Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Hele Animal Imaging af Drosophila melanogaster ved hjælp af microcomputed tomografi

Published: September 2, 2020 doi: 10.3791/61515

Summary

En protokol præsenteres, der giver mulighed for visualisering af intakt Drosophila melanogaster på ethvert udviklingsstadium ved hjælp af mikrocomputeret tomografi.

Abstract

Biomedicinske billeddannelsesværktøjer gør det muligt at undersøge molekylære mekanismer på tværs af rumlige skalaer, fra gener til organismer. Drosophila melanogaster, en velkarakteriseret modelorganisme, har nydt godt af brugen af lys- og elektronmikroskopi til at forstå genfunktion på niveau med celler og væv. Anvendelsen af billeddannelsesplatforme, der giver mulighed for en forståelse af genfunktion på hele den intakte organisme, vil yderligere øge vores viden om genetiske mekanismer. Her præsenteres en hel dyrebilleddannelsesmetode, der skitserer de trin, der er nødvendige for at visualisere Drosophila på ethvert udviklingsstadium ved hjælp af mikrokompliceret tomografi (μ-CT). Fordelene ved μ-CT omfatter kommercielt tilgængelige instrumentering og minimal hands-on tid til at producere nøjagtige 3D-oplysninger på mikron-niveau opløsning uden behov for væv dissektion eller clearing metoder. Parret med software, der fremskynder billedanalyse og 3D-rendering, detaljeret morfometrisk analyse af ethvert væv eller organsystem kan udføres for bedre at forstå mekanismer for udvikling, fysiologi og anatomi for både beskrivende og hypotese test undersøgelser. Ved at udnytte en billeddannelse arbejdsgang, der inkorporerer brugen af elektronmikroskopi, lysmikroskopi, og μ-CT, en grundig evaluering af genfunktion kan udføres, hvilket fremmer nytten af denne kraftfulde model organisme.

Introduction

Billeddannelsesmetoder, der giver mulighed for en detaljeret undersøgelse af indvendige strukturer af et objekt uden at ødelægge dets overordnede 3D-arkitektur, har vist sig at være meget gavnlige for en række forskellige discipliner, herunder fysik, teknik, materialevidenskab, arkæologi, palæontologi, geologi ogbiologi 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Blandt disse ikke-destruktive billeddannelsesmetoder er røntgenbaserede platforme især nyttige på grund af højenergi røntgenstrålernes evne til at trænge ind i mange forskellige prøvetyper og materialer med minimal spredning sammenlignet med synlige lysbølger. Computertomografi (CT), Mikrokompliceret tomografi (μ-CT), Nanocomputed Tomography (Nano-CT) og Synkrotronmikrotomografi har derfor vist sig som de primære teknologier til røntgenbaseret billeddannelse af prøver lige fra meter til mikron, med millimeter til submikronopløsningskapacitet10,11,12,13,14.

Mens disse platforme adskiller sig i deres design, røntgengeometri og komponenter for at afbalancere prøvestørrelse og opløsning, er de alle afhængige af det samme grundlæggende princip for billedoptagelse: en kilde til røntgenstråler, der rejser gennem objektet og fanges af en detektor. Differentialdæmpning af røntgenstrålen, når den passerer gennem forskellige tætheder i objektet, genererer billedkontrast. 3D-data opnås ved at rotere enten prøven eller detektoren, indsamle en række 2D-projektionsbilleder, der derefter rekonstrueres ved hjælp af algoritmer, til tomogrammer, der indeholder 3D-oplysninger, hvis opløsning er isotropisk i x,y,z15. For mange bordplade μ-CT-scannere, der udnytter en kegle-beam X-ray geometri til projektet røntgenstråler på det objekt, der afbildes, Feldkamp algoritme bruges til præcist at rekonstruere objektet med minimal fejl16.

Opløsningen af en given platform bestemmes primært af systemparametre som størrelsen af røntgenstrålen (spotstørrelse), scannergeometri (afstand fra objekt til røntgenkilde), størrelsen af pixels på detektoren og den anvendte rekonstruktionsalgoritme. Yderligere faktorer, såsom scannervibrationer, udsving i røntgenstrålen, prøvebevægelser og materialetype eller kemisk plet, der bruges til at visualisere objektet, kan også påvirke rumlig opløsning betydeligt under billeddannelser i den virkelige verden15.

Til biomedicinske applikationer har CT og μ-CT spillet en central rolle i at fremme vores forståelse af anatomi, fysiologi, udvikling og sygdomsmekanismer, der tjener som et værktøj til både menneskelige patientdiagnoser og som en præklinisk billeddannelsesplatform for modelorganismer17,18. For eksempel bruger Mouse International Phenotyping Consortium, hvis mål er at identificere funktionen af hvert gen i musegenomet, μ-CT som en del af deres phenotyping pipeline19. Deres resultater har været afgørende for at forstå gener involveret i udvikling og sygdomsprocesser, samtidig med at de tjener som atlas for mus anatomi og udvikling20. Andre modelorganismer, såsom zebrafisk og rotter, har også fuldt ud taget brugen af μ CT til udførelse af hele dyr phenotyping af en række gen mutanter17,21,22,23.

Fordelen ved at kombinere hele dyrebilleddannelse med modelorganismer er, at en mekanistisk forståelse af genfunktion for en given biologisk proces kan udforskes fuldt ud. Dette er muligt på grund af de velkarakteriseret genomer og mange genetiske værktøjer til rådighed i modelorganismer, der giver mulighed for præcis manipulation af genfunktion på forskellige udviklingstidspunkter, specifikke væv, individuelle celler og endda subcellulære organeller. Disse omfatter binære udtrykssystemer som UAS/GAL4-systemet (og dets mange derivater), CRISPR/Cas9 og RNAi24,25,26. Når disse genetiske værktøjer anvendes sammen med en kraftig billeddannelsespipeline bestående af elektronmikroskopi, lysmikroskopi (fluorescerende og ikke-fluorescerende) og hele dyrs billeddannelse som μ-CT, kan der opnås en grundig evaluering af molekyler, celler, væv, organer og hele organismen, hvilket giver mulighed for en meget dybere forståelse af genfunktion.

Denne protokol fokuserer på brugen af μ-CT i den ikke-pattedyrsmodelorganisme Drosophila melanogaster, hvis utallige genetiske værktøjer har hjulpet med at belyse mange molekylære mekanismer26,27. Det blev vedtaget fra tidligere protokoller i ikke-model insekter1,28,29,30,31,32, og bygger ud af tidligere μ-CT-undersøgelser i Drosophila at etablere en standardiseret protokol til dens anvendelse i dette dyr33,34,35,36,37,38,39 ,40,41. Trinnene til vellykket prøveforberedelse, billedbehandling og analyse af μ-CT-datasæt ved hjælp af kommercielt tilgængelige scannere er skitseret. Med denne protokol kan alle udviklingsstadier af fluen visualiseres ved høj opløsning til både beskrivende og hypotese-test undersøgelser, herunder taksonomi, anatomi, udvikling, fysiologi og sygdom27. Denne protokol vil også være nyttig til billeddannelse stort set alle insekt og endda ikke-levende materialer, der kræver kemisk farvning for billede kontrast til at forbedre visualisering ved μ-CT.

Protocol

1. Prøvevalg og præparat af neglebånd

  1. Vælg det passende udviklingstidspunkt (embryo, larve, puppe eller voksen) til billeddannelse.
    1. For embryonale stadier, bur hunner på druesaft agar plader smurt med gær pasta og indsamle æg hver 30-60 min. Lad disse embryoner udvikle sig ved 25 °C, indtil det rette stadium er nået.
    2. For larvestadier skal du indsamle første og anden instars fra tidsindsatte embryoopsamlingsforsøg. Vælg direkte vandrer 3rd instars fra siden af mad hætteglas under ikke-crowding betingelser.
    3. For pupal timing, indsamle hvide præ-pupper (omvendt spirakler) og notere den tid, hvor neglebånd begynder at brune. Dyrene vil udvikle sig gennem 15 stadier af pupal udvikling på bestemte tidspunkt efter neglebånd bruning og kan indsamles i overensstemmelse hermed42.
    4. Saml voksne som jomfruer efter ekslosion og lad det alder i en fødevare hætteglas i en nødvendig mængde tid (f.eks 5 dage for fuldstændig tarm udvikling).
  2. Overfør 5-50 dyr til et 1,5 mL mikrocentrifugerør indeholdende 1 mL på 0,5% Triton X-100 i 1x Fosfat Buffered Saline (0,5% PBST). Mens du trykker på røret med jævne mellemrum på bordpladen, inkuberes i 5 min ved stuetemperatur (RT) for at hjælpe med fjernelsen af den hydrofobiske belægning og gør det muligt for dyr at blive helt nedsænket.
    1. For embryonale, larve og pupal faser, standse yderligere udvikling ved at placere røret i en varmeblok indstillet til 100 ° C for 20 s efterfulgt af afkøling på RT i 5 min.
      BEMÆRK: Dyr kan også lynesfrosset i flydende nitrogen37.

2. Fiksering og farvning

  1. Fjern 0,5% PBST, og tilsæt 1 mL bouins løsning. Trykrøret for at sikre, at dyrene er helt nedsænket.
    ADVARSEL: Bouins opløsning indeholder formaldehyd. Det kan forårsage akut toksicitet for hud og øjne, hvis det spildes og kan være dødeligt, hvis det sluges. Brug handsker, sikkerhedsbriller og en kittel ved håndtering.
    BEMÆRK: Yderligere fikseringsteknikker kan også anvendes, såsom brug af ethanol. Fordelene ved andre fikseringsmidler er beskrevet i detaljer i ref.1,30.
    1. For embryo- og voksenprøver inkuberes på bænken i 16-20 timer på RT.
    2. Til larve- og pupalprøver skal dyrene fikses i 2 timer ved RT. Kassér Bouins opløsning og vask med 1x PBS i 5 min tre gange. Overfør til en multi-brønd dissekering parabol, der indeholder 1x PBS og bruge en lille minutien pin fastgjort til en holder til at stikke et hul i den forreste og bageste neglebånd er omhyggelig med ikke at forstyrre nogen underliggende blødt væv.
    3. Overfør larve- og pupalprøver tilbage til et mikrofugerør, og tilsæt 1 mL frisk Bouins opløsning. Inkuber på bænken i 24 timer på RT.
  2. Fjern Bouins opløsning, og vask prøven i 30 min med 1 mL μ-CT Wash Buffer (0,1 M Na2HPO4, 1,8% Saccharose) eller 1x PBS tre gange.
  3. Tilsæt 1 mL af den relevante farvningsopløsning og inkuber på bordpladen i 2-7 dage.
    BEMÆRK: Pletvalg vil afhænge af mange faktorer, men er generelt en balance mellem penetration, inkubationstid og opløsning. Generelt giver fosfotungstic syre (PTA) overlegen kontrast og opløsning af blødt væv, men kræver mekanisk afbrydelse af neglebånd og længere inkubationstider. Fordelene ved forskellige plettetyper er beskrevet i detaljer i ref.1.
    1. Til jodfarvning anvendes 1 mL af 0,1 N I2KI (Lugol Solution). Inkuber i 2 dage. Ingen yderligere afbrydelse af den voksne neglebånd er nødvendig.
    2. Brug 1 mL af en 0,5% (w/v) opløsning fortyndet i vand til fosfotungstisk syre (PTA). Forstyrre den voksne neglebånd, enten ved at fjerne mundpartikler eller stikke huller i brystkassen eller abdominal kutikula med en lille minutien pin fastgjort til en holder. Inkuber i 5-7 dage eller længere, hvis vævsfarvningen forekommer ikke-homogen.
  4. Vask med 1 mL ultrapurt vand eller 1x PBS i 30 min. Gentag vasketrin. Opbevar dyr på RT i ultrapurt vand eller 1x PBS i op til en måned.
  5. Hvis dyr skal scannes, mens de er hydreret, skal de gå direkte til punkt 4. Hvis der er behov for længere opbevaring af prøven, skal du gå videre til protokollens afsnit 3.

3. Kritisk punkttørring (valgfrit)

  1. Udfør en ethanol (EtOH) dehydreringsserie på prøven: 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 100%. Tilsættes 1 mL af EtOH-opløsningen, og inkuber på bænken i 1 time for hver koncentration i den angivne rækkefølge.
  2. Efter den sidste 100% EtOH blød, erstatte med frisk 100% EtOH og lad prøve inkubere på bordpladen natten over.
  3. Udfør kritisk punkttørring af prøver efter producentens anvisninger.
    BEMÆRK: Elektronmikroskopifaciliteter har generelt en kritisk punkttørringsmaskine (se Materialetabel),der vil udføre tørring af prøven efter EtOH-dehydrering.

4. Prøvemontering

  1. For kritisk punkt tørrede prøver, varm lim prøver til en insektstift eller anden holder designet til at passe ind i chuck af den roterende fase eller placere den i en plast eller glas kapillær rør (~ 1,0-1,25 mm indre diameter).
  2. For hydrerede prøver fyldes en P10-pipettespids med vand og fastgør den smalle ende ved enten varmeforsegling eller paraffinfilm for at forhindre lækage.
    FORSIGTIG: Sørg for at pakke eventuelle forbindelser tæt ind, så vandet ikke siver ud i scanneren og forårsager skade.
    1. Overfør en enkelt prøve til pipettespidsen ved hjælp af sammenkr. Brug en lang, slank genstand, såsom en sløvet 20 G nål eller en anden pipettespids, skub forsigtigt prøven ned i spidsen, indtil den bare kontakter pipetspidsens væg for at holde den på plads.
    2. Dæk åbningen af pipettespidsen med paraffinfilm for at forhindre fordampning af vand under lange scanninger.
    3. Monter P10-pipetten ved hjælp af en holder, der er konstrueret til at passe ind i spændepatronen i det roterende trin (Figur 1A-C).

5. Scanning

  1. Udfør de nødvendige kalibreringer af maskinen før billeddannelse for dagen.
    BEMÆRK: Disse vil variere fra producent til producent, og det anbefales at rådføre sig med en applikationsspecialist for at bestemme de rigtige trin. Se materialetabellen for at få specifikke oplysninger om den opsætning og software, der bruges i denne protokol. Generelt kalibreringer såsom en fase akse justering for at fjerne enhver 'wobble' forbundet med chuck er off-akse i forhold til den roterende fase og udfører flad-felt korrektioner for at sikre ensartet baggrund pixel intensiteter på kameraet giver optimale billeddannelse betingelser for den bedste opløsning og datasæt, der er sammenlignelige på tværs af flere scanninger.
  2. Åbn scannerdøren for at få adgang til den roterende scenepatron ved at klikke på ikonet 'Åbn dør' i øverste venstre hjørne af softwaren. Prøven fastgøres ved at stramme kraven omkring prøveholderens bund.
    BEMÆRK: Brug et forsigtigt tryk, når prøven fastgøres til den roterende chuck, for at opretholde scannerjusteringen.
  3. Indstil scanningsparametre i den software, der styrer scanneren, for optimal opløsning og kontrast.
    BEMÆRK: Disse skal bestemmes empirisk, da røntgenkilden, kameraet/detektoren og geometrien for hver scanner varierer fra producent til producent. Yderligere oplysninger til valg af de bedste parametre kan også findes her43, samt fra producentens applikationsspecialist.
    1. Åbn X-Ray-kildestrømskontrolelementet (Indstillinger | Røntgenkilde). Brug skyderen barer til at indstille X-ray spænding til 30-40 kV og strøm til 100-110 μA til at producere en X-ray stråle med 3-4W af magt og en lille spot størrelse for forbedret opløsning.
    2. Brug dialogboksen Anskaffelsestilstande (Indstillinger | Anskaffelsestilstande) for at indstille kameraets eksponeringstid til 500-800 ms.
    3. Brug skyderen ved siden af ikonet for forstørrelsesglas nederst i softwaren til at indstille den ønskede billedpixelstørrelse (~700 nm til 4 μm), afhængigt af kameraindstillinger og placering. Dette bestemmer antallet af projektion billeder, der er erhvervet under scanningen, med flere fremskrivninger, der fører til forbedret opløsning, men længere scanning gange (se repræsentative resultater).
    4. Klik og træk skyderen ved siden af den roterende pil nederst i softwaren for at flytte prøven langs dens 360°-rotationssti. Sørg for, at prøven forbliver inden for synsfeltet.
  4. Klik på ikonet 'Start anskaffelse' (blåt cirkelpilikon) øverst i softwaren. Der vises en dialogboks, der gør det muligt at angive yderligere scanningsparametre, og den fil- og outputmappe, hvor scanningen gemmes, til at blive navngivet.
    1. Indstil den tilfældige bevægelse til 10 og gennemsnitlig 4-6 billeder. Rotationstrinnet beregnes automatisk afhængigt af de anvendte kameraindstillinger.
  5. Start scanningen ved at klikke på 'OK' i dialogboksen Anskaffelse. Der vises en anden dialogboks med statuslinje, der viser scanningstiden. Scanneren vil nu erhverve en række projektion billeder (Figur 1D) af prøven langs rotationsvejen og behøver ikke at blive overvåget.

6. Genopbygning

  1. Hvis du vil generere tomogrammet, skal du udføre billedrekonstruktion ved hjælp af projektionsbillederne.
    BEMÆRK: Mens næsten alle rekonstruktion af billeder fra keglestrålegeometrier er afhængige af Feldkamp-algoritmen16, vil individuelle parametre variere afhængigt af softwareimplementeringen og bør bestemmes empirisk. Følgende indstillinger, der er specifikke for en kommercielt tilgængelig software (se Materialetabel),kan bruges som vejledning. Parametre som forskydningskompensation, reduktion af ringartefakt og korrektion af strålehærdning (0 % for de fleste flueprøver) udføres på en iterativ måde for at vælge de bedste værdier til den endelige genopbygning. For avancerede brugere, der ønsker mere kontrol over genopbygningsprocessen, se MATLAB-grænsefladen her44.
  2. Udføre en indledende billedjustering ved hjælp af en skiftkorrektionsalgoritme baseret på referencescanninger45 (Handlinger | X/Y-justering med en referencescanning).
  3. Finjuster hver rekonstruktionsparameter (Start | Finjustering). Dette aktiverer dialogboksen 'Parameter finjustering'.
    1. Finjuster justeringen ved at klikke på 'Næste' til 'Efterjustering '. Angiv antallet af gentagelser til fem og parametertrinnet til 1,0. Klik på knappen Start for at generere en række eksempler. Vælg det billede, der er korrekt justeret.
      BEMÆRK: Et korrekt justeret billede vil ikke være sløret eller vise 'klipning' artefakter, hvor en ellers kontinuerlig struktur (såsom neglebånd) vises split.
    2. Finjuster reduktionen af ringartefaktet ved at klikke ved siden af den. Angiv antallet af gentagelser til fem og parametertrinnet til 1,0. Klik på knappen Start for at generere en række eksempler. Vælg det billede, der indeholder færrest ringe.
  4. Når ovenstående parametre er optimeret for at give det bedste billede, skal du sikre dig, at de valgte værdier er korrekt repræsenteret under fanen Indstillinger (Indstillinger).
  5. Juster eventuelle endelige lysstyrke- og kontrastværdier ved hjælp af histogrammet, filparametre som bitdybde og -type, og brug et investeringsafkast (Region of Interest), der kun omfatter interessestrukturerne (f.eks. kun hele farten eller hovedet) for at reducere beregningstiden (Output).
  6. Begynd genopbygningen (Start | Start). Hvis der kræves flere rekonstruktioner, skal du føje den aktuelle afbildning til batchmanageren (Start | Føj til batch) og gentag trin 6.2-6.5 for de resterende billeder.

7. Billedanalyse

  1. Visualiser tomogram i to og tre dimensioner og udfør yderligere morfometrisk analyse med freeware eller kommerciel software.
    BEMÆRK: Oplysninger om den software, der bruges i denne protokol, findes i materialetabellen. Andre softwarepakker, der er i stand til at evaluere μ-CT datasæt omfatter freeware muligheder såsom FIJI46,Seg3D (www.seg3D.org)47, og ITK-SNAP48, plus kommerciel software (f.eks AMIRA). Andre applikationer, der anvender maskinlæringsbaserede algoritmer til at semiautomatere segmenteringsprocessen, kan hjælpe med at fremskynde arbejdsgange og reducere menneskelig bias (f.eks. Biomedisa49).
  2. Importer tomogramfilen til softwaren (| Importer billedfiler). De metadata, der er knyttet til filen, indlæses automatisk i vinduet, men kan også indstilles manuelt, så de svarer til billedegenskaberne.
  3. Hvis du vil segmentere en interessestruktur, skal du klikke på fanen Målgruppe i venstre side af skærmen. Opret et nyt interesseområde (ROI) (Grundlæggende | Ny), giv det et navn og vælg en passende farve.
  4. Definer det tærskelområde, der omfatter interessestrukturen (område | Definer område) ved hjælp af skyderen.
  5. Vælg en passende 2D- eller 3D-roi-malerværktøjstilstand (ROI Painter | Pensel mulighed).
  6. Sådan males et område, der er defineret af tærsklen. tryk på Ctrl-tasten, og hold den nede, mens venstre musetast holder den nede. Hvis du vil fjerne et område, skal du trykke på Skift-tasten og holde den nede, mens venstre musetast holder den nede.
    BEMÆRK: Hvis du vil ændre størrelsen på cirkulær eller firkantet pensel, skal du blot rulle musehjulet, mens du holder tasterne Ctrl eller Skift nede.
  7. Fortsæt med at male strukturen af interesse i hele sin Z-volumen.
  8. Konverter investeringsafkast til en maske (eksporter | Til en | normal).
  9. Fremhæv meshoverlejringen ved at klikke på den i panelet Dataegenskaber og indstillinger i øverste højre hjørne.
  10. Glat masken ved hjælp af et passende antal gentagelser (Smooth Mesh | gentagelser).
    BEMÆRK: Brug den samme maskeudjævningsværdi for alle billeder, der skal sammenlignes.
  11. Sørg for, at målingerne af mesh ROI (Surface Area, Volume og Feret Diameter) vises i panelet Information i højre side af skærmen til grundlæggende morfometrisk analyse. Yderligere analyse kan udføres ved hjælp af objektanalysemodulet.
  12. Gengive mesh-objektet og hele tomogrambilledet, og visualiser i 3D. Brug den indbyggede Movie Maker til at generere en video af objektet (Højreklik | Vis Movie Maker) ved hjælp af individuelle rammer fra fremviseren (Tilføj nøgle).
    BEMÆRK: Flere visuelle forbedringer kan også anvendes på filmen ved hjælp af fanen visuelle effekter i højre panel for at fremhæve visse funktioner osv.
  13. Eksporter videoen til visning ved hjælp af knappen Eksporter animation i Movie Maker.

Representative Results

Figur 2 viser billeder af et embryo, 3rd instar larver, pupper på pharate voksen fase (P7), og en voksen kvindelig flyve farves med jod og afbildet hydreret i vand ved hjælp af en kommerciel bordplade scanner. Fremragende bevarelse og endda farvning af sarte væv er synlige, så alle større organer let kan identificeres og anvendes til morfometrisk analyse og 3D visualisering.

Typisk, scanninger, der erhverver færre projektion billeder af prøven giver lavere opløsning end scanninger, der erhverver flere projektion billeder, med afvejning er tid brugt scanning. Selvom scanningstider vil variere efter instrument og andre scanningsparametre, tager scanninger, der erhverver et par hundrede fremskrivninger (~ 3 μm billede pixelstørrelse) ca. 30 min pr. prøve, mens scanninger bestående af tusindvis af projektionbilleder (700 nm-1,25 μm billed pixelstørrelse) kan tage 8-16 timer. En sammenligning af den samme voksne fluehovedkasse taget i både 'langsom' (tusindvis af fremskrivninger) og 'hurtig' (hundredvis af fremskrivninger) scanningstilstand er vist i figur 3. Det er vigtigt, at morfometriske analyser ikke adskiller sig mellem "langsomme" og "hurtige" scanninger (Figur 3C)40. Vores billedbehandling pipeline, derfor udnytter hurtige scanninger til at generere en tilstrækkelig stor stikprøvestørrelse til morfometrisk analyse, og langsomme scanninger til at visualisere eventuelle morfologiske eller anatomiske defekter ved højere opløsning. Ved hjælp af softwaren (trin 7) kan ethvert vævs- eller organsystem af interesse segmenteres og bruges til morfometrisk analyse og visualiseres i 3D ved hjælp af filmproducenten (Movie 1).

Figur 4 viser et eksempel på flyvelivet, der er farvet med PTA og afbildet hydreret (vand) eller efter kritisk punkttørring (CPD) på et røntgenmikroskop (Materialetabel). Detaljerne fra en kombination af PTA og mulighederne i denne platform er let tydelige i disse billeder, således at individuelle epithelia celler i midgut og sæd bundter i testiklerne er let løses. Mens CPD-billedet viser marginalt øget opløsning i forhold til den hydrerede prøve, opnås bedre bevarelse af ultrastrukturen af sarte væv (såsom fedtcellerne nær neglebånd) med hydrerede prøver (Movie 2).

Figure 1
Figur 1: Oversigt over scannerdesign og prøvemontering til μ-CT. (A) En kommerciel bordplade μ-CT-scanner. (B) Se inde i scanneren. Røntgenkilden (til højre) udsender røntgenstråler, der passerer gennem prøven placeret på et roterende stadium (gul pil). Dæmpning af disse røntgenstråler genererer billedkontrast, når de passerer gennem prøven og på detektoren, som består af en scintillationsskærm, der konverterer røntgenstråler til fotoner og et standard CCD-kamera (venstre). (C) Montering af en voksen frugtflue til hydreret billeddannelse i vand. Forbindelsespunkterne mellem pipettespidsen og messingholderen er pakket ind i paraffinfilm for at forhindre lækage og potentiel skade på scanneren. Scene chuck er også fremhævet. Bemærk, at pipettespidsen var placeret lidt off-axis, hvilket førte til en længere scanningstid og reduceret opløsning i den endelige rekonstruktion. (D) En enkelt 2D projektion billede af en voksen kvindelig flyve; hundreder til tusinder af disse fremskrivninger erhverves under en scanning langs rotationsaksen og bruges til genopbygning til at generere tomogrammer, der indeholder isotropisk opløsning og nøjagtige 3D-oplysninger. Vægtstænger (C) = 2 mm. P, Posterior; V, Ventral. Dette tal er ændret fra Schoborgm.fl. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Alle Drosophila melanogaster livscyklus faser, afbilledet af μ-CT. Prøver farves med jod og afbildet hydreret i vand. Vist er et enkelt 2D-udsnit. (A) Et foster, der har afsluttet de tidlige stadier af gastrulation (stjerne). (B) En tredje instar larve. (C) En P7-pharate voksen under metamorfose. (D) En voksen kvinde. Forskellige organer er fremhævet: BWM, kroppens væg muskler; Br, hjerne; Cd, cardia; Cr, afgrøde; DLMs, dorsale langsgående muskler; DVM, rygmuskler; E-AD, øjenantenneskive; Em, embryo; FB, fede kroppe; FBCs, fedt kropsceller; H, hjerte; Hg, hindgut; La, lamina; L, ben; Mg, midgut; OL, hjerneoptisk lap; Ov, ovipositor; PC, pupal kutikula; SG, spytkirtler; VNC, ventral nerveledning; W, vinge; WD, vingeskive. Skalastænger (A) = 100 μm; B)-D) = 500 μm. D, Dorsal A, Forreste; L, til venstre. Scanningsparametre: Kilde til prøveafstand (mm): (A, D) 36,5, (B) 48,8, (C) 40,3. Kilde til kameraafstand (mm): (A, D) 350, (B, C) 285. Kameraets pixelstørrelse (μm): (A-D) 11,6. Pixelstørrelse for billede (μm): (A, D) 1,2, (B) 1,9, (C) 1,7. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Scanningsparametre og billedopløsning ændrer ikke morfometriske analyser. Et voksenhoved scannet ved hjælp af både (A, A') 'hurtige' scannerindstillinger (hundredvis af fremskrivninger) og (B, B') 'langsomme' scannerindstillinger (tusindvis af fremskrivninger). Hjernen er skitseret i gult. (C) Hjernevolumenmålinger fra langsomme og hurtige scanninger. Fremhævede strukturer: AL; antennelap; CB, central hjerne; FB, ventilatorformet krop; FCs, fedtceller; La, lamina; Lo, stjernetåge; LoP, lobula plade; Mig, medulla; Re, nethinden. n = 5, Welchs t-test. ns = ikke signifikant. Skalastænger = 100 μm. Scanningsparametre: Kilde til prøveafstand (mm): (A) 44,4, (B) 36,5. Kilde til kameraafstand (mm): (A) 348 (B) 350. Kameraets pixelstørrelse (μm): (A-B) 11,6. Pixelstørrelse for billede (μm): (A) 2,95, (B) 1,2. Dette tal er ændret fra Schoborgm.fl. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Drosophila melanogaster mave afbilledet af røntgenmikroskopi. Maven blev plettet med 0,5% PTA og afbildet hydreret (vand) eller efter kritisk punkttørring (CPD). (A) Kritisk punkt Tørret mave, vist fra YZ perspektiv og (A') XZ perspektiv. (B) Hydreret mave, vist fra YZ perspektiv og (B') XZ perspektiv. Forskellige organer er fremhævet: FC, fedtceller; Hg, hindgut; Mg, Midgut; SP, sædpumpe; Te, Testikler. Vægtstænger (A) = 250 μm. D, Dorsal; A, Forreste; L, til venstre. Scanningsparametre: Kilde til prøveafstand (mm): (A) 6.7, (B) 7. Kilde til kameraafstand (mm): (A) 28 (B) 29,5. Formål: (A-B) 4X. Pixelstørrelse (μm): (A-B) 0,65. Klik her for at se en større version af dette tal.

Film 1: En tredje instar larve, gengivet i 3D ved hjælp af Movie Maker i Dragonfly. Fremhævede organer omfatter hjernen (gul), eye-antennal imaginale diske (rød), fedt krop (blå) og kroppens væg muskler (grøn). Klik her for at downloade denne film.

Film 2: Sammenligning af prøver afbildet i vand eller følg kritisk punkt tørring. Abdomens farves med 0,5% PTA er vist. Begge underliv blev scannet med identiske indstillinger for billedpixelstørrelse (0,65 μm). En række 2D-skiver er vist i et 'Z-stack' format (YZ), der starter ved rygoverfladen og slutter ved mavens ventrale overflade. Organer fremhævet: FC, fedtceller; Mg, Midgut; SP, sædpumpe; Te, Testikler. Scanningsparametre: Kilde til prøveafstand (mm): (A) 6.7, (B) 7. Kilde til kameraafstand (mm): (A) 28 (B) 29,5. Formål: (A-B) 4X. Pixelstørrelse (μm): (A-B) 0,65. Klik her for at downloade denne film.

Discussion

Visualisering intakt Drosophila melanogaster på alle udviklingsstadier er forblevet en udfordring, primært på grund af uforeneligheden af lysmikroskopi med den tykke, pigmenterede kutikula, der findes i dette dyr. Mens andre hele dyr imaging metoder, såsom Magnetic Resonance Imaging (MR), Optisk Sammenhæng Tomografi (OKT), og ultramikroskopi kombineret med væv clearing er blevet brugt med succes i fluer50,51,52,53,54, μ-CT præsenterer en række fordele, der gør det ideelt for hele dyr imaging af denne organisme13,15,30 . Røntgenstråler trænger let ind i pigmenteret kutikula, og deres lille bølgelængde giver mulighed for submikronbilleddannelse. Mærkning kræver minimal investering i bredt tilgængelige kemikalier og ingen specialiserede bænk færdigheder13. μ-CT-scannere er også kommercielt tilgængelige, og omkostningerne kan sammenlignes med lette mikroskopiplatforme, samtidig med at de er mere attraktive for bredere vifte af discipliner (geologi, palæontologi, teknik osv.), der også kan drage fordel af dens tilgængelighed på en institution. Synkrotron X-Ray kilder kan også bruges til høj opløsning μ-CT-billeddannelse af faste og levende insekter31,55,56, men er mindre tilgængelige end kommercielle benchtop scannere.

Denne protokol giver en effektiv måde at opnå μ CT-billeder af flyve voksne, pupper, larve og cellulære embryoner. Bemærk, at for mange af de trin, der er skitseret ovenfor, kan alternative metoder også anvendes til at forberede prøver til billeddannelse. Andre undersøgelser har givet en detaljeret sammenligning af forskellige fikserings-, mærknings - og tørretrin til brug i insekter , og de, der er interesseret i at anvende denneteknik,opfordres til at vurdere fordelene ved hver tilgang1,4,13,29,30,57. Mens denne protokol er relativt ligetil, præsenteres et par nyttige forslag.

For det første skal man være forsigtig, når man forstyrrer neglebånd af intakte prøver, således at underliggende blødt væv ikke forstyrres væsentligt. Det er vigtigt at lade larve og tidlige pupal stadier gennemgå fiksering i 2 timer i Bouins opløsning, før du stikker. Dette vil stivne vævet og begrænse mængden af hæmolymfe, der vil ose ud af neglebåndshullerne, hvilket kan ændre orgelarkitekturen. Individuelle kropssegmenter (hoved, brystkasse og mave) af den voksne kan adskilles, hvis strukturen (erne) af interesse er placeret der. Det anbefales at bruge en skalpel til rent at skære gennem disse segmenter i stedet for at trække dem fra hinanden med sammentrækninger, hvilket kan forstyrre 3D-arkitekturen i tarmen eller centralnervesystemet, for eksempel. Hvad angår timing, behøver voksne generelt kun 16 timer. for fuldstændig fiksering, mens larve- og pupalstadier skal 24 timer. Hvis jod- eller PTA-farvningen ser ujævn ud, kan prøven også placeres tilbage i opløsning for at inkubere længere, indtil der er opnået selv farvning. Endelig bør hydrerede prøver ikke placeres ved 4 °C, da dette synes at fremkalde dannelse af luftbobler i kroppens hulrum efter opvarmning til stuetemperatur.

For det andet vil prøvemonteringen variere efter instrument, trintype, og om prøven skal forblive hydreret eller har været kritisk punkttørret. Hvis prøven er hydreret, skal den ikke lækkes og eventuelt ødelægge scanneren. Når prøven monteres inde i en pipettespids, skal du sørge for at skubbe forsigtigt med en sløvet genstand, indtil prøverne møder let modstand og ikke kan bevæge sig. Skubbe for hårdt kan føre til neglebånd deformation og underliggende strukturelle defekter. Sørg også for, at prøven er justeret i holderen så tæt på rotationsaksen som muligt. Enhver wobble vil øge scanning gange på grund af det større synsfelt og reducere opløsningen af den endelige tomogram efter genopbygningen.

For det tredje vil scannerindstillingerne for anskaffelse af projektionsbilleder også variere fra instrument til instrument. For at maksimere scannerens opløsningsevne skal X-ray beam spot size være så lille som muligt (5-10 μm). Dette kan opnås ved at afbalancere røntgenspænding og strømindstillinger, således at den samlede effekt er 3-4 W. Med disse indstillinger og den passende eksponeringstid på kameraet kan der opnås korrekt røntgenstråledæmpning af prøven og optimal billedkontrast. Brugen af aluminiums- eller kobberfiltre mellem objektet og røntgenkilden kan bruges til at finjustere de optimale røntgenenergiindstillinger for den bedste billedkontrast eller dæmpe strålen tilstrækkeligt til, at højere drevne kilder kan bruges. Med hensyn til billedopløsning vil dette afhænge af mange forskellige variabler, herunder plettype, antal projektionbilleder, billedpixelstørrelse, kameraposition, prøvebevægelse, scannervibrationer og rekonstruktionsparametre. En bar mønster fantom (QRM GmbH), der indeholder kendte størrelse markører kan hjælpe med at evaluere rumlig opløsning for en given scanner og kamera indstilling.

Det er også værd at vurdere fordelene ved billeddannelse kritisk punkt tørrede eller hydrerede prøver. Sombke et al. foretog en sammenlignende vurdering af de to metoder og fandt, at kritisk punkttørring var overlegen i μ CT-applikationer, der involverede leddyr30. Fordelene ved hydrerede prøver er imidlertid, at dyr udsættes for mindre kemisk og mekanisk eksponering, der kan føre til både kvantitative og morfologiske artefakter. Dette har også tendens til at bevare sarte væv bedre end CPD. Hydrerede prøver har imidlertid en meget kortere holdbarhed og bør afbildes senest en måned efter fikseringen, da vævsforringelse og nedsat billedkvalitet bliver indlysende på det tidspunkt. Opløsningen af hydrerede prøver vil også være lidt mindre end en kritisk punkttørret prøve, fordi røntgenstråler også skal trænge gennem både en plastpipetspids og den omgivende væske (vand eller buffer). Kritisk punkt Tørrede prøver kan bevares i meget længere tid, især når de opbevares på Drierite. De kan også placeres direkte i røntgenstrålestien ved blot at lime vingerne eller benene til en insektstift og placere den i scenepatronen, hvilket forenkler monteringsprocessen. Men den omfattende ethanol dehydrering af disse prøver kan føre til væv svind og tab af sarte væv arkitektur, hvilket er grunden til det er vigtigt at udføre en række stigende EtOH koncentrationer for at minimere disse virkninger. Ikke desto mindre skal det bemærkes, at alle former for kemisk behandling, herunder paraformaldehydfiksering og endda jodfarvning kan forårsage vævssvind58,59. Mens ingen af metoderne vil give målinger af 'faktisk organstørrelse' i en levende flue, er morfometriske målinger stadig gyldige, når man sammenligner mutante og vilde dyr, så længe fikserings-, farvnings- og tørretrin udføres ens for begge sæt prøver - helst parallelt.

Afslutningsvis giver μ-CT et nyttigt hele dyr imaging værktøj til Drosophila33,34,35,36,37,38,39,40,41. Mange andre undersøgelser har fremvist kraften i denne teknologi til forståelse af forskellige aspekter af insekt taksonomi, økologi, fysiologi, udvikling og anatomi, der kan hjælpe med at informere fremtidige undersøgelser i fluer1,28,30,31,32,55,56,57 . Kombineret med de genetiske og lette mikroskopiværktøjer, der allerede er meget udbredt i denne organisme, kan μ-CT positionere sig i en eksperimentel rørledning, der giver mulighed for en dybere forståelse mellem genotype og fænotype.

Disclosures

Forfatteren erklærer ingen konkurrerende eller finansielle interesser.

Acknowledgments

Intet af dette ville have været muligt uden støtte fra Nasser Rusan. Jeg vil gerne takke H. Doug Morris, Danielle Donahue, og Brenda Klaunberg af NIH Mouse Imaging Facility og Ben Ache af Micro Photonics for uddannelse og nyttig diskussion. Jeg takker også Mansoureh Norouzi Rad fra Zeiss for at scanne maveprøver på Xradia 520 Versa. Lauren Smith, Samantha Smith og Rachel Ng hjalp også med scanning. Mike Marsh fra Object Research Systems ydede Dragonfly teknisk support. Jeg er også taknemmelig for støtte fra National Heart, Lung, and Blood Institute (1K22HL137902-01) og Start Up Fonde fra University of Wyoming. Jeg takker også de anonyme korrekturlæsere for deres nyttige forslag og kommentarer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100% Ethanol For critical point drying
Bouin's Solution Sigma-Aldrich HT10132 For animal fixation
Critical Point Dryer Dries samples using the critical point method; multiple options available (Balzers CPD 020 or Leica EMCPD300)
Dragonfly Software Object Research Systems For visualization and segmentation of micro-CT datasets; https://www.theobjects.com/dragonfly/index.html
Heat Block For microfuge tubes
Image Analysis Workstation Should contain sufficient RAM and quality graphics card for 3D rendering
Iodine Solution (I2KI) Fisher Scientific SI86-1 For staining
Microcomputed Tomography Scanner Bruker Skyscan 1172 Cone-beam X-Ray geometry; detector is a Hamamatsu 10 MP camera with 11.54 µm pixel size.
Microcomputed Tomography Scanner Software Bruker For controling the scanner itself (e.g., performing flat field corrections, X-ray tube power, camera expsoure times, acquisition, etc.)
Minutien Pins Fine Science Tools 26002-15 For poking hole in cuticle
NRecon Image Reconstruction Software Bruker Used to reconstruct cross-section images from 2D projection images taken with cone-beam X-Ray geometry
P10 pipet tips Genesee Scientific 24-120 Sample mounting
Phosphate Buffered Saline Resarch Products International P32060-4000.0 Dilute to 1X with water before use
Phosphotungstic Acid Hydrate Sigma-Aldrich 79690-25g For staining
Pin Holder Fine Science Tools 26018-17 For Minutien Pins
Triton X-100 Research Products International 111036 To remove waxy coating from adult flies (as 0.5% PBST)
X-Ray Microscope Zeiss Xradia 520 Versa Cone-beam X-Ray geometry featuring Fresnel zone plate objective lenses for Resoluton at a Distance (RaaD™)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, 11 (2009).
  2. Rahman, I. A., Smith, S. Y. Virtual paleontology: computer-aided analysis of fossil form and function. Journal of Paleontology. 88 (04), 633-635 (2014).
  3. Carlson, W. D. Three-dimensional imaging of earth and planetary materials. Earth and Planetary Science Letters. 249 (3-4), 133-147 (2006).
  4. Gutiérrez, Y., Ott, D., Töpperwien, M., Salditt, T., Scherber, C. X-ray computed tomography and its potential in ecological research: A review of studies and optimization of specimen preparation. Ecology and Evolution. 8 (15), 7717-7732 (2018).
  5. Abel, R. L., et al. Digital preservation and dissemination of ancient lithic technology with modern micro-CT. Computers & Graphics. 35 (4), 878-884 (2011).
  6. Kastengren, A., Powell, C. F. Synchrotron X-ray techniques for fluid dynamics. Experiments in Fluids. 55 (3), 1686 (2014).
  7. Boerckel, J. D., Mason, D. E., McDermott, A. M., Alsberg, E. Microcomputed tomography: approaches and applications in bioengineering. Stem Cell Research & Therapy. 5 (6), 144 (2014).
  8. Du Plessis, A., Yadroitsev, I., Yadroitsava, I., Le Roux, S. G. X-Ray Microcomputed Tomography in Additive Manufacturing: A Review of the Current Technology and Applications. 3D Printing and Additive Manufacturing. 5 (3), 227-247 (2018).
  9. Cnudde, V., Boone, M. N. High-resolution X-ray computed tomography in geosciences: A review of the current technology and applications. Earth-Science Reviews. 123, 1-17 (2013).
  10. Zhu, Y., Zhang, J., Li, A., Zhang, Y., Fan, C. Synchrotron-based X-ray microscopy for sub-100nm resolution cell imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 39, 11-16 (2017).
  11. Kampschulte, M., et al. Nano-Computed Tomography: Technique and Applications. RoFo: Fortschritte Auf Dem Gebiete der Rontgenstrahlen und der Nuklearmedizin. 188 (2), (2016).
  12. Seeram, E. Computed tomography: A technical review. Radiologic Technology. 89 (3), 279-302 (2018).
  13. Rawson, S. D., Maksimcuka, J., Withers, P. J., Cartmell, S. H. X-ray computed tomography in life sciences. BMC Biology. 18 (1), 21 (2020).
  14. Morton, E. J., Webb, S., Bateman, J. E., Clarke, L. J., Shelton, C. G. Three-dimensional x-ray microtomography for medical and biological applications. Physics in Medicine and Biology. 35 (7), 805-820 (1990).
  15. Lin, A. S. P., Stock, S. R., Guldberg, R. E. Microcomputed Tomography. Springer Handbook of Microscopy. , Springer. 2 (2019).
  16. Feldkamp, L. A., Davis, L. C., Kress, J. W. Practical cone-beam algorithm. Journal of the Optical Society of America A. 1 (6), 612 (1984).
  17. Clark, D. P., Badea, C. T. Micro-CT of rodents: state-of-the-art and future perspectives. Physica Medica: PM: An International Journal Devoted to the Applications of Physics to Medicine and Biology: Official Journal of the Italian Association of Biomedical Physics (AIFB). 30 (6), 619-634 (2014).
  18. Schambach, S. J., Bag, S., Schilling, L., Groden, C., Brockmann, M. A. Application of micro-CT in small animal imaging. Methods. 50 (1), 2-13 (2010).
  19. Collins, F. S., Rossant, J., Wurst, W. A mouse for all reasons. Cell. 128 (1), International Mouse Knockout Consortium 9-13 (2007).
  20. Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3D mouse embryo atlas based on micro-CT. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).
  21. Dyer, E. L., et al. Quantifying Mesoscale Neuroanatomy Using X-Ray Microtomography. eNeuro. 4 (5), (2017).
  22. Weinhardt, V., et al. Quantitative morphometric analysis of adult teleost fish by X-ray computed tomography. Scientific Reports. 8 (1), 16531 (2018).
  23. Ding, Y., et al. Computational 3D histological phenotyping of whole zebrafish by X-ray histotomography. eLife. 8, 44898 (2019).
  24. Ahmadzadeh, E., et al. A collection of genetic mouse lines and related tools for inducible and reversible intersectional mis-expression. Development. 147 (10), (2020).
  25. Koster, R., Sassen, W. A. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. 2015, 151-163 (2015).
  26. Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: A primer on the Drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
  27. Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Disease Models & Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).
  28. Smith, D. B., et al. Exploring miniature insect brains using micro-CT scanning techniques. Scientific Reports. 6, 21768 (2016).
  29. Swart, P., Wicklein, M., Sykes, D., Ahmed, F., Krapp, H. G. A quantitative comparison of micro-CT preparations in Dipteran flies. Scientific Reports. 6, 39380 (2016).
  30. Sombke, A., Lipke, E., Michalik, P., Uhl, G., Harzsch, S. Potential and limitations of X-Ray micro-computed tomography in arthropod neuroanatomy: a methodological and comparative survey. The Journal of Comparative Neurology. 523 (8), 1281-1295 (2015).
  31. Betz, O., et al. Imaging applications of synchrotron X-ray phase-contrast microtomography in biological morphology and biomaterials science. I. General aspects of the technique and its advantages in the analysis of millimetre-sized arthropod structure. Journal of Microscopy. 227, Pt 1 51-71 (2007).
  32. Wipfler, B., Pohl, H., Yavorskaya, M. I., Beutel, R. G. A review of methods for analysing insect structures - the role of morphology in the age of phylogenomics. Current Opinion in Insect Science. 18, 60-68 (2016).
  33. Chen, W. C., et al. Toward a new insight of calcium oxalate stones in Drosophila by micro-computerized tomography. Urolithiasis. 46 (2), 149-155 (2017).
  34. Fabian, B., Schneeberg, K., Beutel, R. G. Comparative thoracic anatomy of the wild type and wingless (wg1cn1) mutant of Drosophila melanogaster (Diptera). Arthropod Structure & Development. 45 (6), 611-636 (2016).
  35. Harrison, J. F., et al. Developmental plasticity and stability in the tracheal networks supplying Drosophila flight muscle in response to rearing oxygen level. Journal of Insect Physiology. , (2017).
  36. Klok, C. J., Kaiser, A., Socha, J. J., Lee, W. K., Harrison, J. F. Multigenerational effects of rearing atmospheric oxygen level on the tracheal dimensions and diffusing capacities of pupal and adult Drosophila melanogaster. Advances in Experimental Medicine and Biology. 903, (2016).
  37. Mattei, A. L., Riccio, M. L., Avila, F. W., Wolfner, M. F. Integrated 3D view of postmating responses by the Drosophila melanogaster female reproductive tract, obtained by micro-computed tomography scanning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8475-8480 (2015).
  38. Mizutani, R., Saiga, R., Takeuchi, A., Uesugi, K., Suzuki, Y. Three-dimensional network of Drosophila brain hemisphere. Journal of Structural Biology. 184 (2), 271-279 (2013).
  39. Mizutani, R., Takeuchi, A., Akamatsu, G., Uesugi, K., Suzuki, Y. Element-specific microtomographic imaging of Drosophila brain stained with high-Z probes. Journal of Synchrotron Radiation. 15, Pt 4 374-377 (2008).
  40. Schoborg, T. A., Smith, S. L., Smith, L. N., Morris, H. D., Rusan, N. M. Micro-computed tomography as a platform for exploring Drosophila development. Development. 146 (23), (2019).
  41. Chaturvedi, D., Prabhakar, S., Aggarwal, A., Atreya, K. B., VijayRaghavan, K. Adult Drosophila muscle morphometry through microCT reveals dynamics during ageing. Open Biology. 9 (6), 190087 (2019).
  42. Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66, 57-80 (1981).
  43. Withers, P. J. X-ray nanotomography. Materials Today. 10 (12), 26-34 (2007).
  44. Bleichrodt, F., et al. Easy implementation of advanced tomography algorithms using the ASTRA toolbox with Spot operators. Numerical Algorithms. 71 (3), 673-697 (2016).
  45. Salmon, P. L., Liu, X., Sasov, A. A post-scan method for correcting artefacts of slow geometry changes during micro-tomographic scans. Journal of X-ray Science and Technology. 17 (2), 161-174 (2009).
  46. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  47. CIBC Seg3D: Volumetric Image Segmentation and Visualization. Scientific Computing and Imaging Institute (SCI). , Available from: http://www.seg3d.org (2016).
  48. Yushkevich, P. A., et al. User-guided 3D active contour segmentation of anatomical structures: significantly improved efficiency and reliability. Neuroimage. 31 (3), 1116-1128 (2006).
  49. Lösel, P., Heuveline, V. Enhancing a diffusion algorithm for 4D image segmentation using local information. Medical Imaging 2016: Image Processing. 9784, (2016).
  50. Null, B., Liu, C. W., Hedehus, M., Conolly, S., Davis, R. W. High-resolution, in vivo magnetic resonance imaging of Drosophila at 18.8 Tesla. Plos One. 3 (7), 2817 (2008).
  51. Holmes, J. In vivo real-time optical coherence tomography imaging of Drosophila for cardiovascular research. Nature Methods. 6 (10), 5557 (2009).
  52. Men, J., et al. Optical coherence tomography for brain imaging and developmental biology. IEEE journal of selected topics in quantum electronics: a publication of the IEEE Lasers and Electro-optics Society. 22 (4), 6083213 (2016).
  53. Jährling, N., Becker, K., Schönbauer, C., Schnorrer, F., Dodt, H. U. Three-dimensional reconstruction and segmentation of intact Drosophila by ultramicroscopy. Frontiers in Systems Neuroscience. 4, 1 (2010).
  54. Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).
  55. Socha, J. J., Westneat, M. W., Harrison, J. F., Waters, J. S., Lee, W. K. Real-time phase-contrast x-ray imaging: a new technique for the study of animal form and function. BMC Biology. 5, 6 (2007).
  56. Westneat, M. W., et al. Tracheal respiration in insects visualized with synchrotron x-ray imaging. Science. 299 (5606), 558-560 (2003).
  57. Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
  58. Stowell, R. E. Effect on tissue volume of various methods of fixation, dehydration, and embedding. Stain Technology. 16 (2), 67-83 (1941).
  59. Vickerton, P., Jarvis, J., Jeffery, N. Concentration-dependent specimen shrinkage in iodine-enhanced microCT. Journal of Anatomy. 223 (2), 185-193 (2013).

Tags

Udviklingsbiologi Udgave 163 Drosophila melanogaster mikrocomputeret tomografi præklinisk billeddannelse billedanalyse human sygdom modellering phenotyping
Hele Animal Imaging af <em>Drosophila melanogaster</em> ved hjælp af microcomputed tomografi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schoborg, T. A. Whole Animal Imaging More

Schoborg, T. A. Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography. J. Vis. Exp. (163), e61515, doi:10.3791/61515 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter