μm. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. *p < .05, **p < .005, ***p < .0005. Delen van het cijfer zijn gewijzigd van ref.24. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Cellulair verspreidingsgebied beïnvloedt de eiwitexpressie van SC's. (A) Cel verspreiden gebied van verschillende zaaien dichtheden werd gevisualiseerd door rhodamine-phalloidin (rood) en kernen kleuring (blauw). (B) Histogram met het gemiddelde verspreidingsgebied van SC's in elke toestand. (C) De kernen van SC's die op niet-gepatterde substraten of lijnpatronen waren gezaaid, waren bevlekt met DAPI (blauw) om morfologie aan te tonen. (D) Histogram met kwantificering van de kernverhouding op gedessineerde en niet-gepatterde substraten. (E) Westelijke vlek met expressie van c-Jun en p75NTR van cellen met een verschillend verspreidingsgebied. (F) Westelijke vlek die de eiwitexpressie van SK's op niet-gepatterde en line-patroon substraten vertoont. Schaalbalk = 50 μm. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. *p < .05, **p < .005, ***p < .0005. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: SC morfologie en rekimpact c-Jun expressie van SC's. (A) Schematisch met celmicropatronen voor vormen met een verschillende beeldverhouding. (B) fBSA-kleuring (rood) met de vorm van micropatronen na afdrukken via microcontact. Schaalbalk = 10 μm. (C) Histogram met kernverhouding van micropatroon-SK's. (D, E) Histogram met de gemiddelde pixel fluorescerende intensiteit van c-Jun voor elk van de geometrische omstandigheden. (F) Rhodamine-phalloidin (rood), kernen (blauw) en c-Jun (groen) werden gekleurd op de verschillende micropatronen. Schaalbalk = 10 μm. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. *p < .05, **p < .005, ***p < .0005. Delen van het cijfer zijn gewijzigd van ref.24. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

SCs kunnen bevorderen zenuwregeneratie als gevolg van hun fenotypische transformatie en regeneratieve potentieel na zenuwletsel. Echter, hoe ECM cues reguleren deze regeneratieve capaciteit blijft meestal onduidelijk, potentieel belemmeren niet alleen de ontwikkeling van biomaterialen die gericht zijn op zenuwregeneratie te bevorderen, maar ook het begrip van de mechanismen die betrokken zijn bij zenuwregeneratie. Om te beginnen met dit samenspel te onderzoeken, celkweek substraten werden gemaakt waar ECM cues zoals stijfheid, eiwit coating, en lijm topografie kan worden gecontroleerd. De mogelijkheid om micropattern lijm topografie is een belangrijk kenmerk binnen het protocol, gebruik te maken van de gemeenschappelijke methode van microcontact afdrukken. Dit substraat is echter anders dan het glas, omdat de compressiekracht die op de PDMS-stempels wordt uitgeoefend, op een passend niveau moet zijn om de gewenste vorm van celkleefgebieden op celkweeksubstraten te bereiken. Door fluorescerende runderserumalbumine (fBSA) te gebruiken als modeleiwit om celkleefgebieden te visualiseren en de compressiekrachten op de PDMS-stempels aan te passen, kan dit probleem uiteindelijk worden verholpen. Een ander belangrijk verschil met glas is het verwijderen van overtollige Pluronic F-127 die wordt gebruikt om de rest van het substraat niet-lijm. Na deze behandeling zijn de cellenkweeksubstraten zeer hydrofoob, waardoor het een uitdaging is om natte celkweeksubstraten te behouden tijdens wasbeurten, wat belangrijk is voor de structurele integriteit van micropatronend eiwit37. Daarom wordt aanbevolen om meerdere pipetten te gebruiken om oplossingen bijna gelijktijdig te aspireren en te injecteren om te voorkomen dat substraten volledig uitdrogen.

Hoewel micropatterning de vorm van cellen nauwkeurig kan controleren en geen ingewikkelde synthetische procedures vereist met behulp van celblokkeringspolymeren polymeren zoals OEGMA, zijn de methoden die worden gebruikt om de eiwitexpressie van micropatronen te kwantificeren soms beperkt38. Monsters die beschikbaar zijn bij micropatronen zijn bijvoorbeeld over het algemeen beperkt tot een paar honderd cellen per coverslip, wat onvoldoende is om cellysates voor te bereiden om te worden gebruikt voor westerse vlekken of qPCR. Gezien dit, immunofluorescentie kleuring alleen werd gebruikt om eiwitexpressie voor micropatterned cellen kwantificeren, het beperken van de verscheidenheid van eiwitten die kunnen worden gekwantificeerd. Om dit aan te pakken, gebruikten we lijnpatronen om celverlenging te bevorderen voor grotere celpopulaties en met succes cellysates te bereiden die door westerse vlek werden geanalyseerd. Andere methoden zoals toegepaste elektrische velden of uitgelijnde elektrospunvezels kunnen ook worden toegepast om de verlenging van celpopulaties39,40te regelen . Elektrische velden passen echter mogelijk niet in alle toepassingen voor NGO's, aangezien de geleidbaarheid van veelgebruikte biomaterialen zoals polymeer op basis van collageen en zijde zeer laag is28,41,42. Daarentegen zijn uitgelijnde elektrospun nanovezels met succes geïmplanteerd in NGO's om sc-uitlijning, rek en migratie te bevorderen, evenals neurite-uitgroei43,44. Het kan ook dwingend blijken om SC-gedrag op line-patterned substraten te vergelijken met die op substraten met uitgelijnde nanovezels, aangezien gevoerde patronen en uitgelijnde nanovezels twee van de meest voorkomende geleidingsmechanismen zijn die zijn opgenomen in NGO's45.

Het gedetailleerde micropatterningprotocol maakt gebruik van PDMS gecoate coverslips als celkweeksubstraten, met een maximaal oppervlak Young's modulus van 1119 kPa. Dergelijke stijfheid bootst veel weefsel na, maar het is misschien niet mogelijk om osteogenese van mesenchymale stamcellen te modelleren, die over het algemeen vereisen dat de modulus van de jongen van het oppervlak meer dan 1 Gpa46bedraagt. Voor dergelijke situaties is glas een alternatieve kandidaat, maar de adsorptie van Pluronic F-127 vereist relatief hoge oppervlaktehydrofobiteit die glas niet bezit. Om de hydrofobeiteit te verhogen, kan glas worden behandeld met dimethyl dichlorosilane in dichloorbenzene. Hierna kan uv-ozonbehandeling worden gebruikt om de hydrofielheid voor microcontactprinten te verhogen47.

Uiteindelijk werd een celcultuurplatform ontwikkeld waar ECM-stimuli individueel kunnen worden afgestemd met kwantificeerde eiwitexpressie. We hebben vastgesteld dat sc regeneratieve capaciteit wordt bevorderd door bepaalde mechanische en chemische ECM-signalen, die vervolgens inspiratie kunnen bieden in het toekomstige ontwerp van biomateriaaltoepassingen zoals NGO's en celtransplantatieprocessen waarbij ECM-kenmerken mogelijk moeten worden geoptimaliseerd24. Niettemin kan het afstemmen van deze ECM-signalen een uitdagende onderneming zijn, met name in vivo. Vooruit, dit platform kan worden gebruikt om belangrijke mechanismen die betrokken zijn bij de fenotypische overgang van SCs ontleden, zoals gereguleerd door de ECM. Door dit te bereiken, kan manipulatie van intracellulaire signalen mogelijk zijn om sc regeneratieve capaciteit te bevorderen zonder de noodzaak van speciale platforms in vitro48,49. Dit heeft het potentieel voor baanbrekend werk in de ontwikkeling van technologieën voor zenuwreparatie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen potentiële belangenconflict werd gemeld door de auteurs.

Acknowledgments

De auteurs erkennen dankbaar de financiering steun van de Universiteit van Cincinnati. De auteurs bedanken ook Ron Flenniken van de Universiteit van Cincinnati Advanced Materials Characterization laboratorium voor ondersteuning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Albumin from Bovine Serum (BSA), Texas Red conjugate Thermo Fisher Scientific A23017 BSA staining to show micropatterns
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7076S Antibody used for western blot analysis
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074S Antibody used for western blot analysis
BrdU Thermo Fisher Scientific B23151 Reagent used to measure cell proliferation
BrdU primary antibody conjugated with Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific B35130 Used to visualize BrdU in cell proliferation assays
Collagen I Thermo Fisher Scientific A10483-01 Protein used to coat coverslips
Compression force test machine TestResources Instrument to quantify mechanical properties of polymers
Dulbecco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher Scientific 11965092 Cell culture medium
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 16000044 Cell culture medium supplemental
Fibronectin Thermo Fisher Scientific 33010-018 Protein used to coat coverslips
Fluorescence microscope Nikon Eclipse Ti2 Fluorescence microscope
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) Thermo Fisher Scientific 78440 Protease and Phosphatase Inhibitor
Laminin Thermo Fisher Scientific 23017015 Protein used to coat coverslips
Mounting medium with DAPI Thermo Fisher Scientific P36971 Coverslip mountant and nuclei staining
Mouse c-Jun primary antibody Thermo Fisher Scientific 711202 Primary antibody to visualize c-Jun protein
Mouse β-Actin primary antibody Cell Signaling Technology 3700S Loading control for western blot experiments
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 Cell culture medium supplemental
Photoresist SU 2010 KAYAKU SU8-2010 Photoresist
Pluronic F-127 Sigma Aldrich P-2443 Block non-specific protein binding
Rabbit c-Jun primary antibody Cell Signaling Technology 9165S Primary antibody for visualization of c-Jun protein
Rabbit myelin basic protein primary antibody Abcam ab40390 Primary antibody for visualization of MBP
Rabbit p75NTR primary antibody Cell Signaling Technology 8238S Primary antibody for visualization of p75NTR
Rhodamine phalloidin Thermo Fisher Scientific R415 Visualization of cell cytoskeleton
RIPA buffer Abcam ab156034 Cell lysis buffer
RT4-D6P2T Schwann cell line ATCC CRL-2768 Cell line used in experiments
SYLGARD 184 PDMS base and curing agent Sigma Aldrich 761036 Tunable polymer used to coat coverslips
Trypsin Thermo Fisher Scientific 15090-046 Cell dissociation reagent
UV-Ozone cleaner Novascan Increase hydrophicility of PDMS
Versene (1x) Thermo Fisher Scientific 15040066 Cell dissociation reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Taylor, C. A., Braza, D., Rice, J. B., Dillingham, T. The Incidence of Peripheral Nerve Injury in Extremity Trauma. American Journal of Physical Medicine & Rehabilitation. 87, 381-385 (2008).
  2. Noble, J., Munro, C. A., Prasad, V. S. S. V., Midha, R. Analysis of Upper and Lower Extremity Peripheral Nerve Injuries in a Population of Patients with Multiple Injuries. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 45, 116-122 (1998).
  3. Jessen, K. R., Mirsky, R. The repair Schwann cell and its function in regenerating nerves. Journal of Physiology. 594, 3521-3531 (2016).
  4. Arthur-Farraj, P. J., et al. c-Jun Reprograms Schwann Cells of Injured Nerves to Generate a Repair Cell Essential for Regeneration. Neuron. 75, 633-647 (2012).
  5. Jessen, K. R., Mirsky, R. The Success and Failure of the Schwann Cell Response to Nerve Injury. Frontiers in Cell Neurosciences. 13, 33 (2019).
  6. Gomez-Sanchez, J. A., et al. After Nerve Injury, Lineage Tracing Shows That Myelin and Remak Schwann Cells Elongate Extensively and Branch to Form Repair Schwann Cells, Which Shorten Radically on Remyelination. Journal of Neuroscience. 37 (37), 9086-9099 (2017).
  7. Deumens, R., et al. Repairing injured peripheral nerves: Bridging the gap. Progress in Neurobiology. 92, 245-276 (2010).
  8. Höke, A., Gordon, T., Zochodne, D. W., Sulaiman, O. A. R. A decline in glial cell-line-derived neurotrophic factor expression is associated with impaired regeneration after long-term Schwann cell denervation. Experimental Neurology. 173, 77-85 (2002).
  9. Jones, S., Eisenberg, H. M., Jia, X. Advances and future applications of augmented peripheral nerve regeneration. International Journal of Molecular Sciences. 17, 1-17 (2016).
  10. Harris, G. M., et al. Nerve Guidance by a Decellularized Fibroblast Extracellular Matrix. Matrix Biology. 60-61, 176-189 (2017).
  11. Harris, G. M., Piroli, M. E., Jabbarzadeh, E. Deconstructing the Effects of Matrix Elasticity and Geometry in Mesenchymal Stem Cell Lineage Commitment. Advanced Function Mater. 24 (16), 2396-2403 (2014).
  12. Pryzhkova, M. V., Harris, G. M., Ma, S., Jabbarzadeh, E. Patterning pluripotent stem cells at a single cell level. Journal of Biomaterials and Tissue Engineering. 3 (4), 461-471 (2013).
  13. Engler, A. J., Sweeney, H. L., Discher, D. E., Schwarzbauer, J. E. Extracellular matrix elasticity directs stem cell differentiation. Journal of Musculoskeleton and Neuronal Interaction. 7 (4), 335 (2007).
  14. Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
  15. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  16. Pickup, M. W., Mouw, J. K., Weaver, V. M. The extracellular matrix modulates the hallmarks of cancer. EMBO Reports. 15, 1243-1253 (2014).
  17. Chernousov, M. A., Carey, D. J. Schwann cell extracellular matrix molecules and their receptors. Histology and Histopathology. 15, 593-601 (2000).
  18. Shibata, S., et al. Selective Laminin-Directed Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Distinct Ocular Lineages. Cell Reports. 25 (6), 1668-1679 (2018).
  19. Mcbeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell Shape, Cytoskeletal tenstion and RhoA regulate stem cell lineage committment. Developmental Cell. 6, 483-495 (2004).
  20. Halder, G., Dupont, S., Piccolo, S. Transduction of mechanical and cytoskeletal cues by YAP and TAZ. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13, 591-600 (2012).
  21. Jessen, K. R., Mirsky, R. The repair Schwann cell and its function in regenerating nerves. Journal of Physiology. 594 (13), 3521-3531 (2016).
  22. Lopez-Fagundo, C., Bar-Kochba, E., Livi, L. L., Hoffman-Kim, D., Franck, C. Three-dimensional traction forces of Schwann cells on compliant substrates. Journal of The Royal Society Interface. 11, 20140247 (2014).
  23. Gu, Y., et al. The influence of substrate stiffness on the behavior and functions of Schwann cells in culture. Biomaterials. 33, 6672-6681 (2012).
  24. Xu, Z. Y., Orkwis, J. A., DeVine, B. M., Harris, G. M. Extracellular matrix cues modulate Schwann cell morphology, proliferation, and protein expression. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. , (2019).
  25. Urbanski, M. M., et al. Myelinating glia differentiation is regulated by extracellular matrix elasticity. Scientific Reports. 6, 1-12 (2016).
  26. Sun, Y., et al. Tunable stiffness of graphene oxide/polyacrylamide composite scaffolds regulates cytoskeleton assembly. Chemical Sciences. 9 (31), 6516-6522 (2018).
  27. Hwang, J. H., et al. Extracellular matrix stiffness regulates osteogenic differentiation through MAPK activation. PLoS One. 10, 1-16 (2015).
  28. Ryan, A. J., et al. A Physicochemically Optimized and Neuroconductive Biphasic Nerve Guidance Conduit for Peripheral Nerve Repair. Advanced Healthcare Materials. 6, 1-13 (2017).
  29. Du, J., et al. Prompt peripheral nerve regeneration induced by a hierarchically aligned fibrin nanofiber hydrogel. Acta Biomaterialia. 55, 296-309 (2017).
  30. Huang, L., et al. A compound scaffold with uniform longitudinally oriented guidance cues and a porous sheath promotes peripheral nerve regeneration in vivo. Acta Biomaterialia. 68, 223-236 (2018).
  31. Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices. Jouranl of Visualized Experiments. (119), e55276 (2017).
  32. Gupta, R., et al. Shear stress alters the expression of myelin-associated glycoprotein (MAG) and myelin basic protein (MBP) in Schwann cells. Journal of Orthopaedic Research : Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 23, 1232-1239 (2005).
  33. Harris, G. M., Shazly, T., Jabbarzadeh, E. Deciphering the combinatorial roles of geometric, mechanical, and adhesion cues in regulation of cell spreading. PLoS One. 8 (11), (2013).
  34. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  35. Schreck, I., et al. C-Jun localizes to the nucleus independent of its phosphorylation by and interaction with JNK and vice versa promotes nuclear accumulation of JNK. Biochemical and Biophysical Research Communications. 407, 735-740 (2011).
  36. Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact printing of proteins for cell biology. Journal Visualized Experiments. (22), e1065 (2008).
  37. Treter, J., et al. Washing-resistant surfactant coated surface is able to inhibit pathogenic bacteria adhesion. Applied Surface Science. 303, 147-154 (2014).
  38. Lutz, J. F. Polymerization of oligo(ethylene glycol) (meth)acrylates: Toward new generations of smart biocompatible materials. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 46 (11), 3459-3470 (2008).
  39. Marcus, M., et al. Interactions of Neurons with Physical Environments. Advanced Healthcare Materials. 6, (2017).
  40. Pu, J. Golgi polarization in a strong electric field. Journal of Cell Science. 118, 1117-1128 (2005).
  41. Blaker, J. J., et al. Bioactive Silk-Based Nerve Guidance Conduits for Augmenting Peripheral Nerve Repair. Advanced Healthcare Materials. 7, 1800308 (2018).
  42. Daly, W., Yao, L., Zeugolis, D., Windebank, A., Pandit, A. A biomaterials approach to peripheral nerve regeneration : bridging the peripheral nerve gap and enhancing functional recovery. Journal of the Royal Society of Interface. 9 (67), 202-221 (2012).
  43. Xia, H., et al. Directed neurite growth of rat dorsal root ganglion neurons and increased colocalization with Schwann cells on aligned poly(methyl methacrylate) electrospun nanofibers. Brain Research. 1565, 18-27 (2014).
  44. Wang, H. B., Mullins, M. E., Cregg, J. M., McCarthy, C. W., Gilbert, R. J. Varying the diameter of aligned electrospun fibers alters neurite outgrowth and Schwann cell migration. Acta Biomaterialia. 6, 2970-2978 (2010).
  45. Carvalho, C. R., Oliveira, J. M., Reis, R. L. Modern Trends for Peripheral Nerve Repair and Regeneration: Beyond the Hollow Nerve Guidance Conduit. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 337 (2019).
  46. Yang, Y., Wang, K., Gu, X., Leong, K. W. Biophysical Regulation of Cell Behavior - Cross Talk between Substrate Stiffness and Nanotopography. Engineering. 3, 36-54 (2017).
  47. Tan, J. L., Liu, W., Nelson, C. M., Raghavan, S., Chen, C. S. Simple Approach to Micropattern Cells on Common Culture Substrates by Tuning Substrate Wettability. Tissue Engineering. 10, 865-872 (2004).
  48. Grove, M., et al. YAP/TAZ initiate and maintain schwann cell myelination. Elife. 6, 1-27 (2017).
  49. Poitelon, Y., et al. YAP and TAZ control peripheral myelination and the expression of laminin receptors in Schwann cells. Nature Neuroscience. 19, 879-887 (2016).

Tags

Deze maand in JoVE Schwann cellen perifere zenuw matrix stijfheid extracellulaire matrix micropatterning cel fenotype plasticiteit celvorm
Voorbereiding van Tunable Extracellular Matrix Microenvironments om Schwann Cell Phenotype Specification te evalueren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xu, Z., Orkwis, J. A., Harris, G. M. … More

Xu, Z., Orkwis, J. A., Harris, G. M. Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification. J. Vis. Exp. (160), e61496, doi:10.3791/61496 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter