Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

הדמיה חיה שלמה של Drosophila melanogaster באמצעות טומוגרפיה מיקרו-מחשבתית

Published: September 2, 2020 doi: 10.3791/61515
Automatic Translation
1
1Department of Molecular Biology, University of Wyoming

Summary

פרוטוקול מוצג המאפשר הדמיה של Drosophila melanogaster שלם בכל שלב של פיתוח באמצעות טומוגרפיה מיקרו מחשב.

Abstract

כלי הדמיה ביו-רפואיים מאפשרים חקירה של מנגנונים מולקולריים על פני קשקשים מרחביים, גנים ועד אורגניזמים. Drosophila melanogaster, אורגניזם מודל מאופיין היטב, נהנה משימוש במיקרוסקופיה אור ואלקטרון כדי להבין את תפקוד הגנים ברמה של תאים ורקמות. היישום של פלטפורמות הדמיה המאפשרות הבנה של תפקוד הגנים ברמה של האורגניזם השלם כולו ישפר עוד יותר את הידע שלנו על מנגנונים גנטיים. כאן מוצגת שיטת הדמיה מלאה של בעלי חיים המתארת את השלבים הדרושים כדי לדמיין את Drosophila בכל שלב התפתחותי באמצעות טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (μ-CT). היתרונות של μ-CT כוללים מכשור זמין מסחרית וזמן מעשי מינימלי כדי לייצר מידע תלת-ממדי מדויק ברזולוציה ברמת מיקרון ללא צורך בשיטות ניתוח רקמות או ניקוי. בשילוב עם תוכנה המאיצה ניתוח תמונה ועיבוד תלת-ממדי, ניתן לבצע ניתוח מורפומטרי מפורט של כל מערכת רקמות או איברים כדי להבין טוב יותר מנגנוני פיתוח, פיזיולוגיה ואנטומיה הן למחקרי בדיקה תיאוריים והן למחקרי בדיקת השערה. על ידי שימוש בתהליך הדמיה המשלבת שימוש במיקרוסקופיה אלקטרונית, מיקרוסקופיה קלה ו- μ-CT, ניתן לבצע הערכה יסודית של תפקוד הגנים, ובכך לקדם את התועלת של אורגניזם מודל רב עוצמה זה.

Introduction

שיטות הדמיה המאפשרות חקירה מפורטת של מבנים פנימיים של אובייקט מבלי להרוס את הארכיטקטורה התת-ממדית הכוללת שלו הוכיחו את עצמם כמועילות באופן נרחב למספר דיסציפלינות שונות, כולל פיזיקה, הנדסה, מדע החומרים, ארכיאולוגיה, פליאונטולוגיה, גיאולוגיה וביולוגיה1,2,3,4,5,6,7,8,9 . בין שיטות הדמיה לא הרסניות אלה, פלטפורמות מבוססות רנטגן שימושיות במיוחד בשל היכולת של צילומי רנטגן באנרגיה גבוהה לחדור סוגים וחומרים שונים רבים עם פיזור מינימלי בהשוואה לגלי אור נראים. טומוגרפיה ממוחשבת (CT), טומוגרפיה ממוחשבת מיקרו (μ-CT), טומוגרפיה ננו-ממוחשבת (ננו-CT) ומיקרוטומוגרפיה של סינכרוטרון התגלו, אם כן, כטכנולוגיות העיקריות להדמיה מבוססת קרני רנטגן של דגימות הנעות בין מטרים למיקרונים, עם יכולות רזולוציה מילימטריות עד תת-מיקרון10,11,12,13,14.

בעוד פלטפורמות אלה שונות בעיצובן, בגיאומטריית קרני הרנטגן וברכיבים שלהן כדי לאזן בין גודל דגימה לרזולוציה, כולן מסתמכות על אותו עיקרון בסיסי ללכידת תמונה: מקור לצילומי רנטגן העוברים דרך האובייקט ונלכדים על ידי גלאי. חיכוך דיפרנציאלי של קרן הרנטגן כשהיא עוברת דרך דחיסויות שונות בתוך האובייקט יוצרת ניגודיות תמונה. נתונים תלת-ממדיים מתקבלים על ידי סיבוב המדגם או הגלאי, איסוף סדרה של תמונות הקרנה 2D כי הם משוחזרים לאחר מכן באמצעות אלגוריתמים לתוך טומוגרמה המכילה מידע 3D שהרזולוציה שלהם היא איזוטרופית x, y,z15. עבור סורקי μ-CT רבים המשתמשים בגיאומטריית רנטגן של קרן חרוט כדי להקרין צילומי רנטגן באובייקט שממוצל, אלגוריתם פלדקמפ משמש לשחזור מדויק של האובייקט עם שגיאות מינימליות16.

הרזולוציה של פלטפורמה נתונה נקבעת בעיקר על ידי פרמטרי מערכת כגון גודל קרן הרנטגן (גודל ספוט), גיאומטריית סורק (מרחק מאובייקט למקור רנטגן), גודל הפיקסלים בגלאי ואלגוריתם השחזור המועסק. גורמים נוספים, כגון תנודות סורק, תנודות קרן רנטגן, תנועת מדגם, סוג החומר או כתם כימי המשמש לדמיין את האובייקט יכול גם להשפיע באופן משמעותי על רזולוציה מרחבית תחת condidtions הדמיה בעולם האמיתי15.

עבור יישומים ביו-רפואיים, CT ו- μ-CT מילאו תפקיד מרכזי בקידום הבנתנו מנגנוני אנטומיה, פיזיולוגיה, פיתוח ומחלות, המשמשים ככלי הן לאבחנות המטופלים האנושיים והן כפלטפורמת הדמיה פרה-אקלינית עבור אורגניזמים מודל17,18. לדוגמה, קונסורציום פנוטיפינג הבינלאומי עכבר, שמטרתו לזהות את הפונקציה של כל גן בגנום העכבר, משתמש μ-CT כחלק צינור פנוטיפינגשלהם 19. התוצאות שלהם היו קריטיות להבנת גנים המעורבים בתהליכי התפתחות ומחלות, ובמקביל שימשו אטלס לאנטומיה ופיתוח שלעכברים 20. אורגניזמים מודל אחרים, כגון דגי זברה וחולדות, אימצו גם את השימוש μ-CT לביצוע פנוטיפינג של בעלי חיים שלמים של מספר מוטציותגנים 17,21,22,23.

היתרון של שילוב הדמיה של בעלי חיים שלמים עם אורגניזמים לדוגמה הוא שניתן לחקור באופן מלא הבנה מכנית של תפקוד הגנים לתהליך ביולוגי נתון. זה אפשרי בגלל הגנומים המאופיינים היטב וכלים גנטיים רבים הזמינים באורגניזמים מודל המאפשרים מניפולציה מדויקת של תפקוד הגנים בנקודות זמן התפתחותיות ברורות, רקמות ספציפיות, תאים בודדים, ואפילו אברונים תת-תאיים. אלה כוללים מערכות ביטוי בינאריות כגון מערכת UAS /GAL4 (ונגזרותיה הרבות), CRISPR/Cas9 ו- RNAi24,25,26. כאשר כלים גנטיים אלה משמשים בשילוב עם צינור הדמיה רב עוצמה המורכב ממיקרוסקופיה אלקטרונית, מיקרוסקופיה קלה (פלואורסצנטית ולא פלואורסצנטית), והדמיה של בעלי חיים שלמים כגון μ-CT, הערכה יסודית של מולקולות, תאים, רקמות, איברים והאורגניזם כולו ניתן להשיג, המאפשר הבנה עמוקה הרבה יותר של תפקוד הגנים.

פרוטוקול זה מתמקד בשימוש μ-CT באורגניזם המודל הלא יונקי Drosophila melanogaster, שכליו הגנטיים הרבים עזרו להדגיש מנגנונים מולקולריים רבים26,27. הוא אומץ מפרוטוקולים קודמים בחרקים שאינם מודל1,28,29,30,31,32, ובונה ממחקרים קודמים μ-CT בדרוסופילים כדי לקבוע פרוטוקול סטנדרטי לשימושו בחיה זו 33 ,34,35,36,37,38,39 ,40,41. השלבים להכנה מוצלחת של מדגם, הדמיה וניתוח של ערכות נתונים fly μ-CT באמצעות סורקים זמינים מסחרית מפורטים. עם פרוטוקול זה, ניתן לדמיין את כל השלבים ההתפתחותיים של הזבוב ברזולוציה גבוהה הן עבור מחקרים תיאוריים והן למחקרי בדיקת השערה, כולל טקסונומיה, אנטומיה, פיתוח, פיזיולוגיה ומחלה27. פרוטוקול זה יהיה שימושי גם להדמיה כמעט כל חרק ואפילו חומרים שאינם חיים הדורשים כתמים כימיים עבור ניגודיות תמונה כדי לשפר את ההדמיה על ידי μ-CT.

Protocol

1. בחירת דוגמאות והכנת חתך

  1. בחר את נקודת הזמן ההתפתחותית המתאימה (עובר, זחל, גולם או מבוגר) להדמיה.
    1. עבור שלבים עובריים, כלוב נקבות על צלחות אגר מיץ ענבים מרוח עם ממרח שמרים ולאסוף ביצים כל 30-60 דקות. השאירו עוברים אלה לפתח ב 25 °C (70 °F) עד לשלב הנכון הוא הגיע.
    2. עבור שלבי זחל, לאסוף instars הראשון והשני מניסויים איסוף עוברים מתוזמן. בחר ישירות 3 כוכבים3 rd מהצד של מקטורן המזון בתנאים שאינם צפיפות.
    3. לתזמון הגולם, לאסוף לפני גולם לבן (spiracles הפוך) ולשים לב לזמן שבו גוון האוויר מתחיל להשחים. בעלי חיים יתקדמו דרך 15 שלבים של התפתחות הגולם בנקודות זמן מוגדרות לאחר השחמת חתך וניתן לאסוף אותם בהתאם42.
    4. לאסוף מבוגרים כבתולים לאחר אקסלוסיה ולאפשר להזדקן בחתנת מזון למשך פרק זמן נדרש (למשל, 5 ימים להתפתחות מעיים מלאה).
  2. העבר 5-50 בעלי חיים לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל המכיל 1 מ"ל של 0.5% טריטון X-100 ב 1x תמיסת מלח חוצצת פוספט (0.5% PBST). תוך הקשה על הצינור מעת לעת על הספסל, דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT) כדי לסייע בהסרת הציפוי ההידרופובי ולאפשר לבעלי חיים להיות שקועים לחלוטין.
    1. עבור שלבים עובריים, זחלים וגומה, לעצור התפתחות נוספת על ידי הצבת הצינור בלוק חום להגדיר 100 °C (20 s) ואחריו קירור ב RT במשך 5 דקות.
      הערה: בעלי חיים יכולים גם להיות קפואים בחנקן נוזלי37.

2. קיבעון וכתמים

  1. הסר 0.5% PBST והוסף 1 מ"ל של הפתרון של Bouin. צינור ברז כדי להבטיח שבעלי החיים שקועים לחלוטין.
    זהירות: הפתרון של בוין מכיל פורמלדהיד. זה עלול לגרום רעילות חריפה לעור ולעיניים אם נשפך והוא יכול להיות קטלני אם נבלע. ללבוש כפפות, משקפי בטיחות וחלוק מעבדה בעת הטיפול.
    הערה: טכניקות קיבעון נוספות ניתן להשתמש גם, כגון שימוש באתנול. היתרונות של קיבועים אחרים מתוארים בפירוט בנציג1,30.
    1. עבור דגימות עובר ומבוגרים, דגירה על הספסל במשך 16-20 שעות ב RT.
    2. עבור דגימות זחלים וגועל, לתקן בעלי חיים עבור 2 שעות ב RT. להשליך את הפתרון של Bouin ולשטוף עם 1x PBS במשך 5 דקות שלוש פעמים. מעבירים לצלחת ניתוח רב-טובה המכילה 1x PBS ומשתמשים בסיכת מינוטין קטנה המחוברת למחזיק כדי לנקב חור בעור הקדמי והאחורי נזהרים שלא לשבש כל רקמה רכה שבבסיסה.
    3. מעבירים דגימות זחל וגופרית בחזרה לצינור מיקרו-פאג' ומוסיפים 1 מ"ל של תמיסת בואן טרייה. דגירה על ספסל במשך 24 שעות ב RT.
  2. הסר את הפתרון של Bouin וחץ דגימה למשך 30 דקות עם 1 מ"ל של חוצץ שטיפת μ-CT (0.1 M Na2HPO4, 1.8% סוכרוז) או 1x PBS שלוש פעמים.
  3. מוסיפים 1 מ"ל של פתרון הכתמים המתאים ודגרה על ספסל במשך 2-7 ימים.
    הערה: בחירת הכתם תהיה תלויה בגורמים רבים, אך היא בדרך כלל איזון בין חדירה, זמן דגירה ורזולוציה. באופן כללי, חומצה פוספוטונגסטית (PTA) מספקת ניגודיות ורזולוציה מעולים של רקמות רכות אך דורשת הפרעה מכנית של הציפורן ותנאי הדגירה הארוכים יותר. היתרונות של סוגי כתמים שונים מתוארים בפירוט בנציג1.
    1. עבור כתמי יוד, השתמש 1 מ"ל של 0.1 N I2KI (פתרון לוגול). דגירה ליומיים. אין צורך בהפרעה נוספת לתחכוך למבוגרים.
    2. להכתמת חומצה פוספוטונגסטית (PTA), יש להשתמש ב-1 מ"ל של תמיסה של 0.5% (w/v) מדוללת במים. לשבש את נקבת בטן למבוגרים, או על ידי הסרת איברי הפה או לדקור חורים בבית החזה או בטן עם סיכת minutien קטנה מחובר למחזיק. דגירה במשך 5-7 ימים, או יותר אם כתמי רקמות נראה לא הומוגני.
  4. לשטוף עם 1 מ"ל של מים אולטרה-תפותיים או 1x PBS במשך 30 דקות. חזור על שלב הכביסה. יש לאחסן בעלי חיים ב-RT במים אולטרה-תפותיים או ב-1x PBS למשך עד חודש.
  5. אם יש לסרוק בעלי חיים בזמן התייבשות, יש להמשיך ישירות לסעיף 4. אם יש צורך בשימור ארוך יותר של המדגם, המשך לסעיף 3 של הפרוטוקול.

3. ייבוש נקודות קריטי (אופציונלי)

  1. בצע סדרת התייבשות אתנול (EtOH) על המדגם: 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 100%. מוסיפים 1 מ"ל של פתרון EtOH ודגרה על הספסל במשך שעה אחת עבור כל ריכוז בסדר כאמור.
  2. לאחר 100% EtOH הסופי להשרות, להחליף עם 100% EtOH טרי ולתת מדגם דגירה על הספסל לילה.
  3. בצע ייבוש נקודות קריטי של דגימות בהתאם להוראות היצרן.
    הערה: מתקני מיקרוסקופיה אלקטרונים בדרך כלל יש מכונת ייבוש נקודה קריטית (ראה טבלה של חומרים)שתבצע את ייבוש המדגם לאחר התייבשות EtOH.

4. הרכבה לדוגמה

  1. עבור דגימות מיובשות בנקודה קריטית, דגימות דבק חם סיכת חרקים או מחזיק אחר שנועדו להתאים בתוך הצ'אק של השלב המסתובב או למקם אותו בצינור נימי פלסטיק או זכוכית (~ 1.0-1.25 מ"מ קוטר פנימי).
  2. עבור דגימות לחות, מלאו טיפ P10 pipette במים ואבטחו את הקצה הצר על ידי איטום חום או סרט פרפין למניעת דליפה.
    אזהרה: הקפד לעטוף את כל החיבורים בחוזקה כך מים לא לדלוף לתוך הסורק ולגרום נזק.
    1. מעבירים דגימה אחת לקצה הפיפטה באמצעות מלקחיים. באמצעות חפץ ארוך ודקים, כגון מחט 20 גרם קהה או קצה פיפטה אחר, דוחפים בזהירות את הדגימה במורד הקצה עד שהיא רק יוצרת קשר עם הקיר של קצה הצינור כדי להחזיק אותה במקומה.
    2. לכסות את הפתיחה של קצה pipette עם סרט פרפין כדי למנוע אידוי של מים במהלך סריקות ארוכות.
    3. הר את פיפטת P10 באמצעות מחזיק שנועד להתאים בתוך הצ'אק של השלב המסתובב(איור 1A-C).

5. סריקה

  1. בצע את כל הכיול הדרוש של המכונה לפני ההדמיה למשך היום.
    הערה: אלה ישתנו לפי יצרן ומומלץ להתייעץ עם מומחה יישום כדי לקבוע את השלבים הנכונים. נא עיין בטבלת החומרים לקבלת מידע ספציפי אודות ההתקנה והתוכנה המשמשות בפרוטוקול זה. בדרך כלל, כיולים כגון יישור ציר שלב כדי להסיר כל 'תנודה' המשויכת לכך שהצ'אק מחוץ לציר ביחס לשלב המסתובב וביצוע תיקוני שדה שטוח כדי להבטיח עוצמות אחידות של פיקסלי רקע במצלמה מספקים תנאי הדמיה אופטימליים לרזולוציה הטובה ביותר ולערימות נתונים הדומות בסריקות מרובות.
  2. פתח את דלת הסורק כדי לקבל גישה לבמה המסתובבת על-ידי לחיצה על סמל 'דלת פתוחה' בפינה הימנית העליונה של התוכנה. חבר את המדגם על ידי הידוק הצווארון סביב הבסיס של מחזיק המדגם.
    הערה: השתמש/י בלחץ עדין בעת חיבור הדגימה לצ'אק המסתובב כדי לשמור על יישור הסורק.
  3. הגדר פרמטרי סריקה בתוכנה השולטת בסורק לרזולוציה וניגודיות מיטביות.
    הערה: אלה יצטרכו להיקבע אמפירית כמו מקור רנטגן, מצלמה / גלאי, וגיאומטריה של כל סורק ישתנו לפי היצרן. מידע נוסף לבחירת הפרמטרים הטובים ביותר ניתן למצוא גם כאן43, כמו גם מן המומחה היישום של היצרן.
    1. פתח את בקרת צריכת החשמל של מקור הרנטגן (אפשרויות | מקור צילום רנטגן). השתמש בפסי המחוון כדי להגדיר מתח רנטגן ל- 30-40 kV וזרם ל- 100-110 μA כדי לייצר קרן רנטגן עם הספק של 3-4 ואט וגודל ספוט קטן לרזולוציה משופרת.
    2. שימוש בתיבת הדו-שיח מצבי רכישה(אפשרויות | מצבי רכישה) כדי להגדיר את זמן החשיפה למצלמה ל 500-800 ms.
    3. השתמש בסרגל המחוון הממוקם לצד סמל הזכוכית המגדלת בתחתית התוכנה כדי להגדיר את גודל פיקסל התמונה הרצוי (~ 700 ננומטר עד 4 מיקרומטר), בהתאם להגדרות המצלמה ולמיקום. פעולה זו קובעת את מספר תמונות ההקרנה שנרכשו במהלך הסריקה, עם תחזיות נוספות המובילות לרזולוציה משופרת אך זמני סריקה ארוכים יותר (ראה תוצאות מייצגות).
    4. לחץ וגרור את סרגל המחוון הממוקם לצד החץ המסתובב בתחתית התוכנה כדי להזיז את הדוגמה לאורך נתיב הסיבוב שלה ב- 360°. ודא שהדגימה נשארת בשדה הראייה.
  4. לחץ על הסמל 'התחל רכישה' (סמל חץ עיגול כחול) בחלק העליון של התוכנה. מופיעה תיבת דו-שיח המאפשרת להגדיר פרמטרי סריקה נוספים ואת תיקיית הקבצים והפלט שבה יישמרו שם הסריקה.
    1. הגדר את התנועה האקראית ל- 10 ומסגרות ממוצעות של 4-6. שלב הסיבוב מחושב באופן אוטומטי בהתאם להגדרות המצלמה בהן נעשה שימוש.
  5. התחל בסריקה על-ידי לחיצה על 'אישור' בתיבת הדו-שיח רכישה. מופיעה תיבת דו-שיח של מד התקדמות שני המציג את זמן הסריקה. הסורק ירכוש כעת סדרה של תמונות הקרנה (איור 1D) של הדגימה לאורך נתיב הסיבוב ואין צורך לפקח עליהן.

6. שחזור

  1. כדי ליצור את ההנמוגרפיה, בצע שחזור תמונה באמצעות תמונות ההקרנה.
    הערה: בעוד שכמעט כל השחזור של תמונות מסורקי גיאומטריה של קרן חרוט מסתמכים על אלגוריתם פלדקמפ16, פרמטרים בודדים ישתנו בהתאם ליישום התוכנה ויש לקבוע אותם אמפירית. ההגדרות הבאות, הספציפיות עבור תוכנה זמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים) יכולות לשמש כמדריך. פרמטרים כגון פיצוי אי-התאמה, הפחתת חפץ טבעת ותיקון התקשות קרן (0% עבור רוב דגימות הזבובים) מבוצעים באופן איטרטיבי כדי לבחור את הערכים הטובים ביותר לשחזור הסופי. עבור משתמשים מתקדמים שרוצים שליטה רבה יותר על תהליך השחזור, ראה ממשק MATLAB כאן44.
  2. ביצוע יישור תמונה ראשוני על-ידי שימוש באלגוריתם לתיקון משמרות המבוסס על סריקותייחוס 45 (Actions | יישור X/Y עם סריקת ייחוס).
  3. כוונון עדין של כל פרמטר שחזור (התחל | כוונון עדין). פעולה זו מפעילה תיבת דו-שיח 'כוונון עדין של פרמטר'.
    1. כוונן את היישורעל-ידילחיצה על 'הבא' ל' לאחר היישור '. הגדר את מספר האיטרציות ל- 5 ואת שלב הפרמטר ל- 1.0. לחץ על לחצן התחל כדי ליצור סידרה של תצוגות מקדימות. בחר את התמונה המיושרת כראוי.
      הערה: תמונה מיושרת כהלכה לא תהיה מטושטשת או תציג חפצים 'גיזומים' שבהם מופיע מבנה רציף אחר (כגון החיתוך).
    2. כוונן את הפחתת חפץ הטבעת על-ידי לחיצה לידו. הגדר את מספר האיטרציות ל- 5 ואת שלב הפרמטר ל- 1.0. לחץ על לחצן התחל כדי ליצור סידרה של תצוגות מקדימות. בחר את התמונה המכילה את מספר הטבעות הבודד ביותר.
  4. לאחר שהפרמטרים שלעיל עברו אופטימיזציה כדי לתת את התמונה הטובה ביותר, ודא שהערכים שנבחרו מיוצגים כראוי בכרטיסיה הגדרות (הגדרות).
  5. התאם ערכי בהירות וניגודיות סופיים באמצעות היסטוגרמה, פרמטרי קובץ כגון עומק סיבית וסוג, והשתמש באזור עניין (ROI) המקיף רק את מבני העניין (למשל, זבוב שלם או ראש בלבד) כדי לקצר את זמן החישוב(Output).
  6. התחל את השחזור (התחל | התחל). אם נדרשים שחזורים מרובים, הוסף את התמונה הנוכחית למנהל האצווה(התחל | הוסף לאצווה) וחזור על שלבים 6.2-6.5 עבור התמונות הנותרות.

7. ניתוח תמונה

  1. דמיינו טומוגרמה בשניים ושלושה ממדים ובצעו ניתוח מורפומטרי נוסף עם תוכנה חופשית או תוכנה מסחרית.
    הערה: פרטי התוכנה המשמשת בפרוטוקול זה זמינים בטבלת החומרים. חבילות תוכנה אחרות המסוגלות להעריך ערכות נתונים μ-CT כוללות אפשרויות תוכנה חופשית כגון FIJI46, Seg3D (www.seg3D.org)47ו- ITK-SNAP48, בתוספת תוכנה מסחרית (למשל, AMIRA). יישומים אחרים שמשתמשים באלגוריתמים מבוססי למידת מכונה כדי להפוך את תהליך הפילוח לאוטומטי למחצה יכולים לעזור להאיץ זרימות עבודה ולהפחית את ההטיה האנושית (למשל, Biomedisa49).
  2. יבא את קובץ ההנמוגרפיה לתוכנה (קובץ | ייבוא קבצי תמונה). המטה-נתונים המשויכים לקובץ אמורים להיטען אוטומטית לחלון, אך ניתן להגדיר אותם גם באופן ידני כך שיתאימו למאפייני התמונה.
  3. כדי לפלח מבנה עניין, לחץ על הכרטיסיה פלח שוק בצד שמאל של המסך. יצירת אזור עניין חדש (ROI) (| בסיסי חדש), תן לו שם ובחר צבע מתאים.
  4. הגדר את טווח הסף המקיף את מבנה הריבית (טווח | הגדרת טווח) באמצעות סרגל המחוון.
  5. בחרו מצב כלי מתאים לצייר ROI 2D או תלת-ממדי(מברשת | אפשרות מברשת צבע).
  6. כדי לצבוע אזור המוגדר לפי הסף; הקש והחזק את מקש Ctrl בעת החזקת מקש העכבר השמאלי. כדי להסיר אזור, הקש והחזק את מקש Shift תוך החזקת מקש העכבר השמאלי.
    הערה: כדי לשנות את הגודל של מברשת צבע עגולה או מרובעת, פשוט גלול את גלגל העכבר תוך החזקת המקשים Ctrl או Shift.
  7. המשך לצבוע את מבנה העניין לאורך כל נפח Z שלו.
  8. המרת ההבח לאותה רשת(ייצוא | | רשת רגיל).
  9. סמן את שכבת-העל של רשת הרשת על-ידי לחיצה עליו בחלונית 'מאפייני נתונים והגדרות' בפינה השמאלית העליונה.
  10. החל את רשת הרשת באמצעות מספר מתאים של איטרציות (רשת חלקה | איטרציות).
    הערה: השתמש באותו ערך איטרציה של החלקת רשת ישנים עבור כל התמונות שיש להשוות.
  11. ודא שהמדידות של רשת החזרה על רשת(שטח פנים, נפח וקוטר Feret) מוצגות בחלונית 'מידע' בצד ימין של המסך לניתוח מורפומטרי בסיסי. ניתן לבצע ניתוח נוסף באמצעות מודול ניתוח אובייקטים.
  12. רנדרו את עצם רשת הרשת ואת תמונת טומוגרמה כולה והדמיינו בתלת-ממד. השתמש ביוצר הסרטים המוכלל כדי ליצור וידאו של האובייקט(לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני | הצג את יוצר הסרטים) באמצעות מסגרות בודדות מהמציג(הוסף מפתח).
    הערה: ניתן להחיל מספר שיפורים חזותיים על הסרט גם באמצעות הכרטיסייה אפקטים חזותיים בחלונית הימנית כדי להדגיש תכונות מסוימות, וכו '.
  13. יצא את הווידאו להצגה באמצעות לחצן יצא הנפשה ביוצר הסרטים.

Representative Results

איור 2 מציג תמונות של עובר, זחלי אינסטאר3, גלמים בשלב הבוגרים של פארה (P7), וזבוב מבוגר מוכתם ביוד ודמותו מיובשת במים באמצעות סורק ספסל מסחרי. שימור מעולה ואפילו כתמים של רקמות עדינות נראים לעין, ומאפשרים לזהות בקלות את כל האיברים העיקריים ולהשתמש בהם לניתוח מורפומטרי והדמיה תלת ממדית.

בדרך כלל, סריקות שרוכשות פחות תמונות הקרנה של הדגימה מספקות רזולוציה נמוכה יותר מאשר סריקות שרוכשות יותר תמונות הקרנה, כאשר ההחלפה היא זמן שהוקדש לסריקה. למרות זמני הסריקה ישתנו על ידי מכשיר ופרמטרים אחרים סריקה, סריקות לרכוש כמה מאות תחזיות (~ 3 מיקרומטר גודל פיקסל תמונה) לוקח בערך 30 דקות לכל דגימה, בעוד סריקות המורכבות אלפי תמונות הקרנה (700 nm-1.25 μm גודל פיקסל תמונה) יכול לקחת 8-16 שעות. השוואה של אותה כיסוי ראש זבוב למבוגרים שצולם הן במצב סריקה 'איטי' (אלפי תחזיות) והן במצב סריקה 'מהיר' (מאות תחזיות) מוצגת באיור 3. חשוב לציין, ניתוחים מורפומטריים אינם שונים בין סריקות 'איטיות' ו'מהירות' (איור 3C)40. צינור ההדמיה שלנו, אם כן, משתמש בסריקות מהירות כדי ליצור גודל מדגם גדול מספיק לניתוח מורפומטרי, וסריקות איטיות כדי לדמיין פגמים מורפולוגיים או אנטומיים ברזולוציה גבוהה יותר. באמצעות התוכנה (שלב 7), כל רקמה או מערכת איברים של עניין ניתן לפלח ולהשתמש לניתוח מורפומטרי ודמיינו בתלת-ממד באמצעות יוצר הסרטים (סרט 1).

איור 4 מראה דוגמה של הבטן הזבוב מוכתם עם PTA ו התמונה hydrated (מים) או בעקבות ייבוש נקודה קריטית (CPD) על מיקרוסקופ רנטגן (שולחן החומרים). הפרטים המוענקים על ידי שילוב של ועד ההורים והיכולות של פלטפורמה זו ניכרים בקלות בתמונות אלה, כך שתאי אפיתליה בודדים של מידגוט וחבילות זרע בתוך האשכים נפתרים בקלות. בעוד שתמונת CPD מראה רזולוציה מוגברת שולית בהשוואה לדגימה hydrated, שימור טוב יותר של אולטרה מבנה של רקמות עדינות (כגון תאי השומן ליד החתך) מושגת עם דגימות hydrated(סרט 2).

Figure 1
איור 1: מבט כולל על עיצוב הסורק והרכבת הדגימה עבור μ-CT. (A)ספסל מסחרי μ-CT סורק. (B)הצג בתוך הסורק. מקור הרנטגן (מימין) פולט צילומי רנטגן העוברים דרך המדגם הממוקם על שלב מסתובב (חץ צהוב). ההנחיה של צילומי רנטגן אלה יוצרת ניגודיות תמונה כאשר הם עוברים דרך המדגם אל הגלאי, המורכב ממסך נוצץ הממיר צילומי רנטגן לפוטונים ומצלמת CCD סטנדרטית (משמאל). (ג)הרכבה של זבוב פירות בוגר להדמיה מיובשת במים. נקודות החיבור בין קצה הפיפטה למחזיק הפליז עטופים בסרט פרפין למניעת דליפה ונזק פוטנציאלי לסורק. גם צ'אק הבמה מודגש. שימו לב שקצה הפיפטה היה ממוקם מעט מחוץ לציר, מה שהוביל לזמן סריקה ארוך יותר ולצמצום הרזולוציה בשחזור הסופי. (D)תמונת הקרנה דו-ממדית אחת של זבוב נקבה בוגר; מאות עד אלפי תחזיות אלה נרכשות במהלך סריקה לאורך ציר הסיבוב ומשמשות לשחזור כדי ליצור טומוגרמה המכילה רזולוציה איזוטרופית ומידע תלת-ממדי מדויק. מוטות קנה מידה (C) = 2 מ"מ. P, אחורי; וי, גחון. נתון זה שונה מ Schoborg ואח'40. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: כל שלבי מחזור החיים של Drosophila melanogaster, בתמונה על ידי μ-CT. דגימות מוכתמות ביוד ותמונה hydrated במים. מוצג פרוסה 2D יחיד. (א)עובר שהשלים את השלבים המוקדמים של גסטריולציה (כוכבית). (B)זחל כוכב שלישי. (C)P7 pharate מבוגר במהלך מטמורפוזה. (ד)נקבה בוגרת. איברים שונים מודגשים: BWM, שרירי דופן הגוף; בר, מוח; דיסק, קרדיה; Cr, יבול; DLMs, שרירי אורך שרירי גלשית שרירים; DVM, שרירי גחון גחון שרירים; E-AD, דיסק אנטנה לעיניים; אם, עובר; FB, גופים שמנים; FBCs, תאי גוף שומן; ח', לב; ה"ג, הינדגוט; לה, למינה; L, רגל; מ"ג, מידגוט; OL, אונה אופטית במוח; אוב, ovipositor; PC, ציפורניים pupal; ס"ג, בלוטות רוק; VNC, כבל עצב גחוני; W, כנף; WD, דיסק כנף. מוטות קנה מידה (A) = 100 מיקרומטר; (B)-(D) = 500 מיקרומטר. D, דורסל; א' ל', שמאלה. פרמטרי סריקה: מקור למרחק דגימה (מ"מ): (A, D) 36.5, (B) 48.8, (C) 40.3. מקור למרחק מצלמה (מ"מ): (A, D) 350, (B, C) 285. גודל פיקסל מצלמה (מיקרומטר): (A-D) 11.6. גודל פיקסל תמונה (מיקרומטר): (A, D) 1.2, (B) 1.9, (C) 1.7. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: פרמטרי סריקה ורזולוציית תמונה אינם משנים ניתוחים מורפומטריים. ראש מבוגר נסרק באמצעות הגדרות הסורק 'מהיר'(A, A') (מאות תחזיות) והגדרות הסורק 'איטי' (אלפי תחזיות) ו-(B, B') (אלפי תחזיות). המוח מתואר בצהוב. (C)מדידות נפח המוח מסריקות איטיות ומהירות. מבנים מודגשים: אל על; אונת האנטנה; CB, מוח מרכזי; FB, גוף בצורת מאוורר; FCs, תאי שומן; לה, למינה; לו, לובולה; LoP, צלחת לובולה; אני, מדולה; רי, רשתית. n = 5, מבחן t של וולש. ns = לא משמעותי. סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר. פרמטרי סריקה: מקור למרחק דגימה (מ"מ): (A) 44.4, (B) 36.5. מקור למרחק מצלמה (מ"מ): (A) 348 (B) 350. גודל פיקסל מצלמה (מיקרומטר): (A-B) 11.6. גודל פיקסל תמונה (מיקרומטר): (A) 2.95, (B) 1.2. נתון זה שונה מ Schoborg ואח'40. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: הבטן של דרוזופילה מלנוגאסטר בתמונה של מיקרוסקופיה של קרני רנטגן. הבטן הוכתמה עם 0.5% PTA ותמונה hydrated (מים) או בעקבות ייבוש נקודה קריטית (CPD). (A)נקודה קריטית בטן מיובשת, מוצג מנקודת המבט YZ ו (A') XZ בפרספקטיבה. (B)בטן מיובשת, מוצג מנקודת המבט של YZ ו -(B') XZ בפרספקטיבה. איברים שונים מודגשים: FC, תאי שומן; ה"ג, הינדגוט; מ"ג, מידגוט; SP, משאבת זרע; טה, אשכים. מוטות קנה מידה (A) = 250 מיקרומטר. D, דורסל; א' ל', שמאלה. פרמטרי סריקה: מקור למרחק דגימה (מ"מ): (A) 6.7, (B) 7. מקור למרחק מצלמה (מ"מ): (A) 28 (B) 29.5. מטרה: (A-B) 4X. גודל פיקסל תמונה (מיקרומטר): (A-B) 0.65. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

סרט 1: זחל כוכב שלישי, שניתן בתלת-ממד באמצעות יוצר הסרטים בדרקון. איברים מודגשים כוללים את המוח (צהוב), דיסקים דמיוניים עיניים-אנטנה (אדום), גוף השומן (כחול) ואת שרירי דופן הגוף (ירוק). אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט הזה.

סרט 2: השוואה בין דוגמאות שתמונות במים או מעקב אחר ייבוש נקודות קריטי. בטן מוכתמת עם 0.5% PTA מוצגים. שתי הבטן נסרקו עם הגדרות זהות בגודל פיקסל תמונה (0.65 מיקרומטר). סדרה של פרוסות דו-ממדיות מוצגות בתבנית 'Z-stack' (YZ) החל ממשטחת הגדש וכלה במשטח הגחון של הבטן. איברים מודגשים: FC, תאי שומן; מ"ג, מידגוט; SP, משאבת זרע; טה, אשכים. פרמטרי סריקה: מקור למרחק דגימה (מ"מ): (A) 6.7, (B) 7. מקור למרחק מצלמה (מ"מ): (A) 28 (B) 29.5. מטרה: (A-B) 4X. גודל פיקסל תמונה (מיקרומטר): (A-B) 0.65. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט הזה.

Discussion

הדמיית Drosophila melanogaster שלם בכל השלבים ההתפתחותיים נותרה אתגר, בעיקר בשל חוסר תאימות של מיקרוסקופיה אור עם עבה, פיגמנט חותך נמצא בחיה זו. בעוד שיטות הדמיה של בעלי חיים שלמים אחרות, כגון הדמיית תהודה מגנטית (MRI), טומוגרפיה קוהרנטית אופטית (OCT) ו ultramicroscopy בשילוב עם ניקוי רקמות שימשו בהצלחה זבובים50,51,52,53,54, μ-CT מציג מספר יתרונות שהופכים אותו אידיאלי עבור הדמיה חיה שלמה של אורגניזם זה13,15,30 . צילומי רנטגן חודרים בקלות את החתך הפיגמנטי ואורך הגל הקטן שלהם מאפשר הדמיה תת-מיקרונית. תיוג דורש השקעה מינימלית בכימיקלים זמינים נרחבים וללא כישורי ספסל מיוחדים13. סורקי μ-CT זמינים גם הם מסחרית, והעלויות דומות לפלטפורמות מיקרוסקופיות קלות, ובמקביל אטרקטיביות יותר למגוון רחב יותר של דיסציפלינות (גיאולוגיה, פליאונטולוגיה, הנדסה וכו ') שיכולות גם ליהנות לזמינותה במוסד. ניתן להשתמש במקורות רנטגן סינכרוטרון גם להדמיית μ-CT ברזולוציה גבוהה של חרקים קבועים וחיים31,55,56, אך הם נגישים פחות מסורקים מסחריים.

פרוטוקול זה מספק דרך יעילה להשיג תמונות μ-CT של מבוגרים מעופפים, גלמים, זחלים ועוברים תאיים. שים לב כי עבור רבים מהצעדים המתוארים לעיל, ניתן להחיל שיטות חלופיות גם כדי להכין דוגמאות להדמיה. מחקרים אחרים סיפקו השוואה מפורטת של של שלבי קיבעון, תיוג וייבוש שונים לשימוש בחרקים ואלה המעוניינים לאמץ טכניקה זו מוזמניםלהעריךאת היתרונות של כל גישה 1,4,13,29,30,57. בעוד פרוטוקול זה הוא פשוט יחסית, כמה הצעות מועילות מוצגות.

ראשית, יש לנקוט זהירות בעת שיבוש חתך של דגימות שלמות, כך שבבית רקמות רכות אינן משובשות באופן משמעותי. חשוב לתת לשלבי זחלים ופופאלים מוקדמים לעבור קיבעון במשך שעתיים בפתרון של בוין לפני לחטט. זה יקשיח את הרקמה ויגביל את כמות המולימפ כי יהיה למטלג מתוך חורי נקב, אשר יכול לשנות את ארכיטקטורת האיברים. מקטעי גוף בודדים (ראש, בית חזה ובטן) של המבוגר ניתן להפריד אם המבנה של עניין ממוקמים שם. מומלץ להשתמש באזמל כדי לחתוך בצורה נקייה את המקטעים האלה במקום להפריד אותם עם מלקחיים, אשר יכול לשבש את הארכיטקטורה 3D של המעיים או מערכת העצבים המרכזית, למשל. באשר לתזמון, מבוגרים בדרך כלל צריכים רק 16 שעות. עבור קיבוע מלא, בעוד שלבים זחל וגופל צריך 24 שעות. כמו כן, אם כתמי יוד או PTA נראה לא אחיד, המדגם יכול להיות ממוקם בחזרה בתמיסה לדגור זמן רב יותר עד אפילו כתמים מושגת. לבסוף, דגימות hydrated לא צריך להיות ממוקם ב 4 °C (50 °F), כמו זה נראה לגרום להיווצרות של בועות אוויר בתוך חלל הגוף לאחר התחממות לטמפרטורת החדר.

שנית, הרכבה מדגם ישתנה לפי מכשיר, סוג שלב והאם המדגם צריך להישאר hydrated או כבר נקודה קריטית מיובשת. אם hydrated, להבטיח את המדגם לא לדלוף ואולי להרוס את הסורק. בעת הרכבת הדגימה בתוך קצה פיפטה, הקפידו לדחוף בעדינות עם חפץ קהה עד שהדגימות נתקלות בהתנגדות קלה ולא יכולות לזוז. לחיצה קשה מדי עלולה להוביל לעיוות בקצרה ולפגמים מבניים. כמו כן, ודא כי המדגם מיושר במחזיק קרוב ככל האפשר לציר הסיבוב. כל תנודה תגדיל את זמני הסריקה בשל שדה הראייה הגדול יותר ותפחית את הרזולוציה של טומוגרמה הסופית לאחר השחזור.

שלישית, הגדרות הסורק לרכישת תמונות הקרנה ישתנו גם הן לפי מכשיר. כדי למקסם את יכולות הרזולוציה של הסורק, גודל ספוט קרן הרנטגן צריך להיות קטן ככל האפשר (5-10 מיקרומטר). ניתן להשיג זאת על ידי איזון מתח רנטגן והגדרות זרם, כך שההספק הכולל הוא 3-4 W. עם הגדרות אלה וזמן החשיפה המתאים במצלמה, ניתן להשיג חיווי נכון של קרן הרנטגן על ידי הדגימה וניגודיות תמונה אופטימלית. השימוש במסנני אלומיניום או נחושת בין האובייקט למקור הרנטגן יכול לשמש לכוונון הגדרות אנרגיית הרנטגן האופטימליות לניגודיות התמונה הטובה ביותר או להחלשת הקרן מספיק כדי להשתמש במקורות בעלי עוצמה גבוהה יותר. באשר לרזולוציית התמונה, הדבר יהיה תלוי במשתנים רבים ושונים, כולל סוג כתם, מספר תמונות הקרנה, גודל פיקסל תמונה, מיקום המצלמה, תנועת הדגימה, תנודות הסורק ופרמטרים של שחזור. פנטום תבנית סרגל (QRM GmbH) המכיל סמני גודל ידועים יכול לסייע בהערכת רזולוציה מרחבית עבור הגדרת סורק ומצלמה נתונה.

כדאי גם להעריך את היתרונות של הדמיה נקודה קריטית מיובש או hydrated דגימות. Sombke ואח ' ביצע הערכה השוואתית של שתי השיטות ומצא ייבוש נקודה קריטית להיות מעולה עבור יישומי μ-CT מעורבים פרוקי רגליים30. עם זאת, היתרונות של דגימות hydrated הם כי בעלי חיים חשופים פחות חשיפה כימית ומכאנית שיכול להוביל הן כמותי ומורפולוגית. זה גם נוטה לשמר רקמות עדינות טוב יותר מאשר CPD. עם זאת, דגימות hydrated יש חיי מדף קצרים בהרבה צריך להיות התמונה לא יאוחר מחודש לאחר קיבעון מאז השפלת רקמות ואיכות תמונה מופחתת הופך ברור בשלב זה. כמו כן, הרזולוציה של דגימות hydrated יהיה קצת פחות מדגם מיובש נקודה קריטית, כי צילומי רנטגן חייבים לחדור גם דרך קצה פיפטה פלסטיק ואת הנוזל שמסביב (מים או חוצץ). דגימות מיובשות נקודה קריטית ניתן לשמר במשך פרקי זמן ארוכים בהרבה, במיוחד כאשר נשמר על Drierite. הם גם יכולים להיות ממוקמים ישירות בנתיב קרן הרנטגן פשוט על ידי הדבקת הכנפיים או הרגליים סיכת חרקים והצבתו על צ'אק הבמה, פישוט תהליך ההרכבה. עם זאת, התייבשות האתנול הנרחבת של דגימות אלה יכולה להוביל להתכווצות רקמות ואובדן ארכיטקטורת רקמות עדינה, ולכן חשוב לבצע מגוון של ריכוזי EtOH גוברים כדי למזער את ההשפעות האלה. עם זאת, יש לציין כי כל צורות הטיפול הכימי, כולל קיבעון paraformaldehyde ואפילו כתמי יוד יכול לגרום התכווצותרקמות 58,59. אף על פי שאף אחת מהשיטות לא תספק מדידות של 'גודל איברים בפועל' בזבוב חי, מדידות מורפוטיות עדיין תקפות בעת השוואת בעלי חיים מוטנטיים וטיפוסי בר כל עוד שלבי הקיבעון, הכתמים והייבוש מתבצעים באופן זהה עבור שתי קבוצות הדגימות – רצוי במקביל.

לסיכום, μ-CT מספק כלי הדמיה בעל חיים שלם שימושי עבור Drosophila33,34,35,36,37,38,39,40,41. מחקרים רבים אחרים הציגו את כוחה של טכנולוגיה זו להבנת היבטים שונים של טקסונומיה חרקים, אקולוגיה, פיזיולוגיה, פיתוח ואנטומיה שיכולים לעזור ליידע מחקרים עתידיים זבובים1,28,30,31,32,55,56,57 . בשילוב עם כלי מיקרוסקופיה גנטית ואור כבר בשימוש נרחב באורגניזם זה, μ-CT יכול למקם את עצמו בתוך צינור ניסיוני המאפשר הבנה עמוקה יותר בין גנוטיפ פנוטיפ.

Disclosures

המחבר אינו מצהיר על אינטרסים מתחרים או פיננסיים.

Acknowledgments

כל זה לא היה אפשרי ללא תמיכתו של נאצר רוסאן. אני רוצה להודות לדאג מוריס, דניאל דונהיו וברנדה קלונברג ממתקן הדמיית העכברים של NIH ובן אצ'ה ממיקרו פוטוניקס על האימונים והדיון המועיל. אני גם מודה למנסורה נורוזי ראד מזאייס על סריקת דגימות בטן בקסרדיה 520 ורסה. גם לורן סמית', סמנתה סמית ורייצ'ל אנג עזרו בסריקה. מייק מארש ממערכות מחקר אובייקטים סיפק תמיכה טכנית שפירית. אני גם אסיר תודה על התמיכה של מכון הלב, הריאות והדם הלאומי (1K22HL137902-01) וקרנות סטארט אפ מאוניברסיטת ויומינג. אני גם מודה לסוקרים האנונימיים על ההצעות וההערות המועילות שלהם.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100% Ethanol For critical point drying
Bouin's Solution Sigma-Aldrich HT10132 For animal fixation
Critical Point Dryer Dries samples using the critical point method; multiple options available (Balzers CPD 020 or Leica EMCPD300)
Dragonfly Software Object Research Systems For visualization and segmentation of micro-CT datasets; https://www.theobjects.com/dragonfly/index.html
Heat Block For microfuge tubes
Image Analysis Workstation Should contain sufficient RAM and quality graphics card for 3D rendering
Iodine Solution (I2KI) Fisher Scientific SI86-1 For staining
Microcomputed Tomography Scanner Bruker Skyscan 1172 Cone-beam X-Ray geometry; detector is a Hamamatsu 10 MP camera with 11.54 µm pixel size.
Microcomputed Tomography Scanner Software Bruker For controling the scanner itself (e.g., performing flat field corrections, X-ray tube power, camera expsoure times, acquisition, etc.)
Minutien Pins Fine Science Tools 26002-15 For poking hole in cuticle
NRecon Image Reconstruction Software Bruker Used to reconstruct cross-section images from 2D projection images taken with cone-beam X-Ray geometry
P10 pipet tips Genesee Scientific 24-120 Sample mounting
Phosphate Buffered Saline Resarch Products International P32060-4000.0 Dilute to 1X with water before use
Phosphotungstic Acid Hydrate Sigma-Aldrich 79690-25g For staining
Pin Holder Fine Science Tools 26018-17 For Minutien Pins
Triton X-100 Research Products International 111036 To remove waxy coating from adult flies (as 0.5% PBST)
X-Ray Microscope Zeiss Xradia 520 Versa Cone-beam X-Ray geometry featuring Fresnel zone plate objective lenses for Resoluton at a Distance (RaaD™)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, 11 (2009).
  2. Rahman, I. A., Smith, S. Y. Virtual paleontology: computer-aided analysis of fossil form and function. Journal of Paleontology. 88 (04), 633-635 (2014).
  3. Carlson, W. D. Three-dimensional imaging of earth and planetary materials. Earth and Planetary Science Letters. 249 (3-4), 133-147 (2006).
  4. Gutiérrez, Y., Ott, D., Töpperwien, M., Salditt, T., Scherber, C. X-ray computed tomography and its potential in ecological research: A review of studies and optimization of specimen preparation. Ecology and Evolution. 8 (15), 7717-7732 (2018).
  5. Abel, R. L., et al. Digital preservation and dissemination of ancient lithic technology with modern micro-CT. Computers & Graphics. 35 (4), 878-884 (2011).
  6. Kastengren, A., Powell, C. F. Synchrotron X-ray techniques for fluid dynamics. Experiments in Fluids. 55 (3), 1686 (2014).
  7. Boerckel, J. D., Mason, D. E., McDermott, A. M., Alsberg, E. Microcomputed tomography: approaches and applications in bioengineering. Stem Cell Research & Therapy. 5 (6), 144 (2014).
  8. Du Plessis, A., Yadroitsev, I., Yadroitsava, I., Le Roux, S. G. X-Ray Microcomputed Tomography in Additive Manufacturing: A Review of the Current Technology and Applications. 3D Printing and Additive Manufacturing. 5 (3), 227-247 (2018).
  9. Cnudde, V., Boone, M. N. High-resolution X-ray computed tomography in geosciences: A review of the current technology and applications. Earth-Science Reviews. 123, 1-17 (2013).
  10. Zhu, Y., Zhang, J., Li, A., Zhang, Y., Fan, C. Synchrotron-based X-ray microscopy for sub-100nm resolution cell imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 39, 11-16 (2017).
  11. Kampschulte, M., et al. Nano-Computed Tomography: Technique and Applications. RoFo: Fortschritte Auf Dem Gebiete der Rontgenstrahlen und der Nuklearmedizin. 188 (2), (2016).
  12. Seeram, E. Computed tomography: A technical review. Radiologic Technology. 89 (3), 279-302 (2018).
  13. Rawson, S. D., Maksimcuka, J., Withers, P. J., Cartmell, S. H. X-ray computed tomography in life sciences. BMC Biology. 18 (1), 21 (2020).
  14. Morton, E. J., Webb, S., Bateman, J. E., Clarke, L. J., Shelton, C. G. Three-dimensional x-ray microtomography for medical and biological applications. Physics in Medicine and Biology. 35 (7), 805-820 (1990).
  15. Lin, A. S. P., Stock, S. R., Guldberg, R. E. Microcomputed Tomography. Springer Handbook of Microscopy. , Springer. 2 (2019).
  16. Feldkamp, L. A., Davis, L. C., Kress, J. W. Practical cone-beam algorithm. Journal of the Optical Society of America A. 1 (6), 612 (1984).
  17. Clark, D. P., Badea, C. T. Micro-CT of rodents: state-of-the-art and future perspectives. Physica Medica: PM: An International Journal Devoted to the Applications of Physics to Medicine and Biology: Official Journal of the Italian Association of Biomedical Physics (AIFB). 30 (6), 619-634 (2014).
  18. Schambach, S. J., Bag, S., Schilling, L., Groden, C., Brockmann, M. A. Application of micro-CT in small animal imaging. Methods. 50 (1), 2-13 (2010).
  19. Collins, F. S., Rossant, J., Wurst, W. A mouse for all reasons. Cell. 128 (1), International Mouse Knockout Consortium 9-13 (2007).
  20. Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3D mouse embryo atlas based on micro-CT. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).
  21. Dyer, E. L., et al. Quantifying Mesoscale Neuroanatomy Using X-Ray Microtomography. eNeuro. 4 (5), (2017).
  22. Weinhardt, V., et al. Quantitative morphometric analysis of adult teleost fish by X-ray computed tomography. Scientific Reports. 8 (1), 16531 (2018).
  23. Ding, Y., et al. Computational 3D histological phenotyping of whole zebrafish by X-ray histotomography. eLife. 8, 44898 (2019).
  24. Ahmadzadeh, E., et al. A collection of genetic mouse lines and related tools for inducible and reversible intersectional mis-expression. Development. 147 (10), (2020).
  25. Koster, R., Sassen, W. A. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. 2015, 151-163 (2015).
  26. Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: A primer on the Drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
  27. Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Disease Models & Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).
  28. Smith, D. B., et al. Exploring miniature insect brains using micro-CT scanning techniques. Scientific Reports. 6, 21768 (2016).
  29. Swart, P., Wicklein, M., Sykes, D., Ahmed, F., Krapp, H. G. A quantitative comparison of micro-CT preparations in Dipteran flies. Scientific Reports. 6, 39380 (2016).
  30. Sombke, A., Lipke, E., Michalik, P., Uhl, G., Harzsch, S. Potential and limitations of X-Ray micro-computed tomography in arthropod neuroanatomy: a methodological and comparative survey. The Journal of Comparative Neurology. 523 (8), 1281-1295 (2015).
  31. Betz, O., et al. Imaging applications of synchrotron X-ray phase-contrast microtomography in biological morphology and biomaterials science. I. General aspects of the technique and its advantages in the analysis of millimetre-sized arthropod structure. Journal of Microscopy. 227, Pt 1 51-71 (2007).
  32. Wipfler, B., Pohl, H., Yavorskaya, M. I., Beutel, R. G. A review of methods for analysing insect structures - the role of morphology in the age of phylogenomics. Current Opinion in Insect Science. 18, 60-68 (2016).
  33. Chen, W. C., et al. Toward a new insight of calcium oxalate stones in Drosophila by micro-computerized tomography. Urolithiasis. 46 (2), 149-155 (2017).
  34. Fabian, B., Schneeberg, K., Beutel, R. G. Comparative thoracic anatomy of the wild type and wingless (wg1cn1) mutant of Drosophila melanogaster (Diptera). Arthropod Structure & Development. 45 (6), 611-636 (2016).
  35. Harrison, J. F., et al. Developmental plasticity and stability in the tracheal networks supplying Drosophila flight muscle in response to rearing oxygen level. Journal of Insect Physiology. , (2017).
  36. Klok, C. J., Kaiser, A., Socha, J. J., Lee, W. K., Harrison, J. F. Multigenerational effects of rearing atmospheric oxygen level on the tracheal dimensions and diffusing capacities of pupal and adult Drosophila melanogaster. Advances in Experimental Medicine and Biology. 903, (2016).
  37. Mattei, A. L., Riccio, M. L., Avila, F. W., Wolfner, M. F. Integrated 3D view of postmating responses by the Drosophila melanogaster female reproductive tract, obtained by micro-computed tomography scanning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8475-8480 (2015).
  38. Mizutani, R., Saiga, R., Takeuchi, A., Uesugi, K., Suzuki, Y. Three-dimensional network of Drosophila brain hemisphere. Journal of Structural Biology. 184 (2), 271-279 (2013).
  39. Mizutani, R., Takeuchi, A., Akamatsu, G., Uesugi, K., Suzuki, Y. Element-specific microtomographic imaging of Drosophila brain stained with high-Z probes. Journal of Synchrotron Radiation. 15, Pt 4 374-377 (2008).
  40. Schoborg, T. A., Smith, S. L., Smith, L. N., Morris, H. D., Rusan, N. M. Micro-computed tomography as a platform for exploring Drosophila development. Development. 146 (23), (2019).
  41. Chaturvedi, D., Prabhakar, S., Aggarwal, A., Atreya, K. B., VijayRaghavan, K. Adult Drosophila muscle morphometry through microCT reveals dynamics during ageing. Open Biology. 9 (6), 190087 (2019).
  42. Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66, 57-80 (1981).
  43. Withers, P. J. X-ray nanotomography. Materials Today. 10 (12), 26-34 (2007).
  44. Bleichrodt, F., et al. Easy implementation of advanced tomography algorithms using the ASTRA toolbox with Spot operators. Numerical Algorithms. 71 (3), 673-697 (2016).
  45. Salmon, P. L., Liu, X., Sasov, A. A post-scan method for correcting artefacts of slow geometry changes during micro-tomographic scans. Journal of X-ray Science and Technology. 17 (2), 161-174 (2009).
  46. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  47. CIBC Seg3D: Volumetric Image Segmentation and Visualization. Scientific Computing and Imaging Institute (SCI). , Available from: http://www.seg3d.org (2016).
  48. Yushkevich, P. A., et al. User-guided 3D active contour segmentation of anatomical structures: significantly improved efficiency and reliability. Neuroimage. 31 (3), 1116-1128 (2006).
  49. Lösel, P., Heuveline, V. Enhancing a diffusion algorithm for 4D image segmentation using local information. Medical Imaging 2016: Image Processing. 9784, (2016).
  50. Null, B., Liu, C. W., Hedehus, M., Conolly, S., Davis, R. W. High-resolution, in vivo magnetic resonance imaging of Drosophila at 18.8 Tesla. Plos One. 3 (7), 2817 (2008).
  51. Holmes, J. In vivo real-time optical coherence tomography imaging of Drosophila for cardiovascular research. Nature Methods. 6 (10), 5557 (2009).
  52. Men, J., et al. Optical coherence tomography for brain imaging and developmental biology. IEEE journal of selected topics in quantum electronics: a publication of the IEEE Lasers and Electro-optics Society. 22 (4), 6083213 (2016).
  53. Jährling, N., Becker, K., Schönbauer, C., Schnorrer, F., Dodt, H. U. Three-dimensional reconstruction and segmentation of intact Drosophila by ultramicroscopy. Frontiers in Systems Neuroscience. 4, 1 (2010).
  54. Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).
  55. Socha, J. J., Westneat, M. W., Harrison, J. F., Waters, J. S., Lee, W. K. Real-time phase-contrast x-ray imaging: a new technique for the study of animal form and function. BMC Biology. 5, 6 (2007).
  56. Westneat, M. W., et al. Tracheal respiration in insects visualized with synchrotron x-ray imaging. Science. 299 (5606), 558-560 (2003).
  57. Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
  58. Stowell, R. E. Effect on tissue volume of various methods of fixation, dehydration, and embedding. Stain Technology. 16 (2), 67-83 (1941).
  59. Vickerton, P., Jarvis, J., Jeffery, N. Concentration-dependent specimen shrinkage in iodine-enhanced microCT. Journal of Anatomy. 223 (2), 185-193 (2013).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 163 Drosophila melanogaster טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת הדמיה פרה-אקלינית ניתוח תמונה מודל מחלות אנושיות פנוטיפינג
הדמיה חיה שלמה של <em>Drosophila melanogaster</em> באמצעות טומוגרפיה מיקרו-מחשבתית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schoborg, T. A. Whole Animal Imaging … More

Schoborg, T. A. Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography. J. Vis. Exp. (163), e61515, doi:10.3791/61515 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter