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Developmental Biology

마이크로 컴퓨팅 단층 촬영을 사용하여 드로소필라 멜라노가스터의 전체 동물 이미징

Published: September 2, 2020 doi: 10.3791/61515
Automatic Translation
1
1Department of Molecular Biology, University of Wyoming

Summary

마이크로컴퓨터 단층 촬영을 사용하여 개발 단계에서 온전한 드로소필라 멜라노가스터를 시각화할 수 있는 프로토콜이 제시된다.

Abstract

생물 의학 화상 진찰 공구는 유전자에서 유기체에 공간 비늘에 걸쳐 분자 기계장치의 조사를 허용합니다. Drosophila 멜라노가스터, 잘 특징적인 모형 유기체는, 세포와 조직의 수준에서 유전자 기능을 이해하기 위하여 빛과 전자 현미경 검사법의 사용에서 유익했습니다. 전체 온전한 유기체의 수준에서 유전자 기능의 이해를 허용하는 화상 진찰 플랫폼의 응용은 유전 기계장치에 대한 우리의 지식을 더욱 강화할 것입니다. 여기에 전체 동물 이미징 방법은 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (μ-CT)을 사용하여 모든 발달 단계에서 Drosophila를 시각화하는 데 필요한 단계를 설명 제시된다. μ-CT의 장점은 조직 해부 또는 청산 방법에 대한 필요없이 미크론 수준의 해상도에서 정확한 3D 정보를 생성하기 위해 시판 가능한 계측 및 최소한의 실습 시간을 포함한다. 이미지 분석 및 3D 렌더링을 가속화하는 소프트웨어와 결합하여 모든 조직 또는 장기 시스템의 상세한 형태 분석은 설명 및 가설 테스트 연구를 위한 개발, 생리학 및 해부학 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해 수행될 수 있습니다. 전자 현미경 검사법, 광 현미경 검사법 및 μ-CT의 사용을 통합하는 이미징 워크플로우를 활용하여 유전자 기능에 대한 철저한 평가를 수행하여 이 강력한 모델 유기체의 유용성을 발전시킬 수 있습니다.

Introduction

전체 적인 3D 아키텍처를 파괴하지 않고 물체의 내부 구조를 상세히 조사할 수 있도록 하는 이미징 방법은 물리학, 공학, 재료 과학, 고고학, 고생물학, 지질학, 생물학1,2,3,4,5,6,7,8,9등 다양한 분야에 널리 유익한 것으로 입증되었습니다. . 이러한 비파괴 이미징 방법 중, X선 기반 플랫폼은 가시 광선에 비해 최소한의 산란으로 많은 다른 샘플 유형과 재료를 관통하는 고에너지 X 선의 능력으로 인해 특히 유용합니다. 컴퓨터 단층 촬영 (CT), 마이크로 컴퓨팅 단층 촬영 (μ-CT), 나노 컴퓨팅 단층 촬영 (나노 CT), 및 싱크로트론 미세 토그래피는, 따라서, 밀리미터에서 마이크로폰에 이르기까지 샘플의 X 선 기반 이미징에 대한 주요 기술로등장10,11,12,13,14.

이러한 플랫폼은 샘플 크기와 해상도의 균형을 맞추기 위해 설계, X-ray 형상 및 구성 요소와 다르지만 모두 물체를 통과하여 검출기에 의해 캡처되는 X 선 소스인 이미지 캡처에 대한 동일한 기본 원칙에 의존합니다. X선 빔이 오브젝트 내의 다양한 밀도를 통과할 때 차감하여 이미지 대비를 생성합니다. 3D 데이터는 샘플 또는 검출기를 회전하여 알고리즘을 사용하여 분해되는 일련의 2D 프로젝션 이미지를 수집하여 x, y,z15에서이소트로픽이 있는 3D 정보를 포함하는 토모그램으로 재구성한다. 원뿔 빔 X선 형상을 사용하여 이미지되는 물체에서 X선을 투영하는 많은 벤치탑 μ CT 스캐너의 경우 Feldkamp 알고리즘은 최소한의 오류16으로물체를 정확하게 재구성하는 데 사용됩니다.

주어진 플랫폼의 해상도는 주로 X선 빔(spot size), 스캐너 지오메트리(물체에서 X선 소스까지의 거리), 검출기의 픽셀 크기 및 채택된 재구성 알고리즘과 같은 시스템 파라미터에 의해 결정됩니다. 스캐너 진동, X선 빔 변동, 샘플 이동 및 물체를 시각화하는 데 사용되는 재료 유형 또는 화학 적 얼룩과 같은 추가 요인은 실제 이미징콘디션(15)에서공간 해상도에 큰 영향을 미칠 수 있다.

생물 의학 응용을 위해, CT와 μ-CT는 해부학, 생리학, 발달 및 질병 기계장치에 대한 우리의 이해를 발전시키는 데 중요한 역할을했으며, 인간 환자 진단과 모델유기체17,18을위한 전임상 이미징 플랫폼으로서 역할을 합니다. 예를 들어, 마우스 게놈의 모든 유전자의 기능을 식별하는 것이 목표인 마우스 인터내셔널 페노티핑 컨소시엄은 μ-CT를 피노핑파이프라인(19)의일부로 활용한다. 그들의 결과는 또한 마우스 해부학 및 발달을 위한 아틀라스역할을 하는 동안 발달과 질병 프로세스에 관련되었던 유전자를 이해하기 위한 중요했습니다20. 제브라피시 및 쥐와 같은 다른 모델 유기체는 또한 유전자돌연변이체(17, 21,22,23)의수의 전체 동물 페노핑을 수행하기 위한 μ-CT의 사용을 완전히수용했다.

전체 동물 화상 진찰과 모델 유기체를 결합하는 장점은 주어진 생물학적 과정에 대한 유전자 기능에 대한 기계적 이해가 완전히 탐구 될 수 있다는 것입니다. 이것은 명백한 발달 시점에서 유전자 기능의 정확한 조작을 허용하는 모형 유기체에서 유효한 잘 특징인 게놈 및 많은 유전 공구 때문에 가능합니다, 특정 조직, 개별 세포, 및 심지어 세포 세포 소기관. 여기에는 UAS/GAL4 시스템(및 많은 파생상품), CRISPR/Cas9 및 RNAi24,25, 26과같은 바이너리 식 시스템이포함됩니다. 이러한 유전 적 도구는 전자 현미경 검사법, 광 현미경 검사법 (형광 및 비 형광)으로 구성된 강력한 이미징 파이프 라인과 함께 사용될 때, μ CT와 같은 전체 동물 이미징, 분자, 세포, 조직, 장기 및 전체 유기체의 철저한 평가를 달성 하여 유전자 기능에 대한 훨씬 더 깊은 이해를 가능하게합니다.

이 프로토콜은 비 포유류 모델 유기체 Drosophila melanogaster에서 μ CT의 사용에 초점을 맞추고, 누구의 무수한 유전 도구는 수많은 분자 메커니즘을 해명 하는 데 도움이26,27. 비모델 곤충1,28,29,30,31,32의이전 프로토콜에서 채택되었으며, 드로소필라에서 이전 μ CT 연구를 기반으로 이 동물33,34,35,36,37, 38,38, 39에사용할 수 있는 표준화된 프로토콜을확립했습니다. ,40,41. 상용 스캐너를 사용하여 플라이 μ-CT 데이터 세트의 성공적인 샘플 준비, 이미징 및 분석을 위한 단계가 설명되어 있습니다. 이 프로토콜을 통해 비행의 모든 발달 단계는 분류, 해부학, 발달, 생리학 및질병(27)을포함한 설명 및 가설 테스트 연구 모두에 대해 고해상도로 시각화될 수 있다. 이 프로토콜은 또한 μ-CT에 의한 시각화를 향상시키기 위해 이미지 대비를 위해 화학 적 염색을 필요로하는 거의 모든 곤충및 비 살아있는 물질을 이미징하는 데 유용할 것입니다.

Protocol

1. 샘플 선택 및 큐티클 준비

  1. 이미징을 위한 적절한 발달 시간점(배아, 애벌레, 푸파 또는 성인)을 선택하십시오.
    1. 배아 단계의 경우, 효모 페이스트로 얼룩진 포도 주스 한천 접시에 케이지 암컷을 넣고 30-60분마다 계란을 수집합니다. 적절한 단계에 도달 할 때까지 25 °C에서 개발하기 위해 이러한 배아를 둡니다.
    2. 애벌레 단계의 경우, 시간 별과 제2 별을 시간 별 수집 실험에서 수집합니다. 밀집하지 않는 조건에서 음식 유리병 의 측면에서 방황 하는 3rd 별 직접 선택 합니다.
    3. pupal 타이밍의 경우 흰색 프리 푸파 (반전 된 첨탑)를 수집하고 큐티클이 갈색으로 변하기 시작하는 시간을 기록하십시오. 동물은 큐티클 브라우닝에 따라 정의된 시점에서 15단계의 푸팔 발달을 통해 진행되며 그에 따라42개에서수집할 수 있다.
    4. 백과 다음 처녀로 성인을 수집하고 필요한 시간 (예를 들어, 완전한 창자 개발을위한 5 일)에 대한 음식 유리병에 나이를 허용합니다.
  2. 5-50마리의 동물을 1.5mL 마이크로센심분리기 튜브로 옮기면 1x 인산염 완충식식살린(0.5% PBST)에서 0.5% 트리톤 X-100의 1mL를 함유한다. 벤치탑에서 주기적으로 튜브를 두드리는 동안 실온(RT)에서 5분 동안 배양하여 소수성 코팅 제거를 돕고 동물이 완전히 침수될 수 있도록 합니다.
    1. 배아, 애벌레 및 푸팔 단계의 경우, 튜브를 100°C로 설정된 열블록에 20초로 설정한 다음 5분 동안 RT에서 냉각하여 추가 개발을 체포한다.
      참고 : 동물은 액체 질소(37)에서얼어 붙을 수도 있습니다.

2. 고정 및 염색

  1. 0.5% PBST를 제거하고 부인 솔루션 1mL을 추가합니다. 동물을 완전히 잠수할 수 있도록 튜브를 탭합니다.
    주의: 부인의 해결책에는 포름알데히드가 포함되어 있습니다. 그것은 유출 하는 경우 피부와 눈에 급성 독성을 일으킬 수 있습니다 및 삼 킨 경우 치명적일 수 있습니다. 취급 시 장갑, 안전 안경 및 실험실 코트를 착용하십시오.
    참고: 에탄올 사용과 같은 추가 고정 기술도 사용할 수 있습니다. 다른 고정제의 장점은 참조1,30에자세히 설명되어 있습니다.
    1. 배아 및 성인 샘플의 경우 RT에서 16-20 h의 벤치탑에 배양하십시오.
    2. 애벌레와 푸팔 샘플의 경우 RT. De Bouin의 용액에서 2 h로 동물을 수정하고 1x PBS로 5 분 세 번 세척하십시오. 1x PBS가 들어 있는 다중 잘 해부접시로 옮기고 홀더에 부착된 작은 미누티엔 핀을 사용하여 전방및 후방 큐티클에 구멍을 찔러 근본적인 연조직을 방해하지 않도록 주의하십시오.
    3. 애벌레와 푸팔 샘플을 마이크로퍼지 튜브로 다시 옮기고 신선한 부인용 1mL을 추가합니다. RT에서 24 시간 동안 벤치 탑에 인큐베이션.
  2. 부인용액을 제거하고 μ-CT 워시 버퍼(0.1M Na2HPO4,1.8% 수크로즈) 또는 1x PBS 세 번으로 30분 동안 시료를 세척하십시오.
  3. 적절한 염색 용액 1mL을 추가하고 2-7 일 동안 벤치 탑에 인큐베이션하십시오.
    참고: 얼룩 선택은 여러 가지 요인에 따라 다르지만 일반적으로 침투, 잠복기 및 해상도 사이의 균형입니다. 일반적으로 인포퉁산(PTA)은 연조직의 뛰어난 대비및 분해능을 제공하지만, 큐티클과 더 긴 잠복기의 기계적 중단이 필요합니다. 다른 얼룩 유형의 장점은 심판1에서자세히 설명됩니다.
    1. 요오드 염색의 경우 0.1 N I2KI(루골 용액)의 1mL을 사용하십시오. 2 일 동안 인큐베이션. 성인 표기의 더 이상 중단이 필요하지 않습니다.
    2. 인산(PTA) 염색의 경우 물에서 희석된 0.5%(w/v) 용액의 1mL을 사용하십시오. 구강 부품을 제거하거나 홀더에 작은 미누티엔 핀이 부착된 흉부 또는 복부 큐티클의 구멍을 뚫어 성인 큐티클을 방해합니다. 조직 염색이 비 균질한 것처럼 보이는 경우 5-7 일 동안 배양또는 더 이상 배양하십시오.
  4. 초순수 1mL 또는 PBS 1x으로 30분 동안 세척합니다. 반복 세척 단계. 동물을 RT에 초순수 수로 또는 1x PBS에 최대 1개월 동안 보관하십시오.
  5. 수분을 공급하는 동안 동물을 스캔하려면 섹션 4로 직접 진행하십시오. 샘플의 더 긴 보존이 필요한 경우 프로토콜의 섹션 3로 진행합니다.

3. 임계 점 건조 (선택 사항)

  1. 샘플에서 에탄올(EtOH) 탈수 계열을 수행합니다: 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 100% EtOH 용액의 1mL을 추가하고 명시된 순서대로 각 농도에 대해 1h의 벤치탑에 인큐베이션을 넣습니다.
  2. 마지막 100 % EtOH 담그 후 신선한 100 % EtOH로 교체하고 밤새 벤치 탑에 샘플 인큐베이션을 하십시오.
  3. 제조업체의 지시에 따라 시료의 임계 점 건조를 수행합니다.
    참고: 전자 현미경 설비에는 일반적으로 EtOH 탈수 다음 시료의 건조를 수행하는 임계 점 건조 기(재료 표참조)가 있습니다.

4. 샘플 마운팅

  1. 비판적으로 점 건조 시료의 경우, 회전 단계의 척 내에 장착하거나 플라스틱 또는 유리 모세관 튜브 (~1.0-1.25 mm 내경)에 배치하도록 설계된 곤충 핀 또는 기타 홀더에 뜨거운 접착제 샘플을 넣습니다.
  2. 수화 시료의 경우 P10 파이펫 팁을 물로 채우고 열 밀봉 또는 파라핀 필름으로 좁은 끝을 확보하여 누출을 방지합니다.
    주의: 물이 스캐너에 누출되지 않고 손상을 입히도록 연결을 단단히 감싸야 합니다.
    1. 단일 시편을 집게를 사용하여 파이펫 팁으로 옮김합니다. 둔한 20G 바늘이나 다른 파이펫 팁과 같은 길고 날씬한 물체를 사용하여 피펫 팁의 벽에 닿을 때까지 조심스럽게 표본을 팁 아래로 밀어 제자리에 고정합니다.
    2. 긴 스캔 중에 물의 증발을 방지하기 위해 파라핀 필름으로 파이펫 팁의 개방을 덮습니다.
    3. 회전단계(그림 1A-C)의척 내에 맞게 설계된 홀더를 사용하여 P10 파이펫을 장착합니다.

5. 스캔

  1. 하루 동안 이미징하기 전에 필요한 교정을 수행합니다.
    참고: 제조업체마다 다르며 응용 프로그램 전문가와 상의하여 적절한 단계를 결정하는 것이 좋습니다. 이 프로토콜에 사용되는 설정 및 소프트웨어에 대한 구체적인 정보는 재료 표를 참조하십시오. 일반적으로, 무대 축 정렬과 같은 보정은 척이 회전 단계에 비해 축을 벗어난 것을 제거하고 카메라의 균일한 배경 픽셀 강도를 보장하기 위해 평평한 필드 보정을 수행하여 여러 스캔에서 비교할 수 있는 최상의 해상도 및 데이터 집합을 위한 최적의 이미징 조건을 제공합니다.
  2. 스캐너 도어를 열어 소프트웨어 왼쪽 상단 모서리에 있는'오픈 도어'아이콘을 클릭하여 회전스테이지 척에 액세스할 수 있습니다. 샘플 홀더의 베이스 주위에 칼라를 조이면 샘플을 부착합니다.
    참고: 시료를 회전 척에 부착할 때 부드러운 압력을 사용하여 스캐너 정렬을 유지합니다.
  3. 최적의 해상도와 대비를 위해 스캐너를 제어하는 소프트웨어의 스캔 매개 변수를 설정합니다.
    참고: X선 소스, 카메라/검출기 및 각 스캐너의 형상은 제조업체에 따라 달라지기 때문에 이러한 사항을 경험적으로 결정해야 합니다. 최고의 매개 변수를 선택하는 추가 정보는 여기에서 찾을 수 있습니다43,뿐만 아니라 제조업체의 응용 프로그램 전문가에서.
    1. X선 소스 전원 제어(옵션 | 열기 엑스레이 소스). 슬라이더 바를 사용하여 X선 전압을 30-40kV로 설정하고 전류를 100-110 μA로 설정하여 3-4W의 출력과 작은 스팟 크기로 X선 빔을 생성하여 향상된 해상도를 확인합니다.
    2. 획득 모드 대화 상자사용(옵션 | 획득 모드)카메라 노출 시간을 500-800ms로 설정합니다.
    3. 카메라 설정 및 위치에 따라 원하는 이미지 픽셀 크기(~700nm ~ 4 μm)를 설정하려면 소프트웨어 하단의 돋보기 아이콘 옆에 있는 슬라이더 막대를 사용합니다. 이렇게 하면 검사 중에 획득되는 프로젝션 이미지의 수가 결정되며, 더 많은 프로젝션이 향상된 해상도로 이어지지만 스캔 시간이 길어집니다(대표 결과참조).
    4. 소프트웨어 하단의 회전 화살표 옆에 있는 슬라이더 막대를 클릭하고 드래그하여 360° 회전 경로를 따라 샘플을 이동합니다. 샘플이 시야 내에 있는지 확인합니다.
  4. 소프트웨어 상단의'시작 획득'아이콘(파란색 원 화살표 아이콘)을 클릭합니다. 추가 검색 매개 변수를 설정할 수 있는 대화 상자와 스캔이 저장될 파일 및 출력 폴더의 이름을 지정할 수 있습니다.
    1. 임의 이동을 10프레임과 평균 4-6프레임으로 설정합니다. 회전 단계는 사용되는 카메라 설정에 따라 자동으로 계산됩니다.
  5. 인수 대화 상자에서'OK'를클릭하여 검사를 시작합니다. 검사 시간을 표시하는 두 번째 진행률 막대 대화 상자가 나타납니다. 스캐너는 이제 회전 경로를 따라 시편의 일련의 프로젝션이미지(그림 1D)를획득하고 모니터링할 필요가 없습니다.

6. 재건

  1. 토모그램을 생성하려면 프로젝션 이미지를 사용하여 이미지 재구성을 수행합니다.
    참고: 원뿔 빔 형상 스캐너에서 이미지를 거의 모든 재구성하는 것은 Feldkamp 알고리즘16에의존하지만 개별 매개 변수는 소프트웨어 구현에 따라 달라지며 경험적으로 결정되어야 합니다. 상용 소프트웨어에 대한 특정 설정(재료 표참조)을 가이드로 사용할 수 있습니다. 정렬 불량 보정, 링 아티팩트 감소 및 빔 경화 보정(대부분의 플라이 샘플의 경우 0%)과 같은 매개 변수는 최종 재구성을 위한 최상의 값을 선택하기 위해 반복적인 방식으로 수행됩니다. 재구성 프로세스를 더 많이 제어하고자하는 고급 사용자의 경우 여기에서 MATLAB 인터페이스를 참조하십시오44.
  2. 참조스캔(45)에 기반한 시프트 보정 알고리즘을 활용하여 초기 이미지 정렬을수행합니다(동작 | 참조 검사와 X/Y 정렬).
  3. 각 재구성 매개 변수를 미세조정(시작 | 미세 조정). 이렇게 하면 '매개 변수 미세 조정' 대화 상자가 활성화됩니다.
    1. '다음'을 클릭하여정렬을 미세 조정합니다. 반복 수를 5개로 설정하고 매개 변수 단계를 1.0으로 설정합니다. 시작 버튼을 클릭하여 일련의 미리 보기를 생성합니다. 올바르게 정렬된 이미지를 선택합니다.
      참고: 제대로 정렬된 이미지가 흐릿하지 않거나 '전단' 아티팩트가 표시되지 않으며, 그렇지 않으면 연속 구조(예: 큐티클)가 분할된 것처럼 보입니다.
    2. 그 옆에 클릭하여 링 아티팩트 감소를 미세 조정합니다. 반복 수를 5개로 설정하고 매개 변수 단계를 1.0으로 설정합니다. 시작 버튼을 클릭하여 일련의 미리 보기를 생성합니다. 가장 적은 수의 링이 포함된 이미지를 선택합니다.
  4. 위의 매개 변수가 최상의 이미지를 제공하도록 최적화되면 선택한 값이 설정탭(설정)에 올바르게 표현되었는지 확인합니다.
  5. 히스토그램, 비트 깊이 및 유형과 같은 파일 매개 변수를 사용하여 최종 밝기 및 대비 값을 조정하고 관심 구조(예: 전체 플라이 또는 헤드 만)만 포괄하는 관심 영역(ROI)을 사용하여 계산시간(출력)을줄입니다.
  6. 재건시작(시작 | 시작). 여러 번 의 재구성이 필요한 경우 현재 이미지를 배치 관리자에 추가합니다(시작| 배치에 추가) 나머지 이미지에 대 한 6.2-6.5 단계를 반복 합니다.

7. 이미지 분석

  1. 토모그램을 2차원과 3차원에서 시각화하고 프리웨어 또는 상용 소프트웨어로 추가 적인 형태 분석을 수행합니다.
    참고: 이 프로토콜에 사용되는 소프트웨어의 세부 정보는 재료 표에서확인할 수 있습니다. μ-CT 데이터 세트를 평가할 수 있는 다른 소프트웨어 패키지에는 FIJI46,Seg3D(www.seg3D.org)47,ITK-SNAP48,상업용 소프트웨어(예: AMIRA)와 같은 프리웨어 옵션이 포함됩니다. 세분화 프로세스를 반자동화하기 위해 기계 학습 기반 알고리즘을 사용하는 다른 응용 프로그램은 워크플로우속도를 높이고 인간의 바이어스(예: Biomedisa49)를줄일 수 있습니다.
  2. 토모그램 파일을 소프트웨어로가져오기(파일 | 이미지 파일 가져오기). 파일과 연결된 메타데이터는 창에 자동으로 로드되어야 하지만 이미지 속성과 일치하도록 수동으로 설정할 수도 있습니다.
  3. 관심 있는 구조를 분할하려면 화면 왼쪽의 세그먼트 탭을 클릭합니다. 새로운 관심 영역(ROI)만들기(기본 | 신규)- 이름을 지정하고 적절한 색상을 선택합니다.
  4. 관심 구조를 포괄하는 임계값 범위정의(범위 | 범위 정의) 슬라이더 막대를 사용하여.
  5. 적절한 2D 또는 3D ROI 화가 도구모드(ROI painter | 선택 페인트 브러시 옵션).
  6. 임계값에 의해 정의된 영역을 페인트하려면; 왼쪽 마우스 키를 들고 있는 동안 Ctrl 키를 길게 누릅니다. 영역을 제거하려면 왼쪽 마우스 키를 유지하면서 Shift 키를 길게 누릅니다.
    참고: 원형 또는 정사각형 페인트 브러시의 크기를 변경하려면 Ctrl 또는 Shift 키를 들고 마우스 휠을 스크롤하기만 하면 됩니다.
  7. 전체 Z 볼륨전체에 걸쳐 관심 구조를 계속 그립니다.
  8. ROI를 메시로변환(내보내기 | 메시| 정상).
  9. 오른쪽 상단 모서리에 있는 데이터 속성 및 설정 패널에서 메시 오버레이를 클릭하여 강조 표시합니다.
  10. 적절한 수의 반복(부드러운 메시 | 사용하여 메시를부드럽게 합니다. 반복).
    참고: 비교할 모든 이미지에 대해 동일한 메시 스무딩 반복 값을 사용합니다.
  11. 기본 형태 분석을 위해 화면 오른쪽에 있는 정보 패널에 메쉬 ROI(표면적, 볼륨 및 페렛 직경)의측정값이 표시되는지 확인합니다. 개체 분석 모듈을사용하여 추가 분석을 수행할 수 있습니다.
  12. 메시 오브젝트와 전체 토모그램 이미지를 렌더링하고 3D로 시각화합니다. 내장 된 동영상 제작자를 사용하여 개체의 비디오를 생성합니다(마우스 클릭 | 뷰어의 개별 프레임을 사용하여 동영상 제작자표시(키 추가).
    참고: 오른쪽 패널의 시각 효과 탭을 사용하여 동영상에 몇 가지 시각적 향상 을 적용하여 특정 기능 등을 강조표시할 수도 있습니다.
  13. 동영상 제작자에서 내보내기 애니메이션 버튼을 사용하여 볼 수 있도록 비디오를 내보냅니다.

Representative Results

도 2는 배아,3rd 인스타 애벌레, 팬레이 성인 단계(P7)의 강아지, 그리고 상업용 벤치탑 스캐너를 사용하여 물에 요오드와 이미지 수화로 염색된 성인 여성의 비행을 보여줍니다. 우수한 보존 및 섬세한 조직의 얼룩이 명백하여 모든 주요 장기를 쉽게 식별하고 형태 분석 및 3D 시각화에 사용할 수 있습니다.

일반적으로 시편의 프로젝션 이미지를 적게 획득하는 스캔은 더 많은 프로젝션 이미지를 획득하는 검사보다 낮은 해상도를 제공하며, 절충은 스캔에 소요되는 시간입니다. 스캔 시간은 기기 및 기타 스캔 매개 변수에 따라 다르지만, 수백 개의 투영(~3 μm 이미지 픽셀 크기)을 획득하는 스캔은 시편당 약 30분이 소요되는 반면 수천 개의 프로젝션 이미지(700 nm-1.25 μm 이미지 픽셀 크기)로 구성된 스캔은 8-16h를 취할 수 있습니다. 동일한 성인 플라이 헤드케이스를 '슬로우'(수천 개의 프로젝션)와 '빠른'(수백 개의 프로젝션) 스캔 모드에서 비교한 것이 그림 3에표시됩니다. 중요하게도, 형태 분석은 '느린'과 '빠른'스캔(그림 3C)40사이에 다르지 않다. 따라서 당사의 이미징 파이프라인은 빠른 스캔을 사용하여 형태 분석을 위한 충분한 크기의 샘플 크기를 생성하고 스캔을 느리게 하여 더 높은 해상도로 형태학적 또는 해부학적 결함을 시각화합니다. 소프트웨어(7단계)를 이용하여, 관심 있는 모든 조직 또는 장기 시스템은 형태분석에 사용될 수 있으며 영화제작자(Movie 1)를사용하여 3D로 시각화할 수 있다.

도 4는 PTA와 이미지수화(water)로 염색된 플라이 복부(water) 또는 X선 현미경(재료표)에서임계점 건조(CPD)를 따르는 예를 나타낸다. PTA의 조합과이 플랫폼의 기능에 의해 제공되는 세부 사항은 이러한 이미지에서 쉽게 분명하다, 이러한 이미지에서 쉽게 분명하다, 이러한 미드 구트와 고환 내에서 정자 번들의 개별 상피 세포는 쉽게 해결된다. CPD 이미지는 수화 샘플에 비해 약간 증가된 해상도를 나타내지만, 섬세한 조직의 초구조(예: 큐티클 근처의 지방 세포)의 보다 나은 보존이 수화샘플(Movie 2)으로달성된다.

Figure 1
그림 1: μ-CT용 스캐너 설계 및 샘플 마운팅 개요입니다. (A)상업용 벤치탑 μ-CT 스캐너. (B)스캐너 내부를 볼 수 있습니다. X선 소스(오른쪽)는 회전 스테이지(노란색 화살표)에 있는 샘플을 통과하는 엑스레이를 방출합니다. 이러한 X선의 감쇠는 시료를 통과하여 검출기로 전달될 때 이미지 콘트라스트를 생성하며, 이는 X선을 광자로 변환하는 신경화 스크린과 표준 CCD 카메라(왼쪽)로 구성됩니다. (C)수화 영상을 위해 성인 과일 플라이를 장착하여 수분을 공급합니다. 파이펫 팁과 황동 홀더 사이의 연결 점은 스캐너의 누출 및 잠재적 손상을 방지하기 위해 파라핀 필름으로 감싸입니다. 스테이지 척도 강조 표시됩니다. 파이펫 팁은 약간 오프축으로 배치되어 스캔 시간이 길어지고 최종 재구성에서 해상도가 감소했습니다. (D)성인 여성의 단일 2D 프로젝션 이미지; 이러한 투영의 수백 ~ 수천 회전 축을 따라 스캔 하는 동안 획득 하 고 등위 체능 해상도 와 정확한 3D 정보를 포함 하는 토모 그램을 생성 하는 재구성에 사용 됩니다. 스케일 바 (C) = 2mm. P, 후방; V, 복부. 이 그림은 스코보그 등40에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 모든 드로소필라 멜라노가스터 수명 주기 단계, μ-CT에 의해 이미지. 요오드와 물에 수화 된 이미지로 얼룩진 샘플. 표시된 단일 2D 슬라이스입니다. (A)가스측(별표)의 초기 단계를 완료한 배아. (B)세 번째 인스타 애벌레. (C)변태 동안 P7 피질 성인. (D)성인 여성. 다양한 장기가 강조 표시됩니다 : BWM, 신체 벽 근육; Br, 뇌; CD, 카디아; Cr, 자르기; DORS, 등쪽 세로 근육; DVM, 등쪽 복부 근육; E-AD, 눈 안테나 디스크; Em, 배아; FB, 지방 시체; FbCs, 지방 체 세포; H, 심장; Hg, 힌드구트; 라, 라미나; L, 다리; Mg, 미드구트; OL, 뇌 광학 엽; Ov, 난란 시터; PC, 푸팔 큐티클; SG, 타액 땀샘; VNC, 복부 신경 코드; W, 날개; WD, 날개 디스크. 스케일 바 (A) = 100 μm; (B)-(D) = 500 μm D, 도르살; A, 전방; L, 왼쪽. 스캐닝 매개 변수: 소스 투 샘플 거리(mm): (A, D) 36.5, (B) 48.8, (C) 40.3. 카메라 거리(mm)에 소스: (A, D) 350, (B, C) 285. 카메라 픽셀 크기(μm): (A-D) 11.6. 이미지 픽셀 크기(μm): (A, D) 1.2, (B) 1.9, (C) 1.7. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 매개 변수 및 이미지 해상도를 스캔하면 형태 분석이 변경되지 않습니다. 성인 헤드는 모두(A, A)' 빠른' 스캐너 설정(수백 개의 투영)과(B, B)'느린' 스캐너 설정(수천 개의 프로젝션)을 사용하여 스캔했습니다. 뇌는 노란색으로 설명되어 있습니다. (C)느리고 빠른 스캔에서 뇌 볼륨 측정. 강조 표시된 구조: AL; 안테나 로브; CB, 중앙 뇌; FB, 팬 모양의 몸; FC, 지방 세포; 라, 라미나; 로, 로불라; LoP, 로불라 플레이트; 나, 수질; 다시, 망막. n = 5, 웰치의 t-테스트. ns = 중요하지 않습니다. 스케일 바 = 100 μm. 스캐닝 매개변수: 소스 투 샘플 거리(mm): (A) 44.4, (B) 36.5. 카메라 거리(mm)에 소스: (A) 348 (B) 350. 카메라 픽셀 크기(μm): (A-B) 11.6. 이미지 픽셀 크기(μm): (A) 2.95, (B) 1.2. 이 그림은 스코보그 등40에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: X선 현미경 검사법에 의해 이미지된 Drosophila 멜라노가스터 복부. 복부는 0.5% PTA와 이미지 수화(물) 또는 임계점 건조(CPD)를 따라 염색하였다. (A)YZ 원근및 (A') XZ 원근에서 나타난 임계점 말린 복부. (B)YZ 원근과 (B') XZ 관점에서 보여지는 수분화 복부. 다양한 장기가 강조강조됩니다 : FC, 지방 세포; Hg, 힌드구트; Mg, 미드구트; SP, 정자 펌프; 테, 테스. 스케일 바 (A) = 250 μm. D, 도르살; A, 전방; L, 왼쪽. 매개 변수 스캔: 소스에서 샘플 거리(mm): (A) 6.7, (B) 7. 카메라 거리(mm)에 대한 소스): (A) 28 (B) 29.5. 목표: (A-B) 4X. 이미지 픽셀 크기(μm): (A-B) 0.65. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

영화 1: 잠자리의 영화 제작자를 사용하여 3D로 렌더링된 세 번째 인스타 애벌레. 강조 된 장기는 뇌 (노란색), 눈 안테나 상상 디스크 (빨간색), 지방 몸 (파란색) 및 신체 벽 근육 (녹색)을 포함한다. 이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

동영상 2: 물 속에서 이미지된 시료를 비교하거나 임계점 건조를 따릅니다. 0.5% PTA로 염색된 복부가 표시됩니다. 두 복부 모두 동일한 이미지 픽셀 크기 설정(0.65 μm)으로 스캔되었습니다. 일련의 2D 슬라이스는 등쪽 표면에서 시작하여 복부의 복부 표면에서 끝나는 'Z 스택' 형식(YZ)으로 표시됩니다. 강조 장기: FC, 지방 세포; Mg, 미드구트; SP, 정자 펌프; 테, 테스. 매개 변수 스캔: 소스에서 샘플 거리(mm): (A) 6.7, (B) 7. 카메라 거리(mm)에 대한 소스): (A) 28 (B) 29.5. 목표: (A-B) 4X. 이미지 픽셀 크기(μm): (A-B) 0.65. 이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

모든 발달 단계에서 온전한 Drosophila melanogaster를 시각화하는 것은 주로이 동물에서 발견되는 두껍고 색소화 된 큐티클과 가벼운 현미경 검사법의 비호환성으로 인해 어려움을 유지하고 있습니다. 자기 공명 영상 (MRI), 광학 일관성 단층 촬영 (OCT), 조직 클리어링과 결합 된 초미세 검사법과 같은 다른 전체 동물 이미징 방법은 파리50,51,52,53,54,μ-CT와 같은 다른 전체 동물 이미징 방법이 이 유기체13,15,30의 전체 동물 이미징에 이상적이되는 많은 장점을 제시합니다. . 엑스레이는 쉽게 안료 표피를 관통하고 그들의 작은 파장은 서브 미크론 화상 진찰을 허용합니다. 라벨링은 널리 사용 가능한 화학 물질에 대한 최소한의 투자가 필요하며 전문 벤치기술(13)이필요하지 않습니다. μ-CT 스캐너도 시판되고, 비용은 가벼운 현미경 플랫폼에 필적하는 동시에 기관에서 사용할 수 있는 더 넓은 범위(지질학, 고생물학, 엔지니어링 등)에 더 매력적입니다. 싱크로트론 X선 소스는 고정 및 살아있는 곤충31,55,56의고해상도 μ-CT 이미징에도 사용할 수 있지만 상업용 벤치탑 스캐너보다 접근이 덜합니다.

이 프로토콜은 비행 성인, 강아지, 애벌레 및 세포화 배아의 μ CT 이미지를 얻을 수있는 효율적인 방법을 제공합니다. 위에서 설명한 많은 단계의 경우 이미징을 위한 샘플을 준비하기 위해 대체 방법을 적용할 수도 있습니다. 다른 연구는 곤충에 사용하기 위한 상이한 고정, 라벨링 및 건조 단계에 대한 상세한 비교를 제공했으며, 이 기술을 채택하는 데 관심이 있는 사람들은 각 접근법1,4,13,29,30,57의장점을 평가하는 것이 좋습니다. 이 프로토콜은 비교적 간단하지만 몇 가지 유용한 제안이 표시됩니다.

첫째, 근본적인 연조직이 현저하게 중단되지 않도록 온전한 견본의 표피를 중단할 때 주의해야 합니다. 애벌레와 초기 pupal 단계는 찌르기 전에 부인의 솔루션에서 2 시간 동안 고정을 겪는 것이 중요합니다. 이것은 조직을 뻣뻣하게 하고 기관 건축을 바꿀 수 있는 큐티클 구멍에서 스며드는 혈몰리의 양을 제한할 것입니다. 성인의 개별 신체 세그먼트(머리, 흉부 및 복부)는 관심있는 구조가 있는 경우 분리될 수 있다. 예를 들어, 장이나 중추 신경계의 3D 아키텍처를 방해할 수 있는 집게로 떼어내는 대신 메스를 사용하여 이러한 세그먼트를 깔끔하게 슬라이스하는 것이 좋습니다. 타이밍에 관해서는, 성인은 일반적으로 단지 16 시간 필요. 완전한 고정을 위해, 애벌레와 pupal 단계는 24 h가 필요한 반면. 또한 요오드 또는 PTA 염색이 고르지 않은 것처럼 보이는 경우, 샘플은 얼룩이 도출될 때까지 더 오래 배양하기 위해 용액에 다시 배치될 수 있다. 마지막으로, 수화 시료는 4°C에 배치되어서는 안 되며, 이는 실온으로 온난화한 후 체내의 기포 형성을 유도하는 것으로 보인다.

둘째, 시료 마운팅은 계측기, 스테이지 유형 및 시료가 수분을 유지해야 하는지 또는 임계점을 건조해야 하는지 여부에 따라 달라집니다. 수분을 공급하는 경우 샘플이 누출되지 않고 스캐너를 파괴할 수 있는지 확인합니다. 피펫 팁 안에 샘플을 장착할 때, 표본이 약간의 저항을 겪고 움직일 수 없을 때까지 둔한 물체로 부드럽게 밀어넣으십시오. 너무 강하게 밀면 큐티클 변형과 근본적인 구조적 결함으로 이어질 수 있습니다. 또한 샘플이 가능한 한 회전 축에 가깝게 홀더에 정렬되어 있는지 확인합니다. 모든 흔들림은 더 큰 시야로 인해 스캔 시간을 늘리고 재건 후 최종 토모그램의 해상도를 줄입니다.

셋째, 프로젝션 이미지를 획득하기 위한 스캐너 설정도 기기마다 다릅니다. 스캐너의 해상도 기능을 최대화하려면 X선 빔 스팟 크기는 가능한 한 작아야 합니다(5-10 μm). 이는 X-Ray 전압과 전류 설정의 균형을 맞추어 총 전력이 3-4W인 것을 달성할 수 있습니다. 이러한 설정과 카메라의 적절한 노출 시간을 통해 샘플에 의한 적절한 X선 빔 감쇠와 최적의 이미지 콘트라스트를 달성할 수 있습니다. 물체와 X선 소스 사이에 알루미늄 또는 구리 필터를 사용하여 최적의 이미지 콘트라스트를 위해 최적의 X선 에너지 설정을 미세 조정하거나 더 높은 전원을 사용할 수 있도록 빔을 충분히 감쇠하는 데 사용할 수 있습니다. 이미지 해상도는 얼룩 유형, 투사 이미지 수, 이미지 픽셀 크기, 카메라 위치, 샘플 움직임, 스캐너 진동 및 재구성 매개 변수를 포함한 다양한 변수에 따라 달라집니다. 알려진 크기 마커가 포함된 막대 패턴 팬텀(QRM GmbH)은 지정된 스캐너 및 카메라 설정에 대한 공간 해상도를 평가하는 데 도움이 될 수 있습니다.

또한 화상 진찰 임계 점 건조 또는 수화 샘플의 장점을 평가 가치가있다. Sombke 등은 두 가지 방법에 대한 비교 평가를 수행하고절지동물(30)을포함하는 μ-CT 응용 분야에서 임계점 건조가 우수하다는 것을 발견했다. 그러나, 수화 견본의 이득은 동물이 양적 및 형태학적 유물 둘 다로 이끌어 낼 수 있는 더 적은 화학및 기계적인 노출을 복종한다는 것입니다. 이것은 또한 CPD 보다는 더 나은 섬세한 조직을 보존하는 경향이 있습니다. 그러나, 수화 된 샘플은 유통 기한이 훨씬 짧으며 조직 저하 및 감소 된 이미지 품질이 그 시점에서 명백해지기 때문에 고정 후 한 달 이상 이미지화되어야합니다. 또한, 수화 시료의 분해능은 금속 파이펫 팁과 주변 액체(물 또는 완충)를 통해 X선이 침투해야 하기 때문에 임계점 건조 시료보다 약간 적을 것이다. 임계 점 건조 시료는 특히 건조기에 보관할 때 훨씬 더 오랜 시간 동안 보존할 수 있습니다. 또한 날개나 다리를 곤충 핀에 접착하여 스테이지 척에 배치하여 장착 과정을 단순화하여 X선 빔 경로에 직접 배치할 수 있습니다. 그러나, 이러한 샘플의 광범위한 에탄올 탈수는 조직 수축 및 섬세한 조직 아키텍처의 손실로 이어질 수 있으며, 이러한 효과를 최소화하기 위해 EtOH 농도를 증가시키는 것이 중요한 이유입니다. 그럼에도 불구하고, 파라포름알데히드 고정 및 요오드 염색을 포함한 모든 형태의 화학 적 처리가 조직 수축을 일으킬 수 있음을 주목해야한다58,59. 두 방법 모두 살아있는 비행에서 '실제 장기 크기'의 측정을 제공하지 는 않지만, 고정, 염색 및 건조 단계가 두 샘플 세트에 대해 동일하게 수행되는 한 돌연변이 및 야생 형 동물을 비교할 때 형태 측정은 여전히 유효합니다.

결론적으로, μ-CT는 드로소필라33,34,35,36,37,38,39,40,41에유용한 전체 동물 이미징 도구를 제공한다. 다른 많은 연구는 곤충 분류, 생태학, 생리학, 개발 및 파리1,28,30,31,32,55,56,57의 미래 연구를 알리는 데 도움이 될 수있는 해부학의 다양한 측면을 이해하기위한이 기술의 힘을선보였습니다. . 이미 이 유기체에서 널리 사용되는 유전 및 가벼운 현미경 도구와 결합된 μ-CT는 유전자형과 표현형 사이의 깊은 이해를 허용하는 실험 파이프라인 내에 위치할 수 있습니다.

Disclosures

저자는 경쟁또는 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

나세르 루산의 지원없이는 이 중 어느 것도 불가능했을 것이다. NIH 마우스 이미징 시설의 H. 더그 모리스, 다니엘 도나휴, 브렌다 클라운버그, 그리고 마이크로 포토닉스의 벤 아쉬에게 교육과 유용한 토론을 감사드립니다. 나는 또한 Xradia 520 Versa에 복부 샘플을 스캔자이스의 만수레 노루지 라드 감사합니다. 로렌 스미스, 사만다 스미스, 레이첼 응도 스캔을 도왔다. 물체 연구 시스템의 마이크 마쉬는 잠자리 기술 지원을 제공했다. 또한 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소 (1K22HL137902-01)와 와이오밍 대학의 시작 기금의 지원에 감사드립니다. 나는 또한 그들의 유용한 제안과 의견에 대한 익명의 검토자에게 감사드립니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100% Ethanol For critical point drying
Bouin's Solution Sigma-Aldrich HT10132 For animal fixation
Critical Point Dryer Dries samples using the critical point method; multiple options available (Balzers CPD 020 or Leica EMCPD300)
Dragonfly Software Object Research Systems For visualization and segmentation of micro-CT datasets; https://www.theobjects.com/dragonfly/index.html
Heat Block For microfuge tubes
Image Analysis Workstation Should contain sufficient RAM and quality graphics card for 3D rendering
Iodine Solution (I2KI) Fisher Scientific SI86-1 For staining
Microcomputed Tomography Scanner Bruker Skyscan 1172 Cone-beam X-Ray geometry; detector is a Hamamatsu 10 MP camera with 11.54 µm pixel size.
Microcomputed Tomography Scanner Software Bruker For controling the scanner itself (e.g., performing flat field corrections, X-ray tube power, camera expsoure times, acquisition, etc.)
Minutien Pins Fine Science Tools 26002-15 For poking hole in cuticle
NRecon Image Reconstruction Software Bruker Used to reconstruct cross-section images from 2D projection images taken with cone-beam X-Ray geometry
P10 pipet tips Genesee Scientific 24-120 Sample mounting
Phosphate Buffered Saline Resarch Products International P32060-4000.0 Dilute to 1X with water before use
Phosphotungstic Acid Hydrate Sigma-Aldrich 79690-25g For staining
Pin Holder Fine Science Tools 26018-17 For Minutien Pins
Triton X-100 Research Products International 111036 To remove waxy coating from adult flies (as 0.5% PBST)
X-Ray Microscope Zeiss Xradia 520 Versa Cone-beam X-Ray geometry featuring Fresnel zone plate objective lenses for Resoluton at a Distance (RaaD™)

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발달 생물학 문제 163 Drosophila 멜라노가스터,마이크로 컴퓨터 단층 촬영 전임상 이미징 이미지 분석 인간 질병 모델링 페노티핑
마이크로 컴퓨팅 단층 촬영을 사용하여 <em>드로소필라 멜라노가스터의</em> 전체 동물 이미징
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Schoborg, T. A. Whole Animal Imaging … More

Schoborg, T. A. Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography. J. Vis. Exp. (163), e61515, doi:10.3791/61515 (2020).

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